CN104404022B

CN104404022B - 具有光化学活性的生物材料及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN104404022B
Application number: CN201410780391.3A
Authority: CN
Inventors: 杨春平; 何慧军; 程燕; 曾光明; 向海弘; 罗乐
Original assignee: Hunan University
Current assignee: Hunan University
Priority date: 2014-12-17
Filing date: 2014-12-17
Publication date: 2018-05-29
Anticipated expiration: 2034-12-17
Also published as: CN104404022A

Abstract

本发明公开了一种具有光化学活性的生物材料，是以酿酒酵母菌（S. cerevisiae）为载体，酿酒酵母菌的菌丝上负载有纳米TiO₂；酿酒酵母菌表面包裹有海藻酸钙。其制备方法包括以下步骤：将无菌纳米TiO₂、酿酒酵母孢子液、海藻酸钠溶液混合得到混合溶液；将混合溶液滴加到无菌CaCl₂溶液中，固化得到纳米TiO₂‑酿酒酵母孢子‑海藻酸钙微球；对制备的纳米TiO₂‑酿酒酵母孢子‑海藻酸钙微球进行培养得到具有光化学活性的生物材料。本发明的具有光化学活性的生物材料有二氧化钛的光化学性能以及酿酒酵母的微生物性能，具有清洁效果好、无污染等优点，可应用于苯酚废水的处理。

Description

具有光化学活性的生物材料及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及有机废水的生物处理技术领域，尤其涉及一种具有光学活性的生物材料及其制备方法，还涉及该具有光学活性的生物材料在有机废水处理的应用。

背景技术

随着城市化进程的加快和工农业的迅速发展，我国绝大多数城市都存在着较为严重的水污染问题。大量未经处理的城市垃圾、工业废水和生活污水不断排入自然水体中，使水体中的有机物含量急剧升高，特别是难降解有机物的量逐年增加，水体污染已成为全球性的环境污染问题，对于有机废水特别是难降解有机废水的治理至关重要。

目前对于有机废水的处理通常采用物理化学法和生物法两大类。其中，物理化学法对有机废水具有一定的处理能力，但费用较高且出水难以达到排放标准，传统生物法对中低浓度的有机废水处理效果较好，但其抗冲击能力有待提高，且对于难降解有机物的处理有一定的局限性。因此，寻求一种更安全、有效的有机废水处理技术成为当务之急。

酵母菌作为一种自然界常见菌种，已被广泛使用于科研及工业生产中，其中利用酿酒酵母菌处理有机废水的研究已有报道。酿酒酵母细胞为球形或者卵形，直径在5~10微米，是发酵中常用的生物种类，大量存在于酿酒企业的酒糟、酒曲中，因此其收集简单容易。采用酿酒酵母处理有机废水的优点主要表现为廉价、易得，但因其较难回收重复利用，抗冲击性能差以及对难降解有机物的处理能力较弱。

对于酿酒酵母处理有机废水的不足，许多研究工作者做了大量的工作，特别是采用了固定化技术对酿酒酵母固定从而增加其重复利用和抗冲击性。在专利CN102059100“一种磁性酿酒酵母菌的制备方法及其处理印染废水技术”公开了一种磁性酿酒酵母菌复合吸附材料的制备方法，其中包括磁性纳米四氧化三铁的制备以及酵母菌、四氧化三铁被戊二醛的固定，同时应用于对印染废水的处理。在CN102559796“一种利用固定化酵母细胞制备栀子蓝色素的方法”公开了一种普通的海藻酸钙固定产β-葡萄糖苷酶的酵母菌的方法。文献“固定化酵母菌、纳米TiO₂复合吸附剂对Ni²⁺，Cr³⁺，Pb²⁺吸附性能研究”（水处理技术，2011,37(11):38-41）研究制备了海藻酸钠、明胶和PVA混合包埋剂包裹含纳米二氧化钛和死酵母菌的生物材料，并用于处理重金属废水。上述文献在对固定化酵母菌重复利用及重金属处理方面有一定的研究，但此类酵母菌固定化方法对处理有机废水特别是难降解有机废水还存在处理效率低等缺陷。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种具有光学活性的生物材料及其制备方法，为酿酒酵母的利用提供了新途径，同时结合二氧化钛的光催化降解效应，提高酿酒酵母对有机废水特别是难降解有机废水的处理效果，避免二次污染。

为解决上述技术问题，提供了一种具有光化学活性的生物材料，是以酿酒酵母菌（S. cerevisiae）为载体，酿酒酵母菌的菌丝上负载有纳米TiO₂；酿酒酵母菌表面包裹有海藻酸钙。

作为一个总的技术构思，本发明还提供了上述的具有光化学活性的生物材料的制备方法，包括以下步骤：

（1）将无菌纳米TiO₂、酿酒酵母孢子液、海藻酸钠溶液混合得到混合溶液；

（2）将混合溶液滴加到无菌CaCl₂溶液中，固化得到纳米TiO₂-酿酒酵母孢子-海藻酸钙微球；

（3）对制得的纳米TiO₂-酿酒酵母孢子-海藻酸钙微球进行培养得到具有光化学活性的生物材料。

上述的制备方法，优选的，步骤（1）中海藻酸钠的浓度为3w/v%～6w/v%。

上述的制备方法，优选的，步骤（1）中纳米TiO₂粒子、含活酿酒酵母孢子溶液、海藻酸钠溶液的质量体积比为（0.05g～0.15g）∶（0.5mL～1.5mL）∶2mL。

上述的制备方法，优选的，活酿酒酵母孢子溶液的孢子浓度为2.5×10⁶ cfu/mL。

上述的制备方法，优选的，步骤（2）中混合溶液与无菌CaCl₂溶液的体积比为1∶5。

上述的制备方法，优选的，步骤（3）中培养过程具体为：将纳米TiO₂-酿酒酵母孢子-海藻酸钙微球至液体YPD培养基中，以120～150rpm转速在28～30℃下恒温振荡培养48h，然后滤出微球，完成培养过程。

作为本发明的同一技术构思，本发明还提供了一种采用前述的具有光化学活性的生物材料或采用前述制备方法制得的具有光化学活性的生物材料应用，包括以下步骤：将具有光化学活性的生物材料加入苯酚废水中，苯酚作为碳源并加入其他营养元素，进行恒温振荡培养12h以上，完成对苯酚废水的处理。

上述的应用，优选的，苯酚废水的pH为6.2，恒温振荡培养的温度为28℃、转速为150rpm，具有光学活性的生物材料的添加量为3g/100mL。

上述的应用，优选的，营养元素包括占苯酚浓度46.5%的硝酸钠、占苯酚浓度3.36%的磷酸二氢钾、0.5g/L KCl、0.5g/L MgSO₄·7H₂O、0.01g/L FeSO₄、0.001g/L VB₁、微量元素10mL/L；所述微量元素的配方为：1.5g/L氨三乙酸、5.0g/L MnSO₄、0.1g/L CoCl₂、0.1g/LZnSO₄·7H₂O、0.01g/L CuSO₄·5H₂O、0.01g/L KAL(SO₄)₂·12H₂O、0.01g/L Na₂MoO₄·2H₂O、0.01g/L H₃BO₃。

本发明的创新点在于：

本发明采用的二氧化钛在光照条件下将对微生物有高毒性、难吸收的苯酚分解成低毒性、易吸收的苯醌或甲酸等有机物，进而被酿酒酵母作为营养元素吸收利用而降解。本发明将二氧化钛的化学分解作用及酿酒酵母的微生物作用结合起来，达到了降解苯酚目的。而且起包埋作用的海藻酸钙，由于其具有多孔性及透明性能，即保证了营养元素进入材料内部供微生物生长同时也不会妨碍光的透过性，此外海藻酸钙也会阻碍酿酒酵母直接与高浓度苯酚接触，降低苯酚对酿酒酵母的毒害作用。

同时，本发明经过大量的实验发现：过量的纳米二氧化钛则对微生物有毒害作用，在0.5～1.5ml的孢子溶液中加入纳米二氧化钛的量0.05g～0.15g，既保证了纳米二氧化钛的光降解作用，对酿酒酵母又不会有损害作用。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

（1）本发明的复合型生物材料是一种集物理、化学和生物降解作用于一体的生物材料，具体是以酿酒酵母作为生物降解成分，则纳米TiO₂作为光化学催化成分用以进一步降解有机污染物，海藻酸钙则作为固定化介质将酿酒酵母菌和纳米TiO₂紧密结合以增强整个材料的机械强度、稳定性。其中酿酒酵母较常见并容易得到，对有机物、重金属等一些污染物质有一定的处理效果，且该微生物具有一定的耐污染能力。适量纳米二氧化钛能够刺激酿酒酵母微生物的生长，同时，在光照条件下，纳米二氧化钛有较好的光催化效果，对难降解的有机物有一定的降解效果。海藻酸钙固定纳米二氧化钛和酿酒酵母孢子，是为了让纳米二氧化钛和酿酒酵母包裹在一起，让制成的材料便于收集，也可以降低废水中高浓度有机物对酿酒酵母的毒害作用。

（2）本发明的复合型生物材料经过培养后，固定在复合型生物材料中的酿酒酵母孢子成长为成熟的个体，微球长大近一倍，在光照作用下对有机废水特别是难降解有机废水有很好的降解效果，进一步提高了复合型生物材料的降解能力。

（3）本发明采用的二氧化钛为粒径50nm左右的纳米二氧化钛，纳米粒径的二氧化钛光催化作用更强，对苯酚的降解效果更好。

（4）本发明制备的光化学活性复合型生物材料在有机废水处理中，不仅处理工艺和设备简单，操作方便，成本低，处理效果好且清洁无污染，是一种可以广泛采用的、能够高效去除有机废水的复合型生物材料。

附图说明

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述。

图1为具有光学活性的生物材料的结构示意图。

图2为纳米TiO₂-酿酒酵母孢子-海藻酸钙微球的外形图和经过培养后的具有光学活性的生物材料的外形图。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体优选的实施例对本发明作进一步描述，但并不因此而限制本发明的保护范围。

实施例

以下实施例中所采用的材料和仪器均为市售。其中酿酒酵母菌（S. cerevisiae）购于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号是GIM2.90。

实施例1：

参见图1，本发明的一种具有光化学活性的生物材料，以活酿酒酵母菌（S. cerevisiae）为载体，在酿酒酵母负载了纳米TiO₂粒子，海藻酸钙作为固定化介质包裹在酿酒酵母菌表面，将酿酒酵母菌菌体和纳米TiO₂紧密包裹在一起。

实施例1的具有光学活性的生物材料的制备方法，具体包括以下步骤：

（1）在无菌条件下，称取0.05g纳米TiO₂与1.5mL孢子浓度为2.5×10⁶cfu/mL的酿酒酵母孢子溶液混合均匀，之后加入2mL浓度为4 w/v %的海藻酸钠溶液，充分混匀，得到混合溶液，混合溶液的体积为3.5mL。

（2）在无菌条件下，将步骤（1）中制备得到的混合溶液利用无菌注射器逐滴滴加到17.5mL质量浓度为5w/v%的无菌CaCl₂溶液中，于室温下固化4h，得到平均直径1mm的纳米TiO₂-酿酒酵母孢子-海藻酸钙微球。

（3）将步骤（2）中制备得到的纳米TiO₂-酿酒酵母孢子-海藻酸钙微球，用无菌水洗涤3次，然后转移至100mL液体YPD培养基中（YPD培养基成分为1L水中加入10g酵母膏、20g蛋白胨、20g葡萄糖），在28℃、150rpm条件下恒温振荡培养48h，之后收集培养后的小球，得到本实施例的具有光化学活性的生物材料。

一种实施例1的具有光学活性的生物材料处理苯酚废水的应用，具体的应用方法为：

分别将3g步骤（2）制备得到的纳米TiO₂-酿酒酵母孢子-海藻酸钙微球和步骤（3）中经过培养后的具有光学活性的生物材料3g加入到100mL苯酚浓度为200mg/L的废水中。苯酚作为C源，并补充酿酒酵母菌需要的其他营养元素（营养元素为在1L含酚废水中加入0.93g NaNO₃、0.07g KH₂PO₄、0.5g KCl、0.5g MgSO₄·7H₂O、0.01g FeSO₄、0.001g VB₁、微量元素10mL。其中微量元素配方为1L水加入：1.5g氨三乙酸、5.0g MnSO₄、0.1g CoCl₂、0.1gZnSO₄·7H₂O、0.01g CuSO₄·5H₂O、0.01g KAL(SO₄)₂·12H₂O、0.01g Na₂MoO₄·2H₂O、0.01gH₃BO₃），调节废水pH为6.2，在28℃、150rpm及40瓦的日光灯照射下恒温振荡12h（恒温振荡时间为12h以上，均可实施）。待反应完成后直接过滤，采用4-氨基安替比林分光光度法测定滤液中苯酚浓度。结果表明，未经培养的纳米TiO₂-酿酒酵母孢子-海藻酸钙微球对苯酚的去除率为68.51%；本实施例的具有光学活性的生物材料对苯酚的去除率可达85.37%。

实施例2：

本发明的一种具有光化学活性的生物材料，以活酿酒酵母菌（S. cerevisiae）为载体，在酿酒酵母负载了纳米TiO₂粒子，海藻酸钙作为固定化介质包裹在酿酒酵母菌表面，将酿酒酵母菌菌体和纳米TiO₂紧密包裹在一起。

实施例2的具有光学活性的生物材料的制备方法，具体包括以下步骤：

（1）在无菌条件下，称取0.15g纳米TiO₂与1mL孢子浓度为2.5×10⁶cfu/mL的酿酒酵母孢子溶液混合均匀，之后加入2mL浓度为6w/v%的海藻酸钠溶液，充分混匀，得到混合溶液，混合溶液的体积为3mL。

（2）在无菌条件下，将步骤（1）中制备得到的混合溶液利用无菌注射器逐滴滴加到15mL浓度为5 w/v %的无菌CaCl₂溶液中，于室温下固化12h，得到平均直径1mm的纳米TiO₂-酿酒酵母孢子-海藻酸钙微球。

将实施例2的培养后具有光学活性的生物材料3g加入到100mL苯酚浓度为200mg/L的废水中，苯酚作为C源，并补充酿酒酵母菌需要的其他营养元素（营养元素为1L含酚废水中加入0.93g NaNO₃、0.07g KH₂PO₄、0.5g KCl、0.5g MgSO₄·7H₂O、0.01g FeSO₄、0.001gVB₁、微量元素10mL。其中微量元素配方为1L水加入：1.5g氨三乙酸、5.0g MnSO₄、0.1gCoCl₂、0.1g ZnSO₄·7H₂O、0.01g CuSO₄·5H₂O、0.01g KAL(SO₄)₂·12H₂O、0.01g Na₂MoO₄·2H₂O、0.01g H₃BO₃），调节废水pH为6.2，在28℃、150rpm及40瓦的日光灯照射下恒温振荡12h。待反应完成后直接过滤，采用4-氨基安替比林分光光度法测定滤液中苯酚浓度。结果表明，本实施例的具有光学活性的生物材料对苯酚的去除率可达91.37%。

实施例1仅为本发明优选的实施例，在本发明中，纳米TiO₂粒子、含活酿酒酵母孢子溶液、海藻酸钠溶液的质量体积比为（0.05g～0.15g）∶（0.5mL～1.5mL）∶2mL，海藻酸钠溶液的浓度为3 w/v %～6 w/v %；步骤（3）的培养温度为28～30℃，转速为120～150rpm均可实施，并达到相同或相似的技术效果。

对比例1：

将1.5ml孢子浓度为2.5×10⁶cfu/mL的活酿酒酵母菌（S. cerevisiae）加入到100mL液体YPD培养基中（YPD培养基成分为1L水中加入10g酵母膏、20g蛋白胨、20g葡萄糖），在28℃、150rpm条件下恒温振荡培养48h，之后在转速3000rpm离心10min，收集微生物，然后将获得的微生物全部加入到100mL苯酚浓度为200mg/L的废水中，进行处理，处理条件与实施例1相同。采用4-氨基安替比林分光光度法测定滤液中苯酚浓度，对比例1的酿酒酵母对苯酚的去除率为61.47%。

对比例2：

在1.5 ml孢子浓度为2.5×10⁶cfu/mL的活酿酒酵母菌（S. cerevisiae）中加入2ml质量浓度为4%的海藻酸钠溶液，配制成混合溶液，将该混合溶液利用无菌注射器逐滴滴加到17.5mL质量浓度为5%的无菌CaCl₂溶液中，于室温下固化4h，得到平均直径1mm的酿酒酵母孢子-海藻酸钙微球。之后将该微球用无菌水洗涤3次，然后转移至100mL液体YPD培养基中（YPD培养基成分为1L水中加入10g酵母膏、20g蛋白胨、20g葡萄糖），在28℃、150rpm条件下恒温振荡培养48h，收集培养后的小球。从培养后的小球中称取3g加入到100mL苯酚浓度为200mg/L的废水中，进行处理，处理条件与实施例1相同。采用4-氨基安替比林分光光度法测定滤液中苯酚浓度，对比例2的酿酒酵母孢子-海藻酸钙微球对苯酚的去除率为75.04%。

对比例3：

（1）在无菌条件下，称取0.2g纳米TiO₂与1mL孢子浓度为2.5×10⁶cfu/mL的酿酒酵母孢子溶液混合均匀，之后加入2mL质量浓度为6%的海藻酸钠溶液，充分混匀，得到混合溶液，混合溶液的体积为3mL。

（2）将该混合溶液利用无菌注射器逐滴滴加到15.0mL质量浓度为5%的无菌CaCl₂溶液中，于室温下固化12h，得到平均直径1mm的纳米TiO₂-酿酒酵母孢子-海藻酸钙微球。

（3）将步骤（2）中制备得到的纳米TiO₂-酿酒酵母孢子-海藻酸钙微球，用无菌水洗涤3次，然后转移至100mL液体YPD培养基中（培养基成分为1L水中加入10g酵母膏、20g蛋白胨、20g葡萄糖），在28℃、150rpm条件下恒温振荡培养48h，收集培养后的小球。

从培养后的小球中称取3g加入到100mL苯酚浓度为200mg/L的废水中，进行处理，处理条件与实施例1相同。对比例3的小球对苯酚的去除率为71.15%。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制。虽然本发明已以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限定本发明。任何熟悉本领域的技术人员，在不脱离本发明的精神实质和技术方案的情况下，都可利用上述揭示的方法和技术内容对本发明技术方案做出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同替换、等效变化及修饰，均仍属于本发明技术方案保护的范围内。

Claims

1.一种具有光化学活性的生物材料，其特征在于，所述具有光化学活性的生物材料是以酿酒酵母菌（S. cerevisiae）为载体，所述酿酒酵母菌的菌体上负载有纳米TiO₂；所述酿酒酵母菌表面包裹有海藻酸钙；

所述具有光化学活性的生物材料的制备方法，包括以下步骤：

（2）将所述混合溶液滴加到无菌CaCl₂溶液中，固化得到纳米TiO₂-酿酒酵母孢子-海藻酸钙微球；

（3）对所述的纳米TiO₂-酿酒酵母孢子-海藻酸钙微球进行培养得到具有光化学活性的生物材料；

所述步骤（1）中所述无菌纳米TiO₂、酿酒酵母孢子液、海藻酸钠溶液的质量体积比为（0.05g～0.15g）∶（0.5mL～1.5mL）∶2mL；

所述酿酒酵母孢子液的孢子浓度为2.5×10⁶ cfu/mL；

所述步骤（1）中所述海藻酸钠溶液的浓度为4 w/v %～6 w/v %；所述步骤（2）中所述无菌CaCl₂溶液的质量浓度为5w/v%；所述步骤（2）中所述混合溶液与所述无菌CaCl₂溶液的体积比为1∶5。

2.一种具有光化学活性的生物材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

所述酿酒酵母孢子液的孢子浓度为2.5×10⁶ cfu/mL；

所述步骤（1）中所述海藻酸钠溶液的浓度为4 w/v %～6 w/v %；所述步骤（2）中所述无菌CaCl₂溶液的质量浓度为5w/v%；

所述步骤（2）中所述混合溶液与所述无菌CaCl₂溶液的体积比为1∶5。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）中培养过程具体为：将所述纳米TiO₂-酿酒酵母孢子-海藻酸钙微球转移至液体YPD培养基中，以120～150rpm转速在28～30℃下恒温振荡培养48h，然后滤出微球，完成培养过程。

4.一种权利要求1所述的具有光化学活性的生物材料处理苯酚废水的应用，其特征在于，所述应用方法为：将具有光化学活性的生物材料加入苯酚废水中，以苯酚作为碳源，并在所述苯酚废水中加入营养元素，进行恒温振荡培养12h以上，完成对苯酚废水的处理。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述苯酚废水的pH为6.2，所述恒温振荡培养的温度为28℃、转速为150rpm，具有光学活性的生物材料的添加量为3g/100mL。

6.根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于，所述营养元素包括占苯酚浓度46.5%的硝酸钠、占苯酚浓度3.36%的磷酸二氢钾、0.5g/L KCl、0.5g/L MgSO₄·7H₂O、0.01g/LFeSO₄、0.001g/L VB₁、微量元素10mL/L；所述微量元素的配方为：1.5g/L氨三乙酸、5.0g/LMnSO₄、0.1g/L CoCl₂、0.1g/L ZnSO₄·7H₂O、0.01g/L CuSO₄·5H₂O、0.01g/L KAl(SO₄)₂·12H₂O、0.01g/L Na₂MoO₄·2H₂O、0.01g/L H₃BO₃。