CN104395318B

CN104395318B - 一类多氧孕甾烷化合物及用途

Info

Publication number: CN104395318B
Application number: CN201380031642.1A
Authority: CN
Inventors: 叶阳; 林革; 姚胜; 杜健华; 马良; 蔡若涓; 唐春萍; 银春; 柯昌强; 王亚周
Original assignee: Shanghai Institute of Materia Medica of CAS; Chinese University of Hong Kong CUHK
Current assignee: Shanghai Institute of Materia Medica of CAS; Chinese University of Hong Kong CUHK
Priority date: 2012-06-14
Filing date: 2013-06-14
Publication date: 2018-04-13
Anticipated expiration: 2033-06-14
Also published as: CN103483413B; CN104395318A; WO2013185635A1; CN103483413A

Abstract

本发明公开了一类多氧孕甾烷化合物及其在制备用于逆转或抑制肿瘤细胞多药耐药性的药物中的用途。

Description

一类多氧孕甾烷化合物及用途

技术领域

本申请涉及药物化学领域，具体地，涉及一类多氧孕甾烷化合物及其医药用途，特别是该类化合物在制备用于逆转或抑制肿瘤细胞多药耐药性的药物中的用途。

背景技术

多药耐药性(Mutidrug Resistance，MDR)是指肿瘤细胞对一种抗肿瘤药物出现耐药的同时，对其他结构不同、作用靶位不同的抗肿瘤药物也产生抗药性的现象。MDR是肿瘤化疗的一个主要的障碍。通常MDR是由肿瘤细胞内ABC转运体的过表达而将抗肿瘤药物逆浓度梯度转移出细胞、导致药物在肿瘤细胞积累的下降而引起。ABC转运体是一组大的膜结合蛋白，它是由两个核苷酸结合结构域和两个跨膜区组成，将药物底物主动转运出细胞是由跨膜区所介导。目前在人类基因组中已鉴定的ABC转运体有48种，基于序列的相似度，它们被分成了7个亚家族(A-G)。与MDR相关的3种主要的ABC转运体，分别是由ABCB1(或MDR-1)基因编码的P-gp，由ABCC1(或MRP1)基因编码的MRP1以及由ABCG2基因编码的BCRP/ABCG2。它们具有广泛的底物特异性，能够转运多种药物，毒物，代谢物和内源性物质。因此，它们的过表达常见于化疗药物筛选的肿瘤细胞系和临床耐药性。

P-gp可以转运包括蒽环类抗生素(anthracyclines)长春胺类(vincas)、紫杉烷类(taxanes)、依托泊苷(etoposide)和米托蒽醌(mitoxantrone)在内的各类化疗药物。P-gp广泛的表达在体内的不同组织，在脑的毛细血管内皮细胞和其它器官包括肠、睾丸和皮肤更有显著地高表达。P-gp表达常见于肾癌、结肠癌、肾上腺癌和畸胎癌。P-gp底物药物能通过一个或者多个结合位点与转运体结合，因此其转运的机理拥有一定的适应性。维拉帕米(Verapamil)是第一个已知的P-gp抑制剂，研究表明它能够通过抑制P-gp所介导的向外转运来增加抗肿瘤药物在多药耐药细胞内的浓度。这一发现使得逆转抗肿瘤药物的耐药性燃起了希望。目前一些在临床上使用的药物，如钙调蛋白阻滞剂、免疫抑制剂环孢菌素A及抗激素类药物三苯氧胺等，均被发现具有较强P-gp的抑制活性，但这些药物因自身具有其它药理活性而均不能作为P-gp抑制剂与抗肿瘤药联用，来增强抗肿瘤药物对MDR肿瘤细胞的敏感性。

因此，迫切希望发明一种有效的MDR抑制剂或逆转剂，能够与抗肿瘤药联用逆转恶性肿瘤的多药耐药性。

发明内容

本发明的目的是提供一种新型MDR抑制剂或逆转剂，能够与抗肿瘤药联用有效逆转恶性肿瘤的多药耐药性。

本发明的第一方面提供了一类结构如下式所示的多氧孕甾烷化合物：

其中，S₂为S₃为

Ra为Rb为

Tig为mBu为Bz为Ac为

本发明的第二方面提供了一种制备如上第一方面所述多氧孕甾烷化合物的方法，该方法包括如下步骤：

1、通光散干燥藤茎粉碎后，在室温条件下，使用95％的工业酒精对通光散的干燥藤茎提取三次，每次三天，将每次的乙醇提取液合并，蒸除溶剂后，得乙醇提取物。该提取物悬浮于蒸馏水，然后相继用乙酸乙酯和正丁醇萃取，蒸去溶剂后，分别得到乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物。

2、将乙酸乙酯提取物进行硅胶柱层析，依次用石油醚∶乙酸乙酯10∶3，2∶1，4∶3，1∶1(分别对应组分A、B、C、D)，乙酸乙酯(对应组分E)，然后乙酸乙酯∶甲醇20∶1，20∶3，20∶1(分别对应组分F、G、H)洗脱，按薄层同一斑点合并，得A-H共8个组分。这8个组分经硅胶柱层析、小孔树脂柱层析、制备型高效液相色谱分离纯化，得到上述化合物。

本发明的第三方面提供了如上第一方面所述多氧孕甾烷化合物在制备用于逆转或抑制肿瘤细胞多药耐药性的药物中的用途，更具体地，所述多氧孕甾烷化合物能够逆转或抑制至少一种ABC转运体所介导的多药耐药性，优选能够逆转或抑制选自P-gp、MRP1和ABCG2中的一种、两种或三种转运体所介导的多药耐药性，更优选能够同时逆转或抑制选自P-gp、MRP1和ABCG2中的两种或三种转运体所介导的多药耐药性。

优选地，所述肿瘤细胞指的是结肠癌细胞、乳腺癌细胞、肝癌细胞、肺癌细胞、胃癌细胞、大肠癌细胞、骨肉瘤细胞、宫颈癌细胞。更优地所述肿瘤细胞指的是结肠癌细胞或乳腺癌细胞，更佳地为人结肠癌耐药亚细胞系SW620/Ad300，人乳腺癌耐药亚细胞系MCF-7/VP和MCF-7/FLV1000。

在如上述第一方面所述的多氧孕甾烷化合物中，作为一种与已知肿瘤细胞多药耐药逆转剂的化学结构不同的肿瘤细胞多药耐药逆转剂，可以与抗肿瘤药物或其他肿瘤细胞多药耐药逆转剂药物共同使用，提高抗肿瘤疗效。优选地化合物POP 52、86、87和88能够逆转选自P-gp、MRP1和ABCG2中一种或多种的ABC转运体所介导的MDR，更优选地，化合物POP86和87能够同时逆转P-gp、MRP1和ABCG2三种ABC转运体所介导的MDR。

所述多氧孕甾烷化合物可以与选自烷化剂类、紫杉烷类、抗生素类、蒽环类、鬼臼毒素类、长春碱类、喜树碱类、替尼类药物中的一种或多种组合使用。更具体地，所述多氧孕甾烷化合物可以与顺铂、多西他赛、阿霉素、米托蒽醌、替尼泊苷、长春新碱、拓扑替康、吉非替尼等联合使用。

在如上述第一方面所述的多氧孕甾烷化合物中，作为一类结构已知的多氧孕甾烷化合物，这类化合物至少能够逆转有一种ABC转运体所介导的MDR，可以与抗肿瘤药物或其他肿瘤细胞多药耐药逆转剂药物共同使用，提高抗肿瘤疗效。优选地POP 53，55，63和65能够同时逆转由两种或多种ABC转运体P-gp和MRP1所介导的MDR，更优地POP 65能够同时逆转由三种转运体P-gp、MRP1和ABCG2所介导的MDR。

本发明的第四方面提供了一种在体外细胞模型上测试多氧孕甾烷化合物逆转肿瘤细胞多药耐药性的方法。优选地肿瘤细胞多药耐药是与选自P-gp、MRP1和ABCG2中的一种或多种转运体相关的。

本发明的第四方面中，提供了一种药物组合物，包含：(1)选自化合物POP52、化合物POP53、化合物POP55、化合物POP56、化合物POP62、化合物POP63、化合物POP65、化合物POP66、化合物POP86、化合物POP87、化合物POP88、化合物POP73、化合物POP74、化合物POP75、化合物POP76、化合物POP77、化合物POP81的一个或多个化合物；以及(2)药学上可接受的盐。

本发明的第五方面中，提供了如本发明第四方面所述的药物组合物的用途，(a)用作用于逆转或抑制肿瘤细胞多药耐药性的药物；和/或(b)用作P-gp和/或MRP1和/或ABCG2的抑制剂。

在本发明的第六方面中，提供了如通式V所示的化合物的用途，所述化合物用于制备：(i)用于逆转或抑制肿瘤细胞多药耐药性的药物组合物；和/或(ii)P-gp抑制剂；

其中，R^a和R^b各自独立地为氢、乙酰基(Ac)、异丙酰基、苯甲酰基(Bz)、2-甲基丁酰基(mBu)或者巴豆酰基(Tig)；n为1～5的整数。

在另一优选例中，n为1～2的整数。

在另一优选例中，所述化合物选自下组：

化合物	Ra	Rb	n
				POP68	mBu	Ac	1
POP69	Bz	Ac	1
				POP70	Tig	Ac	1
POP71	Bz	mBu	1
				POP82	Bz	Ac	2
POP83	Tig	Tig	2
				POP84	mBu	Ac	2
POP85	Tig	Ac	2。

在另一优选例中，所述药物组合物或抑制剂包含选自下组的一个或多个化合物：

在另一优选例中，所述药物组合物或抑制剂包含化合物POP 68、69、70、71、82、83、84和85；且以所述药物组合物的总重量计，所述化合物POP 68、69、70的含量之和不低于50重量％。

在另一优选例中，所述药物组合物或抑制剂包含化合物POP 68、69、70、71、82、83、84和85；且以所述药物的总重量计，所述化合物POP 68、69、70的含量之和不低于85重量％。

在另一优选例中，所述药物组合物或抑制剂包含化合物POP 68、69和70；且以所述药物组合物的总重量计，所述化合物的含量之和为100重量％。

在另一优选例中，所述化合物用于制备用于逆转或抑制肿瘤细胞由P-gp转运体所介导的多药耐药性的药物组合物。

在另一优选例中，所述肿瘤细胞包括：结肠癌细胞、乳腺癌细胞、肝癌细胞、肺癌细胞、胃癌细胞、大肠癌细胞、骨肉瘤细胞或、宫颈癌细胞。

在另一优选例中，所述药物组合物还含有其它的治疗药物，所述的其它的治疗药物为选自烷化剂类、紫杉烷类、抗生素类、蒽环类、喜树碱类、替尼类、鬼臼毒素类和长春碱类药物中的一种或多种。

在另一优选例中，所述的其它的治疗药物为选自顺铂、多西他赛、阿霉素、米托蒽醌、替尼泊苷、长春新碱、拓扑替康、吉非替尼中的一种或多种。

在另一优选例中，所述的药物还包含药学上可接受的载体。

在另一优选例中，所述药物组合物为口服制剂。

在本发明第七方面中，提供了一种药物组合物，包含：

(a)如通式V所示的化合物中的一种或多种化合物：

其中，R^a和R^b各自独立地为氢、乙酰基(Ac)、异丙酰基、苯甲酰基(Bz)、2-甲基丁酰基(mBu)或者巴豆酰基(Tig)；n为1～5的整数；

(b)药学上可接受的载体。

在另一优选例中，所述药物组合物包含化合物POP 68、69、70、71、82、83、84和85；且以所述药物组合物的总重量计，所述化合物POP 68、69、70的含量之和不低于50重量％。

在另一优选例中，所述药物组合物包含化合物POP 68、69、70、71、82、83、84和85；且以所述药物组合物的总重量计，所述化合物POP 68、69、70的含量之和不低于85重量％。

在另一优选例中，所述药物组合物包含化合物POP 68、69和70，且以所述药物组合物的总重量计，所述化合物的含量之和为100重量％。

在本发明第八方面中，提供了一种如本发明第七方面所述的药物组合物的用途，(a)用作用于逆转或抑制肿瘤细胞多药耐药性的药物；和/或(b)用作P-gp抑制剂。

在另一优选例中，所述的药物组合物用作用于逆转或抑制P-gp转运体所介导的多药耐药性的药物。

在另一优选例中，所述肿瘤细胞包括：结肠癌细胞、乳腺癌细胞、肝癌细胞、肺癌细胞、胃癌细胞、大肠癌细胞、骨肉瘤细胞或宫颈癌细胞。

在另一优选例中，所述的药物组合物还含有其它的治疗药物，所述的其它的治疗药物为选自烷化剂类、紫杉烷类、抗生素类、蒽环类、喜树碱类、替尼类、鬼臼毒素类和长春碱类药物中的一种或多种。

在另一优选例中，所述的药物组合物为口服制剂。

在本发明第九方面中，提供了一种试剂盒，其包含：

(1)通式V所示的化合物或第七方面所述的药物组合物；和

(2)肠道菌；

其中，R^a和R^b各自独立地为氢、乙酰基、异丙酰基、苯甲酰基、2-甲基丁酰基或巴豆酰基；n为1～5的整数。

在另一优选例中，所述的肠道菌包括：双歧杆菌(Bifidobacterium)、乳酸菌(Lactobacillus)、多形拟杆菌(Bacteroides thetaiotaomicron)、大肠杆菌(E.coli)、芽孢杆菌(Bacillus)、脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)等。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了两个代表性POP化合物在人结肠肿瘤细胞上逆转阿霉素(doxorubicin)多药耐药性的活性作用。其中，图A显示了活性代谢产物POP 63逆转多药耐药性的活性。如图所示，POP63在敏感母细胞SW620上对阿霉素的细胞毒没有明显影响；而在耐药细胞SW620/Ad300上能通过逆转多药耐药性，从而显著地增强阿霉素的细胞毒作用。图B显示了前药化合物POP85无逆转肿瘤细胞SW620/Ad300多药耐药性的作用。

图2显示了阳性对照物和两个代表POP化合物在人乳腺癌细胞上逆转紫杉醇的多药耐药性的活性作用。其中，图A-C分别显示了阳性对照物PSC833、活性代谢产物POP63和前药化合物POP68的逆转多药耐药性的作用。如图所示，POP63和PSC833都能在耐药细胞LCC6MDR1上通过逆转多药耐药性来显著增强紫杉醇的细胞毒作用，而在敏感母细胞LCC6上则对紫杉醇的细胞毒作用无影响；而结果显示前药化合物POP68在耐药细胞LCC6MDR1上无逆转多药耐药性的作用。

图3显示了前药组合物c的肠道菌群转化，其中，图A显示了前药化合物POP 68-70在肠道菌群处理后的代谢率，图B显示了前药化合物POP 68-70在肠道菌群处理后活性代谢产物POP62、63、66的转化率。

图4为前药组合物c口服给药后血药浓度与时间的关系图，其中，图A为前药组合物c口服给药后前药化合物POP 68-70的血药浓度与时间的关系图，图B为前药组合物c口服给药后活性代谢产物POP 62、63、66的血药浓度与时间的关系图。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，意外地从通光散植物中得到了一系列用于逆转或抑制肿瘤细胞MDR的活性化合物，这些化合物可有效逆转肿瘤细胞肿瘤细胞MDR。发明人还得到了一系列用于逆转或抑制肿瘤细胞MDR的前药化合物，该化合物本身并没有逆转肿瘤细胞MDR的活性，但是它们在体内或在肠道菌群作用下的代谢产物具有逆转或抑制MDR的活性。在此基础上，发明人完成了本发明。

本发明所述的化合物可为“活性化合物”或“前药化合物”。

如本文所用，本发明所述的“活性化合物”是指选自化合物POP52、化合物POP53、化合物POP55、化合物POP56、化合物POP62、化合物POP63、化合物POP65、化合物POP66、化合物POP86、化合物POP87、化合物POP88、化合物POP73、化合物POP74、化合物POP75、化合物POP76、化合物POP77、化合物POP81的一个或多个化合物。

如本文所用，本发明所述的“前药化合物”均指通式V所示的化合物。

如本文所用，本发明所述的“前药组合物”均指包含本发明前药化合物的组合物。

前体药物(prodrug)，也称前药、药物前体、前驱药物等，是指经过生物体内转化后才具有药理作用的化合物。前体药物本身没有生物活性或活性很低，经过体内代谢后变为有活性的物质，这一过程的目的在于增加药物的生物利用度，加强靶向性，降低药物的毒性和副作用。

药物组合物

本发明所述的药物组合物可包含本发明的“活性化合物”和/或“前药化合物”。

由于本发明的前药化合物在体内的代谢产物具有优异的逆转或抑制肿瘤细胞的多药耐药性的活性，因此含有一种或多种的本发明前药化合物的药物组合物(即前药组合物)可用于逆转或者抑制肿瘤细胞多药耐药性，从而提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。其中，所述肿瘤细胞包括人结肠癌细胞、人乳腺癌细胞、人肝癌细胞、人肺癌细胞系、胃癌细胞、大肠癌细胞、骨肉瘤细胞或人宫颈癌细胞等。较佳地为人结肠癌细胞和人乳腺癌细胞，更佳地为人结肠癌耐药亚细胞系SW620/Ad300和人乳腺癌耐药亚细胞系LCC6MDR1。

本发明的药物组合物还可以是包含本发明活性化合物的药物组合物，从而可用于逆转或者抑制肿瘤细胞多药耐药性，其中，所述肿瘤细胞指的是结肠癌细胞、乳腺癌细胞、肝癌细胞、肺癌细胞、胃癌细胞、大肠癌细胞、骨肉瘤细胞、宫颈癌细胞。更优地所述肿瘤细胞指的是结肠癌细胞或乳腺癌细胞，更优选的为人结肠癌耐药亚细胞系SW620/Ad300或人乳腺癌耐药亚细胞系MCF-7/VP和MCF/FLV1000。

本发明的药物组合物包含安全有效量范围内的本发明化合物及药理上可以接受的赋形剂或载体。其中“安全有效量”指的是：化合物的量足以明显改善病情，而不至于产生严重的副作用。通常，药物组合物含有1-2000mg本发明化合物/剂，更佳地，含有10-200mg本发明化合物/剂。较佳地，所述的“一剂”为一个胶囊或药片。

在一优选例中，本发明的前药组合物包含化合物POP 68、69、70、71、82、83、84和85，且以前药组合物的总重量计，上述化合物POP 68、69、70的含量之和不低于50重量％。

在另一优选例中，本发明的前药组合物包含化合物POP 68、69、70、71、82、83、84和85，且以前药组合物的总重量计，上述化合物POP 68、69、70的含量之和不低于85重量％。

在另一优选例中，本发明的前药组合物包含化合物POP 68、69和70，且以前药组合物的总重量计，上述化合物的含量之和为100重量％。

“药学上可以接受的载体”指的是：一种或多种相容性固体或液体填料或凝胶物质，它们适合于人使用，而且必须有足够的纯度和足够低的毒性。“相容性”在此指的是组合物中各组份能和本发明的化合物以及它们之间相互掺和，而不明显降低化合物的药效。药学上可以接受的载体部分例子有纤维素及其衍生物(如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素钠、纤维素乙酸酯等)、明胶、滑石、固体润滑剂(如硬脂酸、硬脂酸镁)、硫酸钙、植物油(如豆油、芝麻油、花生油、橄榄油等)、多元醇(如丙二醇、甘油、甘露醇、山梨醇等)、乳化剂(如吐温)、润湿剂(如十二烷基硫酸钠)、着色剂、调味剂、稳定剂、抗氧化剂、防腐剂、无热原水等。

本发明的化合物或药物组合物代表性施用方式包括口服、注射等等。其中本发明的前药化合物或前药组合物的代表性的施用方式为口服。

用于口服给药的固体剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、散剂和颗粒剂。在这些固体剂型中，本发明化合物与至少一种常规惰性赋形剂(或载体)混合，如柠檬酸钠或磷酸二钙，或与下述成分混合：(a)填料或增容剂，例如，淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸；(b)粘合剂，例如，羟甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶；(c)保湿剂，例如，甘油；(d)崩解剂，例如，琼脂、碳酸钙、马铃薯淀粉或木薯淀粉、藻酸、某些复合硅酸盐、和碳酸钠；(e)缓溶剂，例如石蜡；(f)吸收加速剂，例如，季胺化合物；(g)润湿剂，例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；(h)吸附剂，例如，高岭土；和(i)润滑剂，例如，滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠，或其混合物。胶囊剂、片剂和丸剂中，剂型也可包含缓冲剂。

固体剂型如片剂、糖丸、胶囊剂、丸剂和颗粒剂可采用包衣和壳材制备，如肠衣和其它本领域公知的材料。它们可包含不透明剂，并且，这种组合物中本发明化合物或化合物的释放可以延迟的方式在消化道内的某一部分中释放。可采用的包埋组分的实例是聚合物质和蜡类物质。必要时，活性化合物也可与上述赋形剂中的一种或多种形成微胶囊形式。

用于口服给药的液体剂型包括药学上可接受的乳液、溶液、悬浮液、糖浆或酊剂。除了活性化合物外，液体剂型可包含本领域中常规采用的惰性稀释剂，如水或其它溶剂，增溶剂和乳化剂，例知，乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、丙二醇、1，3-丁二醇、二甲基甲酰胺以及油，特别是棉籽油、花生油、玉米胚油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油或这些物质的混合物等。

除了这些惰性稀释剂外，组合物也可包含助剂，如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、矫味剂和香料。

除了本发明化合物外，悬浮液可包含悬浮剂，例如，乙氧基化异十八烷醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨醇酯、微晶纤维素、甲醇铝和琼脂或这些物质的混合物等。

本发明化合物可以单独给药，或者与其他药学上可接受的化合物联合给药，例如选自烷化剂类、紫杉烷类、抗生素类、蒽环类、喜树碱类、替尼类、鬼臼毒素类和长春碱类药物中的一种或多种，较佳地可以与顺铂、多西他赛、阿霉素、米托蒽醌、替尼泊苷、长春新碱、拓扑替康、吉非替尼等联合使用。

使用药物组合物时，是将安全有效量的本发明化合物适用于需要治疗的哺乳动物(如人)，其中施用时剂量为药学上认为的有效给药剂量，对于60kg体重的人而言，日给药剂量通常为1～2000mg，优选20～500mg。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

前药化合物或前药组合物的制备方法

本发明的前药化合物可通过现有技术中常规方法制备得到。本发明还提供了一种优选的制备方法，包括步骤：

1.粉碎通光散某部位(如藤茎部位)，在一定温度(如室温)下，用提取溶剂(如50％～95％工业乙醇或者甲醇)对其进行提取数次(如1～3次)，浓缩提取液，得到浸膏。

2.将浸膏悬浮于蒸馏水后，用萃取剂(如正丁醇、乙酸乙酯、二氯甲烷、氯仿等)进行萃取数次(如1-3次)，浓缩萃取液，得到提取物。

3.取提取物溶解(如加乙酸乙酯溶解)后与硅胶(如MCI GEL)拌样，经柱层析(如MCI GEL柱)，以洗脱液洗脱(如依次以乙醇-水溶液10％、85％、95％洗脱)，收集和浓缩合适的馏分(如85％的馏分)，得馏分A。

4.取馏分A溶解(如加乙酸乙酯溶解)后与硅胶(如MCI GEL)拌样，经柱层析(如MCIGEL柱)，再次以洗脱液洗脱(如依次用乙醇-水溶液20％、40％、60％、80％、95％洗脱)，经薄层色谱分析合并同一斑点的馏分后，得到多种馏分(分别记为A1、A2、A3、A4、A5等等)。

5.对所得馏分经选自下组的一种或多种方法进行纯化：凝胶柱层析(如sephadexLH-20柱)、硅胶柱层析、制备型高效液相色谱纯化等等，获得本发明的前药化合物。

本发明的前药组合物可通过现有技术中常规方法制备得到，也可以将纯的本发明的化合物根据所需要的重量或体积比例或根据植物中天然存在的比例配比制得本发明的前药组合物。所述的植物为通光散，尤其指通光散藤茎部位。

本发明还优选提供了多种本发明药物组合物的制备方法，例如

方法一，包括步骤：

2.将浸膏悬浮于蒸馏水后，用萃取剂(如正丁醇、乙酸乙酯、二氯甲烷、氯仿等)进行萃取数次(如1-3次)，浓缩萃取液，得到前药组合物a。

方法二，包括步骤：

3.取前药组合物a溶解(如加乙酸乙酯溶解)后与硅胶(如MCI GEL)拌样，经柱层析(如MCI GEL柱)，以洗脱液洗脱(如依次以乙醇-水溶液10％、85％、95％洗脱)，收集和浓缩合适的馏分(如85％的馏分)，得馏分A。

4.取馏分A溶解(如加乙酸乙酯溶解)后与硅胶(如MCI GEL)拌样，经柱层析(如MCIGEL柱)，再次以洗脱液洗脱(如依次用乙醇-水溶液20％、40％、60％、80％、95％洗脱)，经薄层色谱分析合并同一斑点的馏分后，收集富集含有化合物POP 68-70的馏分，得前药组合物b。

方法三、包括步骤：

5.将纯化合物POP 68、69、70按其在植物中存在的天然比例配比，得前药组合物c。

应理解，本发明优选例是从通光散中制备得到本发明的化合物，也可以从任意已知的含有本发明化合物的植物中制得。

用途

本发明提供了一种通过测定待测化合物在体外和/或体内的代谢产物及其活性来判定该化合物是否为前药的方法，所述方法优选包括步骤：

(a)将待测化合物置于含有肠道菌群溶液的培养基(如BHI培养基)中培养(如在在简易厌氧袋中37℃厌氧培养)，在不同时间点取样后终止(如加甲醇)肠道菌群转化，样品经离心后收集上清液进行分析检测(如HPLC-MS)前药化合物的代谢速率以及各自代谢产物的生成速率；和/或

(b)将待测化合物溶解于生理盐水中，以口服和静脉注射的方式给大鼠给药。在不同的时间点抽取大鼠血样，经离心后收集血浆，分析检测(如HPLC-MS)前药化合物的代谢速率以及各自代谢产物的生成速率；以及

(c)将待测化合物以及其各自应对的代谢产物与敏感母细胞和耐药细胞培养于含有阿霉素(Dox或Doxorubicin)的培养液中培养，通过SRB法测定阿霉素的细胞毒性。

(d)若待测化合物无明显增加阿霉素对耐药细胞的细胞毒性；而其代谢产物则显著增加阿霉素对耐药细胞的细胞毒性；从而判定所述待测化合物为前药化合物。

本发明还提供了一种体外细胞模型，用于测试本发明前药化合物逆转或者抑制肿瘤细胞多药耐药性的方法。所述体外细胞模型包括敏感母细胞SW620和耐药亚细胞系SW620/Ad300、敏感母细胞LCC6和耐药亚细胞LCC6MDR1。

本发明还提供了一种疾病治疗方法。所述方法包括步骤：在对需要治疗的对象(如哺乳动物)施用疾病治疗药物之前、同时或之后，施用(如口服)本发明的化合物或药物组合物。

本发明还提供了一种试剂盒，其包含：

(1)本发明所述的前药化合物或本发明所述的前药组合物；和

(2)肠道菌。

优选地，所述试剂盒还包含用药说明书，例如在对需要治疗的对象(如哺乳动物)施用疾病治疗药物之前、同时或之后，先将所述化合物或药物组合物经肠道菌消化，再施用(可以是注射或口服等)该经消化后的化合物或药物组合物。

如本文所用，本发明所述肠道菌包括：双歧杆菌(Bifidobacterium)、乳酸菌(Lactobacillus)、多形拟杆菌(Bacteroides thetaiotaomicron)、大肠杆菌(E.coli)、芽孢杆菌(Bacillus)、脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)等。

本发明的主要优点在于：

1.提供了一类活性化合物及其用于逆转或抑制肿瘤细胞多药耐药性的用途。

2.还提供了一类通式V所示前药化合物的用于逆转或抑制肿瘤细胞多药耐药性的药物的新用途。

3.还提供了一种包含通式I所示前药化合物的一种或多种的前药组合物。

下面结合具体实施，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

活性化合物部分

实施例1 多氧孕甾烷类化合物的提取与分离

通光散干燥藤茎21.0Kg粉碎后，在室温条件下，使用40L 95％的工业酒精对通光散的干燥藤茎提取三次，每次三天，将每次的乙醇提取液合并，蒸除溶剂后，得到3.4kg的深色浸膏。将浸膏用10L的蒸馏水悬浮，然后相继用10L乙酸乙酯和10L正丁醇进行萃取三次，提取液分别合并，蒸去溶剂后，分别得到乙酸乙酯提取物460g，正丁醇提取物500g。将270g乙酸乙酯提取物用硅胶柱层析分离，经石油醚∶乙酸乙酯10∶3，2∶1，4∶3，1∶1(分别对应组分A、B、C、D)，乙酸乙酯(对应组分E)，然后乙酸乙酯∶甲醇20∶1，20∶3，20∶1(分别对应组分F、G、H)得到八个组分A-H。组分C经硅胶柱层析(氯仿∶石油醚10∶1)后所得馏分制备型高效液相色谱纯化(乙腈∶水20％～50％，15毫升/分钟，0-192分钟)得化合物POP 52(11mg)；组分D经过小孔树脂柱层析(甲醇/水60％，70％，85％，100％，然后丙酮)，然后再经过硅胶柱层析(氯仿∶甲醇100∶1)得化合物POP 81(28mg)；组分E先经过小孔树脂柱层析(甲醇：60％，70％，85％，100％，然后丙酮)，然后再经过制备型高效液相色谱纯化(乙腈∶水25％～55％，15毫升/分钟，0-192分钟)得化合物POP 74(25mg)和POP 75(23mg)；馏分F先经过硅胶柱层析(氯仿∶甲醇50∶1)，然后再制备型高效液相色谱纯化(乙腈∶水23％～52％，15毫升/分钟，0-192分钟)得化合物POP 73(56mg)、POP 86(14mg)、POP 87(13mg)和POP 88(34mg)；馏分G经过小孔树脂柱层析(甲醇/水50％～70％)，然后再经过制备型高效液相色谱纯化(乙腈∶水30％～60％，15毫升/分钟，0-192分钟)得化合物POP 76(46mg)和POP 77(14mg)。

实施例2 多氧孕甾烷类化合物的提取与分离

通光散干燥藤茎21.0Kg粉碎后，在室温条件下，使用40L 95％的工业酒精对通光散的干燥藤茎提取三次，每次三天，将每次的乙醇提取液合并，蒸除溶剂后，得到3.4kg的深色浸膏。将浸膏用10L的蒸馏水悬浮，然后相继用10L乙酸乙酯和10L正丁醇进行萃取三次，提取液分别合并，蒸去溶剂后，分别得到乙酸乙酯提取物460g，正丁醇提取物500g。将270g乙酸乙酯提取物用硅胶柱层析分离，经石油醚∶乙酸乙酯10∶3，2∶1，4∶3，1∶1，乙酸乙酯，然后乙酸乙酯∶甲醇20∶1，20∶3，20∶1)梯度洗脱后得到八个组分(A-H)。组分B经过重结晶处理得化合物POP 62(2.5g)。组分C经小孔树脂柱层析(甲醇∶水50％，60％，70％，85％，100％，然后丙酮)，所得70％馏分经过硅胶柱层析(氯仿∶甲醇＝150∶1)后再经过制备型高效液相色谱(乙腈∶水25％～55％，15毫升/分钟，0-192分钟)得化合物POP 56(82mg)；所得85％馏分再经过硅胶柱层析(氯仿∶甲醇＝100∶1)纯化得化合物POP53(203mg)；所得85％馏分经过硅胶柱层析(氯仿∶甲醇＝100∶1)然后再经过制备型高效液相色谱(乙腈∶水35％～55％，15毫升/分钟，0-192分钟)纯化得化合物POP 55(28mg)。组分D经小孔树脂柱层析(甲醇∶水65％，70％，75％，80％，90％，100％，然后丙酮)后所得80％馏分再经过硅胶柱层析(氯仿∶甲醇50∶1)纯化得化合物POP 63(1.2g)。组分经E小孔树脂柱层析(甲醇∶水65％，70％，75％，80％，90％，100％，然后丙酮)后，所得80％馏分经过制备型高效液相色谱(乙腈∶水28％～62％，15毫升/分钟，0-192分钟)纯化得化合物POP 65(16mg)。组分F经过重结晶处理后所得固体经过制备型高效液相色谱(乙腈∶水20％～50％，15毫升/分钟，0-192分钟)纯化得到化合物POP 66(38mg)。

实施例3 新的多氧孕甾烷类化合物及活性化合物的结构鉴定

化合物POP 52，白色无定形粉末，硫酸-香兰素显色剂作用下在TLC板上显示黄色斑点。EI-MS显示分子量为488，根据高分辨EI-MS显示的精确分子量488.2763并结合其¹H-NMR和¹³C-NMR确定其分子式为C₂₈H₄₀O₇。在该化合物的¹H-NMR(见表4)中显示质子信号δ_H2.20(m)，1.42(m)和1.63(m)，0.88(t，J＝7.5)，1.04(d，J＝7.0Hz)及对应的¹³C NMR谱(见表1)中的碳信号δ_C 175.5(s)，41.2(d)，26.1(t)，11.7(q)，15.3(q)信号，提示该化合物含有一个2-甲基丁酰取代基。而δ_H1.97(s)和δ_C170.6(s)，20.8(q)处的信号提示该化合物中含有一个乙酰基取代基。与已知化合物POP 53的¹³C NMR谱数据相比较，发现POP52的信号中少了一个与氧原子连接的次甲基碳，多了一个酮羰基碳，而且除了C-3位附近的碳信号外它们的数据基本一致。因此推断该化合物为C-3位为酮基的通光藤甙元。在其HMBC谱中，观察到H-11{δ_H5.40(t，J＝10.0Hz)}与δ_C 175.5(s)间，H-12{δ_H5.0(d，J＝10.1Hz)}与δ_C170.6(s)间均相关信号，说明取代基2-甲基丁酰连接在C-11位，而取代基乙酰基连接在C-12位。根据现有技术报道[Luo S.Q.，et al.，Assigment of the Proton and Carbon-13 NMR spetra ofC21steroids 12β-O-acetyl tenacigenin A and tenacigenin A by two dimensionalNMR techniques and computer modeling.Magn.Reson.Chem.，1993，31，215.]，当C-17位的乙酰基边链为α构型时，H-17质子被相临的质子裂分后表现为为dd峰，耦合常数约为11.5和7.0Hz；当C-17位的乙酰基边链为β构型时，H-17质子被裂分后表现为一个宽的d峰，耦合常数约为7.0Hz。分析化合物POP 52的H-17{δ_H2.92(d，J＝7.6Hz)}质子的裂分方式和耦合常数，并结合ROESY谱中H-17与Me-18，H-12与Me-21之间的相关关系，推断该化合物的C-17位为H-17β构型。因此新化合物POP 52得以确定并被被命名为：11α-O-2-甲基丁酰基-12β-O-乙酰基-3-酮通光藤甙元B。

其余化合物的结构鉴定都可以通过类似的方法，分析¹H-NMR、¹³C-NMR、EI-MS、HR-EIMS、2D-NMR以及与已知化合物的波谱数据相比较，从而确证其结构。

多氧孕甾烷类化合物的物理和波谱学数据。

POP 52，C₂₈H₄₀O₇，白色无定形粉末，EI-MS：488([M]⁺，10)，386(24)，344(78)，327(16)，283(100)，230(57)，156(46).HR-EIMS：488.2763[M]⁺(C₂₈H₄₀O₇；calc.288.2774).碳谱数据见表1。氢谱数据见表4。

POP 73，C₃₇H₈₅O₁₃；无色，无定形粉末，IR(KBr)：v_max3425，2929，1705，1628，1735，1163，1082cm^-1.HR-ESI-MS：m/z 733.3817[M+Na]⁺(C₃₇H₅₈O₁₃Na；calc.733.3775).碳谱数据见表1和表2。氢谱数据见表3和表5.

POP 74，C₄₀H₆₂O₁₃；无色，无定型粉末，IR(KBr)：v_max3448，2933，1700，1648，1450，1269，1163，1082cm^-1.HR-ESI-MS：m/z 773.4056[M+Na]⁺(C₄₀H₆₂O₁₃Na；calc.773.4088).¹³C-NMR数据见表1和表2.¹H-NMR数据见表3和表5.

POP 75，C₄₂H₆₀O₁₃；无色，无定型粉末，IR(KBr)：v_max3434，2933，1714，1627，1452，1276，1068cm^-1.HR-ESI-MS：m/z 795.3943[M+Na]⁺(C₄₂H₆₀O₁₃Na；calc.795.3932).¹³C-NMR数据见表1和表2.¹H-NMR数据见表3和表5.

POP 76，C₄₁H₆₆O₁₇；无色，无定型粉末，IR(KBr)：v_max3423，2931，1691，1637，1452，1383，1163，1078，617cm^-1.HR-ESI-MS：m/z 853.4233[M+Na]⁺(C₄₁H₆₆O₁₇Na；calc.853.4198).¹³C-NMR数据见表1和表2.¹H-NMR数据见表3和表5.

POP 77，C₄₆H₇₂O₁₈；无色，无定型粉末，UV λ_max(MeOH)(logε)210(4.12)nm.IR(KBr)：v_max3423，2933，1651，1452，1383，1267，1161，1078，989cm^- ¹.HR-ESI-MS：m/z 935.4586[M+Na]⁺(C₄₆H₇₂O₁₈Na；calc.935.4661).¹³C-NMR数据见表1和表2.¹H-NMR数据见表3和表5.

POP 81，C₃₇H₈₈O₁₃；无色，无定型粉末，IR(KBr)：v_max3457，2937，1739，1637，1454，1384，1236，1062cm^-1.HR-ESI-MS：m/z 733.3764[M+H]⁺(C₃₇H₈₈O₁₃Na；calc.733.3775).¹H--NMR和¹³C-NMR数据见表7.

POP 86，C₄₂H₆₄O₁₅；无色，无定型粉末，LC-ESIMS：831.5([M+Na]⁺).¹³C-NMR数据见表1和表2.¹H-NMR数据见表4和表6.

POP 87，C₄₂H₆₆O₁₅；无色，无定型粉末，LC-ESIMS：833.4[M+Na]⁺，809.4[M-H]^-.HR-ESIMS：833.4271[M+Na]⁺(C₄₂H₆₆O₁₅Na，calc.833.4299).¹³C-NMR数据见表1和表2.¹H-NMR数据见表4和表6.

POP 88，C₄₈H₇₄O₂₀；无色，无定型粉末，LC-ESIMS：969.4([M-H]^-)，993.4([M+Na]⁺).IR(KBr)：v_max：3427，2933，1736，1707，1649，1369，1269，1163，1080，1032，922，563cm^-1.UVλ_max(MeOH)(logε)：215(4.25)nm.¹³C-NMR数据见表1和表2.¹H-NMR数据见表4和表6.

POP 53，11α-氧-2-甲基丁酰基-12β-氧-乙酰基通光藤苷元B，白色粉末， LC-ESIMS：490([M]⁺).¹³C-NMR(CDCl₃，100MHz)：37.5(t，C-1)，31.1(t，C-2)，70.4(d，C-3)，38.3(t，C-4)，44.0(d，C-5)，26.6(t，C-6)，31.7(t，C-7)，66.7(s，C-8)，51.0(d，C-9)，38.7(s，C-10)，68.4(d，C-11)，75.0(d，C-12)，45.7(s，C-13)，71.3(s，C-14)，26.5(t，C-15)，24.7(t，C-16)，60.0(d，C-17)，16.7(q，C-18)，12.6(q，C-19)，210.6(s，C-20)，29.6(q，C-21)，175.6(s，C-1′)，41.3(d，C-2′)，26.1(t，C-3′)，11.7(q，C-4′)，15.3(q，C-5′)，170.7(s，C-1″)，20.7(q，C-2″).

POP 55，11α-氧-2-苯甲酰基-12β-氧-乙酰基通光藤苷元B，白色粉末， LC-ESIMS：490([M]⁺).¹³C-NMR(CDCl₃，100MHz)：37.3(t，C-1)，30.3(t，C-2)，69.4(d，C-3)，38.2(t，C-4)，44.0(d，C-5)，26.6(t，C-6)，31.8(t，C-7)，66.9(s，C-8)，51.2(d，C-9)，38.8(s，C-10)，69.6(d，C-11)，75.1(d，C-12)，45.8(s，C-13)，71.4(s，C-14)，26.6(t，C-15)，24.8(t，C-16)，59.8(d，C-17)，16.7(q，C-18)，12.7(q，C-19)，210.8(s，C-20)，30.0(q，C-21)，165.9(s，C-1′)，130.1(s，C-2′)，129.5(d，C-3′)，128.5(d，C-4′)，133.2(d，C-5′)，128.5(d，C-6′)，129.5(d，C-7′)，170.8(s，C-1″)，20.3(q，C-2″).

POP 56，11α-氧-巴豆酰基-12β-氧-乙酰基通光藤苷元B，白色粉末， LC-ESIMS：488.2([M]⁺).¹³C-NMR(CDCl₃，100MHz)：37.0(t，C-1)，29.9(t，C-2)，69.4(d，C-3)，38.1(t，C-4)，43.9(d，C-5)，26.3(t，C-6)，31.6(t，C-7)，66.7(s，C-8)，51.0(d，C-9)，38.6(s，C-10)，68.5(d，C-11)，74.9(d，C-12)，45.5(s，C-13)，71.2(s，C-14)，26.3(t，C-15)，24.8(t，C-16)，59.6(d，C-17)，16.4(q，C-18)，12.5(q，C-19)，210.8(s，C-20)，29.9(q，C-21)，167.1(s，C-1′)，128.4(s，C-2′)，137.9(d，C-3′)，14.3(q，C-4′)，11.8(q，C-5′)，170.6(s，C-1″)，20.3(q，C-2″).

POP 62，通光藤苷H，白色粉末，LC-ESIMS：793([M-H]^-).¹H-NMR(CDCl₃，400MHz)：0.81(3H，t，J＝7.5Hz，H-4′)，0.97(3H，d，J＝5.5Hz，H-5′)，0.98(3H，s，H-19)，1.00(3H，s，H-18)，1.24，1.30(各3H，d，J＝6.0Hz，H-6 of糖结构片段)，1.90(3H，s，H-2″)，2.13(3H，s，H-21)，2.86(1H，br.d，J＝7.4Hz，H-17β)，3.33，3.60(各3H，s OMe-3 of糖结构片段)，3.72(1H，t，J＝3.0Hz，Allo-H-3)，4.52(1H，dd，J＝9.8，1.8Hz，Ole-H-1)，4.72(1H，d，J＝8.3Hz，Allo-H-1)，4.91(1H，d，J＝10.2，H-12α)，5.28(1H，t，J＝10.0Hz，H-11β)，6.68(1H，qq，J＝7.2，1.9Hz，H-3′).

POP 63，通光藤苷I，白色粉末，LC-ESIMS：813([M-H]^-).¹H-NMR(CDCl₃，400MHz)：1.06(3H，s，H-19)，1.09(3H，s，H-18)，1.20，1.27(各3H，d，J＝6.0Hz，H-6 of糖结构片段)，1.54(3H，s，H-2”)，2.15(3H，s，H-21)，2.90(1H，br.d，J＝7.3Hz，H-17β)，3.31，3.60(各3H，sOMe-3 of糖结构片段)，3.73(1H，t，J＝3.0Hz，Allo-H-3)，4.50(1H，dd，J＝9.8，1.8Hz，Ole-H-1)，4.73(1H，d，J＝8.2Hz，Allo-H-1)，5.06(1H，d，J＝10.2，H-12α)，5.54(1H，t，J＝10.2Hz，H-11β)，7.36(2H，d，J＝7.6Hz，H-4’，6′)，7.50(1H，d，J＝7.2Hz，H-5′)，7.90(2H，d，J＝8.0Hz，H-3′，7′).

POP 65，Marsdenoside B，无色粉末，LC-ESIMS：855.4([M+Na]⁺).¹H-NMR(CDCl₃，400MHz)：1.67(6H，s，J＝6.9Hz，Me-5′，Me-5″)，1.06(s，Me-19)，1.11(s，Me-18)，1.25(d，J＝6.0Hz，Allo-Me-6)，1.36(d，J＝5.5Hz，Ole-Me-6)，1.75(s，Me-5″)，1.69(d，J＝7.1Hz，Me-4′)，1.71(d，J＝7.1Hz，Me-4″)，2.03(1H，d，J＝10.1Hz，H-9)，2.20(s，Me-21)，2.92(1H，br.d，J＝7.1Hz，H_β-17)，3.37(s，Ole-OMe)，3.66(s，Allo-OMe)，4.56(dd，J＝9.6，1.6Hz，Ole-H-1)，4.79(1H，d，J＝8.3Hz，Allo-H-1)，5.05(1H，d，J＝10.1Hz，H_α-12)，5.46(1H，d，J＝10.1Hz，H_β-11)，6.66(1H，qq，J＝7.0Hz，H-3″)，6.79(1H，qq，J＝6.0Hz，H-3″).

POP 66，通光藤苷G，白色粉末，LC-ESIMS：791([M-H]^-).¹H-NMR(CDCl₃，400MHz)：0.97(3H，s，H-19)，1.02(3H，s，H-18)，1.17，1.28(个3H，d，J＝6Hz，H-6 of糖结构片段)，1.67(3H，d，J＝6.6Hz，H-4′)，1.68(3H，s，H-5′)，1.77(3H，s，H-2″)，2.10(3H，s，H-21)，2.85(1H，br.d，J＝7.3Hz，H-17β)，3.11(1H，m，H-3α)，3.29，3.60(各3H，s OMe-3 of糖结构片段)，3.70(1H，t，J＝3.0Hz，Allo-H-3)，4.50(1H，dd，J＝8.8，1.6Hz，Ole-H-1)，4.71(1H，d，J＝8.2Hz，Allo-H-1)，4.92(1H，d，J＝10.1，H-12α)，5.32(1H，t，J＝10.2Hz，H-11β)，6.68(1H，qq，J＝7.2，1.9Hz，H-3′).

实施例4 药物活性测试

4.1、化学品和试剂

伐司朴达(Valspodar，PSC833)，烟曲霉毒素C(fumitremorgin C，FTC)和人乳腺癌细胞株MK571购自美国国家癌症研究中心。胎牛血清、PBS、DMEM和RPMI1640购自GibcoInvitrogen(Carlsbad，California，USA)。所有在制备多氧孕甾烷类化合物中使用的溶剂均为分析纯标准，由上海化工厂(上海，中国)提供。阿霉素(Doxorubicin，Dox)、米托蒽醌(Mitoxantrone)、维拉帕米、磺酰罗丹明B(sulforhodamine B，SRB)和其它化学试剂均购自Sigma-Aldrich(St Louis，MO，USA)。

4.2、细胞系与细胞培养

指定的P-gp，MRP1或ABCG2过表达的耐药细胞系被用来测试多氧孕甾烷化合物的逆转多药耐药活性。P-gp过表达的SW620/Ad300，MRP-1过表达的MCF-7/VP和ABCG2过表达的MCF-7/FLV1000均购自美国国家癌症研究所。它们分别是透过其母细胞SW620或MCF-7在逐步增加浓度的选用试剂中产生的耐药亚细胞系，并分别培养于含有300μM阿霉素、10μM依托泊苷和1000nM夫拉平度(flavopiridol)的培养液中。在使用前，耐药细胞将会在无药的介质中培养至少两周。这些耐药的肿瘤细胞通过逐步的药物选择，只有一种ABC转运体是过表达的。而且，通过特定的抑制剂对抗单一的转运体来逆转药物的耐药性显示了仅有一种转运体对肿瘤细胞模型的耐药表现作出了贡献。SW620和SW620/Ad300培养于含10％的胎牛血清的RPMI 1640培养液中。MCF-7，MCF-7/VP和MCF-7/FLV1000培养于含10％胎牛血清的DMEM培养液中。通过分别和药物敏感的母细胞SW620或MCF-7比较耐药的倍数和检验P-gp、MRP1或ABCG2的表达水平，耐药肿瘤细胞SW620/Ad300，MCF-7/VP和MCF-7/FLV1000可以得到验证。所有细胞培养于37度，含5％的CO₂饱和湿度的培养箱中。

4.3、细胞毒试验

在高敏感的MCF-7人乳腺癌细胞系上对新的多氧孕甾烷化合物进行筛选。基于磺酰罗丹明B染色三天的细胞毒测试是采用已知的方法进行[Leslie E.M，et al.Structuralrequirements for functional interaction of glutathione tripeptide analogswith the human multidrug resistance protein 1(MRP1).J.Pharmacol.Exp.Ther.2003，304，643.]。通过Benchmark Plus MicroplateSpectrophotometer(Bio-Rad，Hercules，CA，US)采集信号。IC50是通过比较加药组和空白对照组的平均吸收值而得到的。

结果显示：在0-20μM的浓度范围内，多氧孕甾烷化合物无明显的细胞毒作用。

4.4、统计学分析

所有的实验都至少重复三次。差异的统计学意义由Student’s t检验来评定。显著性差异的设定值为P＜0.05。

4.5、多氧孕甾烷类化合物逆转耐药肿瘤细胞的多药耐药性

人乳腺癌细胞MCF-7是美国国家癌症中心(Bethesda，MD，USA)研究所用于肿瘤药物筛选的三个高度敏感人肿瘤细胞系中的一个。本发明中所涉及的多氧孕甾烷类化合物起初使用MCF-7进行筛选。

在多药耐药性活性测试中，多氧孕甾烷类化合物使得肿瘤细胞对三种转运体(P-gp、MRP1或ABCG2)的药物底物的敏感的活性变化是通过比较它们存在和不存在时抗肿瘤药物的IC₅₀值来评估的，然后以逆转倍数因子和减少百分率来表示。

逆转倍数因子＝IC₅₀(抗肿瘤药没加POP)/IC₅₀(抗肿瘤药联用POP)。

减少百分率＝[1-{IC₅₀(耐药细胞中抗肿瘤药和POP联用)/IC₅₀(耐药细胞中仅用抗肿瘤药)}]x100％。

逆转倍数因子和减少百分率(最大值＝100)越高，使药物敏感的作用越强。PSC833(环孢素衍生物)、MRK571(恩曲他滨)和FTC(fumitremorgin C)，分别是已知的特定的P-gp、MRP1和ABCG2的抑制剂，它们将在逆转多药耐药实验中被用作阳性对照。

在药物增敏研究中，这类化合物测试的最大浓度是10μM，多氧孕甾烷类化合物对敏感和耐药细胞的减少百分率的总结见表9。这类化合物在敏感的母细胞SW620和MCF-7以及P-gp过表达的SW620/Ad300；MRP1过表达的MCF-7/VP和ABCG2过表达的MCF-7/FLV1000上的细胞毒活性是通过SRB试验来得到的(表8A～C)。空白对照和阳性对照(PSC833、MK571、FTC)的活性也列了出来以便比较。

从表8中可以看出，化合物POP 86、POP 87、POP 65能够逆转由三种ABC转运体P-gp、MRP1和ABCG2所介导的肿瘤细胞多药耐药性；化合物POP 53、POP 55和POP 63能够逆转由P-gp和MRP1所介导的肿瘤细胞多药耐药性；化合物POP 52和POP 88以及POP 56、PO P 62和POP 66能够逆转由P-gp所介导的肿瘤细胞多药耐药性。

表1 化合物POP 52、73-77、86-88的¹³C NMR数据(100MHz，CDCl₃)(δin ppm)

Ac：乙酰基；Bz：苯甲酰基；mBu：2-甲基丁酰基；Tig：巴豆酰基。

表2 化合物POP73-77、86-88中糖结构片段的¹³C-NMR数据(100MHz，CDCl₃)(δinppm)

Ole：β-D-夹竹桃吡喃糖；Allo：6-去氧-3-氧-甲基-β-D-阿洛吡喃糖；Glu：β-D-葡萄糖。

表3 化合物POP73-77中糖结构片段¹H-NMR数据(400MHz，CDCl₃)(δin ppm，J inHz)

表4 化合物POP52、86-88中糖结构片段的¹H NMR数据(400MHz，CDCl₃).(δin ppm，Jin Hz)

表5 化合物POP73-77中糖结构片段¹H NMR数据(400MHz，CDCl₃)(δin ppm，J inHz)

表6 化合物POP86-88中糖结构片段的¹H NMR数据(400MHz，CDCl₃)(δin ppm，J inHz)

表7 化合物POP81的¹H NMR(400MHz，CDCl₃)和¹³C NMR(100MHz，CDCl₃)数据in(δinppm，J in Hz)

表9 多氧孕甾烷类化合物对耐药细胞的减少百分率(C＝10μM)

前药化合物部分

试剂或原料

通光散采自云南；除植物提取所用溶剂为工业乙醇外，其他所用的有机溶剂均为分析纯，其中乙醇为药用级(含量为50％～95％)；柱层析填料MCI GEL购自日本三菱化工(CHP20P，75-150μm)，柱层析所用水为纯化水；制备型高效液相色谱所用水为双蒸水。

含量测定方法

前药组合物中POP 68-70的含量测定采用高效液相色谱(HPLC)法。液相条件为：

流动相：乙腈-水：35％～65％

检测器：蒸发光散射检测器(ELSD)

流速：1ml/min

柱色谱：Waters Acquity Column BEH RP-C18，1.7μm，2.1×100mm

柱温：40℃

前药组合物中多氧孕甾烷皂苷POP 68-70的含量测定方法：

供试品溶液的制备：精密称前药组合物20.0mg，甲醇溶解后转移至100ml的容量瓶中并定容至刻度，作为供试溶液；

对照品(或称为标准品)溶液的制备：分别称取多氧孕甾烷皂苷POP 68、69、70各10mg，精密称定，加甲醇制成1ml含200μg的溶液，即得。

分别精密量取20μl对照品和供试品溶液，加入到高效液相色谱仪自动进样器中，测定。

实施例5 前药化合物POP 68-71、82-85的制备

5.1 通光散干燥藤茎21.0Kg粉碎后，在室温条件下，使用40L 95％的工业乙醇对通光散的干燥藤茎提取三次，每次三天，将每次的乙醇提取液合并，蒸除溶剂后，得到3.4kg的深色浸膏。将浸膏用10L的蒸馏水悬浮，然后相继用10L乙酸乙酯进行萃取三次，提取液分别合并，蒸去溶剂后得到乙酸乙酯提取物460g。

5.2 取乙酸乙酯提取物270g加乙酸乙酯溶解后与MCI GEL拌样，经过MCI GEL柱层析(2kg)，分别以乙醇-水溶液10％(体积比)、85％、95％洗脱，每次50L，弃除10％、95％的洗脱馏分，收集85％的洗脱馏分，减压蒸馏后得通光散馏分A 180g。

5.3 取馏分A 100g加乙酸乙酯溶解后MCI GEL拌样，经过MCI GLE柱层析(1kg)，依次用乙醇-水20％、40％、60％、80％、95％洗脱，每次25L，洗脱液经薄层色谱分析，合并同一斑点的馏分，得馏分A1(6g)、A2(12g)、A3(18g)、A4(34g)、A5(25g)。

5.4.1 馏分A1(1g)依次经sephadex LH-20(氯仿-甲醇，1∶1)柱层析、硅胶(200目～300目硅胶50g，二氯甲烷-甲醇10∶1～2∶1)柱层析纯化后，再经过制备型高效液相色谱(CH₃CN-H₂O，25％～55％，192min，15ml/min，210nm)制备，得化合物POP 83(15mg)、POP 85(7mg)；

5.4.2 馏分A2(1g)经过硅胶(200～300目，50g，二氯甲烷-甲醇4∶1)柱层析，再经过sephadex LH-20(氯仿-甲醇，1∶1)纯化，得POP 82(12mg)；

5.4.3 馏分A3(1g)经过制备型高效液相色谱法(CH₃CN-H₂O，25％～55％，192min，15ml/min，210nm)初步分离后，再经过硅胶(200～300目，50g，二氯甲烷-甲醇4∶1～2∶1)柱层析、sephadex LH-20(氯仿-甲醇，1∶1)纯化，得POP 84(9mg)；

5.4.4 馏分A4(1g)经过制备型高效液相色谱(CH₃CN-H₂O，35％～65％，192min，15ml/min，210nm)制备，得POP 68(300mg)、POP 70(240mg)以及POP 69，70的混合物220mg；POP 69，70的混合物100mg经过制备型高效液相色谱(CH₃CN-H₂O，35％～65％，192min，15ml/min，210nm)进一步纯化，得POP 69(45mg)和POP 70(12mg)；

5.4.5 馏分A5取1g，先后经硅胶柱层析(200～300目，60g，二氯甲烷-甲醇：10∶1～3∶1)、sephadex LH-20柱层析(氯仿-甲醇6∶4)后，再经制备型高效液相色谱(CH₃CN-H₂O，32％～63％，192min，15ml/min，210nm)纯化，得化合物POP 71(3mg)。

前药化合物POP 68-71，82-85的波谱数据如下：

POP 68(Marsdenoside H)，无色粉末：LC-ESIMS：955([M-H]^-)。¹H-NMR(CDCl₃，400MHz)：0.89(t，J＝7.3Hz，Me-4′)，1.06(d，J＝6.8Hz，Me-5’)，1.05(s，Me-19)，1.08(s，Me-18)，1.28(d，J＝6.0Hz，Allo-Me-6)，1.36(d，J＝5.4Hz，Ole-Me-6)，1.97(s，Me-2″)，2.01(1H，d，J＝10.1Hz，H-9)，2.20(s，Me-21)，2.92(1H，br.d，J＝7.2Hz，H_β-17)，3.37(s，Ole-OMe)，3.60(s，Allo-OMe)，4.38(1H，d，J＝7.8Hz，Glu-H-1)，4.58(dd，J＝9.5，1.6Hz，Ole-H-1)，4.80(1H，d，J＝8.1Hz，Allo-H-1)，4.99(1H，d，J＝10.1Hz，H_α-12)，5.36(1H，d，J＝10.1Hz，H_β-11)。

POP 69(Marsdenoside K)，白色粉末：LC-ESIMS：975([M-H]^-)。¹H-NMR(CDCl₃，400MHz)：1.12(s，Me-19)，1.14(s，Me-18)，1.60(s，Me-2″)，2.17(s，d，J＝10.3Hz，H-9)，2.20(s，Me-21)，2.94(br.d，J＝7.2Hz，H_β-17)，3.52-3.62(m，H-3)，5.12(d，J＝10.1，H_α-12)，5.60(t，J＝10.1Hz，H_β-11)，7.42(2H，t，J＝7.7Hz，H-4′，H-6′)，7.55(t，J＝7.4Hz，H-5’)，7.95(2H，d，J＝7.2Hz，H-3′，H-7′)，4.53(dd，J＝9.8，1.6Hz，Ole-H-1)，1.31(d，J＝6.0Hz，Ole-Me-6)，3.35(s，Ole-OMe)，4.78(d，J＝6.7Hz，Allo-H-1)，1.26(d，J＝5.8Hz，Allo-Me-6)，3.57(s，Allo-OMe)，4.36(d，J＝6.7Hz，Glu-H-1).¹³C-NMR(CDCl₃，100MHz)：37.4(C-1)，29.1(C-2)，76.5(C-3)，34.8(C-4)，44.0(C-5)，26.8(C-6)，31.8(C-7)，66.9(C-8)，51.3(C-9)，39.1(C-10)，69.7(C-11)，75.2(C-12)，45.9(C-13)，71.2(C-14)，26.6(C-15)，25.0(C-16)，59.9(C-17)，16.6(C-18)，12.7(C-19)，210.8(C-20)，30.1(C-21)，97.1(Ole-C-1)，36.2(Ole-C-2)，79.1(Ole-C-3)，82.5(Ole-C-4)，71.4(Ole-C-5)，18.5(Ole-C-6)，55.9(Ole-OMe)，100.1(Allo-C-1)，70.9(Allo-C-2)，80.4(Allo-C-3)，80.6(Allo-C-4)，69.2(Allo-C-5)，18.0(Allo-C-6)，61.2(Allo-OMe)，104.3(Glu-C-1)，73.8(Glu-C-2)，76.1(Glu-C-3)，70.1(Glu-C-4)，75.5(Glu-C-5)，62.1(Glu-C-6).

POP 70(Tenacissoside A)，白色粉末：LC-ESIMS：953([M-H]^-)。¹H-NMR(C₅D₅N，400MHz)：1.20(3H，s，19-H)，1.23(3H，s，18-H)，1.58，1.60(each 3H，d，J＝6Hz，糖结构片段的Me-6)，1.73(3H，br s，4′-H)，1.76(3H，s，5′-H)，1.90(3H，s，2″-H)，2.25(3H，s，21-H)，2.92(1H，br d，J＝6.2Hz，17β-H)，3.48，3.78(3H，s，糖结构片段的3-OMe)，4.75(1H，dd，J＝9.3，1.8Hz，Ole-H-1)，4.89(1H，d，J＝7.6Hz，Glc-H-1))，5.21(1H，d，J＝7.9Hz，Allo-H-1)，5.38(1H，d，J＝10.2Hz，H-12α)，5.73(1H，t，J＝10.1Hz，H-11β)，6.82(1H，qq，J＝7.1，1.8Hz，3′-H).

POP 71(Tenacissoside E)，白色粉末：MF：C₅₃H₇₈O₁₉.MW：1018[M]⁺.¹H-NMR(C₅D₅N，400MHz)：0.55(t，J＝7.3Hz，Me-4′)，0.85(d，J＝6.8Hz，Me-5′)，1.08(s，Me-19)，1.16(s，Me-18)，1.28，1.37(each 3H，d，J＝6.0Hz，糖结构片段的Me-6)，2.28(s，Me-21)，2.98(d，J＝7.7Hz H-17)，3.38，3.60(each 3H，糖结构片段的3-OMe)，4.39(d，J＝7.7Hz，Glu-H-1)，4.58(d，J＝9.8Hz，Ole-H-1)，4.78(d，J＝7.7Hz，Allo-H-1)，5.24(d，J＝10.3Hz，H-12)，5.33(t，J＝10.3Hz，H-11)，7.42(2H，t，J＝7.7Hz，H-4″and H-6″)，7.55(t，J＝7.3Hz，H-5″)，7.96(2H，d，J＝8.1Hz，H-3″和H-7″).

POP 82(tenacigenoside F)：IR(KBr)3419，2935，1724，1662，1452，1375，1277，1161，1072，1030，991，715cm^-1.LC-ESIMS：1161.6[M+Na]⁺，1137.7[M-H]^-.HR-ESIMS：1161.5045[M+Na]⁺(Cal.1161.5094for C₅₆H₈₂O₂₄Na).¹H NMR和¹³CNMR谱数据见表10-13。

POP 83(tenacigenoside G)：IR(KBr)3421，2933，1709，1651，1452，1381，1277，1161，1076，1030，991，715cm^-1.UV：λ_max(MeOH)(logε)：218(4.18)nm.LC-ESIMS：1179.5[M+Na]⁺，1155.7[M-H]^-.HR-ESIMS：1179.5604[M+Na]⁺(Cal.1179.5563for C₅₇H₈₈O₂₄Na).¹H NMR和¹³C NMR谱数据见表10～13。

POP 84(tenacigenoside K)：IR(KBr)3423，2935，1736，1705，1659，1452，1369，1250，1159，1076，1030，991cm^-1：.LC-ESIMS：1141.5361[M+Na]⁺，1117.8[M-H]^-.HR-ESIMS：1141.5361[M+Na]⁺(Cal.1141.5407for C₅₄H₈₆O₂₄Na).¹H和¹³C NMR谱数据见表10～13。

POP 85(tenacigenoside H)：IR(KBr)3415，2935，1740，1707，1651，1452，1383，1271，1074，1030，733cm^-1.UV：λ_max(MeOH)(logε)：215(3.97)nm.LC-ESIMS：1139.5[M+Na]⁺，1115.7[M-H]^-.HR-ESIMS：1139.5298[M+Na]⁺(Cal.1139.5298for C₅₄H₈₄O₂₄Na).¹H和¹³C NMR谱数据见表10～13。

表10 化合物POP 82，83，84，85甙元的¹H NMR谱(CD₃OD，δppm，J in Hz)

No	82	83	84	85
					1	1.30m	1.31m	1.28m	1.24m
	1.56m	1.57m	1.51m	1.49m
					2	1.31m	1.36m	1.41m	1.37m
	1.57m	1.68m	1.74m	1.68m
					3	3.61m	3.62m	3.63m	3.62m
4	1.26m	1.26m	1.26m	1.24m

	1.72m	1.70m	1.70m	1.70m
					5	1.43m	1.40m	1.40m	1.38m
6	1.44m	1.41m	1.41m	1.41m
						1.55m	1.51m	1.52m	1.52m
7	1.28m	1.26m	1.24m	1.25m
						1.84m	1.90m	1.88m	1.87m
9	2.10d(10.2)	1.98d(10.3)	1.94m	1.96m
					11	5.55t(10.2)	5.41t(10.3)	5.32t(10.2)	5.32t(10.1)
12	5.12d(10.1)	5.05d(10.2)	4.98d(10.2)	5.00d(10.2)
					15	1.60m	1.56m	1.54m	1.34m
	2.00m	1.99m	1.95m	1.56m
					16	1.66m	1.64m	1.65m	1.64m
	2.23m	2.20m	2.21m	2.21m
					17	3.02d(7.3)	3.05d(7.3)	2.98d(7.4)	2.98d(7.3)
18	1.12s	1.09s	1.05s	1.08s
					19	1.06s	1.02s	1.00s	1.01s
21	2.14s	2.15s	2.14s	2.13s
					C-11	Bz	Tig	Bu	Tig
2′			2.22m
					3′	7.92d(7.1)	6.65q(7.2)	1.34m	6.76q(6.9)
4′	7.47d(7.6)	1.66d(7.2)	0.90t(6.5)	1.76d(6.9)
					5′	7.60t(7.4)	1.71s	1.04d(7.0)	1.77s
6′	7.47d(7.6)
					7′	7.92d(7.1)
C-12	Ac	Tig	Ac	Ac
					2″	1.55s		1.94s	1.79s
3″		6.65q(7.2)
					4″		1.66d(7.2)
5″		1.71s

表11 化合物POP 82，83，84，85糖单元的¹H NMR谱(CD₃OD，δppm，J in Hz)

No	82	83	84	85
					Ole
1	4.60d(8.5)	4.62d(9.3)	4.65d(8.8)	4.64d(8.5)
					2	1.32m	1.32m	1.34m	1.33m
	2.19m	2.20m	2.21m	2.22m
					3	3.34m	3.35m	3.36m	3.36m
4	3.12m	3.14m	3.16m	3.15m
					5	3.32m	3.34m	3.37m	3.36m
6	1.28d(5.8)	1.31d(6.0)	1.33d(6.1)	1.32d(6.2)
					7	3.36s	3.38s	3.39s	3.38s
Allo
					1	4.66d(7.8)	4.70d(8.3)	4.70d(8.5)	4.70d(8.0)
2	3.30m	3.29m	3.30m	3.30m
					3	3.90m	3.91m	3.92m	3.91m
4	3.30m	3.30m	3.30m	3.31m
					5	3.82m	3.81m	3.82m	3.82m
6	1.27d(6.0)	1.27d(6.2)	1.28d(6.4)	1.28d(6.5)
					7	3.58s	3.57s	3.59s	3.58s

Glu
					1	4.37d(7.7)	4.37d(7.4)	4.38d(5.9)	4.38d(6.3)
2	3.24m	3.24m	3.24m	3.24m
					3	3.50m	3.50m	3.51m	3.50m
4	3.51m	3.51m	3.52m	3.52m
					5	3.42m	3.41m	3.42m	3.42m
6	3.83m	3.81m	3.80m	3.82m
						3.91m	3.92m	3.92m	3.90m
Glu′
					1	4.38d(7.4)	4.39d(7.7)	4.39d(6.9)	4.39d(6.6)
2	3.21m	3.21m	3.20m	3.22m
					3	3.33m	3.33m	3.34m	3.34m
4	3.32m	3.34m	3.32m	3.30m
					5	3.28m	3.28m	3.26m	3.29m
6	3.64m	3.64m	3.63m	3.63m
						3.84m	3.84m	3.84m	3.85m

表12 化合物POP 82，83，84，85甙元的碳谱(CD₃OD，δppm，J in Hz)。

NO	82	83	84	85
					1	39.3t	39.3t	39.6t	39.2t
2	30.7t	30.8t	30.4t	30.8t
					3	78.4d	78.4d	78.3d	78.6d
4	36.4t	36.4t	36.4t	36.4t
					5	45.6d	45.6d	45.5d	45.6d
6	28.4t	28.4t	28.3t	28.4t
					7	33.4t	33.4t	33.5t	33.4t
8	68.7s	68.7s	68.7s	68.7s
					9	53.3d	53.2d	53.1d	53.2d
10	40.7s	40.6s	40.7s	40.6s
					11	71.3d	70.6d	70.4d	70.6d
12	76.5d	76.3d	76.4d	76.4d
					13	47.6s	47.7s	47.5s	47.5s
14	73.6s	73.6s	73.4s	73.5s
					15	28.2t	28.3t	28.1t	28.2t
16	26.5t	26.4t	26.3t	26.5t
					17	61.4d	61.5d	61.7d	61.4d
18	17.4q	17.6q	17.5q	17.5q
					19	13.7q	13.7q	13.7q	13.7q
20	213.6s	213.7s	213.4s	213.6s
					21	30.8q	30.9q	30.5q	30.8q
C-11位	Bz	Tig	Bu	Tiq
					1′	167.9s	169.3s	177.7s	169.2s
2′	131.8s	130.3s	43.0d	130.3s
					3′	131.0d	140.1d	27.9t	140.4d
4′	130.3d	12.5q	12.6q	12.6q
					5′	135.1d	15.0q	16.4q	15.0q
6′	130.3d
					7′	131.0d
C-12位	Ac	Tig	Ac	Ac

1″	172.6s	169.2s	172.8s	172.7s
					2″	20.8q	129.7s	21.4q	21.0q
3″		140.0s
					4″		12.4q
5″		14.9q

表13 化合物POP 82，83，84，85糖元的碳谱(CD₃OD，δppm，J in Hz)

实施例6 前药组合物a的制备

通光散干燥藤茎21.0Kg粉碎后，在室温条件下，使用40L 95％的工业乙醇对通光散的干燥藤茎提取三次，每次三天，将每次的乙醇提取液合并，蒸除溶剂后，得到3.4kg的深色浸膏。将浸膏用10L的蒸馏水悬浮，然后相继用10L乙酸乙酯进行萃取三次，提取液分别合并，蒸去溶剂后得到前药组合物a 460g，经高效液相色谱含量测定，按重量百分比计，化合物POP 68、69、70的含量分别为21.2％，15.1％，16.6％，总含量为52.9％。

实施例7 前药组合物b的制备

通光散干燥藤茎21.0Kg粉碎后，在室温条件下，使用40L 95％的工业乙醇对通光散的干燥藤茎提取三次，每次三天，将每次的乙醇提取液合并，蒸除溶剂后，得到3.4kg的深色浸膏。将浸膏用10L的蒸馏水悬浮，然后相继用10L乙酸乙酯进行萃取三次，提取液分别合并，蒸去溶剂后得到前药组合物a 460g。

取270g前药组合物a加乙酸乙酯溶解后MCI GEL拌样，经过MCI GEL柱层析(2kg)，分别以乙醇-水溶液10％、85％、95％洗脱，每次50L，弃除10％、95％乙醇洗脱馏分，收集85％洗脱液馏分，减压蒸馏后所得残留物取100g，继续进行MCI GEL柱层析(500g)，分别以乙醇-水20％、40％、60％、80％、95％洗脱，每次25L，洗脱液按薄层同一斑点合并，富集含有化合物POP 68-70的馏分，得前药组合物b 60g。经高效液相色谱含量测定，按重量百分含量计，化合物POP 68、69、70的含量分别为35.3％，25.1％，27.6％，总含量为88.0％。

实施例8 前药组合物c的制备

取270g前药组合物a加乙酸乙酯溶解后MCI GEL拌样，经过MCI GEL柱层析(2kg)，分别以乙醇-水溶液10％、85％、95％洗脱，每次50L，弃除10％、95％乙醇洗脱馏分，收集85％洗脱液馏分，减压蒸馏后所得残留物取100g，继续进行MCI GEL柱层析(500g)，分别以乙醇-水20％、40％、60％、80％、95％洗脱，每次25L，洗脱液按薄层同一斑点合并，富集含有化合物POP 68-70的馏分，得前药组合物b 60g。

取前药组合物b 2g，经过反复制备型高效液相色谱制备(CH₃CN-H₂O，35％～65％，192min，15ml/min，210nm)，得纯化合物POP 68(780mg)、69(310mg)、70(323mg)。POP68-70按其在植物中存在的天然比例配比，得前药组合物c，经高效液相色谱含量测定，按重量百分含量计，化合物POP 68、69、70的含量分别为40.0％，28.6％，31.4％，总含量为100％。

实施例9 多氧孕甾烷皂苷前药或前药组合物逆转肿瘤多药耐药活性测试

9.1 细胞系与细胞培养

用于测试多氧孕甾烷类化合物POPs的逆转多药耐药活性的P-gp过表达的耐药细胞系包括人结肠肿瘤细胞SW620/Ad300和人乳腺癌肿瘤细胞LCC6MDR1。其中SW620/Ad300细胞系购自美国国家癌症研究所(National Cancer Institute，NCI)，该细胞系是透过其母细胞SW620在通过逐步增加阿霉素的浓度中而产生的耐药亚细胞系，并培养于含有300μM阿霉素(Dox或Doxorubicin)的培养液中。在使用前，耐药细胞将会在无药的介质中培养至少两周。另一种耐药亚细胞系LCC6MDR1是通过使用逆转录病毒载体将带有P-gp表达的DNA转植入母细胞LCC6中而得到。

这两种耐药亚细胞系都只有一种ABC转运体(P-gp)是过表达的。通过特定的抑制剂伐司朴达(Valspodar，PSC833)对抗单一的转运体来逆转药物的耐药性显示了仅有一种转运体对肿瘤细胞模型的耐药表现作出了贡献。

SW620和SW620/Ad300培养于含10％的胎牛血清的RPMI 1640培养液中，而LCC6和LCC6MDR1培养与含10％的胎牛血清的DMEM培养液中。通过与药物敏感的母细胞比较耐药的倍数和检验P-gp的表达水平，可以验证是否得到耐药肿瘤细胞。所有细胞培养于37度，含5％的CO₂饱和湿度的培养箱中。

9.2 动物管理和饲养条件

雄性Sprague-Dawley大鼠由香港中文大学实验动物服务中心提供，体重在200g～230g之间。大鼠在无菌环境中饲养，温度控制在24±2℃，每天12h光照、12h黑暗，实验前大鼠禁食24h。动物管理和所有实验程序由香港中文大学动物伦理委员会批准。

9.3 逆转耐药肿瘤细胞多药耐药活性实验

化合物POPs的逆转多药耐药活性在上述的两种耐药亚细胞系进行测定。

实验采用磺酰罗丹明B染色法(SRB法)来检测抗癌药阿霉素和紫杉醇在单独使用和与不同化合物POPs联合使用的情况下为期三天的细胞毒性。通过Benchmark PlusMicroplate Spectrophotometer(Bio-Rad，Hercules，CA，US)采集信号。IC₅₀是通过比较加药组和空白对照组的平均吸收值而得到的。

化合物使得肿瘤细胞对P-gp的药物底物的敏感的活性变化是通过比较所述的化合物存在和不存在时抗肿瘤药物的IC₅₀值来评估的，然后以逆转倍数因子和减少百分率来表示，计算方法同实施例4。

9.4 肠道菌群转化实验

人的新鲜的粪便样本来自中国4名健康志愿者(两男两女，20-32岁)，四个粪便样本(每个5g)收集在一起与30ml培养基混合后置于培养皿中，培养基由向100ml的脑心浸液肉汤(BHI，0.37mg/ml)培养基中加入0.05mg的维生素K1、0.5mg的牛肉汤和50mg的L-胱氨酸制备得到。

所得粪便悬浮液在转速为200g下离心5分钟，倒出上清液然后在转速为5000g下离心30分钟，所得沉淀物重新悬浮于10ml BHI培养基中，产生的肠道菌群溶液供本实验用。

多氧孕甾烷皂苷POP 68、69、70经人肠道菌群的生物转化实验在含有25μL肠道菌群溶液和2.5μL二甲亚砜原液的BHI培养基孵育系统中进行。人工配比的前药组合物c 50μg/mL在GsaPak TM简易厌氧袋中37℃厌氧培养0h、0.5h、1h、2h、3h、6h和8h。生物转化反应通过添加0.5ml的冰甲醇终止，然后立即在转速为15000g下离心10分钟，收集上清液1ml在HPLC-MS上进行分析。

代谢产物的生成率(％)＝取样点代谢产物的浓度(μM)/母液中前药化合物的初始浓度(μM)×100％前药化合物的代谢率(％)＝(母液中前药化合物的初始浓度(μM)-取样点代谢产物的浓度(μM))/母液中前药化合物的初始浓度×100％

9.5 大鼠口服给药和静脉注射给药

多氧孕甾烷化合物POP 68、69、70按照一定重量比例混合(1.4∶1∶1.1)在含5％吐温-80的生理盐水中，分别以口服或者静脉注射的方式给大鼠给药。

在0-24小时内，于实验设计的不同时间点抽取血样(200μL)。离心收集血浆并储存-20℃待分析。100μM的血浆样品经等分处理后进行HPLC-MS分析。

9.6 HPLC-MS分析

HPLC-MS分析在对称5μm C18色谱柱(4.6x150mm，购自美国安捷伦科技有限公司)和对称5μm C18色谱柱(4.6x150mm，购自美国安捷伦科技有限公司)上进行；流动相由甲醇(A)和2mM醋酸铵(B)组成。

对于化合物POP 68、69、70的分析，流动相为A∶B 70％∶30％，流速0.70mL/min；

对于化合物POP 62、63、66的分析，流动相为A∶B 75％∶25％，流速0.70mL/min。

ESI源在正离子模式下进行，质谱分析条件如下：

电喷雾电压，5500V；气帘气，20psi；雾化气，40psi；辅助气，20psi，离子源温度，400℃；所用气体均为氮气。去簇电压和入口电压分别设置为80V和10V，采用多重反应监测(MRM)进行定量分析。

9.7 统计学分析同实施例4

9.8 实验结果

9.8.1 本发明前药化合物的代谢产物

9.8.1.1 本发明的前药化合物经口服或肠道菌群转化后

本发明的前药化合物或者包含所述前药化合物的药物组合物经口服在肠道内转化或者在体外经肠道菌群转化为各自的代谢产物。前药化合物与代谢产物之间的对应关系见表14。

表14 前药化合物与代谢产物之间的对应关系

其中，各个取代基如下所示：

9.8.1.2 代谢产物的鉴定

前药化合物POP 68-71，82-85所对应的代谢产物化合物POP62、63、65、66的制备方法如实施例2所述。

9.8.2 逆转肿瘤细胞多药耐药活性

9.8.2.1 与阿霉素联合使用

逆转MDR活性最初是在人结肠肿瘤细胞(母细胞SW620和耐药细胞SW620/Ad300)上通过和抗癌药阿霉素的联合使用进行筛选。

测试组：化合物POP 68-71、POP 82-85；

代谢产物组：化合物POP 62、63、65、66；

阳性对照：PSC833；

所有测试的POP化合物在浓度小于20μM的时候均没有影响细胞增殖，因此，在随后的药物增敏研究中，这类化合物测试的最大浓度是10μM。阿霉素对敏感母细胞SW620和P-gp过表达的耐药细胞SW620/Ad300的细胞毒活性由SRB实验测得。

所测试的化合物POPs的逆转多药耐药活性可以通过对阿霉素在耐药细胞的细胞毒作用(IC₅₀值)的变化来体现。检测结果以逆转倍数因子和减少百分率来表示见表15和图1。其中，单独使用阿霉素以及阿霉素与阳性对照(PSC833)联合使用的结果也列了出来以便比较。

表15 对耐药细胞的逆转倍数因子和减少百分率比较(C＝10μM)

-：无显著变化

9.8.2.2 与紫杉醇联合使用

此外代谢产物(POP62，63和66)和前药化合物(POP68，69和70)对紫杉醇的多药耐药性的逆转能力通过在人乳腺癌细胞(敏感母细胞LCC6和耐药细胞LCC6MDR1)上进行检测，实验方法与9.8.2.1类似，以PSC833为阳性对照，一并进行此检测。检测结果以逆转倍数因子和减少百分率的形式表示(见表16和图2)。

表16 对耐药细胞LCC6MDR1的逆转倍数因子和减少百分率比较(C＝10μM)

-：无显著变化

本实施例结果表明：在12个化合物中，只有活性代谢产物(即化合物POP 62、63、65、66)，能够逆转由P-gp所介导的肿瘤细胞多药耐药性；而另外8个前药化合物(即化合物POP 68-71和82-85)不能逆转由P-gp所介导的肿瘤细胞多药耐药性。

9.8.3 肠道菌群转化或体内转化

本实施例以由三个前药化合物前药化合物POP 68、69、70组成的前药组合物c(1.4∶1∶1.1)为例，来考察前药化合物POP 68-71、82-85在肠道菌群作用下以及在体内的代谢情况，以此来阐明POP 68-71、82-85及包含POP 68-71、82-85的药物组合物为前药化合物/组合物。

9.8.3.1 多氧孕甾烷皂苷类化合物肠道菌群转化代谢研究

由三个前药化合物POP 68、69、70组成的前药组合物c(1.4∶1∶1.1)，经与肠道菌.群溶液孵化后，检测到了化合物POP 68、69、70各自的代谢产物化合物POP 62、63、66，如图3所示。

结果表明：化合物POP 68、69、70在人肠道中能够被肠道菌群转化为各自对应的活性代谢产物POP 62、63、66。

9.8.3.2 多氧孕甾烷皂苷类化合物口服给药后的代谢研究

按比例人工重量配比(1.4∶1∶1.1)的药物组合物POP 68、69、70(即前药组合物c)SD大鼠静脉注射或者口服给药，口服给药后检测到化合物POP 62、63、66(如图4所示)，而静脉注射给药后则没有检测到上述三个代谢产物。

结果表明：活性代谢产物化合物POP 62、63、66只能在其前药化合物口服给药的情况下检测(HPLC-MS)到，这提示多氧孕甾烷皂苷类化合物的代谢是在肠道，而非肝脏内进行。

结论：

本发明的化合物自身并不能逆转由P-gp介导的肿瘤细胞多药耐药性，但是在体内它们能够通过肠道菌群转化为各自的活性代谢产物进而发挥抗MDR活性，因此，本发明的化合物为可用于逆转或抑制肿瘤细胞多药耐药性的前药化合物。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种通式V所示的化合物的用途，其特征在于，所述化合物用于制备：

(i)用于逆转或抑制肿瘤细胞多药耐药性的药物组合物；和/或

(ii)P-gp抑制剂；

其中，R^a和R^b各自独立地为氢、乙酰基、异丙酰基、苯甲酰基、2-甲基丁酰基或巴豆酰基；n为2～5的整数。

2.一种通式V所示的化合物的用途，其特征在于，所述化合物用于制备：

(i)用于逆转或抑制肿瘤细胞多药耐药性的药物组合物；和/或

(ii)P-gp抑制剂；

且通式V所示的化合物选自下组：

化合物 R^a R^b n POP68 mBu Ac 1 POP69 Bz Ac 1 POP70 Tig Ac 1 POP71 Bz mBu 1 POP82 Bz Ac 2 POP83 Tig Tig 2 POP84 mBu Ac 2 POP85 Tig Ac 2。

3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述药物组合物或抑制剂包含化合物POP68、69、70、71、82、83、84和85；且以所述药物组合物的总重量计，所述化合物POP 68、69、70的含量之和不低于50重量％。

4.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述药物组合物或抑制剂包含化合物POP68、69、70、71、82、83、84和85；且以所述药物的总重量计，所述化合物POP 68、69、70的含量之和不低于85重量％。

5.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述药物组合物或抑制剂包含化合物POP68、69和70；且以所述药物组合物的总重量计，所述化合物的含量之和为100重量％。

6.如权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述化合物用于制备用于逆转或抑制肿瘤细胞由P-gp转运体所介导的多药耐药性的药物组合物。

7.如权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述肿瘤细胞包括：结肠癌细胞、乳腺癌细胞、肝癌细胞、肺癌细胞、胃癌细胞、大肠癌细胞、骨肉瘤细胞或宫颈癌细胞。

8.如权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述药物组合物还含有其它的治疗药物，所述的其它的治疗药物为选自烷化剂类、紫杉烷类、抗生素类、蒽环类、喜树碱类、替尼类、鬼臼毒素类和长春碱类药物中的一种或多种。

9.如权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述药物组合物为口服制剂。

10.一种药物组合物，其特征在于，包含：

(a)如通式V所示的化合物中的一种或多种化合物：

其中，R^a和R^b各自独立地为氢、乙酰基、异丙酰基、苯甲酰基、2-甲基丁酰基或巴豆酰基；n为2～5的整数；

(b)药学上可接受的载体。

11.如权利要求10所述的药物组合物的用途，其特征在于，

(a)用作用于逆转或抑制肿瘤细胞多药耐药性的药物；和/或

(b)用作P-gp抑制剂。

12.一种试剂盒，其特征在于，包含：

(1)通式V所示的化合物或权利要求10所述的药物组合物；和

(2)肠道菌；

13.一类结构如下式所示的多氧孕甾烷化合物在制备用于逆转或抑制肿瘤细胞多药耐药性的药物中的用途；其中，所述多药耐药性为P-gp转运体所介导的多药耐药性，且所述的抑制浓度为0.4μmol：

其中，Ra为

Tig为Ac为

14.根据权利要求13所述的用途，其特征在于，所述肿瘤细胞指的是结肠癌细胞、乳腺癌细胞、肝癌细胞、肺癌细胞、胃癌细胞、大肠癌细胞、骨肉瘤细胞或、宫颈癌细胞。

15.根据权利要求13所述的用途，其特征在于，所述多氧孕甾烷化合物与选自烷化剂类、紫杉烷类、抗生素类、蒽环类、喜树碱类、替尼类、鬼臼毒素类和长春碱类药物中的一种或多种联合使用。