CN1043657C - 生产水稻杂种植物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种生产稻杂种的方法，该方法包括下列步骤：对在细胞质中含有的第一有用基因的第一稻原生质体进行X射线照射，以选择性地只破坏其核质；用大约10-30mM的碘乙酰胺、大约为0.1～0.5mM若丹明6G或大约为10～30mMiodoacetage处理核质中含第二有用基因的第二稻原生质体以选择性地钝化细胞质；融合经处理的第一和第二原生质体以形成只具有含第一有用基因的核质和只具有含第二有用基因的细胞质的杂种细胞。

Description

生产水稻杂种植物的方法
本发明涉及一种生产水稻杂种细胞和植株的方法，本发明用于育种水稻。
近年来，许多著作报道了一种整个植株由一种靠细胞融合制备的细胞再生。借助这些方法，能够获得远缘关系的植物杂交，这种杂交过去一直是不可能的。另外，通过这些方法，能获得亲本细胞质的结合或交换(杂化)，但迄今这在普通杂交育种技术中是不能进行的。
不象普通的回交育种那样，需要经过一段长的时间周期，该杂化能在短时间周期内进行因此在育种植物的领域中正在对这种杂交技术进行深入的研究。
然而，至今只有在有限数量的植物种例如烟草、胡罗卜和土豆中得到成功的杂种。
水稻是重要的作物，因而需要培育出带有改进特征的稻植物。然而至今，仍然不能获得稻的杂种甚至稻的体细胞杂交。
因此，本发明的目的是提供一种生产水稻杂种细胞和植株的方法。
通常，为了获得杂种，至少应解决三个问题，即应当选择：
1)破坏亲本原生质体的核质的条件，2)用来钝化其它亲本原生质体的细胞质的条件，3)用于融合原生质体的条件。这些条件对每个植物种都是独特的，因此，对于每个植物种需要适当地选择这些条件。
本发明人为了得到这些条件，经过深入研究，发现，通过X射线的照射能破坏水稻原生质体的核质而不损坏原生质体的生命力；通过用特殊试剂处理原生质体能够钝化水稻原生质体的细胞质而不损坏原生质体的生命力；融合这样处理的原生质体以产生杂种水稻细胞，进而完成本发明。
也就是说，本发明提供一种生产水稻杂种细胞的方法，它包括以下步骤：对在细胞质中含有第一有用基因的第一水稻原生质体进行X射线照射，以选择性地只破坏核质；用碘乙酰胺、若丹明6G或iodoacetage处理在核质中含有第二有用基因的第二水稻原生质体，以选择性地钝化细胞质；融合被处理过的第一和第二原生质体以形成杂种细胞，该杂种细胞只具有含有第一有用基因的细胞质和具有含有第二有用基因的核质。
根据本发明，首先提供一种获得水稻杂种细胞的方法。据此，可在短时间周期内培育具有改进特性的水稻植物而不采用需要长时间周期的普通回交育种。
图1示出了对水稻原生质体进行X射线照射的剂量和从照射的原生质体中再生的集群量之间的关系。
图2示出了处理水稻原生质体用的碘乙酰胺的浓度和从照射的原生质体中再生的集群量之间的关系。
图3示出了处理水稻原生质体用的若丹明6G的浓度和从照射的原生质体中再生的集群量之间的关系。
以下为最佳实施例的详细描述。
这里术语“杂种细胞”指一个原生质体(亚原生质体)的一部分和一个亚原生质体或一个全原生质体的融合产物。
如上所述，本发明的方法包括下列步骤：选择性地破坏第一原生质体的核质，选择性地钝化第二原生质体的细胞质和融合这样处理的第一和第二原生质体。现在将分别描述这些步骤。
Ⅰ．核质的描述
在本发明的方法中，通过对稻原生质体进行X射线照射来破坏在细胞质中具有有用基因的第一水稻原生质体的核质。水稻原生质体自身可由普通公知技术的方法来制备(例如Fujlmura等，植物组织培养通讯，2(2):74～75)。在第一原生质体的细胞质中含有的有用基因例如可以是雄性不育性因子。通过这一步骤必须制出亚原生质体，在亚原生质体中，核质被破坏而保留了正常的细胞质，在最佳实施例中，这可通过对稻原生质体悬浮液进行X射线照射来实现，该稻原生质体悬浮液例如置于皮氏培养皿中，并具有不高于108/ml最好是105～4×107/ml的种群密度。以软X射线作为X射线，对原生质体进行照射，剂量以90～250Krad为好，最佳为120～150Krad，例如通过将具有20～200KV的电压和3～20mA的电能施以商用的X射线管来获得这一剂量。通过这一操作，可获得在一定时间周期内保持其生理特性而防止细胞分裂的稻亚原生质体。
Ⅱ细胞质的钝化
在这一步骤中，在核质中含有有用基因的第二稻原生质体用碘乙酰胺，若丹明6G或用iodoacetage来处理，以钝化原生质体的细胞质。在核质中含有的有用基因例如可以是一种给予稻粒香味的基因，一种给予植物抗寒性的基因和一种给予植物高产的基因。这里细胞质的钝化指的是破坏细胞器或钝化细胞质中的细胞器的复制。在最佳实例中，可通过将原生质体悬浮于高渗溶液例如具有碘乙酰胺、若丹明6G或iodoacetage的0.3～0.5M浓度的葡萄糖溶液中来进行该项处理。在该溶液中的碘乙酰胺或iodoacetage的浓度大约为10～30mM，若丹明6G的浓度大约为0.1～0.5mM。在最佳实例中，为了只获得较理想的杂种，用16～30mM，最好用25～30mM碘乙酰胺来处理原生质体。该处理最好在4℃～30℃，10分钟～30分钟内进行。在该悬浮液中的这些原生质体的种群密度最好不高于108/ml，最佳为106～4×107/ml，在这项处理完成后，用相同的溶液但不合有碘乙酰胺，若丹明6G或iodoacetage来冲洗这些原生质体。由于冲洗这些原生质体通常是借助离心力来进行，所以通常将原生质体悬浮于一个离心管中。该冲洗通常需要进行几次例如4次。
通过这种操作，可获得具有正常核质和已钝化的细胞质的原生质体。虽然原生质体的细胞质被钝化了，但是这样处理的原生质体仍然保留了与其他原生质体融合的这种能力。
Ⅲ．细胞融合
在这一步骤中，将按步骤Ⅰ破坏了核质的原生质体和按步骤Ⅱ钝化了细胞质的原生质体融合。根据公知的聚乙二醇法或电融合法(EF)，可获得这种细胞融合。特别在最佳实施例中，细胞融合可由下列方法进行：
1)聚乙二醇法
将按步骤Ⅰ的X射线处理的原生质体和按步骤Ⅱ处理的原生质体混合这要通过混合两者的原生质体悬浮液来实现。在每个悬浮液中，原生质体的种群密度最好为106～2×107/ml。另外，经X射线处理的原生质体与经试剂处理的原生质体数量比率最好为1∶1～5∶1。向这样得到的原生质体混合悬浮液加入聚乙二醇(平均分子重量最好为1500～9000，具有最好为20～50％重量浓度)。聚乙二醇的容量最好可与悬浮液的容量相同。在室温下将这样得到的混合液保留例如5～15分钟。此后，通过离心去除聚乙二醇，并且通过离心用具有例如0.4M波度的葡萄糖溶液冲洗融合的原生质体，例如冲洗三次。
2)电融合法
用与上述的聚乙二醇法相同的方式混合按步骤Ⅰ的X射线处理的原生质体和按步骤Ⅱ处理的原生质体。然后将混合的悬浮液置于细胞融合装置的一对平行电极之间，再通过依次应用所述的下列电激ⅰ)～ⅲ)来电激这些原生质体。
ⅰ)0.75～2.0mHz,120～200V/cm的高频，处理时间3～10秒
ⅱ)0.75～2.0mHz,200～400V/cm的高频，处理时间0.1～0.3秒
ⅲ)2000～3500V/cm的矩形波或衰减波，处理时间10～300微秒1～3次
在应用ⅰ)～ⅲ)的电压之后，在室温下将原生质体悬浮液保留一般是15～20分钟，随后进行冲洗。
通过上述这些步骤，可获得稻杂种细胞。在上述融合操作后通过用两种荧光着色剂，例如荧光素异硫氰酸盐和若丹明异硫氰酸盐对原生质体进行检查，可证实，用聚乙二醇法或EF法，有30％的原生质体形成杂种细胞。
从这样制备的杂种细胞中能再生整个水稻植株。从杂种细胞再生整个植株可以借助与一般原生质体再生整个植株相同的方法进行，从原生质体中再生整个植株的方法已经建立，并在Fujimura等(Supra)中描述过，相应参见美国专利申请第06/865519号(或欧州专利申请第86108889.8号加拿大专利申请第509543号或中国专利申请第86103448号)。在通常的水土适应后，再生的稻植物可以生长在温室中。
现在将通过例子描述本发明，这些例子只以举例为目的而示出，并不应当以任何受限制的方式来理解。实施例1
根据Fujimura等(1985,Supra)描述的方法，原生质体从稻的悬浮培养细胞中分离出来(稻品种：Sasanishiki，以其美味著称)。对原生质体进行各种剂量X射线照射。经照射的原生质体根据Fujimura等(1985,Supra)进行培养。经照射14天之后，检查再生的集群量，结果见图1所示。在图1中，横坐标代表X射线的总剂量，且纵坐标代表经X射线照射后14天内再生的集群量。
如下所述，对原生质体进行X射线照射：将原生质体悬浮于酶液中，以达到2×107/ml的种群密度，以便防止细胞的再生，其中，该酶液按重量计含有4％的纤维素酶onozuka RS(YakultHonshe有限公司)，1％的Macerozyme R-10(Yakult Honshea有限公司)，0.5％硫酸葡萄糖钾(Meito Sangyou有限公司)，0.5％氯化钙冰合物和0.4M甘露糖醇(PH5.5)。将两毫升的悬浮液置于60毫米直径的皮氏培养皿中，并且对该悬浮液进行X射线照射，通过将100KV，4mA的电能应用到X射线管来产生X射线。X射线的剂量通过改变照射的时间来改变。每分钟的剂量为2Krad。
通过这个实验，可证明为了防止稻原质体体的细胞分裂，必须用不低于90Krad，最好不低于120Krad的X射线照射原生质体，这要比烟草(15Krad)或胡罗卜(60Krad)所需要的X射线的剂量大得多。
另一方面，通过用显微镜观察经X射线照射的原生质体，观察活的原生质体流动，直到经不高于250Krad的X射线剂量的照射后一天为止，或直到经不高于150Krad的X射线剂量的照射后5天为止。
从这一观察，可以看到，如果用90～250Krad，最好为120～150Krad剂量的X射线来照射稻原生质体的话，虽然防止了细胞分裂，但原生质体的生理活性在一定的时间周期内保持在相当高的水平。
从这些可证明，如上所述的核质被破坏的亚原生质体适于作亲本来制备稻杂种。实施例2
根据Fujimura等(1985,Supra)所描述的方法，将原生质体从稻悬浮的细胞培养中分离出来(稻品种：Sasanishiki)，将原生质体悬浮于含有不同量的碘乙酰胺的0.4M葡萄糖中以达到2×107/ml的种群密度，在25℃下保持15分钟。在该项处理后，用0.4M葡萄糖液冲洗原生质体4次。
根据Fujimura等(1985,Supra)所描述的方法培养这样处理的原生质体。根据该处理，经14天后检查再生的集群量，结果见图2。图2中，横坐标表示碘乙酰胺的浓度，纵坐标表示再生的集群量。
通过这一实验所示，必须用含有不低于10mM浓度的碘乙酰胺来处理稻原生质体，这比用于烟草或土豆所需的浓度高得多。
另一方面，用显微镜观察处理过的原生质体，通过这一观察表明，当用含有10～30mM浓度的iodoacetage处理原生质体时，可防止细胞分裂而且原生质体保持其正常的细胞结构直到经过处理后至少两天为止，并且通过用荧光素双醋酸盐(FDA)对原生质体进行着色，表明该原生质体也保持了其生理活性。如果用含有不低于35mM浓度的iodoacetage处理原生质体的话，那么在处理中将毁坏原生质体的结构。
根据这些可证明用含有10～30mm最好为16～30mM浓度的碘乙酰胺处理原生质体所获得的亚原生质体(肪止了细胞分裂并且能生存一定的时间周期)适于作亲本以制备稻杂种。实施例3
根据Fujimura等(1985,Supra)所述的方法，从稻的悬浮培养细胞中分离出原生质体(稻品种：Sasanishiki)。将原生质体悬浮于含有不同量的若丹明6G的0.4M葡萄糖中以达到2×107/ml的种群密度，在25℃下保持15分钟。在该项处理后，用0.4M葡萄糖液冲洗原生质体4次。
根据Fujimura等(1985,Supra)所描述的方法，培养这样处理的原生质体。根据该项处理，14天后检查再生集群量。结果见图3。在图3中横坐标表示若丹明6G的浓度，纵坐标表示再生集群量。
通过该项实验表明，必须用不低于0.1mM浓度的若丹明6G来处理稻原生质体。
另一方面，用显微镜观察处理过的原生质体，通过观察表明，当用含有0.1～0.5mM浓度的若丹明6G处理原生质体时，细胞分裂被防止了，而原生质体保留其正常的细胞结构直到经该项处理后至少两天为止，并且通过用荧光素双醋酸盐(FDA)对原生质体进行着色表明，该原生质体也保留了其生理活性。如果用含有不低于1mM浓度的若丹明6G处理原生质体的话，则在处理中将毁坏原生质体的结构。
从这些实验可证明，通过用含有0.1～0.5mM浓度的若丹明6G处理原生质体可获得稻亚原生质体，其细胞分裂被阻止，且能生存一定的时间周期，可适于作亲本用来制备稻杂种。实施例4
根据Fujimura等(1985,Supra)所描述的方法，从稻的悬浮培养细胞中分离出原生质体(稻品种：MT-CMA5)，根据线粒体DNA(K.Kadowaki等，Japan J.Breed,36,333-339,(1986))的电泳图，已经证实，这种所用的悬浮培养细胞具有Chinsura BoroⅡ型的细胞质雄性不育因子，用125Krad剂量的X射线按实例1所述的方式处理这些原生质体来获得其核质被破坏的亚原生质体。
另一方面，根据Fujimura等(1985,Supra)描述的方法，从稻的悬浮培养细胞(稻品种：Sasanishiki)中分离出原生质体，用30mM的碘乙酰胺处理原生质体，在25℃下保持15分钟，以获得不再具有分裂能力的亚原生质体。
这样获得的MT-CMA5亚原生质体和Sasanishiki亚原生质体分别悬浮于0.4M葡萄糖中，以达到2×107/ml的种群密度，将该悬浮液用1∶1的比率混合，把混合的悬浮液置于细胞融合装置的一对平行电极之间，且按下列顺序对电极施以电能：
1)1MHz的高频，150V/cm，处理时间5秒；
2)1MHz的高频，250V/cm，处理时间0.1秒；
3)2500V/cm的矩形波，处理时间50微秒。
在进行这项电处理之后，将悬浮液在4℃下保留15分钟，然后用0.4M葡萄糖液立即冲洗细胞，这样得到的原生质体在一个培养基中培养，该培养基成份为R2酸盐(Ohira,K,K,Ojima,A.Fujiwura,1973，植物细胞生理(Plant CellPhysiol),14:1113-1121),B5维生素(Gamborg,OIL.,R.A.Miller,K.Ojima,1968,Expt,Cell Res.,50:151-158),0.4M的蔗糖和1ppm的2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)(PH4.5)，温度为27℃，如Fujimura等(1985,Supra)所述。
开始培养两周以后，形成细胞群。该细胞群转移到生长培养基中，该培养基成份为R2酸盐，B5维生素，0.2M葡萄糖，1ppm的2,4-D和0.25ppm的BA(6-苄(基)腺嘌呤)(PH5.0)，并且在27℃下，在该培养基中培养两周。然后细胞群转移到不同的培养基中，该培养基成份为Nb 6酸盐(Chu,C-C,1978，关于植物组织培养的专题论丛(Proceeding ofSymposium on Plant Tissue Culture),P.43～50，科学出版社，北京)，B5维生素，3％的重量的蔗糖，1ppm的NAA(萘乙酸)，2ppm的BA和1％的琼脂(PH5.5)，并且在27℃下培养两周，以再生整个植株。然后使植株适应水土，并在温室中生长以成熟。在开花的时候，进行自花粉和异花传粉和异花授粉以形成稻粒。
通过检查这样再生的稻植物，在用原始的“Sasanishiki”进行授粉之后，根据植株的外观和稻粒的质量，这些稻植物显然是Sasanishiki。然而失去了花粉的生育力。通过线粒体DNA的电泳图检查雄性不育的类型，结果证明，显然线粒体来源于“MT-CMA5”。这些结果清楚地表明，再生稻植株具有“Sasanishiki”的核质，同时又有“MT-GMA5”细胞质的杂种稻植物。实施例5
根据Fujimura等(1985,Supra)所描述的方法，原生质体从稻(品种：MT-CMA5)的悬浮培养细胞中分离出来，已经证实，根据线粒体DNA(K.Mignouna等，Theor Appl.Genet.,74:666-669(1987))的电泳图，该悬浮培养细胞具有WA型细胞雄性不育因子。这些原生质体用150Krad剂量的X射线按实施例1中所述的方式进行处理，以获得其核质被破坏的亚原生质体。
另一方面，根据Fujimura等(1985,Supra)所述的方法，原生质体从稻(品种：Nihonbare)的悬浮培养细胞中分离出来。用25mM的聚乙酰胺处理原生质体，在25℃下保持15分钟，以获得不再有分裂能力的亚原生质体。
这样获得的MT-CMA9亚原生质体和Sasanishiki亚原生质体分别悬浮于0.4M葡萄糖中以达到2×107/ml的种群密度。这样获得的悬浮液按1∶1的比率进行混合。向混合的悬浮液加入等容量的重量百分比为40％的聚乙二醇溶液(平均分子重量为7800～9000)，这样得到的混合物被保留15分钟，然后用0.4M葡萄糖溶液冲洗细胞3次。
按实施例4的方法从这样获得的融合细胞中再生整个稻植株。然后使该植株适应水土，并在温室中生长以成熟。在开花的时候，进行自花传粉和异花授粉以形成稻粒。
通过检查这样再生的稻植物，在用原始的Nihonbare授粉之后，根据植株外观和稻粒的质量来看，这些植物显然是“Nihonbare”，然而失去了花粉的生育力。由线粒体DNA的电泳图检查雄性不育性的类型，结果表明，线粒体显然来源于“MT-CMA9”，这些结果清楚地表明，再生稻植物是具有“Nihonbare的核质，同时又具有“MT-CMA9”细胞质的杂种稻植物。

Claims (9)

1．一种生产稻杂种植物的方法，包括由包括下列步骤的方法获得的杂交稻细胞再生整个植株：
用90～250Krad剂量的X射线对在细胞质中含有第一有用基因的1×106～4×107细胞/毫升第一稻原生质体进行照射，以只破坏原生质体的核质；
用在0.3～0.5M葡萄糖溶液中的10～30mM的碘乙酰胺或0.1～0.5mM的若丹明6G处理在核质中含有第二有用基因的第二稻原生质体以钝化细胞质；
融合处理过的第一和第二原生质体以形成只具有含第二有用基因的核质和只具有含有第一有用基因的细胞质的杂种细胞。
2．根据权利要求1的方法，其特征为X射线为软X射线。
3．根据权利要求1的方法，其特征为X射线的剂量为100～150Krad。
4．根据权利要求1的方法，其特征为用16～30mM浓度的碘乙酰胺处理第二原生质体。
5．根据权利要求4的方法，其特征为周25～30mM浓度的碘乙酰胺处理第二原生质体。
6．根据权利要求1的方法，其特征为用聚乙二醇法融合经处理的第一和第二原生质体。
7．根据权利要求1的方法，其特征为用电融合法融合经处理的第一和第二原生质体。
8．根据权利要求1的方法，其特征为当进行融合处理时，经处理的第二原生质体与经处理的第一原生质体的数量比例为1∶1～1∶5。
9．根据权利要求1的方法，其特征为在细胞质中的第二有用基因为雄性不育基因。
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