CN104365598A - 咖啡酸及其烷基酯在青枯病防治中的应用 - Google Patents
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Abstract
咖啡酸及其烷基酯在青枯病防治中的应用，所述咖啡酸及其烷基酯结构如式(I)所示：
Description
技术领域
本发明属于微生物防控领域，尤其涉及的咖啡酸烷基酯(烷基碳原子数目为1～10)在防治青枯病中的应用，可以作为一种生物抑菌剂进行使用。
背景技术
青枯病(Bacterial Wilt)素有植物“癌症”之称，由青枯劳尔氏菌(Ralstonia solanacearum)引起，是世界上分布最广、危害最严重且最难防治的重大细菌性病害之一。目前，青枯病根据寄主范围可分为1号小种，2号小种，3号小种，4号小种和5号小种。青枯病病原细菌寄主广泛，为害44个科，300余种植物，如茄科、豆科和葫芦科等多种作物，已成为制约相关产业可持续发展的重要因素。
青枯病的发病是由于其病原在植物维管束中繁殖，导致导管阻塞，植物水分运输受阻，从而使植物表现萎蔫症状。青枯病主要症状是植株迅速萎蔫、枯死，茎叶仍保持绿色。病茎的褐变部位用手挤压，有乳白色菌液排出。在高温高湿情况下，该病容易发生，且青枯病发病快、重，防治困难，引起了人们的广泛关注。因此，对青枯病进行有效的防治是十分必要的。
目前，针对青枯病的防治主要有物理防治，化学防治和生物防治三种方法。
已有报道的物理防治青枯病的方法有：2013年，丁伟等在专利CN 103190222A中通过土壤改良、平衡土壤养分，烟苗处理系统和在烟草种植地中加入改良剂控制烟草青枯病。物理防治效果一般，而且治标不治本，需结合其他防治方法作为辅助防治。
已有报道的化学防治青枯病的方法有：2004年，孔凡玉等在《中国烟草科技》中提出20％青枯灵可湿性粉剂对防治烟草青枯病药效达62.1％-81.5％。化学防治效果良好，但对环境容易造成污染。
目前，生物防治青枯病采用的方法有：2014年，Lichun Li等发现黄皮新肉桂酰胺对烟草青枯菌的盆栽防治效果达95.84％。2013年，Leonard Muriithi Kiirika等通过壳聚糖和硅的单一和综合应用来防治西红柿青枯病。2012年，山田隆在专利CN 103547669A中以型线状噬菌体和/或型线状噬菌体感染的青枯病菌作为青枯病预防剂，接种于植物预防青枯病。2009年，张汉千等在《烟草科技》中提出大蒜粗提物对烟草青枯病菌的室内抑制达75.93％。2008年，姜宁等在《植物保护》中提出紫油厚朴皮提取物对马铃薯青枯病菌的最小抑菌浓度为0.1g/L。可见青枯病的生物防治是将来该病综合防控和绿色防控中重要防治方法之一。
综合防控(IPM)是一种农业病虫控制的生态方法，其主要理念是我们努力预防、观测、必要时才用无毒性药剂来干预。最近党和政府在大力推动“公共植保”和“绿色防控”理念。绿色防控要求设置害虫害虫行为阈值，定期监察，采取措施，来解决病虫害问题，在化学防治措施中，提倡使用有机(来源于植物)物质或者天然来源的材料。
绿色防控是IPM的延伸，除了控制方法外，其它各方面都很类似。虽然病虫害综合防治管理和绿色害虫管理选择风险最小的病虫害控制材料，但绿色害虫管理在病虫害控制材料上要求更高，要求使用有机材料(植物)或天然来源的材料。
咖啡酸，又名3,4-二羟基肉桂酸，是一种常见酚酸，咖啡酸广泛分布于天然植物，属于使用来源于植物或者直接来源于自然的有机材料的绿色防控。咖啡酸烷基酯是指含有咖啡酸基本结构单元的一大酯类化合物，具有较广泛的生物活性，如抗癌，抗炎和抗病毒等，且对环境无污染，但在生物防控中未见报道。咖啡酸及咖啡酸烷基酯(烷基碳原子数目为1～10)首次应用于青枯病的防治。
发明内容
技术问题：本发明针对上述问题，本发明提供一种咖啡酸及其烷基酯在青枯病防治中的应用，利用咖啡酸烷基酯(烷基碳原子数目为1～10)抑制桑青枯菌的半致死浓度，这种方法在低浓度咖啡酸烷基酯可以有效的抑制青枯菌，是一种防治青枯病的有效方法。
技术方案：咖啡酸及其烷基酯在青枯病防治中的应用，所述咖啡酸及其烷基酯结构如式(I)所示：
其中，R为H或C1～C10烷基。
所述对防治青枯病有效的式(I)化合物浓度为0.01g/L-12g/L。
式(I)化合物溶于助溶剂，助溶剂包括有机溶剂和表面活性剂，所述有机溶剂为丙酮或二甲基亚砜，添加浓度为5％～50％(v/v)；所述表面活性剂为triton x-100或吐温，添加浓度为5％～50％(v/v)。
防治时，以0.01g/L-12g/L的式(I)化合物进行喷洒，每日使用次数为1～5次。
式(I)结构的咖啡酸及其烷基酯在制备青枯病防治药物中的应用。
一种青枯病防治药物，有效成分为式(I)结构的咖啡酸及其烷基酯。
所述有效成分为式(I)结构的咖啡酸及其烷基酯中的至少一种。
所述青枯病病原菌包括青枯病病原菌Race1(Ralstonia solanacearum Race1)，青枯病病原菌Race2(Ralstonia solanacearum Race2)，青枯病病原菌Race3(Ralstonia solanacearumRace3)，青枯病病原菌Race4(Ralstonia solanacearum Race4)和青枯病病原菌Race5(Ralstoniasolanacearum Race5)。
青枯病病原菌包括青枯菌1号小种(青枯病病原菌Race1)，即马铃薯青枯菌GIM1.74，购自广东省微生物菌种保藏中心(GIMCC)；2号小种(青枯病病原菌Race2)，即木麻黄青枯菌GIM1.76，购自广东省微生物菌种保藏中心(GIMCC)；3号小种(青枯病病原菌Race3)，即番茄青枯菌GIM1000，购自美国模式培养物收藏中心(ATCC)；4号小种(青枯病病原菌Race4)，即生姜青枯菌GIM1.71，购自广东省微生物菌种保藏中心(GIMCC)；5号小种(青枯病病原菌Race5)，即桑青枯菌RS-5，由南京农业大学植物保护学院提供。
咖啡酸烷基酯溶液的制备方法，包括以下步骤：
称量少许咖啡酸烷基酯，分别溶于的助溶剂中，配制成母液，其用量、浓度可以根据需要进行调整。
咖啡酸烷基酯的抑菌效果测定，包括以下方法：
(1)平板对峙法：采用琼脂打孔法初步检测不同咖啡酸烷基酯对青枯菌是否有抑制作用；
(2)分光光度法：采用酶标仪测定加入不同咖啡酸烷基酯的菌液吸光度，准确测定不同咖啡酸烷基酯对青枯菌的抑制率及半抑制浓度。
其中，空白对照为只加培养基的试管的吸光度，OD阴性空白对照为培养基加菌液和不同浓度triton x-100的试管的吸光度，OD咖啡酸烷基酯为培养基加菌液和不同浓度咖啡酸烷基酯的试管的吸光度。
有益效果：利用SPSS软件的Probit过程进行概率单位分析，计算咖啡酸烷基酯对青枯菌的半抑制浓度，确定对青枯病防控效果。本发明提供了利用咖啡酸烷基酯(烷基碳原子数目为1～10)抑制桑青枯菌的半抑制浓度，这种方法显示，在低浓度咖啡酸烷基酯能有效地抑制青枯菌。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明叙述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
本实施例采用平板对峙法检测对桑青枯菌的抑制作用的咖啡酸烷基酯。
青枯菌5号小种，即桑青枯菌RS-5在LB液体培养基(蛋白胨10g；酵母粉10g；氯化钠5g；蒸馏水1000mL；pH(6.97-7.10)150r/min、30℃条件下振荡培养过夜，得到菌悬液。
将咖啡酸，咖啡酸甲酯，咖啡酸乙酯，咖啡酸丙酯，咖啡酸异丙酯，咖啡酸丁酯，咖啡酸戊酯，咖啡酸异戊酯，咖啡酸己酯，咖啡酸庚酯，咖啡酸辛酯，咖啡酸壬酯，咖啡酸癸酯和咖啡酸苯乙酯溶于助溶剂中，配制制成1g/L的溶液，用0.22μm的微孔滤膜进行过滤除菌处理。
平板对峙法：配制LB固体培养基(蛋白胨10g；酵母粉5g；氯化钠10g；琼脂17g；蒸馏水1000mL；pH 6.97-7.10)，将稀释10倍后的菌悬液用平板涂布法均匀涂布于平板上，用打孔器打3个孔，每个孔里放70μL咖啡酸烷基酯，用助溶剂做空白对照。
将平板至于30℃的培养箱培养过夜，观察是否有抑菌圈的形成，如有抑菌圈，表明有抑制作用；反之，则无抑制效果。
结果显示，咖啡酸，咖啡酸甲酯，咖啡酸乙酯，咖啡酸丙酯、咖啡酸异丙酯和咖啡酸苯乙酯对青枯菌5号小种，即桑青枯菌RS-5抑制圈为0.1～0.5cm，说明对桑青枯病有抑制作用。
实施例2
本实施例采用平板对峙法检测对桑青枯菌的抑制作用最优的咖啡酸烷基酯。
青枯菌5号小种，即桑青枯菌RS-5在LB液体培养基150r/min、30℃条件下振荡培养过夜，得到菌悬液。
将咖啡酸，咖啡酸甲酯，咖啡酸乙酯，咖啡酸丙酯，咖啡酸异丙酯，咖啡酸丁酯，咖啡酸戊酯，咖啡酸异戊酯，咖啡酸己酯，咖啡酸庚酯，咖啡酸辛酯，咖啡酸壬酯，咖啡酸癸酯和咖啡酸苯乙酯溶于助溶剂中，配制成1g/L的溶液，用0.22μm的微孔滤膜进行过滤除菌处理。
平板对峙法：配制LB固体培养基，将稀释10倍后的菌悬液用平板涂布法均匀涂布于平板上，用打孔器打3个孔，每个孔里放70μL咖啡酸烷基酯，用助溶剂做空白对照。
将平板至于30℃的培养箱培养过夜，观察是否有抑菌圈的形成，如有抑菌圈，表明有抑制作用；反之，则无抑制效果。
结果显示，咖啡酸丁酯，咖啡酸戊酯，咖啡酸异戊酯，咖啡酸己酯，咖啡酸庚酯，咖啡酸辛酯，咖啡酸壬酯和咖啡酸癸酯对青枯菌5号小种，即桑青枯菌RS-5抑制圈为0.5～1cm，说明对桑青枯病的抑制作用较好。
实施例3
本实施例采用分光光度法检测最低浓度范围的咖啡酸烷基酯对青枯菌的抑制作用，具体方法如下：
青枯菌5号小种，即桑青枯菌RS-5在LB液体培养基150r/min、30℃条件下振荡培养过夜，得到菌悬液。
将咖啡酸烷基酯溶于助溶剂中，配制成60g/L的溶液，用0.22μm的微孔滤膜进行过滤除菌处理。
配制LB液体培养基，每个试管内放2mL液体培养基，将咖啡酸烷基酯用0.22μm的微孔滤膜进行过滤除菌处理，设置不同浓度的咖啡酸烷基酯。
每个试管进行接种，每个菌株每种咖啡酸烷基酯分别做3个重复。
将接种完毕的培养基置于30℃条件下振荡培养24h。
将试管中的菌悬液注入96孔板，加样100μL，采用酶标仪在600nm下读数。
结果显示，咖啡酸烷基酯对青枯菌5号小种，即桑青枯菌RS-5的抑制作用最低浓度范围是0.01g/L～0.05g/L，抑制率为28.245％～36.312％。
实施例4
本实施例采用分光光度法检测最高浓度范围的咖啡酸烷基酯对青枯菌的抑制作用，具体方法如实施例3：
青枯菌5号小种，即桑青枯菌RS-5在LB液体培养基150r/min、30℃条件下振荡培养过夜，得到菌悬液。
将咖啡酸烷基酯溶于助溶剂中，配制成60g/L的溶液，用0.22μm的微孔滤膜进行过滤除菌处理。
配制LB液体培养基，每个试管内放2mL液体培养基，将咖啡酸烷基酯用0.22μm的微孔滤膜进行过滤除菌处理，设置不同浓度的咖啡酸烷基酯。
每个试管进行接种，每个菌株每种咖啡酸烷基酯分别做3个重复。
将接种完毕的培养基置于30℃条件下振荡培养24h。
将试管中的菌悬液注入96孔板，加样100μL，采用酶标仪在600nm下读数。
结果显示，咖啡酸烷基酯对青枯菌5号小种，即桑青枯菌RS-5的抑制作用最高浓度范围10g/L～12g/L，抑制率为54.674％～59.615％。
实施例5
本实施例采用分光光度法检测最优浓度范围的咖啡酸烷基酯对青枯菌的抑制作用，计算咖啡酸烷基酯对青枯菌的半抑制浓度，具体方法如实施例3：
青枯菌5号小种，即桑青枯菌RS-5在LB液体培养基150r/min、30℃条件下振荡培养过夜，得到菌悬液。
将咖啡酸烷基酯溶于助溶剂中，配制成60g/L的溶液，用0.22μm的微孔滤膜进行过滤除菌处理。
配制LB液体培养基，每个试管内放2mL液体培养基，将咖啡酸烷基酯用0.22μm的微孔滤膜进行过滤除菌处理，设置不同浓度的咖啡酸烷基酯。
每个试管进行接种，每个菌株每种咖啡酸烷基酯分别做3个重复。
将接种完毕的培养基置于30℃条件下振荡培养24h。
将试管中的菌悬液注入96孔板，加样100μL，采用酶标仪在600nm下读数。
结果显示，咖啡酸烷基酯对青枯菌5号小种，即桑青枯菌RS-5的抑制作用最优浓度范围5g/L～7g/L，抑制率为71.082％～85.460％，半抑制浓度范围为0.002g/L～7.519g/L。
实施例6
本实施例说明咖啡酸烷基酯对不同青枯病病原菌的抑制效果。
将青枯菌病原菌的1～5号小种，分别为青枯菌1号小种，即马铃薯青枯菌GIM1.74；2号小种，即木麻黄青枯菌GIM1.76；3号小种，即番茄青枯菌GIM1000；4号小种，即生姜青枯菌GIM1.71；5号小种，即桑青枯菌RS-5，在LB液体培养基中150r/min、30℃条件下振荡培养过夜，得到菌悬液。
将咖啡酸烷基酯用0.22μm的微孔滤膜进行过滤除菌处理，设置不同浓度的咖啡酸烷基酯。
将稀释10倍后的菌悬液用平板涂布法均匀涂布于平板上，用打孔器打3个孔，每个孔里放70μL咖啡酸烷基酯，用助溶剂做空白对照。
将平板至于30℃的培养箱培养过夜，观察是否有抑菌圈的形成，如有抑菌圈，表明有抑制作用；反之，则无抑制效果。
结果显示，不同的咖啡酸烷基酯对青枯菌的1～5号小种均产生抑菌圈，抑菌圈大小在0.2cm～0.9cm，说明咖啡酸烷基酯对1～5号小种均有较好的抑制作用。
实施例7
本实施例说明咖啡酸烷基酯在桑树上进行抑菌试验。
将青枯菌5号小种，即桑青枯菌RS-5在LB液体培养基中150r/min、30℃条件下振荡培养过夜，得到菌悬液。将桑青枯病病原菌的菌悬液每天接种于桑苗，使桑苗发病。
将15％～25％有效浓度的不同咖啡酸烷基酯每天用喷雾喷洒致病的桑苗2次。观察咖啡酸烷基酯是否对致病的桑苗有效果。
结果显示，经过0.01g/L-12g/L的有效浓度的不同的咖啡酸烷基酯均对致病桑苗每天用喷雾喷洒1～5次后，致病桑苗病情减轻，说明咖啡酸烷基酯对致病桑苗的发病有抑制效果。
Claims (8)
1.咖啡酸及其烷基酯在青枯病防治中的应用，所述咖啡酸及其烷基酯结构如式(I)所示：
其中，R为H或C1～C10烷基。
2.根据权利要求1所述咖啡酸及其烷基酯在青枯病防治中的应用，其特征在于所述对防治青枯病有效的式(I)化合物浓度为0.01g/L-12g/L。
3.根据权利要求1所述咖啡酸及其烷基酯在青枯病防治中的应用，其特征在于式(I)化合物溶于助溶剂，助溶剂包括有机溶剂和表面活性剂，所述有机溶剂为丙酮或二甲基亚砜，添加浓度为5％～50％(v/v)；所述表面活性剂为triton x-100或吐温，添加浓度为5％～50％(v/v)。
4.根据权利要求1所述咖啡酸及其烷基酯在青枯病防治中的应用，其特征在于以0.01g/L-12g/L的式(I)化合物进行喷洒，每日使用次数为1～5次。
5.权利要求1所述式(I)结构的咖啡酸及其烷基酯在制备青枯病防治药物中的应用。
6.一种青枯病防治药物，其特征在于有效成分为式(I)结构的咖啡酸及其烷基酯。
7.根据权利要求6所述青枯病防治药物，其特征在于所述有效成分为式(I)结构的咖啡酸及其烷基酯中的至少一种。
8.根据权利要求6所述青枯病防治药物，其特征在于所述青枯病病原菌包括青枯病病原菌Racel(Ralstonia solanacearum Racel)，青枯病病原菌Race2(Ralstonia solanacearum Race2)，青枯病病原菌Race3(Ralstonia solanacearum Race3)，青枯病病原菌Race4(Ralstoniasolanacearum Race4)和青枯病病原菌Race5(Ralstonia solanacearum Race5)。
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