CN104342436A - 混合的多核苷酸及其形成方法 - Google Patents

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Abstract

包括第一双链(ds)部分、包括至少一个单链(ss)部分的第二部分以及第三ds部分的混合多核苷酸。所述第二部分与第一ds部分以及第三ds部分连接，以提供经修饰的多核苷酸。

Description

混合的多核苷酸及其形成方法
发明背景
技术领域
本发明涉及多核苷酸构型，更特别地涉及具有混合单链和双链区段用于可靠电传感和光学传感的多核苷酸构型。
相关领域描述
精确且廉价的核酸(例如，DNA和RNA)传感对理解许多科学和生物医学应用是重要的。固态生物传感技术，如人工纳米孔和通道已经整合到射流技术中用于多核苷酸分子的传感。近期，纳米流体设备中的隧道识别已经显示为用于下一代低成本且超速DNA测序的曙光技术。
尽管使用不同的设备配置，这些固态传感技术依赖于超级受限的纳流体室(通道或孔)，其具有低至不足10 nm的临界尺寸以实现必需的线性化和由此导致的单链多核苷酸的连续碱基读数。由于其小的相关长度(persistence length)(3-5 nm)，单链多核苷酸分子非常灵活地在纳米通道或纳米孔外面卷成多种构型，并且它们经历非常高的熵能垒(打开卷曲需要的能量)来易位。这一般导致降低的易位率、不想要的多核苷酸跳动-和-后退而非易位、具有折叠构型的易位以及纳米通道或纳米孔的长时间闭合。
发明概述
混合的多核苷酸包括第一双链(ds)部分、包括至少一个单链(ss)部分的第二部分和第三ds部分。所述第二部分与所述第一ds部分以及所述第三ds部分连接，以提供经修饰的多核苷酸。
用于形成多核苷酸的方法，其包括在多个双链(ds)多核苷酸区段和一个或多个单链(ss)多核苷酸区段的至少一个末端形成黏性末端，和连接多个ds多核苷酸区段之间的一个或多个ss多核苷酸区段的黏性末端，以提供混合的ds-ss多核苷酸。
用于形成多核苷酸的方法，其包括确定双链(ds)多核苷酸区段上的多个识别位点，和在多个识别位点上切割ds多核苷酸区段，以在ds多核苷酸区段之间形成至少一个单链(ss)多核苷酸区段，从而提供混合的ds-ss多核苷酸。
在以下详细描述的示例性实施方案中，这些及其他特征和优点将变得显而易见，需结合附图来阅读所述实施方案。
附图简述
本公开将参考下图提供以下描述的优选实施方案的详细信息，其中：
图1A显示了根据一个示例性实施方案的伸展的单链多核苷酸；
图1B显示了根据一个示例性实施方案的卷曲的单链多核苷酸；
图1C显示了根据一个示例性实施方案的的双链多核苷酸区段；
图2A显示了根据一个示例性实施方案的混合双链和单链多核苷酸；
图2B显示了根据一个示例性实施方案的混合多核苷酸，其具有双链末端且其中具有多个双链和单链多核苷酸区段；
图3A显示了根据一个示例性实施方案通过连接形成混合的多核苷酸；
图3B显示了根据一个示例性实施方案通过切割形成混合的多核苷酸；
图3C显示了根据一个示例性实施方案通过随机测序形成混合的多核苷酸；
图4A显示了根据一个示例性实施方案的具有5-50 nm范围内固定直径D的体积中的单链多核苷酸；
图4B显示了根据一个示例性实施方案的具有5-50 nm范围内固定直径D的体积(volume)中的混合多核苷酸；
图5A显示了根据一个示例性实施方案的具有不同限制区域(50 nm>D1>D2>5 nm)的体积中的单链多核苷酸；
图5B显示了根据一个示例性实施方案的图5A的单链多核苷酸的静电能和吉布斯自由能的图；
图5C显示了根据一个示例性实施方案的具有不同限制区域(50 nm>D1>D2>5 nm)的体积中的双链多核苷酸；
图5D显示了根据一个示例性实施方案的图5C的混合多核苷酸的静电能和吉布斯自由能的图；
图6显示了根据一个示例性实施方案的混合核苷酸的电检测；
图7A显示了根据一个示例性实施方案的具有捕获电极的体积中的单链多核苷酸链；
图7B显示了根据一个示例性实施方案的由静电力推动的体积中的混合多核苷酸链；
图8A显示了根据一个示例性实施方案的用荧光染料标记的混合多核苷酸；
图8B显示了根据一个示例性实施方案的用两种不同荧光染料标记的混合多核苷酸，所述荧光染料通过结合单链和双链区段显示不同的颜色；和
图9显示了根据一个示例性实施方案的方框/流程图，其显示用于形成混合单链和双链多核苷酸的系统/方法。
优选实施方案的详述
根据本发明原理，提供了多核苷酸构型和形成方法。提供了多核苷酸链，其具有用于多功能传感的混合的单链和双链区段。多核苷酸链具有单链区段和双链区段，所述单链区段用于单核苷酸电子读取，所述双链区段用于改善的运动控制、增强的电子读取率以及加强的荧光成像质量。还提供了使用纳流体设备进行的电和光学测定方法，以用于检测此类多核苷酸分子。
图中的流程图和方框图阐明了根据本发明多个实施方案的系统、方法和计算机程序产物的结构、功能性和可能的执行操作。在这一点上，流程图或方框图中的每一方框可以代表包含用于执行具体逻辑功能的一个或多个可执行指令的模块、区段或代码部分。还应指出，在一些备选执行中，方框中指出的功能可能不以图中指出的顺序发生。例如，连续显示的两个方框实际上可能基本上同时执行，或者根据所涉及的功能性，方框有时候可能以相反的顺序执行。还应指出，方框图和/或流程图图解中的每一个方框以及方框图和/或流程图图解中的方框组合可以由基于特定目的且实行特定的功能或行为的硬件系统执行，或者由特定目的的硬件与计算机指令的组合执行。
还应理解，当提及元件如层、区域或基质在另一元件“上面”或“之上”时，其可以直接位于其他元件上面或也可以存在居间元件。相反，当提及元件“直接在另一元件上面”或“直接位于其上”时，不存在任何居间元件。还应理解，当提及元件与另一元件“连接”或“偶联”时，其可以与其他元件直接连接或偶联或可以存在居间元件。相反，当提及元件与另一元件“直接连接”或“直接偶联”时，不存在任何居间元件。
说明书中对本发明原理的“一个实施方案”或“实施方案”以及其其他变型的参考指的是，与实施方案结合描述的特定特征、结构、特性等包括在本发明原理的至少一个实施方案中。因此，说明书中多个地方出现的短语“在一个实施方案中”或“在实施方案中”以及任何其他变型不必指完全相同的实施方案。
应该理解，任何以下“/”、“和/或”以及“至少一个”的使用，例如在“A/B”、“A和/或B”以及“A和B中的至少一个”的情况下旨在包括仅第一个列出的选项(A)的选择，或仅第二个列出的选项(B)的选择，或两个选项(A和B)的选择。又例如，在“A、B和/或C”和“A、B和C中的至少一个”的情况下，该短语旨在包括仅第一个列出的选项(A)的选择，或仅第二个列出的选项(B)的选择，或仅第三个列出的选项(C)的选择，或仅第一个和第二个列出的选项(A和B)的选择，或仅第一个和第三个列出的选项(A和C)的选择，或仅第二个和第三个列出的选项(B和C)的选择，或全部三个选项(A、B和C)的选择。如本领域和相关领域的技术人员显而易见的，可以扩展所列出的许多项目。
现在提及其中数字代表相同或相似元件的图并且开始提及图1A和1B，根据一个示例性实施方案示例性描述单链(ss)多核苷酸链。ss多核苷酸链可以包括例如DNA链或RNA链。ss多核苷酸链102处于线性拉伸状态，外形长度为L0和N0个碱基对。一般而言，ss多核苷酸链不呈现线性状态，而是卷曲构型的松散状态，如ss多核苷酸链104。这是因为ss多核苷酸具有例如约2-5nm的相关长度并且其可以在超窄的纳米通道或纳米孔中延伸几纳米，所述相关长度极其难以装配。ss多核苷酸链104具有长度L0’，所述长度取决于几何限制。
纳米通道和纳米孔指其深度和宽度正好在纳米尺度(例如，从几纳米至100nm)内的一维体积，而其长度可以长得多(例如，几十纳米至几十微米)。特别地，纳米通道指顶端封闭的平面上的经纳米限制的体积，而纳米孔指通过膜垂直钻入的纳米大小的孔。
现在提到图1C，根据一个实施方案示例性描述了双链(ds)多核苷酸链。ds多核苷酸链可以包括例如，DNA链或DNA-RNA互补链。ds多核苷酸链可以包括区段，如分别具有外形长度L1和L2的区段106和108。与ss多核苷酸链相反，延伸ds多核苷酸链较不严格。这是因为其相关长度长得多，大约是例如50 nm或150个碱基对(bp)。这表示较不严格的装配技术可以用于产生通道或纳米孔，以完全延伸ds多核苷酸链，只要所述多核苷酸链的尺寸小于约例如50nm。
现在提到图2A，根据一个实施方案示例性描述了杂合多核苷酸链200。杂合多核苷酸链200包括混合的ds和ss区段。在一个实施方案中，ds-ss杂合多核苷酸链200在链的末端包括ds区段202、204，在中间包括ss区段206。ss区段206可以包括待检测的碱基，并且ds区段202、204为更好地控制多核苷酸运动提供必要的刚性。
为了使ds区段202、204的柔性最小化，可以分别控制区段L1和L2的长度小于、接近或稍大于Kuhn长度(相关长度的两倍)，或约例如100nm。ds区段202、204相应的碱基对数目N1和N2因此分别为大约300。在该长度范围内，ds区段202、204行为适当地像刚性杆并且不卷曲。优选地，L1和L2比Kuhn长度小，以使ds区段202、204总是线性的并且具有用于易位的非常小的能垒。
现在提到图2B，根据一个示例性实施方案显示了杂合多核苷酸链250。杂合多核苷酸链250可以在链250的中间包括多个ss区段和/或多个ds区段。这允许连续读取较长的多核苷酸链。
可以使用多种生物化学方法设计ds-ss杂合多核苷酸链。现在提到图3A，根据一个示例性实施方案通过连接形成ds-ss杂合多核苷酸链。可以在第一个末端上用黏性末端308并在第二个末端上用非磷酸化平末端修饰ds区段302、304。可以在两个末端上用黏性末端308修饰ss区段306。ds区段302、304和ss区段306可以连接形成杂合多核苷酸链。优选地，黏性末端308各自具有不同的碱基：腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、鸟嘌呤(G)和胞嘧啶(C)。
现在提到图3B，根据一个示例性实施方案通过切割形成ds-ss杂合多核苷酸链。ds核苷酸链310包括识别位点312。识别位点312可以由酶314，如，例如切口核酸内切酶切割，以从ds多核苷酸链形成ss区段。
现在提到图3C，根据一个示例性实施方案使用改良的Roche 454方法通过随机测序形成ds-ss杂合多核苷酸链。在构型316中，具有磷酸化末端的ds多核苷酸区段318可以连接到ds衔接头320、322上。衔接头320、322由于在衔接头322上存在生物素标记而不同。衔接头320、322可以具有相同的或不同的核苷酸序列。在构型324中，连接后，在每一个衔接头的连接处存在切口。切口处充满聚合酶(例如，DNA聚合酶)的链置换活性。这形成了具有ds区段320、322和衔接头322上结合生物素的ds多核苷酸区段318。例如，其中ds多核苷酸区段318是DNA时，构型可以是衔接头320-DNA-衔接头322-生物素。也可以使用其他构型，例如衔接头320-DNA-衔接头320或生物素-衔接头322-DNA-衔接头322-生物素。在构型326中，ds多核苷酸区段318通过衔接头322上标记的生物素结合例如链霉抗生物素珠，而未结合的片段被洗掉。然后将固定的片段变性以将ds部分分裂成ss。两条结合的链通过生物素化的衔接头322保持固定，同时仅ss片段被洗掉，以用于随后的测序步骤中。在构型328中，可以加入衔接头320、322的互补链330、332，以从基因组随机多核苷酸形成ds-ss混合的多核苷酸链。
在另一实施方案中，构型328中的ds区段不是通过加入互补衔接头链形成，而是通过衔接头自身(例如通过退火)的杂交自我形成互补衔接头而形成。
在另一实施方案中，构型326中结合链霉抗生物素连接的珠的生物素化单链区段在变性后也与珠一起被收集。然后加入互补衔接头链，以在珠上形成双链衔接头，最后通过切割链霉抗生物素结合的生物素收集双链单链混合的DNA片段。
形成ds-ss杂合多核苷酸的其他方法也可以用于本发明原理的上下文中。例如，在一个实施方案中，可以修饰ds-ss杂合多核苷酸链以结合到黏性末端并连接到另一ss多核苷酸链、ds多核苷酸链，或ds-ss杂合多核苷酸链上。在另一实施方案中，可以通过酶多次切割ds-ss多核苷酸链来形成多个ss区段。
已经发现在受限的体积中ss多核苷酸链与ds-ss杂合多核苷酸链表现非常不同。所述体积可以包括例如，纳流体设备，如纳米通道或纳米孔。可以使用例如绝缘或半导体材料，如二氧化硅(SiO2)、氮化硅(Si3N4)、氧化铝(Al2O3)、二氧化钛(TiO2)、硅(Si)、有机聚合物等，或其组合装配纳米通道或纳米孔。
现在提到图4A，根据一个示例性实施方案示例性描述了体积中的ss多核苷酸。将ss多核苷酸链402限定在具有直径D的体积404中。其中例如5 nm<D<50 nm或D>50 nm时，ss多核苷酸链402随机卷曲，且链末端的位置不受任何控制。ss区段可以通过使用例如氢键、疏水力等结合其不同的区段而形成二级结构。所述结合进一步使ss多核苷酸链402的结构复杂化。
现在提到图4B，示例性描述了体积中的ds-ss杂合多核苷酸。将ds-ss杂合多核苷酸限定在具有直径D的体积458中。其中D小于约例如50nm时，不论外形长度L1和L2多长，ds区段452、454完全延伸。在该限定的体积458内，静电推斥和已占体积效应驱动两个ds区段452、454基本上朝着多核苷酸链的方向彼此远离。ds区段452、454与ss区段456没有强的相互作用，因此不会引起任何更复杂的二级结构。
其中D大于约例如50nm，但不是大得很多(例如，100-200 nm)并且L1和L2均小于约例如100nm时，ds区段452、454仍然完全延伸。在该降低限制的体积458内，静电推斥和已占体积效应较不强，但是足以保持ds区段452、454彼此远离。
其中D大于约例如50nm，但不是大得很多(例如，100-200 nm)并且L1和L2远远大于100nm(例如大约500-1000 nm)时，ds区段452、454将卷曲。此长度的ds区段452、454导致更强的静电推斥并可能保持ds区段452、454彼此远离。
其中当D远远大于约例如50nm时，如果L1和L2小于100nm，那么ds区段452、454可能延伸，或者如果L1和L2大于约例如100nm，那么ds区段452、454可能卷曲。由于存在最小限制，多核苷酸链很可能卷曲。
现在提到图5A，根据一个实施方案示例性描述了具有不同限制区域的体积中的ss多核苷酸链。当从受限制较少的空间进入受限制较多的空间，如在纳米通道中时，ss多核苷酸链与ds-ss杂合多核苷酸链的表现非常不同。将ss多核苷酸链502限制在体积504中。体积504具有直径为D1的受限制较少的区域506和直径为D2的受限制较多的或较窄的区域508，其中D1>D2。受限制较少的区域506可以包括例如微图案较宽通道(micro-patterned wider channel)或无图案本体溶液区域(non-patternedbulk solution region)，而受限制较多的区域508可以包括例如纳米通道或纳米孔。
在一个实施方案中，其中D2小于约例如5nm时，ss多核苷酸链502可能以伸展状态进入较窄的区域508。ss多核苷酸链502也有可能卡在过渡区的界面上并不进入。
在另一实施方案中，其中D2远远大于约例如5nm时，期望ss多核苷酸链502以小速率易位。这是因为ss核苷酸链502经历大的熵障以进入。该熵障使得ss多核苷酸链502很可能进入窄区域508，并且仍然卷曲。这可以极大地增加ss多核苷酸链502和体积504侧壁的摩擦力，其可能导致ss多核苷酸链502卡在窄区域508中。这还将引起多个碱基在折叠链上不想要的读取，并且所述读取可以从链的任何地方开始，而不是从头部或尾部开始。小的相关长度使得ss多核苷酸链502在较窄的区域508中容易变形。
提到图5B，图508显示了ss多核苷酸链的静电能(U)和吉布斯自由能(G＝U-ST)，其中T代表绝对温标，例如开氏中的热力学温度，并且S代表ss多核苷酸链沿通道的熵。在图中，标明了qV，其中q是电荷，V是电压。同样，显示了ΔST，其代表熵障。
回到图5A，在另一实施方案中，其中D2小于约例如5nm时，ss多核苷酸链502可以以伸展状态进入较窄的区域508。同时，熵障甚至更高，因此易位速率甚至更低。ss多核苷酸链502卡在过渡区的界面上并不进入也是可能的，这是因为其卷曲状态(因此具有较大的表面积)可能与较窄的区域508的表面更强烈地相互作用并阻碍进入。
现在提到图5C，根据一个实施方案示例性描述了具有不同限制区域的体积中的ds-ss杂合多核苷酸链。ds-ss多核苷酸链552显示于体积560中，其具有直径为D1的受限制较少的区域562和直径为D2的受限制较多或较窄的区域564。当D2小于约例如50nm时，期望ds-ss多核苷酸链552伸展。因为ds区段554、556是刚性的，所以它们经历非常小的熵障，因此较容易地进入。这允许更多的可控进入方向控制。
提到图5D，图566显示了ds-ss多核苷酸链的静电能和吉布斯自由能。熵障(ΔST)显示小。
回到图5C，在另一实施方案中，D2可以从约例如50 nm逐渐变得小于约例如5nm，并且优选例如3-4nm。因而，ds多核苷酸头部区段554首先进入较窄的区域564中，并牵动ss区段558进入。随着ss区段558进入最窄的区域，它们被迫线性化并连续通过。这基本上允许ss多核苷酸区段558的可控连续读取。
较窄区域564的侧壁可以涂布化学物质，例如自我装配的单层。可以设计所述涂布的化学物质，以与ss区段558的摩擦降低易位速度的方式与ss碱基相互作用。这种额外的摩擦力还可以伸展ss区段558，只要ds区段头部554保持向前牵拉链。
现在提到图6，根据一个示例性实施方案电检测ds-ss杂合多核苷酸链。可以使用例如一对导线电极(traverse electrode)612检测ds-ss杂合多核苷酸链602。优选在受限制较多的区域，如纳米通道或纳米孔中检测ds-ss杂合多核苷酸链602。导线电极612优选包括金属，如金(Au)、钯(Pd)、银(Ag)、铂(Pt)、铝(Al)等，掺杂半导体或传导性半导体，如硅(Si)、镓氮(GaN)等，或其组合。可以用化学物质涂布导线电极612以化学结合用于通道读取的ss多核苷酸碱基。
ds-ss杂合多核苷酸链602的易位产生了电信号，其可以区分ss区段608和ds区段604、606。ds区段604、606缺少活性核苷酸碱基(其可以直接结合电极上的读取化学物质)，因此促进不允许碱基区分的小信号。ss区段608可以活跃地与读取分子相互作用并促进允许碱基区分的信号。图618显示了随时间流逝来自电极612的电流信号。在位置614上评价ds区段604的电极612产生信号620。在位置616上评价ss区段608的电极612产生信号622。
ds-ss杂合多核苷酸链与施加的静电势具有更强的相互作用，因此比ss多核苷酸链更易于控制。现在提到图7A，在其中整合有捕获电极的体积中显示了ss多核苷酸链。ss多核苷酸链702位于具有捕获电极710的体积704中。体积702构建在具有绝缘涂层708的基质706上以用于控制多核苷酸运动。可以将横向感应电极712任选地加入到体积702中。
现在提到图7B，具有ds区段714、716和ss区段718的ds-ss杂合多核苷酸链720位于体积704中。其中体积704的直径D小于约例如50nm时，ds-ss杂合多核苷酸链720是伸展的，而ss多核苷酸链702保持卷曲(图7A)。ds区段714、716具有两倍的电荷并因此经历两次强静电力，其用于将多核苷酸链720推向体积704的壁，以基于摩擦力控制多核苷酸的速度。ds-ss杂合多核苷酸链720的伸展状态产生更均匀的电荷分布，因此经历更均匀地施加的静电力，其利于精确控制多核苷酸链720的运动。
现在提到图8A和8B，可以根据一个示例性实施方案利用荧光染料标记ds-ss杂合多核苷酸链用于光学成像。在图8A中，可以利用荧光染料804标记ds-ss杂合多核苷酸链802。荧光染料804可以包括例如双苯酰亚胺或吲哚来源的染料(例如，Hoechst 33342、Hoechst 33258)、phenanthridinium染料(例如，溴化乙锭、碘化丙啶)、花青染料(例如，Pico Green、YOYO-1碘化物、SYBR Green I、SYBR Gold)等。ds区段806、808可以更好地结合那些荧光染料并产生更强的荧光信号。因而，ds区段806、808允许使用例如光学显微镜更可靠地检测ss区段814的运动。
在图8B中，可以利用多种荧光染料标记ds-ss杂合多核苷酸链，当所述荧光染料结合ss区段814(例如，发射第一种颜色的染料810)或ds区段806、808(例如发射第二种颜色的染料812)时可以发射不同波长的光。所述染料可以包括例如，吖啶橙。因而，可以使用相同的光通道分析或分别分析来自同一条多核苷酸链的ss区段814和ds区段806、808的信号，以独立且变通的方式提供不同区段的更多信息。
现在提到图9，根据一个实施方案示例性描述了显示用于多核苷酸形成的方法的方框/流程图。在方框902中，提供至少一个双链多核苷酸区段。ds多核苷酸区段可以包括例如DNA、DNA-RNA互补链等。
在方框904中，修饰至少一个双链多核苷酸区段，从而在双链多核苷酸区段之间提供一个或多个单链多核苷酸区段。在方框906中，所述修饰可以包括修饰一个末端上的两个双链多核苷酸区段和具有黏性末端的两个末端上的单链多核苷酸区段并连接两个双链多核苷酸区段之间的单链多核苷酸区段。在方框908中，修饰还可以包括切割双链多核苷酸区段的部分以在双链多核苷酸区段之间形成一个或多个单链多核苷酸区段。在方框910中，修饰可以进一步包括连接至少一个ds多核苷酸区段与第一个和第二个衔接头、将至少一个ds多核苷酸区段分裂成至少一个ss多核苷酸区段，并形成至少一个ss多核苷酸区段的第一个和第二个衔接头的互补链。形成互补链可以包括添加互补链、退火以自身形成互补链等。
已经描述了用于可靠的电传感和光学传感的多核苷酸构型的系统和方法的优选实施方案(其旨在示例性而非限制)，应该指出，本领域技术人员在上述教导下可以进行修改和改变。应理解，可以在所公开的特定实施方案中进行改变，所述改变在所附权利要求概括的本发明范围内。因此已经详细地描述了本发明的方面，尤其是专利法所要求的方面，在所附权利要求中给出了请求保护的和希望由专利特许证保护的内容。

Claims (35)

1.混合的多核苷酸，其包含
第一双链(ds)部分；
第二部分，其包括至少一个单链(ss)部分；和
第三ds部分，其中所述第二部分与所述第一ds部分及所述第三ds部分连接，以提供经修饰的多核苷酸。
2.权利要求1所述的多核苷酸，其中所述第二部分包括多个ds和ss部分。
3.权利要求1所述的多核苷酸，其中将所述经修饰的多核苷酸限制在体积中。
4.权利要求3所述的多核苷酸，其中所述体积包括纳米通道和纳米孔中的至少一种。
5.权利要求1所述的多核苷酸，其中用一种或多种荧光染料标记所述经修饰的多核苷酸。
6.权利要求5所述的多核苷酸，其中所述经修饰的多核苷酸的ds部分比ss部分具有更强的荧光。
7.权利要求5所述的多核苷酸，其中所述经修饰的多核苷酸的ds部分与ss部分发射具有不同波长的光。
8.权利要求1所述的多核苷酸，其中所述经修饰的多核苷酸包括DNA和RNA中的至少一种。
9.用于形成多核苷酸的方法，其包括：
在多个双链(ds)多核苷酸区段和一个或多个单链(ss)多核苷酸区段的至少一个末端形成黏性末端；和
连接多个ds多核苷酸区段之间的一个或多个ss多核苷酸区段的黏性末端，以提供混合的ds-ss多核苷酸。
10.权利要求9所述的方法，其中所述连接包括连接多个ds多核苷酸区段之间的一个或多个ss多核苷酸区段。
11.权利要求9所述的方法，其中所述黏性末端具有不同的碱基。
12.权利要求9所述的方法，其进一步包括在体积中检测所述混合的ds-ss多核苷酸，从而区分ds区段和ss区段。
13.权利要求9所述的方法，其进一步包括用一种或多种荧光染料标记所述混合的ds-ss多核苷酸，以使所述混合的ds-ss多核苷酸的ds区段比ss区段具有更强的荧光。
14.权利要求9所述的方法，其进一步包括用一种或多种荧光染料标记所述混合的ds-ss多核苷酸，以使所述混合的ds-ss多核苷酸的ds区段与ss区段发射具有不同波长的光。
15.权利要求9所述的方法，其进一步包括将所述混合的ds-ss多核苷酸限制在体积中。
16.权利要求15所述的方法，其中所述体积包括纳米通道和纳米孔中的至少一种。
17.权利要求15所述的方法，其进一步包括在所述体积中使用电极，以通过向所述体积的壁静电推动所述混合的ds-ss多核苷酸来控制所述混合的ds-ss多核苷酸的运动。
18.权利要求9所述的方法，其进一步包括用一种或多种荧光染料标记所述混合的ds-ss多核苷酸。
19.权利要求18所述的方法，其中所述混合的ds-ss多核苷酸的ds区段比ss区段具有更强的荧光。
20.权利要求18所述的方法，其中所述混合的ds-ss多核苷酸的ds区段与ss区段发射具有不同波长的光。
21.权利要求9所述的方法，其中所述混合的ds-ss多核苷酸包括在多个ds多核苷酸区段之间形成的多个ds和ss区段。
22.权利要求9所述的方法，其中所述混合的ds-ss多核苷酸包括DNA和RNA中的至少一种。
23.形成多核苷酸的方法，其包括：
确定双链(ds)多核苷酸区段上的多个识别位点；和
在所述多个识别位点上切割ds多核苷酸区段，以在ds多核苷酸区段之间形成至少一个单链(ss)多核苷酸区段，从而提供混合的ds-ss多核苷酸。
24.权利要求23所述的方法，其中所述切割包括使用酶切割所述ds多核苷酸区段。
25.权利要求23所述的方法，其中所述切割包括多次切割所述ds多核苷酸区段以在ds多核苷酸区段之间形成多个ss多核苷酸区段。
26.权利要求23所述的方法，其进一步包括检测体积中所述混合的ds-ss多核苷酸，从而区分ds区段和ss区段。
27.权利要求23所述的方法，其进一步包括用一种或多种荧光染料标记所述混合的ds-ss多核苷酸，以使所述混合的ds-ss多核苷酸的ds区段比ss区段具有更强的荧光。
28.权利要求23所述的方法，其进一步包括用一种或多种荧光染料标记所述混合的ds-ss多核苷酸，以使所述混合的ds-ss多核苷酸的ds区段与ss区段发射具有不同波长的光。
29.权利要求23所述的方法，其进一步包括将所述混合的ds-ss多核苷酸限制在体积中。
30.权利要求29所述的方法，其中所述体积包括纳米通道和纳米孔中的至少一种。
31.利要求29所述的方法，其进一步包括在所述体积中使用电极，以通过向所述体积的壁静电推动所述混合的ds-ss多核苷酸来控制所述混合的ds-ss多核苷酸的运动。
32.权利要求23所述的方法，其进一步包括用一种或多种荧光染料标记所述混合的ds-ss多核苷酸。
33.权利要求32所述的方法，其中所述混合的ds-ss多核苷酸的ds区段比ss区段具有更强的荧光。
34.权利要求32所述的方法，其中所述混合的ds-ss多核苷酸的ds区段与ss区段发射具有不同波长的光。
35.权利要求23所述的方法，其中所述混合的ds-ss多核苷酸包括DNA和RNA中的至少一种。
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