CN104328220A - 柑桔黄脉病毒的rt-lamp引物组、检测方法及试剂盒 - Google Patents

柑桔黄脉病毒的rt-lamp引物组、检测方法及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种柑桔黄脉病毒的RT-LAMP引物组、检测方法及试剂盒,属于分子生物学技术领域。本发明提供了柑桔黄脉病毒RT-LAMP检测的外引物对F3、B3和内引物对FIP、BIP，以待测样品总RNA为模板，应用上述的内外引物对在60～63℃恒温反应条件下，进行环介导恒温扩增反应70～100min，扩增完成后80℃再反应5～10min，然后利用琼脂糖凝胶电泳或荧光染料染色，鉴定植株样品是否感染柑桔黄脉病毒。本发明操作简便、检测快速、不需要昂贵的核酸扩增仪器，几十分钟就可完成对RNA的检测，重复性好、准确性高、灵敏度高，适合田间样品的大规模测定和茎尖嫁接脱毒苗的快速评价。

Description

柑桔黄脉病毒的RT-LAMP引物组、检测方法及试剂盒
技术领域
本发明涉及一种环介导等温扩增分子检测方法，尤其涉及一种柑桔黄脉病毒的RT-LAMP引物组、检测方法及试剂盒。
背景技术
柑桔黄脉病由柑桔黄脉病毒(Citrus yellow vein clearing virus,CYVCV)引起。CYVCV属于柑桔病毒属(Mandarivirus)，直径为13-14nm，长约685nm。该病造成柠檬、酸橙等柑桔品种叶片的叶脉黄化至透明，并有叶片反卷、皱缩等症状，严重时可至叶脉坏死、嫩叶脱落，影响树势和产量。
我国柠檬栽培面积达2.67万hm2，年产值达几十亿元，是产地农户收入主要来源之一。近年在我国云南等地相继发现了柑桔黄脉病，且目前无有效的防治药剂，因此柑桔黄脉病的防控对我国柠檬产业健康、稳定发展具有十分重要的意义。
柑桔黄脉病的检测，目前的方法有：指示植物鉴定、电镜检测、RT-PCR等。指示植物鉴定采用柠檬作为指示植物，虽然指示植物进行病毒病鉴定沿用至今，但烦琐耗时。电镜检测前期处理复杂，且对仪器要求高，检出率较低。RT-PCR法具有快速、灵敏和准确的特点，作为一种强有力的检测工具已广泛应用于各种病害的检验与诊断。虽然目前常规RT-PCR已开始运用于CYVCV检测，但其对田间早期病树的检测效果不够理想，灵敏度还有待提高，并且需要专业的PCR仪和电泳仪等特殊仪器，使其在田间的应用受到很大的限制。
2000年由Notomi等发明的环形介导逆转录等温扩增技术(RT-LAMP)是一种新的恒温核酸扩增方法，较传统的核酸扩增方法具有灵敏度高、特异性强、操作方法简单、快速等优点，现已越来越多的应用于各种病毒的检测。其主要原理是通过采用特异地识别靶序列上6个区域的4条引物(2条内引物-FIP/BIP，2条外引物-F3/B3)及具有链置换活性的Bst DNA聚合酶，在等温条件(63℃左右)DNA开始合成。利用可以产生环状结构的引物和Bst DNA聚合酶的链置换合成活性，靶序列两端引物结合处循环不断地产生环状单链结构。当一个引物向双链DNA的互补部位进行碱基配对延伸时，另一条链解离变成单链，引物在恒温条件下不断引发新链的合成，靶基因因此得到高效扩增，最终的扩增产物是一系列反向重复的靶序列构成的茎环结构和多环花椰菜样结构的DNA片段混合物，电泳显现出不同大小条带组成的阶梯式图谱。
发明内容
本发明的目的是提供一种特异性好、灵敏度高的柑桔黄脉病毒的RT-LAMP引物组。
一种柑桔黄脉病毒的RT-LAMP引物组，由外引物对F3、B3和内引物对FIP、BIP组成：
外引物对：
F3：5’-TCCGGGGTAGACGAGAAC-3’；
B3：5’-AGGTCCGTGCCATTTCCT-3’；
内引物对：
FIP：5’-CACATACAGGGAAGCGGGCGCGAAATTCGCGGCATTCG-3’；
BIP：5’-AGAGACACCCTACTTCAGCGGAAGCGTTGGCAATTTTCACAG-3’。
本发明的另一个目的是提供不需要专门的核酸扩增仪器、操作简单方便、特异性好、灵敏度高、检测快速的柑桔黄脉病毒RT-LAMP检测方法。
本发明的柑桔黄脉病毒RT-LAMP检测方法，是以待测样品总RNA为模板，应用上述的外引物对F3、B3和内引物对FIP、BIP在60～63℃恒温反应条件下，进行环介导恒温扩增反应70～100min，扩增完成后80℃再反应5～10min，然后利用琼脂糖凝胶电泳或荧光染料染色，鉴定植株样品是否感染柑桔黄脉病毒。
扩增反应中，总体积25μL的反应体系含有18μL反应液A、5μL引物液B、浓度为20～100ng/μL的总RNA 2μL；其中18μL反应液A含有：2.5μL 10×Bst buffer、3μL 25mM的MgCl2、2μL 4mM的Betaine、2μL 10mM的dNTPs、0.5μL 40U/μL的RNA酶抑制剂、1μL 8U/μL的Bst聚合酶、1μL 10U/μL的AMV逆转录酶、6μL水；5μL引物液B包括2μL 20μM的FIP、2μL 20μM的BIP、0.5μL 10μM的F3、0.5μL 10μM的B3。
本发明的再一个目的是提供一种特异性好、灵敏度高、操作简单的柑桔黄脉病毒RT-LAMP检测试剂盒。
本发明的柑桔黄脉病毒RT-LAMP检测试剂盒，含有上述RT-LAMP引物组：外引物对F3、B3和内引物对FIP、BIP。
除了上述特异引物对外，该试剂盒还含有进行RT-LAMP扩增所需要的Bstbuffer、MgCl2、Betaine、dNTPs、RNA酶抑制剂、Bst聚合酶和AMV逆转录酶。
本发明的有益效果是：以提取样本总RNA为模板，建立了快速检测柑桔黄脉病毒的RT-LAMP技术，不需要单独反转录过程和巢式PCR的二次扩增，减少分子检测的一些环节，降低了检测的污染率。且实验证明检测灵敏度比RT-PCR高10倍，使该方法对柑桔黄脉病毒的早期诊断更准确。本发明操作简便、检测快速、不需要昂贵的核酸扩增仪器，几十分钟就可完成对RNA的检测，重复性好、准确性高、灵敏度高，适合田间样品的大规模测定和茎尖嫁接脱毒苗的快速评价。
附图说明
图1为柑桔黄脉病毒RT-LAMP检测结果示意图；1、3为感染柑桔黄脉病毒的样品，2、4为健康叶片对照。
图2为柑桔黄脉病毒RT-LAMP引物组的特异性检测图；其中1为感染柑桔黄脉病毒的样品，2-7分别为感染柑桔衰退病毒、柑桔鳞皮病毒、柑桔裂皮病毒、温州蜜柑萎缩病毒、柑桔碎叶病毒和柑桔黄龙病的样品。
图3为柑桔黄脉病毒RT-LAMP扩增产物酶切鉴定图；M为50bp Ladder DNAMarker；1为RT-LAMP扩增产物；2-4为RT-LAMP扩增产物经Sau3AI酶切后电泳。
图4为柑桔黄脉病毒常规RT-PCR检测灵敏度检测图；M为50bp Ladder DNAMarker；1-5依次为柑桔黄脉病毒样品稀释10倍、102倍、103倍、104倍、105倍常规RT-PCR检测结果。
图5为柑桔黄脉病毒RT-LAMP检测灵敏度检测图；1-5依次为柑桔黄脉病毒样品稀释10倍、102倍、103倍、104倍、105倍RT-LAMP检测结果。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
本发明的实验材料：
本实验所用分别感染柑桔衰退病毒、柑桔鳞皮病毒、柑桔裂皮病毒、温州蜜柑萎缩病毒、柑桔碎叶病毒、柑桔黄龙病以及柑桔黄脉病毒的植株样品来源于西南大学柑桔研究所保存毒源。
主要试剂及生产者：
Betaine(Promega公司，美国)，RNA酶抑制剂(鼎国公司，中国)，Bst聚合酶(New England Biolabs，美国)，AMV逆转录酶(BioFlux公司，日本)，SYBR GREEN I(鼎国公司，中国)，Sau3AI内切酶(TaKaRa公司，日本),10×H Buffer(TaKaRa公司，日本)，50bp Ladder DNA Marker(Biomed公司，俄罗斯)，10×Bst buffer(New England Biolabs，美国)。
实施例1柑桔黄脉病毒的RT-LAMP检测特异性验证
1、用于检测柑桔黄脉病毒的RT-LAMP引物组
根据柑桔黄脉病毒的外壳蛋白基因的核苷酸序列，设计4条特异性引物，外引物对F3、B3，内引物对FIP、BIP，引物序列如下：
F3序列：5’-TCCGGGGTAGACGAGAAC-3’；
B3序列：5’-AGGTCCGTGCCATTTCCT-3’；
FIP序列：5’-CACATACAGGGAAGCGGGCGCGAAATTCGCGGCATTCG-3’；
BIP序列：5’-AGAGACACCCTACTTCAGCGGAAGCGTTGGCAATTTTCACAG-3’。
2、提取待测样品总RNA
待测样品：选取表现CYVCV典型症状的叶片和健康植株的叶片分别作为正对照和负对照。提取正对照和负对照样品的总RNA：取0.05g叶片于1.5mL无菌eppendorf管内，液氮研磨后加入1mL Trizol，混匀，室温静置5min；再加入0.2mL氯仿，震荡15s，室温静置3min；4℃，12000rpm，离心15min；取上清于干净的1.5mL无菌eppendorf管内，加入0.5ml异丙醇，室温静置10min，4℃，12000g，离心10min；倒掉上清，在eppendorf管内加入1mL 75％的乙醇洗涤；倒掉乙醇，室温干燥5-10分钟，加入30μL水溶解，-20℃保存。
3、RT-LAMP扩增
在反应管中加入18μL反应液A和5μL引物液B，再加入2μL前述提取的待测样品总RNA，建立体积为25μL的扩增反应体系。62℃进行反应(水浴或者烘箱)，反应时间为80min；然后80℃反应5min。18μL反应液A包括：2.5μL 10×Bst buffer、3μL MgCl2(25mM)、2μL Betaine(4mM)、2μL dNTPs(10mM)、0.5μL RNA酶抑制剂(40U/μL)、1μL Bst聚合酶(8U/μL)、1μL AMV逆转录酶(10U/μL)、6μL水；5μL引物液B包括2μL FIP(20μM)、2μL BIP(20μM)、0.5μL F3(10μM)、0.5μL B3(10μM)。
4、结果观察与验证
对前述扩增产物进行结果分析，在扩增产物中加入1μL 100倍稀释的显色液荧光染料SYBR GREEN I，可见表现CYVCV典型症状的正对照样品扩增产物颜色由无色变为黄绿色，表明检测到了柑桔黄脉病毒；健康叶片的负对照样品扩增产物中加入SYBR GREEN I后，离心管中的颜色为SYBR GREEN I的红棕色，未发生颜色变化，表明未检测到柑桔黄脉病毒。
用1.5％的琼脂糖对前述扩增产物进行电泳检测，结果如图1所示：泳道1、3为感染柑桔黄脉病毒的样品，出现特异性阶梯式条带；泳道2、4为健康叶片对照，没有条带。
5、特异性鉴定
按照前述“2提取待测样品总RNA”的方法分别提取感染了柑桔衰退病毒、柑桔鳞皮病毒、柑桔裂皮病毒、温州蜜柑萎缩病毒、柑桔碎叶病毒、柑桔黄龙病以及柑桔黄脉病毒的柑桔叶片的总RNA，使用前述建立的RT-LAMP体系对获得的总RNA进行检测，电泳结果如图2所示，只有柑桔黄脉病毒样品出现特异性阶梯式条带，说明检测到了柑桔黄脉病毒；其余病毒的泳道没有条带；说明该检测方法对柑桔黄脉病检测具有特异性。
6、酶切鉴定
用BioEdit软件对柑桔黄脉病毒RT-LAMP扩增产物片段进行分析，筛选出Sau3AI限制性内切酶('GATC_)对产物进行酶切分析，酶切产物理论值为62、147、183和219bp。建立20μL的酶切体系，酶切体系为：1μL Sau3AI(10U/μL)、2μL 10×H Buffer、2μL RT-LAMP扩增产物、15μL水。37℃反应3h，用8％的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，经EB染色后用凝胶成像系统观察。结果如图3所示，柑桔黄脉病毒RT-LAMP扩增产物经Sau3AI酶切后出现了与理论值相同大小的62、147、183和219bp的条带，证明柑桔黄脉病毒样品RT-LAMP体系扩增出的确实为柑桔黄脉病毒目的条带。
实施例2柑桔黄脉病毒的RT-LAMP检测灵敏度检测
对图1中感染柑桔黄脉病的样品1的总RNA模板进行10倍梯度稀释至105倍，分别采用常规RT-PCR和实施例1中的RT-LAMP进行扩增检测，常规RT-PCR得到469bp的特异性扩增片段，电泳结果如图4所示，总RNA稀释到103倍时常规RT-PCR无法进行检测。RT-LAMP检测结果如图5所示，当总RNA稀释到103倍时RT-LAMP仍可检测出CYVCV,由此可见RT-LAMP检测的灵敏度是常规RT-PCR的10倍。柑桔黄脉病毒的常规RT-PCR所用引物为：上游引物：5’-AAACCTAATCGGTCCTGTG-3’；下游引物：5’-GAGACACCCTACTTCAGCG-3’。

Claims (5)

1.一种柑桔黄脉病毒的RT-LAMP引物组，其特征在于：由外引物对F3、B3和内引物对FIP、BIP组成：
外引物对：
F3：5’-TCCGGGGTAGACGAGAAC-3’；
B3：5’-AGGTCCGTGCCATTTCCT-3’；
内引物对：
FIP：5’-CACATACAGGGAAGCGGGCGCGAAATTCGCGGCATTCG-3’；
BIP：5’-AGAGACACCCTACTTCAGCGGAAGCGTTGGCAATTTTCACAG-3’。
2.一种柑桔黄脉病毒的RT-LAMP检测方法，其特征在于：是以待测样品总RNA为模板，应用权利要求1所述的外引物对和内引物对在60～63℃恒温反应条件下，进行环介导恒温扩增反应70～100min，扩增完成后80℃再反应5～10min，然后利用琼脂糖凝胶电泳或荧光染料染色，鉴定植株样品是否感染柑桔黄脉病毒。
3.根据权利要求2所述的柑桔黄脉病毒的RT-LAMP检测方法，其特征在于：扩增反应体系为：总体积25μL的反应体系含有18μL反应液A、5μL引物液B、浓度为20～100ng/μL的总RNA2μL；其中18μL反应液A含有：2.5μL10×Bst buffer、3μL25mM的MgCl2、2μL4mM的Betaine、2μL10mM的dNTPs、0.5μL40U/μL的RNA酶抑制剂、1μL8U/μL的Bst聚合酶、1μL10U/μL的AMV逆转录酶、6μL水；所述5μL引物液B包括2μL20μM的FIP、2μL20μM的BIP、0.5μL10μM的F3、0.5μL10μM的B3。
4.含有权利要求1所述引物组的柑桔黄脉病毒RT-LAMP检测试剂盒。
5.根据权利要求4所述的柑桔黄脉病毒RT-LAMP检测试剂盒，其特征在于：还含有进行RT-LAMP扩增所需要的Bst buffer、MgCl2、Betaine、dNTPs、RNA酶抑制剂、Bst聚合酶和AMV逆转录酶。
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