CN104312943A - 一株芽孢杆菌及复合废水培养产絮凝剂的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株芽孢杆菌及复合废水培养产絮凝剂的方法，该芽孢杆菌(Bacillus sp.)保藏编号为CGMCC NO.9143。本发明的芽孢杆菌，可以以豆制品废水和/或味精废水为培养基，发酵培养得到多糖絮凝剂。本发明的芽孢杆菌和产絮凝剂的方法，不仅可高产絮凝剂，同时能去除豆制品废水和味精废水的COD和NH4 +-N，此外，得到的多糖絮凝剂不仅可以改善浓缩污泥脱水性能，而且可以去除米氏凯伦藻培养液中的米氏凯伦藻及塔马亚历山大藻培养液中的塔马亚历山大藻。

Description

一株芽孢杆菌及复合废水培养产絮凝剂的方法
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株产絮凝剂的芽孢杆菌的选育、以及味精废水和豆制品废水复合培养芽孢杆菌产絮凝剂的方法。
背景技术
生物絮凝剂具有高效、无毒和可生物降解性，是典型的环境友好功能材料，代表了絮凝剂的重要研发方向之一。Burterfield于1935年从活性污泥中最早筛选到产絮凝剂的微生物。20世纪70年代以来，国内外学者筛选到许多产絮凝剂的微生物，发现从土壤、活性污泥、生活污水、工业废水以及各类沉积物样品中，均可分离得到具有产絮能力的微生物，包括细菌、藻类、放线菌、真菌和酵母等(朱艳彬等，中国环境科学学会学术年会论文集，2009，173-178)。20世纪末，日本学者从旱田土壤分离筛选得到的一株红串红球菌(Rhodococcus erythropolis)S-1产生的NOC-1，是已发现效果最好的生物絮凝剂之一，具有强而广泛的絮凝活性(JTakeda M,Agric.Biol.Chem,1991,55(10):2263-2264)。
生物絮凝剂属于天然有机高分子絮凝剂，可以根据不同的方式进行分类：(1)根据来源不同分为3类：直接利用微生物细胞的絮凝剂，如某些细菌、霉菌、放线菌和酵母；利用微生物细胞提取物的絮凝剂，如酵母细胞壁的葡聚糖、甘露聚糖、蛋白质和N-乙酰葡萄糖胺等；利用微生物细胞代谢产物的絮凝剂，微生物细胞分泌到细胞外的代谢产物，主要成分为多糖及少量的多肽、蛋白质、脂类及其复合物；(2)根据化学组成的不同分为3类：糖类物质，绝大多数是代谢产生的各种多聚糖类；多肽、蛋白质和DNA类物质，已知絮凝能力最好的生物絮凝剂NOC-1的主要成分即为蛋白质，其最大相对分子质量为75万；脂类物质，目前发现的唯一的脂类絮凝剂是1994年Kurane从Rhodococcus erythropolis s-1的培养液中分离出来的生物絮凝剂；(3)根据在分散介质水中所带电荷的不同分为3类：两性型蛋白质和多肽类大分子，为两性电解质；非离子型多糖类生物絮凝剂，属于非离子型絮凝剂；阴离子型直接利用微生物细胞的絮凝剂(李大鹏,哈尔滨工业大学博士论文，2010,4-5)。
以廉价底物为原料培养微生物产絮凝剂被广泛地研究。如Xiaoling Zhang等以糖蜜为原料培养Bacillus licheniformis产絮凝剂，优化的培养基配方为20g·L-1糖蜜、0.4g·L-1尿素、0.4g·L-1NaCl、0.2g·L-1KH2PO4、1.6g·L-1K2HPO4、0.2g·L-1MgSO4；在优化条件下12h内产絮凝剂活性达到700U·ml-1(Xiaoling Zhang,et al,Biotechnology and Bioprocess Engineering,2012,17:1041-1047)。
影响生物絮凝剂发酵的因素很多，培养基的组成、C/N比、培养基的pH值、温度、溶氧等都将影响生物絮凝剂的产率。细胞生长与生物絮凝剂产生的关系因菌种不同而异。根据国内外相关研究者对胞外分泌产絮凝剂的产絮菌的研究表明，其产生胞外代谢物的时间主要应该在对数期后期和稳定期前期、中期，在对数期前期基本上不产絮凝剂。
目前，生物絮凝剂的研究还存在一些问题，主要表现为：(1)絮凝效率低，制备成本高；(2)代谢途径特别是多种菌株产复合絮凝剂的代谢途经及调控机理还不清楚；(3)从大规模工业生产和应用急需解决的关键问题(如降低成本、提高产絮能力、生产的调控、提高产絮稳定性等)角度开展的大规模的发酵技术研究几乎是空白。因此，继续选育具有高效、稳定的产絮能力的微生物种质资源，以及在对其代谢途径和调控机理研究基础上开展的发酵技术研究，是生物絮凝剂真正实现大规模工业生产的关键。
发明内容
本发明的目的在于提供一株产生物絮凝剂的细菌。
本发明的第一方面，提供一株芽孢杆菌(Bacillus sp.)，其保藏编号为CGMCCNO.9143。
本发明的第二方面，提供第一方面所述的芽孢杆菌Bacillus sp.的用途，用于制备絮凝剂。
在另一优选例中，所述絮凝剂为多糖。
本发明的第三方面，提供一种絮凝剂的制备方法，所述方法包括以下步骤：
(a)将保藏编号为CGMCC NO.9143的芽孢杆菌接种于LB培养基中，培养18-24h得到一级种子液；
任选地(b)将步骤(a)得到的一级种子液在种子培养基中培养18-24h得到二级种子液；
以及(c)将步骤(a)得到的一级种子液或步骤(b)得到的二级种子液接种于发酵培养基中培养得到所述絮凝剂。
在另一优选例中，所述絮凝剂为多糖。
在另一优选例中，所述步骤(a)中于35-45℃、150-180rpm的条件下培养。
在另一优选例中，所述步骤(b)中于35-45℃、通气量5-10L/min、搅拌速度350-450rpm的条件下培养。
在另一优选例中，所述步骤(c)中于30-50℃(较佳地35-45℃)的条件下培养。
在另一优选例中，所述种子液的菌液浓度为1-2×109cfu·ml-1。
在另一优选例中，所述步骤(b)中，所述一级种子液与所述种子培养基的体积比3-10:100，较佳地为4-6:100，更佳为5:100。
在另一优选例中，所述二级种子液或所述一级种子液与所述发酵培养基的体积比为5-15:100，较佳地为8-12:100，更佳为10:100。
在另一优选例中，所述发酵培养基为产絮凝剂培养基，较佳地，所述产絮凝剂培养基的组成为：葡萄糖20g、K2HPO45g、KH2PO42g、(NH4)2SO40.2g、NaCl 0.1g、尿素0.5g、酵母膏0.5g、MgSO40.2g、H2O 1000ml、pH7.5。
在另一优选例中，所述种子培养基为废水培养基，pH为7-9，包含以下组分：
豆制品废水和/或味精废水    500-800ml·L-1；
水                         200-500ml·L-1，
其中，所述废水培养基包含豆制品废水和味精废水时，所述豆制品废水的含量为250-500ml·L-1，较佳地为300-400ml·L-1；所述味精废水的含量为150-400ml·L-1，较佳地200-300ml·L-1。
在另一优选例中，所述发酵培养基为废水培养基，pH为7-9，包含以下组分：
豆制品废水和/或味精废水    500-800ml·L-1；
水                         200-500ml·L-1，
其中，所述废水培养基包含豆制品废水和味精废水时，所述豆制品废水的含量为250-500ml·L-1，较佳地为300-400ml·L-1；所述味精废水的含量为150-400ml·L-1，较佳地200-300ml·L-1。
在另一优选例中，所述发酵培养基中还含有0.5-5g·L-1KH2PO4；较佳地为1-4g·L-1KH2PO4；更佳地为1.2-3.5g·L-1KH2PO4。
在另一优选例中，所述发酵培养基中还含有葡萄糖，所述葡糖糖的含量为5-15g·L-1。
在另一优选例中，所述步骤(c)中，在培养至对数期末期，流加5-15g·L-1的葡萄糖，较佳地流加8-12g·L-1的葡萄糖。
在另一优选例中，所述步骤(c)中，在培养至对数期末期，氧饱和度维持在15-95％，较佳地为20-90％，更佳地为25-65％。
在另一优选例中，所述制备方法还包括采用乙醇沉淀出所述絮凝剂的步骤。
在另一优选例中，所述乙醇与所述步骤(c)获得的发酵液的体积比为3-4:1。
本发明的第四方面，提供一种絮凝剂，采用第三方面所述的方法制备获得。
在另一优选例中，所述絮凝剂为多糖。
在另一优选例中，所述絮凝剂具有以下一个或多个特征：
(1)具有如图3所示的红外特征谱图；
(2)具有如图4所示的紫外特征谱图。
本发明的第五方面，提供第四方面所述的絮凝剂的用途，所述絮凝剂用于：
(i)制备改善浓缩污泥脱水性能的促进剂；或
(ii)去除米氏凯伦藻；或
(iii)去除塔马亚历山大藻。
在另一优选例中，去除米氏凯伦藻培养液中的米氏凯伦藻。
在另一优选例中，去除塔马亚历山大藻培养液中的塔马亚历山大藻。
在另一优选例中，所述米氏凯伦藻培养液是F/2培养基。
在另一优选例中，所述塔马亚历山大藻培养液是F/2培养基。
在另一优选例中，所述F/2培养基配方：NaNO375mg、NaH2PO4·H2O 5mg、Na2SiO3·9H2O 20mg、Na2EDTA 4.36mg、FeCl3·6H2O 3.16mg、CuSO4·5H2O 0.01mg、ZnSO4·7H2O 0.023mg、CoCl2·6H2O 0.012mg、MnCl2·4H2O 0.18mg、Na2MoO4·2H2O 0.07mg、维生素B10.1g、维生素B120.5g、生物素0.5g、自然海水(0.4μm孔径滤膜过滤)1000ml。
本发明的芽孢杆菌和产絮凝剂的方法，不仅可高产絮凝剂，而且在较高温度下培养，同时能去除豆制品废水和味精废水的COD和NH4 +-N，此外，得到的多糖絮凝剂不仅可以改善浓缩污泥脱水性能，而且可以去除米氏凯伦藻培养液中的米氏凯伦藻及塔马亚历山大藻培养液中的塔马亚历山大藻。
应理解，在本发明范围内，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一赘述。
附图说明
图1是Bacillus sp.WZ01的革兰氏染色图。
图2是Bacillus sp.WZY01分批补料发酵产絮凝剂的进程图。
图3是絮凝剂的红外光谱分析图谱。
图4是絮凝剂的紫外光谱分析图谱。
具体实施方式
本申请的发明人经过广泛而深入地研究，首次意外研发出一种新的芽孢杆菌(Bacillus sp.)WZY01，具有高的产絮凝剂能力，能在较高温度下培养，并可直接利用豆制品废水和味精废水为营养来源产絮凝剂，可为微生物发酵法生产絮凝剂提供种源。在此基础上，完成了本发明。
芽孢杆菌
本发明采用常规分离方法，从采自浙江温州西片污水处理厂的活性污泥中分离并经复合诱变育种获得一株芽孢杆菌(Bacillus sp.)，编为Bacillus sp.WZY01，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏中心登记入册编号为CGMCC NO.9143，保藏起始日期为2014年05月12日。
LB培养基
LB培养基是常用的细菌培养基，因其营养丰富，可使细菌菌种快速生长而达到活化或作为种子的要求。可以根据《分子克隆实验指南》(J.萨姆布鲁克D.W.拉塞尔著)进行配制。
废水培养基
本发明的废水培养基，pH为7-9，包含以下组分：
豆制品废水和/或味精废水    500-800ml·L-1；
水                         200-500ml·L-1，
其中，当所述废水培养基包含豆制品废水和味精废水时，所述豆制品废水的含量为250-500ml·L-1，较佳地为300-400ml·L-1；所述味精废水的含量为150-400ml·L-1，较佳地200-300ml·L-1，
基于所述复合废水培养基的总体积计。
在另一优选例中，本发明的废水培养基，pH为7-9，包含以下组分：
豆制品废水和味精废水    500-800ml·L-1；
水                      200-500ml·L-1，
其中，所述豆制品废水的含量为250-500ml·L-1，较佳地为300-400ml·L-1；所述味精废水的含量为150-400ml·L-1，较佳地200-300ml·L-1，
基于所述复合废水培养基的总体积计。
在另一优选例中，所述培养基中还含有0.5-5g·L-1KH2PO4；较佳地为1-4g·L-1KH2PO4；更佳地为1.2-3.5g·L-1KH2PO4。
在另一优选例中，所述培养基中还含有葡萄糖，所述葡萄糖的含量为5-15g·L-1，较佳地为8-12g·L-1。
应理解，培养基配方中的水并不包含豆制品废水和味精废水中的水。
本发明的豆制品废水和味精废水没有特别的限制，任何加工豆制品后的废水和任何生产味精后的除菌体蛋白尾液的废水均可用于本发明。
在一优选实施方式中，豆制品废水的COD为15000-20000mg·L-1、NH4 +-N为50-100mg·L-1，pH为4.5-5.5。
在一优选实施方式中，味精废水的COD 20000-25000mg·L-1、NH4 +-N为18000-25000mg·L-1、SO4 2-为50000-60000mg·L-1、pH为4.0-4.5。
絮凝剂
本发明还提供芽孢杆菌(Bacillus sp.)WZY01在复合废水培养基中发酵培养得到的絮凝剂。
在另一优选例中，所述絮凝剂为多糖。
本发明提供的絮凝剂可用于改善浓缩污泥脱水性能、去除米氏凯伦藻培养液中的米氏凯伦藻、或去除塔马亚历山大藻培养液中的塔马亚历山大藻。
优选地，絮凝剂用于改善浓缩污泥脱水性能的适宜添加量为1-2ml 3％絮凝剂溶液，pH 6.2-7.0，温度20-35℃。
优选地，絮凝剂用于去除米氏凯伦藻或塔马亚历山大藻的适宜浓度为0.4-0.6％(W/V)，pH 7.5-8.5。
絮凝剂制备方法
本发明的絮凝剂的制备方法，所述方法包括以下步骤：
(a)将保藏编号为CGMCC NO.9143的芽孢杆菌接种于LB培养基中，培养18-24h得到一级种子液；
(b)将步骤(a)得到的一级种子液在种子培养基中培养18-24h得到二级种子液；
(c)将步骤(b)得到的二级种子液接种于发酵培养基中培养得到所述絮凝剂。
在另一优选例中，所述絮凝剂为多糖。
在另一优选例中，所述步骤(a)中于35-45℃、150-180rpm的条件下培养。
在另一优选例中，所述步骤(b)中于35-45℃的条件下培养，所述步骤(c)中于30-50℃(较佳地35-45℃)的条件下培养。
在另一优选例中，所述种子液的菌液浓度为1-2×109cfu·ml-1。
在另一优选例中，所述步骤(b)中，所述一级种子液与所述种子培养基的体积比3-10:100，较佳地为4-6:100，更佳为5:100。
在另一优选例中，所述二级种子与所述发酵培养基的体积比为5-15:100，较佳地为8-12:100，更佳为10:100。
在另一优选例中，所述发酵培养基为产絮凝剂培养基，其组成为：葡萄糖20g、K2HPO45g、KH2PO42g、(NH4)2SO40.2g、NaCl 0.1g、尿素0.5g、酵母膏0.5g、MgSO40.2g、H2O 1000ml、pH7.5。
在另一优选例中，所述发酵培养基为废水培养基，pH为7-9，包含以下组分：
豆制品废水和/或味精废水    500-800ml·L-1；
水                         200-500ml·L-1，
其中，当所述废水培养基包含豆制品废水和味精废水时，所述豆制品废水的含量为250-500ml·L-1，较佳地为300-400ml·L-1；所述味精废水的含量为150-400ml·L-1，较佳地200-300ml·L-1。
在另一优选例中，所述种子培养基和发酵培养基为废水培养基，pH为7-9，包含以下组分：
豆制品废水和味精废水    500-800ml·L-1；
水                      200-500ml·L-1，
所述豆制品废水的含量为250-500ml·L-1，较佳地为300-400ml·L-1；所述味精废水的含量为150-400ml·L-1，较佳地200-300ml·L-1，
所述种子培养基和发酵培养基可以相同，可以不同。
在另一优选例中，所述培养基中还含有0.5-5g·L-1KH2PO4；较佳地为1-4g·L-1KH2PO4；更佳地为1.2-3.5g·L-1KH2PO4。
在另一优选例中，所述培养基中还含有葡萄糖，所述葡糖糖的含量为5-15g·L-1。
在另一优选例中，所述步骤(c)中，在培养至对数期末期，流加5-15g·L-1的葡萄糖，较佳地流加8-12g·L-1的葡萄糖。
在另一优选例中，所述步骤(c)中，在培养至对数期末期，氧饱和度维持在15-95％，较佳地为20-90％，更佳地为25-65％。
在另一优选例中，所述制备方法还包括采用乙醇沉淀出所述絮凝剂的步骤。
在另一优选例中，所述乙醇与所述步骤(b)获得的发酵液的体积比为3-4:1。
本发明能够达到以下技术效果：
1.本发明提供一种新型的芽孢杆菌(Bacillus sp.)WZY01，具有高的产絮凝剂能力，较高的培养温度，并可直接利用豆制品废水和味精废水为营养来源产絮凝剂，可为微生物发酵法生产絮凝剂提供种源。
2.本发明提供了适合培养菌株Bacillus sp.WZY01产絮凝剂的豆制品废水和味精废水复合的培养基配方和培养方法。
3.在最佳培养条件下，菌株Bacillus sp.WZY01产絮凝剂的产量达8.689g·L-1，产率达0.362g·L-1h-1。
4.本发明不仅可高产絮凝剂，同时能有效去除豆制品废水和味精废水的COD和NH4 +-N。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold SpringHarbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
通用方法
絮凝活性(以絮凝率表征)
在100ml量筒中加入80ml蒸馏水，0.4g高岭土(平均粒度4.5um)，5ml 1％CaCl2溶液，2ml上清液待测样品，再加蒸馏水至100ml，调pH值至7.0，然后倒入150ml烧杯，在磁力搅拌器上快速搅拌1min，慢速搅拌3min，静置10min，吸取一定深度的上清液于550nm处测定吸光度，同时以不加含絮凝剂的上清液作对照，计算絮凝率(刘国祥等，安全与环境学报，2006,6(1):103-106)。
絮凝率＝(A-B)/A×100％
式中A为对照上清液在550nm处的吸光度，B为样品上清液在550nm处的吸光度。
实施例1
絮凝剂产生菌的分离
样品为采自浙江温州西片污水处理厂的活性污泥，将1g活性污泥加入99ml无菌水混匀，然后用无菌水稀释成重量(g)体积(ml)比为10-4、10-5、10-6三个稀释，涂布接种于LB平板，于35℃下培养48h后挑取单菌落在LB平板上划线纯化，直至经镜检为纯培养物为止，然后转接于LB斜面经培养后于4℃下保藏。
将分离获得的纯菌株分别接种于产絮凝剂培养基(葡萄糖20g、K2HPO45g、KH2PO42g、(NH4)2SO40.2g、NaCl 0.1g、尿素0.5g、酵母膏0.5g、MgSO40.2g、H2O1000ml、pH7.5)中，在35℃、160rpm下振荡培养72h，于8000rpm下离心10min得上清液，测定上清液对高岭土悬浊液的絮凝活性，筛选产絮凝活性高的菌株。对产絮凝活性超过70％的菌株进行10代传代培养，以检测其产絮凝活性的稳定性。
经初筛、复筛并传代试验，获得1株产絮凝活性达80.80％并稳定的菌株，该菌株菌体杆状、具荚膜和芽孢、革兰氏阳性(见图1)，初步鉴定为芽孢杆菌，编为Bacillus sp.WZ01。
实施例2
Bacillus sp.WZ01的复合诱变
将实施例1获得的菌株Bacillus sp.WZ01接入装有50ml LB培养基的250ml锥形瓶内，在35℃、150rpm下振荡培养24h进行活化，然后按5％的体积比转接于装有50ml LB培养基的250ml锥形瓶内，在35℃、150rpm下振荡培养至对数期(约18h)。取50ml菌液在5000rpm下离心10min，菌体用生理盐水洗涤2次后，用生理盐水制成108个·ml-1左右的菌悬液。取15ml菌悬液于平皿中进行紫外线诱变。采用功率为15W UV紫外灯，照射距离为20cm，照射时间为18min。取5ml经紫外光照射后菌悬液接种于用黑纸包裹的装有50ml LB培养基的250ml锥形瓶中，在40℃、150rpm下振荡培养4-6h。
将培养4-6h的菌液在5000rpm下离心10min，菌体用pH6.0的磷酸缓冲液洗涤2次后，用pH6.0的磷酸缓冲液制成108个·ml-1左右的菌悬液。取1ml菌悬液于试管中，加1mg·ml-1NTG(用pH6.0的磷酸缓冲液配制)1ml，使NTG终浓度为500μg·ml-1，混匀后置22℃水浴保温30min，并不断摇动试管，然后离心弃上清液终止反应，用LB培养液稀释20倍，22℃水浴过夜，取1滴菌液涂布于LB平板于40℃下培养后挑去单菌落，特别注意挑取生长快、与原始菌株的菌落形态比较有所改变的单菌落。将单菌落在LB平板上划线纯化直至为纯培养物后，转接于LB斜面经培养后于4℃下保藏。
将获得的纯菌株分别接种于产絮凝剂培养基(葡萄糖20g、K2HPO45g、KH2PO42g、(NH4)2SO40.2g、NaCl0.1g、尿素0.5g、酵母膏0.5g、MgSO40.2g、H2O 1000ml、pH7.5)中，在40℃、150rpm下振荡培养72h，于8000rpm下离心10min得上清液，测定上清液对高岭土悬浊液的絮凝活性；剩余上清液中加3-4倍体积的预冷乙醇，4℃下放置过夜，10000rpm离心10min得沉淀，用乙醇洗涤沉淀2次后真空干燥得絮凝剂粗品，称重，计算絮凝剂产量；筛选产絮凝活性和絮凝剂产量高的菌株。对产絮凝活性和絮凝剂产量较原始菌株提高10％以上的菌株进行10代传代培养，以检测其产絮凝活性和絮凝剂产量的稳定性。经筛选并传代试验，获得1株产絮凝活性为93.27％、絮凝剂产量达7.025g·L-1并稳定的菌株，较原始菌株产絮凝活性提高13.37％，絮凝剂产量提高19.53％，编为Bacillus sp.WZY01。
Bacillus sp.WZY01已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏中心登记入册编号为CGMCC NO.9143，保藏起始日期为2014年05月12日。
实施例3
产絮凝剂培养基培养Bacillus sp.WZY01产絮凝剂
将保藏菌株Bacillus sp.WZY01接种于装有100ml LB培养基的500ml锥形瓶中，于40℃、160rpm下培养24h。然后按5％的体积比分别接种于装有100ml产絮凝剂培养基的500ml锥形瓶中，分别于30、35℃、40℃、45℃和50℃下培养72h，摇床转速均为160rpm。培养结束后将发酵液在8000rpm下离心10min后得上清液，测定上清液的絮凝活性。剩余上清液中加3-4倍体积的预冷乙醇，4℃下放置过夜，10000rpm离心10min得沉淀，用乙醇洗涤沉淀2次后真空干燥得絮凝剂粗品，称重，计算絮凝剂产量，结果如表1所示。
产絮凝剂培养基的组成：葡萄糖20g、K2HPO45g、KH2PO42g、(NH4)2SO40.2g、NaCl 0.1g、尿素0.5g、酵母膏0.5g、MgSO40.2g、H2O 1000ml、pH7.5。
由表1看出，Bacillus sp.WZY01在产絮凝剂培养基中产絮凝活性的适宜温度为35-45℃，最适宜温度为40℃。
表1不同温度下Bacillus sp.WZY01产絮活性比较
温度/℃ 絮凝率/％ 絮凝剂产量/g·L-1
30 80.95 5.752
35 91.87 6.902
40 95.42 7.231
45 94.52 7.162
50 75.33 5.382
实施例4
豆制品废水、味精废水及复合废水培养Bacillus sp.WZY01产絮凝剂
豆制品废水取自温州市菜篮子有限公司豆制品厂，经检测：COD 17537.68mg·L-1、NH4 +-N 88.79mg·L-1，pH 4.89-5.10。味精废水(除菌体蛋白尾液)取自温州快鹿味精厂，经检测：COD 23875.56mg·L-1、NH4 +-N 21180.01mg·L-1、SO4 2-57294.6mg·L-1、pH 4.0-4.3。
将保藏菌株Bacillus sp.WZY01接种于装有100ml LB培养基的500ml锥形瓶中，于40℃、160rpm下培养24h，然后按5％的体积比分别接种于装有100ml豆制品废水培养基、味精废水培养基以及豆制品和味精复合废水培养基的500ml锥形瓶中，于40℃、160rpm下培养72h。将发酵液在8000rpm下离心10min后得上清液，测定上清液的絮凝活性。剩余上清液中加3-4倍体积的预冷乙醇，4℃下放置过夜，10000rpm离心10min得沉淀，用乙醇洗涤沉淀2次后真空干燥得絮凝剂粗品，称重，计算絮凝剂产量。结果见表2，
由表2看出，豆制品和味精复合废水培养Bacillus sp.WZY01与单纯豆制品废水比较，絮凝率提高20.70％，絮凝剂产量提高20.84％；与单纯味精废水比较，絮凝率提高10.87％，絮凝剂产量提高10.85％。与在相同温度下在产絮凝剂培养基中的产絮凝活性比较(见实施例3)，在豆制品与味精复合废水培养基中，絮凝率降低12.30％，絮凝剂产量降低16.37％。
豆制品废水培养基组成为：豆制品废水700ml、水300ml、pH 7.0。味精废水培养基组成为：味精废水300ml、水700ml、pH 7.0。豆制品和味精复合废水培养基组成：豆制品废水300ml、味精废水300ml、水400ml、pH 7.0。
表2Bacillus sp.WZY01在不同废水培养基中产絮活性比较
废水类型 絮凝率/％ 絮凝剂产量/g·L-1
豆制品废水 66.36 4.787
味精废水 74.58 5.391
豆制品和味精复合废水 83.68 6.047
实施例5
复合废水培养Bacillus sp.WZY01产絮凝剂的条件优化
采用单因子试验法，研究豆制品和味精复合废水培养Bacillus sp.WZY01产絮凝剂的条件优化。
实验过程为：将保藏菌株Bacillus sp.WZY01接种于装有100ml LB培养基的500mL锥形瓶中，在40℃、150rpm下培养24h得种子，按5％体积比的接种量转接于装有100ml复合废水培养基(碳源0-10g、氮源0-5g、豆制品废水100-500ml、K2HPO40-8g、味精废水500-100ml、水400ml、pH 5.0-10.0)的500ml锥形瓶中，于一定温度(30-50℃)、150rpm下培养72h，将发酵液在8000rpm下离心10min后得上清液，测定上清液的絮凝活性。剩余上清液中加3-4倍体积的预冷乙醇，4℃下放置过夜，10000rpm离心10min得沉淀，用乙醇洗涤沉淀2次后真空干燥得絮凝剂粗品，称重，计算絮凝剂产量。
豆制品废水与味精废水的比例、碳源添加量和种类、氮源添加量和种类、磷源、温度、pH对Bacillus sp.WZY01产絮凝剂的影响的结果如表3-表8所示。
1、豆制品废水和味精废水比例对Bacillus sp.WZY01产絮凝剂的影响
复合废水的总量为600ml·L-1，豆制品废水和味精废水的量均为100-500ml·L-1，种子按5％体积比的接种量转接于装有100ml复合废水培养基(豆制品废水100-500ml、味精废水500-100ml、水400ml、pH 7.0)的500mL锥形瓶中，于温度40℃，150rpm下培养72h，测定絮凝率和絮凝剂产量，结果见表3。
由表3可知，豆制品废水的适宜量为300-400ml·L-1，味精废水的适宜量为300-200ml·L-1。
表3豆制品废水和味精废水比例对Bacillus sp.WZY01产絮活性的影响
2、碳源对Bacillus sp.WZY01产絮凝剂的影响
种子按5％体积比的接种量转接于装有100ml复合废水培养基(碳源10g、豆制品废水400ml、味精废水200ml、水400ml、pH 7.0)的500mL锥形瓶中，于温度40℃，150rpm下培养72h，测定絮凝率和絮凝剂产量，结果见表4。
由表4可知，在复合废水中加入10g·L-1的不同碳源后，除了加葡萄糖后絮凝率和絮凝剂产量提高5％左右之外，其他糖的加入对絮凝率和絮凝剂产量没有明显的提高，说明复合废水的碳源已基本能满足Bacillus sp.WZY01的生长和产絮凝剂的要求。
表4碳源对Bacillus sp.WZY01产絮活性的影响
碳源 絮凝率/％ 絮凝剂产量/g·L-1
对照(不加碳源) 86.03 6.154
葡萄糖 90.51 6.464
蔗糖 85.84 6.058
乳糖 86.12 6.127
淀粉 85.63 6.108
3、氮源对Bacillus sp.WZY01产絮凝剂的影响
种子按5％体积比的接种量转接于装有100ml复合废水培养基(氮源5g、豆制品废水400ml、味精废水200ml、水400ml、pH 7.0)的500ml锥形瓶中，于温度40℃、150rpm下培养72h，测定絮凝率和絮凝剂产量，结果见表5。
由表5可知，在复合废水中加入5g·L-1牛肉膏、蛋白胨和酵母粉后，其絮凝率和絮凝剂产量均下降10％左右，而加入5g·L-1(NH4)2SO4、KNO3和尿素后，其絮凝率和絮凝剂产量没有显著变化，说明复合废水的氮源已能满足Bacillus sp.WZY01的生长和产絮凝剂的要求。
表5氮源对Bacillus sp.WZY01产絮活性的影响
氮源 絮凝率/％ 絮凝剂产量/g·L-1
对照(不加氮源) 85.71 6.104
牛肉膏 77.29 5.481
蛋白胨 76.84 5.328
酵母粉 78.02 5.464
(NH4)2SO4 85.21 6.085
KNO3 86.23 6.201
尿素 85.46 6.098
4、磷源对Bacillus sp.WZY01产絮凝剂的影响
种子按5％体积比的接种量转接于装有100ml复合废水培养基(K2HPO40-8g、豆制品废水400ml、味精废液200ml、水400ml、pH 7.0)的500ml锥形瓶中，于温度40℃、150rpm下培养72h，测定絮凝率和絮凝剂产量，结果见表6。
由表6可知，在复合废水中加入1-4g·L-1的K2HPO4后，其絮凝率和絮凝剂产量均有所提高，其中以2g·L-1为最适宜，其絮凝率和絮凝剂产量均提高10％左右；而K2HPO4超过4g·L-1时，其絮凝率和絮凝剂产量开始下降。
表6磷源对Bacillus sp.WZY01产絮活性的影响
K2HPO4/g·L-1 絮凝率/％ 絮凝剂产量/g·L-1
0 85.94 6.134
1 90.34 6.439
2 94.08 6.694
4 92.99 6.638
6 85.21 6.085
8 77.20 5.621
5、pH对Bacillus sp.WZY01产絮凝剂的影响
种子按5％体积比的接种量转接于装有100ml复合废水培养基(K2HPO42g、豆制品废水400ml、味精废水200ml、水400ml、pH 4.0-10.0)的500ml锥形瓶中，于温度40℃、150rpm下培养72h，测定絮凝率和絮凝剂产量，结果见表7。
由表7可知，当复合废水培养基的pH<7.0或pH>9.0时，絮凝活性和絮凝剂产量均下降，其适宜的pH为7.0-9.0。
表7pH对Bacillus sp.WZY01产絮活性的影响
pH 絮凝率/％ 絮凝剂产量/g·L-1
4.0 35.56 2.536
5.0 60.58 4.251
6.0 79.87 5.669
7.0 94.21 6.701
8.0 95.13 6.885
9.0 93.24 6.621
10.0 80.12 5.689
6、温度对Bacillus sp.WZY01产絮凝剂的影响
种子按5％体积比的接种量转接于装有100ml复合废水培养基(K2HPO42g、豆制品废水400、味精废水200ml、水400ml、pH 7.0)的500ml锥形瓶中，于30-50℃、150rpm下培养72h，测定絮凝率和絮凝剂产量，结果见表8。
由表8可知，当温度<35℃或温度>45℃时，其絮凝率和絮凝剂产率均下降，其适宜的温度为35-45℃。
表8温度对Bacillus sp.WZY01产絮活性的影响
温度/℃ 絮凝率/％ 絮凝剂产量/g·L-1
30 75.23 5.806
35 94.87 6.702
40 95.42 6.831
45 91.54 6.691
50 73.69 5.262
实施例6
溶氧对Bacillus sp.WZY01产絮凝剂的影响
将保藏菌株Bacillus sp.WZY01接种于装有150ml LB培养基的500ml锥形瓶中，在40℃、160rpm下培养24h得种子，种子按5％体积比的接种量转接于装有3L复合废水培养基(K2HPO42g、豆制品废水400ml、味精废水200ml、水400ml、pH7.0)的5L发酵罐中，于40℃、转速400rpm、通气量5L·min-1下培养至对数期末期(约24h)，调节通气量和搅拌速度使稳定期维持不同的氧饱和度，发酵72h后放罐，测定絮凝率和絮凝剂产量，结果见表9。
由表9可以看出，稳定期维持30-60％的氧饱和度有利于产生絮凝剂。
表9溶氧对Bacillus sp.WZY01产絮活性的影响
氧饱和度/％ 絮凝率/％ 絮凝剂产量/g·L-1
0±5 91.21 5.879
30±5 96.73 6.836
60±5 95.68 6.795
90±5 89.45 6.025
实施例7
Bacillus sp.WZY01产絮凝剂的分批补料发酵
将保藏菌株接种于装有150ml LB培养基的500ml锥形瓶中，在40℃、180rpm下培养24h得一级种子。一级种子按5％体积比的接种量转接于装有3L复合废水培养基(K2HPO42g、豆制品废水400ml、味精废水200ml、水400ml、pH 7.0)的5L发酵罐中，于40℃、转速400rpm、通气量5L·min-1下培养24h得二级种子。二级种子按10％体积比的接种量转接于装有30L复合废水培养基的50L发酵罐中，在300rpm、通气量10L·min-1下培养至对数期末期(约24h)，调节通气量和搅拌速度使稳定期维持30-60％的氧饱和度，同时至对数期末期补加10g·L-1葡萄糖，发酵过程定时取样测定生物量(OD680)、COD、NH4 +-N、絮凝率和絮凝剂产量，结果见图2。COD测定采用重铬酸钾氧化法，NH4 +-N测定采用纳氏比色法。
由图2可知，发酵48h后，絮凝率和絮凝剂产量均达到稳定，分别为96.98％和8.689g·L-1，絮凝剂的产率为0.362g·L-1h-1。絮凝剂形成与菌体生长是不同步的，在菌体生长进入对数期末期之后才逐渐形成絮凝剂。NH4 +-N由40.717g·L-1下降至19.236g·L-1，下降21.479g·L-1；COD下降12.531g·L-1。对数期末期流加10g·L-1葡萄糖后，絮凝剂产量提高21.25％。
实施例8
絮凝剂成分鉴定
按实施例7分批补料发酵得到发酵液，经旋转蒸发仪浓缩后，用3-4倍体积的预冷乙醇沉淀絮凝剂，6000rpm离心10min得絮凝剂沉淀，经预冷乙醇洗涤2次后进行冷冻干燥，制得絮凝剂粗品。
用无菌水溶解配制成浓度为3g·L-1的絮凝剂溶液，分别进行红外和紫外光谱分析，结果见图3、图4。
由图3可知，在2900cm-1左右有一特征吸收峰，这是C-H键不对称伸缩振动的结果，此区域的吸收峰是糖类的特征吸收峰；1636cm-1左右的吸收峰则是多糖羧基-COO-的表现；而3436cm-1处的宽吸收峰是分子内-OH伸缩振动所导致的；同时1200-1000cm-1之间的多个吸收峰是多糖环中醚的C-O特征吸收峰；1380cm-1左右的吸收峰是羧基-COO-中C＝O的吸收峰。从图3红外光谱分析结果看出，絮凝剂的活性成份为多糖。
由图4可知，在波长范围为200-400nm内，紫外扫描图大致为一条光滑的曲线，在280nm(蛋白质吸收峰)和260nm(核酸吸收峰)没有特征吸收峰，说明絮凝剂中几乎没有核酸和多肽或蛋白质成份。
实施例9
絮凝剂改善污水厂浓缩污泥脱水性能试验
絮凝剂沉降性能测定：将冷冻干燥后的絮凝剂粗品配制成3％的溶液，在装有50ml浓缩污泥的100ml量筒中加入0-4ml的絮凝剂溶液和2.5ml 1％CaCl2溶液，调pH至中性，搅拌1min后静置30min，测量底部沉淀污泥(即泥水混合液)的体积(赵鑫鑫等，工业水处理，2008，28(11):24-26)，用以表征絮凝剂的适宜投加量，结果见表10。由表10可知，3％絮凝剂溶液的适宜添加量为1-2ml。
表10絮凝剂投加量对底泥体积的影响
污泥脱水率的测定：量取50ml的浓缩污泥于100ml烧杯中，将烧杯置于恒温磁力搅拌器上调节浓缩污泥的温度为12-40℃，边搅拌边加入1ml 3％絮凝剂溶液和2.5ml 1％CaCL2溶液，并调pH4.0-10.0，然后快速搅拌3min(150rpm),慢速搅拌6min(50rpm)、静置5min，然后在4000rpm下离心去上清液得脱水污泥，计算脱水率，以相同条件下不投加絮凝剂的浓缩污泥的脱水率为对照。脱水率/％＝(脱水前污泥质量-脱水后污泥质量)/脱水前污泥质量。
污泥含水率的测定：取少量的污泥于表面皿中，于102℃下烘干至恒重，置干燥器中冷却后称重，计算污泥的含水率，以相同条件下不投加絮凝剂的污泥的含水量为对照。含水率/％＝(烘干前污泥质量-烘干后污泥质量)/烘干前污泥质量。
表11为浓缩污泥的pH为自然pH值(6.2-7.0)，调节浓缩污泥的温度为15-40℃，加入絮凝剂后对浓缩污泥脱水率和含水率影响的测定结果。由表可知，无论哪一温度，投加絮凝剂后，污泥脱水率增加9.09-11.21％，污泥含水量减少8.89-11.16％；最适宜的温度为20-35℃。
表11不同温度下絮凝剂对浓缩污泥脱水率和含水率的影响
表12为浓缩污泥温度为30℃，调活性污泥的pH为5.0-10.0，加入絮凝剂后对浓缩污泥脱水率和含水率影响的测定结果。
由表12看出，絮凝剂改善浓缩污泥的适宜pH为6.0-8.0。
表12不同pH下絮凝剂对浓缩污泥脱水率和含水率的影响
pH 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0
污泥脱水率/％ 65.12 79.86 82.31 81.57 71.98 61.08
污泥含水率/％ 84.23 74.98 72.74 74.69 80.28 87.31
实施例10
絮凝剂去除米氏凯伦藻试验
米氏凯伦藻培养：将米氏凯伦藻藻种按10％体积比接种于F/2培养基中，在温度25±1℃、光强度100μmol·m-2s-1、光照黑暗比12h:12h的条件下培养至对数生长期末期。
F/2培养基配方：NaNO375mg、NaH2PO4·H2O 5mg、Na2SiO3·9H2O 20mg、Na2EDTA4.36mg、FeCl3·6H2O 3.16mg、CuSO4·5H2O 0.01mg、ZnSO4·7H2O 0.023mg、CoCl2·6H2O0.012mg、MnCl2·4H2O 0.18mg、Na2MoO4·2H2O 0.07mg、维生素B10.1g、维生素B120.5g、生物素0.5g、自然海水(0.4μm孔径滤膜过滤)1000ml。
去除率测定：取39ml米氏凯伦藻培养液于烧杯内，加入10ml一定浓度的絮凝剂溶液，1ml 1％的CaCl2溶液，混匀后用NaOH和HCl溶液调pH至8.0左右，然后倒于50ml比色管中，在常温下静置2h，从上层取约10ml藻样测其叶绿素a的含量，以未加入絮凝剂的藻样为参比计算去除率，去除率(％)＝(对照组叶绿素a含量-实验组叶绿素a含量)/对照组叶绿素a含量×100％。
表13为不同浓度絮凝剂对米氏凯伦藻的去除效果的试验结果，由表中可知，絮凝剂对米氏凯伦藻有去除效果，其适宜的絮凝剂浓度(质量体积比，g:ml)为0.4-0.6％。
表13絮凝剂浓度对米氏凯伦藻去除率的影响
絮凝剂浓度/％ 0.0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2
去除率/％ 15.16 39.52 63.28 79.95 80.34 65.31 58.12 45.63
表14为絮凝剂浓度为0.5％，调节不同pH对米氏凯伦藻的去除效果的试验结果，由表可知，絮凝剂去除米氏凯伦藻适宜的pH为7.5-8.5。
表14pH对米氏凯伦藻去除率的影响
pH 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5
去除率/％ 31.57 67.69 79.02 80.59 81.13 70.98 45.91
实施例11
絮凝剂去除塔玛亚历山大藻试验
塔马亚历山大藻培养：将塔马亚历山大藻藻种按10％体积比接种于F/2培养基中，在温度25±1℃、光强度100μmol·m-2s-1、光照黑暗比12h:12h的条件下培养至对数生长期末期。
F/2培养基配方同实施例10。
去除率测定：取39ml塔马亚历山大藻培养液于烧杯内，加入10ml一定浓度的絮凝剂溶液，1ml 1％的CaCl2溶液，混匀后用NaOH和HCl溶液调pH至8.0左右，然后倒于50ml比色管中，在常温下静置2h，从上层取约10ml藻样测其叶绿素a的含量，以未加入絮凝剂的藻样为参比计算去除率，去除率(％)＝(对照组叶绿素a含量-实验组叶绿素a含量)/对照组叶绿素a含量×100％。
表15为不同浓度絮凝剂对塔马亚历山大藻的去除效果的试验结果，由表中可知，絮凝剂对塔马亚历山大藻有去除效果，其适宜的絮凝剂浓度为0.4-0.6％(质量体积比，g:ml)。
表15絮凝剂浓度对塔马亚历山大藻去除率的影响
絮凝剂浓度/％ 0.0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2
去除率/％ 21.37 45.23 71.35 85.14 83.69 75.33 68.21 51.99
表16为絮凝剂浓度为0.5％，调节不同pH对塔马亚历山大藻的去除效果的试验结果，由表可知，絮凝剂去除塔马亚历山大藻适宜的pH为7.5-8.5。
表16pH对塔马亚历山大藻去除率的影响
pH 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5
去除率/％ 39.65 69.78 83.65 86.07 85.64 72.98 50.47
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一株芽孢杆菌(Bacillus sp.)，其保藏编号为CGMCC NO.9143。
2.如权利要求1所述的芽孢杆菌Bacillus sp.的用途，其特征在于，用于制备絮凝剂。
3.一种絮凝剂的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(a)将保藏编号为CGMCC NO.9143的芽孢杆菌接种于LB培养基中，培养18-24h得到一级种子液；
任选地(b)将步骤(a)得到的一级种子液在种子培养基中培养18-24h得到二级种子液；
以及(c)将步骤(a)得到的一级种子液或步骤(b)得到的二级种子液接种于发酵培养基中培养得到所述絮凝剂。
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(a)中于35-45℃、150-180rpm的条件下培养；和/或
所述步骤(b)中于35-45℃、通气量5-10L/min、搅拌速度350-450rpm的条件下培养；和/或
所述步骤(c)中于35-45℃的条件下培养。
5.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述种子培养基为废水培养基，pH为7-9，包含以下组分：
豆制品废水和/或味精废水    500-800ml·L-1；
水                         200-500ml·L-1，
其中，所述废水培养基包含豆制品废水和味精废水时，所述豆制品废水的含量为250-500ml·L-1；所述味精废水的含量为150-400ml·L-1。
6.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述发酵培养基为产絮凝剂培养基或废水培养基，
所述废水培养基的pH为7-9，包含以下组分：
豆制品废水和/或味精废水    500-800ml·L-1；
水                       200-500ml·L-1，
其中，所述废水培养基包含豆制品废水和味精废水时，所述豆制品废水的含量为250-500ml·L-1；所述味精废水的含量为150-400ml·L-1。
7.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(c)中，在培养至对数期末期，流加5-15g·L-1的葡萄糖；和/或
所述步骤(c)中，在培养至对数期末期，氧饱和度维持在15-95％。
8.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括采用乙醇沉淀出所述絮凝剂的步骤。
9.一种絮凝剂，其特征在于，采用权利要求3-9任一项所述的方法制备获得。
10.如权利要求9所述的絮凝剂的用途，其特征在于，所述絮凝剂用于：
(i)制备改善浓缩污泥脱水性能的促进剂；或
(ii)去除米氏凯伦藻；或
(iii)去除塔马亚历山大藻。
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