CN104311642A - 一种肽核酸化合物及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于肽核酸领域，公开了一种肽核酸化合物，所述的肽核酸化合物的碱基序列为5’-CACTTACTGGGATAGCGG-3’。所述的一种肽核酸化合物的制备方法，包括下述步骤：（1）将氨基保护的肽核酸单体接到固相载体上；（2）脱除保护基使氨基游离出来；（3）下一个氨基保护的肽核酸单体与载体上的肽核酸的氨基偶合反应生成肽键；（4）重复上述步骤至肽核酸序列合成完成，序列为5’-CACTTACTGGGATAGCGG-3’；（5）将肽核酸序列从固相载体上列接下来，并脱除所有侧链保护基；（6）将上述产物经过凝胶柱分离和反向HPLC纯化，得到最终产物。

Description

一种肽核酸化合物及其制备方法
技术领域
本发明属于化学合成领域，涉及一种肽核酸化合物及其制备方法，具体是涉及一种具有抑制黑色素生成效果的肽核酸化合物及其制备方法。 
背景技术
酪氨酸酶在人体黑色素形成过程中起着关键作用，黑色素细胞内的酪氨酸在酪氨酸酶的作用下转换为多巴，并进一步氧化为多巴醌，多巴醌经过一系列中间产物最终形成真黑色素。通过减少酪氨酸酶的生成或抑制酪氨酸酶的活性实现抑制黑色素生成的效果在皮肤病防治、肿瘤治疗以及美容领域都有着重要的意义。近年来随着分子生物学的发展基因干扰技术为减少酪氨酸酶生成提供了一条可行的途径，其原理是根据碱基互补配对特性将与酪氨酸酶基因片段互补的RNA或肽核酸(PNA)序列引入黑色素细胞，通过引入序列与目标基因片段的特异性结合阻碍酪氨酸酶基因的表达，从而实现减少酪氨酸酶生成进而减少黑色素生成的效果。 
目前所用的干扰序列有RNA和PNA，其中PNA以中性的肽链酰胺2-氨基乙基甘氨酸键取代了DNA中的戊糖磷酸二酯键骨架，不仅可以通过Watson-Crick碱基配对的形式识别并结合DNA或RNA序列，形成稳定的双螺旋结构，又由于其不带负电荷，与DNA和RNA之间不存在静电斥力，结合的稳定性和特异性都大为提高，成为基因干扰治疗中更加安全高效的手段。 
发明内容
要解决的技术问题：本发明提出了一种肽核酸化合物TDS的制备方法及应用，它与黑色素细胞序列中酪氨酸酶的基因序列片段互补，并且与酪氨酸酶基因以外的任何人类已知基因序列无同源性，TDS通过与酪氨酸酶的特异结合达到抑制酪氨酸酶和黑色素生成的效果。 
技术方案：本发明公开了一种肽核酸化合物，其碱基序列为5’-CACTTACTGGGATAGCGG-3’，记为TDS。 
该肽核酸化合物通过以下四种肽核酸单体合成： 
肽核酸序列可通过固相多肽合成法制备，制备方法如下： 
(1)将氨基保护的肽核酸单体接到固相载体上； 
(2)脱除保护基使氨基游离出来； 
(3)下一个氨基保护的肽核酸单体与载体上的肽核酸的氨基偶合反应生成肽键； 
(4)重复上述步骤至肽核酸序列合成完成，序列为5’-CACTTACTGGGATAGCGG-3’； 
(5)将肽核酸序列从固相载体上列接下来，并脱除所有侧链保护基； 
(6)将上述产物经过凝胶柱分离和反向HPLC纯化，得到最终产物。其中肽核酸单体用下列通式表示： 
G为腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶四种碱基中的一种。 
有益效果：经飞行时间质谱鉴定，所得产物的分子量与理论值相符。将培养后的人黑色素瘤细胞株A375加入培养皿中，控制细胞密度为2×104，分别加入终浓度为10、20、30、40、50ppm的TDS，培养24小时后分别测量细胞存活数、细胞酪氨酸酶活性和黑色素含量，并记录其与空白对照组(不加入TDS)结果的百分比值，其结果如下： 
细胞存活数： 
TDS浓度(ppm) 10 20 30 40 50
细胞存活数 97.2±0.8％ 96.8±1.2％ 96.2±1.0％ 95.5±0.9％ 92.7±1.2％
酪氨酸酶活性： 
黑色素生成量： 
TDS浓度(ppm) 10 20 30 40 50
黑色素生成量 81.2±2.7％ 77.6±3.0％ 72.5±2.6％ 65.1±2.3％ 52.6±3.2％
上述结果可以看出，该肽核酸化合物TDS细胞毒性较小，对于细胞酪氨酸酶和黑色素的生成具有明显的抑制作用，在皮肤病防治、肿瘤治疗和美容领域都有潜在的应用前景。该肽核酸序列可以通过多肽固相合成法制备，该方法技术成熟，质量稳定，适合批量化生产。 
附图说明
图1为固相多肽合成制备方法的示意图。 
具体实施方式
下述实施例中HOBt为1-羟基苯并三唑，DCC为二环己基碳二亚胺，DCM为二氯甲烷，DMF为N,N-二甲基甲酰胺，NMP为N-甲基吡咯烷酮，TFA为三氟乙酸，TIS为苯甲硫醚。 
实施例一： 
1.称取100mg固相多肽合成树脂于反应器中，充分洗涤后加入PNA-C 50mg，HOBt 34mg，DCC 51mg，DCM 3mL，DMF 0.5mL，室温下搅拌3h，以DCM和NMP交替洗涤后以25％的TFA/DCM溶液脱保护30分钟后用DCM和NMP交替洗涤树脂。 
2.重复上述操作，将目标PNA序列中的单体按从5’到3’的顺序依次接入。 
3.在反应器中缓慢加入TFA/TIS/H2O＝95/2.5/2.5的溶液，反应3小时后过滤并用氮气吹去大部分的溶剂，先后用无水乙醚和30％乙酸水溶液和洗涤，再用1.5:1的乙腈/水和30％乙酸水溶液交替洗涤，合并洗液，减压蒸馏后冷冻干燥得到粗产物。 
4.将粗产物溶于2-3毫升0.5mol/L的乙酸溶液，滤除不溶物，使用凝胶柱纯化，淋洗液为0.5mol/L乙酸溶液，流速为1mL/min，收集淋洗曲线第一个主峰处的 产物，冷冻干燥。 
5.粗产物经HPLC纯化，色谱柱为C18柱，流动相为：A：0.1％TFA/H2O，B：70％CH3CN/0.1％TFA/H2O，流速为1mL/min，配比梯度按下表所示： 
  A B Curve
初始 100 0  
30min 50 50 6
40min 50 50 6
45min 100 0 6
经过HPLC纯化后得到最终产品。 
实施例二： 
1.称取150mg固相多肽合成树脂于反应器中，充分洗涤后加入PNA-C 50mg，HOBt 34mg，DCC 51mg，DCM 3mL，DMF 0.5mL，40摄氏度下搅拌1h，以DCM和NMP交替洗涤后以25％的TFA/DCM溶液脱保护30分钟后用DCM和NMP交替洗涤树脂。 
2.重复上述操作，将目标PNA序列中的单体按从5’到3’的顺序依次接入。 
3.将反应后的树脂放入氟化氢裂解仪中，加入1滴苯甲醚，将裂解仪抽真空并冷却，加入2mL液态氟化氢，-5℃反应2小时，使用油泵抽除未反应的氟化氢。先后用无水乙醚和30％乙酸水溶液和洗涤，再用1.5:1的乙腈/水和30％乙酸水溶液交替洗涤，合并洗液，减压蒸馏后冷冻干燥得到粗产物。 
4.将粗产物溶于2毫升0.5mol/L的乙酸溶液，滤除不溶物，使用凝胶柱纯化，淋洗液为0.5mol/L乙酸溶液，流速为1mL/min，收集淋洗曲线第一个主峰处的产物，冷冻干燥。 
5.粗产物经HPLC纯化得到最终产品。 
实施例三： 
1.使用自动多肽固相合成仪，按下表设置相关参数，循环反应直至PNA序列完成。 
2.将反应产物取出并转移到裂解容器中，缓慢加入TFA/TIS/H2O＝95/2.5/2.5的溶液，反应3小时后过滤并用氮气吹去大部分的溶剂，先后用无水乙醚和30％乙酸水溶液和洗涤，再用1.5:1的乙腈/水和30％乙酸水溶液交替洗涤，合并洗液，减压蒸馏后冷冻干燥得到粗产物。 
3.将粗产物溶于2-3毫升0.5mol/L的乙酸溶液，滤除不容物，使用凝胶柱纯化，淋洗液为0.5mol/L乙酸溶液，流速为1mL/min，收集淋洗曲线第一个主峰处的产物，冷冻干燥。 
4.粗产物经HPLC纯化得到最终产品。 
实施例四： 
1.使用带有微波反应的自动多肽固相合成仪，按下表设置相关参数，循环反应直至PNA序列完成。 
2.将反应产物取出并转移到裂解容器中，缓慢加入TFA/TIS/H2O＝95/2.5/2.5的溶液，反应3小时后过滤并用氮气吹去大部分的溶剂，先后用无水乙醚和30％乙酸水溶液和洗涤，再用1.5:1的乙腈/水和30％乙酸水溶液交替洗涤，合并洗液，减压蒸馏后冷冻干燥得到粗产物。 
3.将粗产物溶于2-3毫升0.5mol/L的乙酸溶液，滤除不容物，使用凝胶柱纯化，淋洗液为0.5mol/L乙酸溶液，流速为1mL/min，收集淋洗曲线第一个主峰处的产物，冷冻干燥。 
4.粗产物经HPLC纯化得到最终产品。 

Claims (6)

1. 一种肽核酸化合物，其特征在于，所述的肽核酸化合物的碱基序列为5’-CACTTACTGGGATAGCGG-3’。
2. 根据权利要求1所述的一种肽核酸化合物，其特征在于所述的肽核酸化合物由单体构成，所述的单体用下列通式表示：
G为腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶四种碱基中的一种。
3. 根据权利要求1所述的一种肽核酸化合物的制备方法，其特征在于制备方法包括下述步骤：（1）将氨基保护的肽核酸单体接到固相载体上；
（2）脱除保护基使氨基游离出来；
（3）下一个氨基保护的肽核酸单体与载体上的肽核酸的氨基偶合反应生成肽键；
（4）重复上述步骤至肽核酸序列合成完成，序列为5’-CACTTACTGGGATAGCGG-3’；
（5）将肽核酸序列从固相载体上列接下来，并脱除所有侧链保护基；
（6）将上述产物经过凝胶柱分离和反向HPLC纯化，得到最终产物。
4. 根据权利要求3所述的一种肽核酸化合物的制备方法，其特征在于制备方法包括下述步骤：
（1）称取固相多肽合成树脂于反应器中，充分洗涤后加入PNA-C，HOBt，DCC，DCM，DMF，室温下搅拌，以DCM和NMP交替洗涤后以TFA/DCM 溶液脱保护后用DCM和NMP交替洗涤树脂；
（2）重复上述操作，将目标PNA序列中的单体按从5’到3’的顺序依次接入，序列为5’-CACTTACTGGGATAGCGG-3’；
（3）在反应器中缓慢加入TFA/TIS/H2O=95/2.5/2.5（重量比）的溶液，反应后过滤并用氮气吹去大部分的溶剂，先后用无水乙醚和30%乙酸水溶液洗涤，再用1.5:1的乙腈/水和30%乙酸水溶液交替洗涤，合并洗液，减压蒸馏后冷冻干燥得到粗产物；
（4）将粗产物溶于0.5 mol/L的乙酸溶液，滤除不溶物，使用凝胶柱纯化，，收集淋洗曲线第一个主峰处的产物，冷冻干燥；
（5）粗产物经HPLC纯化，经过HPLC纯化后得到最终产品。
5. 根据权利要求3所述的一种肽核酸化合物的制备方法，其特征在于制备方法包括下述步骤：
（1）称取100mg固相多肽合成树脂于反应器中，充分洗涤后加入PNA-C 50mg，HOBt 34mg，DCC 51mg， DCM 3mL，DMF 0.5mL，室温下搅拌3h，以DCM和NMP交替洗涤后以25%的TFA/DCM 溶液脱保护30分钟后用DCM和NMP交替洗涤树脂；
（2）重复上述操作，将目标PNA序列中的单体按从5’到3’的顺序依次接入，序列为5’-CACTTACTGGGATAGCGG-3’；
（3）在反应器中缓慢加入TFA/TIS/H2O=95/2.5/2.5的溶液，反应3小时后过滤并用氮气吹去大部分的溶剂，先后用无水乙醚和30%乙酸水溶液和洗涤，再用1.5:1的乙腈/水和30%乙酸水溶液交替洗涤，合并洗液，减压蒸馏后冷冻干燥得到粗产物；
（4）将粗产物溶于2-3毫升0.5 mol/L的乙酸溶液，滤除不溶物，使用凝胶柱纯化，淋洗液为0.5 mol/L乙酸溶液，流速为1ml/min，收集淋洗曲线第一个主峰处的产物，冷冻干燥；
（5）粗产物经HPLC纯化，色谱柱为C18柱，流动相为：A：0.1%TFA/H2O，B：70%CH3CN/0.1%TFA/H2O，流速为1mL/min，经过HPLC纯化后得到最终产品。
6. 根据权利要求3所述的一种肽核酸化合物的制备方法，其特征在于制备方法包括下述步骤：（1）称取150mg固相多肽合成树脂于反应器中，充分洗涤后加入PNA-C 50mg，HOBt 34mg，DCC 51mg，DCM 3mL，DMF 0.5mL，40摄氏度下搅拌1h，以DCM和NMP交替洗涤后以25%的TFA/DCM 溶液脱保护30分钟后用DCM和NMP交替洗涤树脂；
（2）重复上述操作，将目标PNA序列中的单体按从5’到3’的顺序依次接入，序列为5’-CACTTACTGGGATAGCGG-3’；
（3）将反应后的树脂放入氟化氢裂解仪中，加入1滴苯甲醚，将裂解仪抽真空并冷却，加入2mL液态氟化氢，-5℃反应2小时，使用油泵抽除未反应的氟化氢；先后用无水乙醚和30%乙酸水溶液和洗涤，再用1.5:1的乙腈/水和30%乙酸水溶液交替洗涤，合并洗液，减压蒸馏后冷冻干燥得到粗产物；
（4）将粗产物溶于2毫升0.5 mol/L的乙酸溶液，滤除不溶物，使用凝胶柱纯化，淋洗液为0.5 mol/L乙酸溶液，流速为1mL/min，收集淋洗曲线第一个主峰处的产物，冷冻干燥；
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