CN104306454B - 莲子心总生物碱制备方法及其医药用途 - Google Patents

莲子心总生物碱制备方法及其医药用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种莲子心总生物碱制备方法及其医药用途，属于莲子心有效部位新的制备方法及其药物用途。以莲子心原料，经过醇冷浸提取、脱脂、酸化除其他成分、碱化通过吸附树脂柱吸附、酸性醇溶液洗脱、重结晶等方法得到一种莲子心总生物碱，其产率1％以上，纯度90％以上。莲子心总生物碱在制备降血脂药物中有着广泛的药物用途。

Description

莲子心总生物碱制备方法及其医药用途
技术领域
本发明涉及莲子心总生物碱制备方法及其在降血脂药物中的应用。
背景技术
莲子心总生物碱是以莲心碱、异莲心碱、甲基莲心碱为主要成分的生物碱混合物。
莲子心系睡莲科植物莲Nelumbo nucifera Gaertn.的成熟种子中的干燥幼叶及胚根。其味苦、寒，归心、肾经，研究表明，莲子心的主要成分为莲心碱、异莲心碱、甲基莲心碱等生物碱及木犀黄酮苷、金丝桃苷、芸香苷等黄酮类。具有降血压、抗心律失常、抑制血小板聚集、抗氧化及清除活性自由基、抗心肌缺血、松弛平滑肌、强心、抗癌、对脑缺血损伤的保护、改善急性肺损伤及肺纤维化、中枢抑制、降血糖、治疗前列腺增生等药理作用。
有文献报道莲子心具有抗肿瘤作用，且抗肿瘤作用的活性部位为总生物碱而非总黄酮和总多糖。对人肝癌细胞HepG2、人胃癌细胞SGC-7901、人乳腺癌细胞MCF-7和人结肠癌细胞RKO的IC50为0.055～0.131mg/mL。据文献报道甲基莲心碱甲基莲心碱具有广泛的提高化疗疗效的作用，且毒副作用较小。
现有莲子心提取物医药用途相关专利5项：《莲子心及其生物碱和其衍生物的新用途》公开号CN103070927A、《莲子心或其提取物的新用途》公开号CN102091131A、《莲子心及其提取物的新用途》C公开号N101862374A、《一种莲子心有效部位提取物及其用途》公开号CN1593598A、《一种莲子心生物碱提取物其制备方法及其在制备心脑血管疾病药物中的应用》公开号CN1670026A。
发明内容
本发明提供一种莲子心总生物碱制备方法及其医药用途。目的利用中药莲子心，经过高度醇浸提，大孔吸附树脂柱分离的方法，制备一种具有较强降血脂活性的莲子心提取物。
本发明涉及的莲子心总生物碱制备方法，包括下列步骤：
提取：将莲子心粉碎为粗粉，用8～12体积倍量75～85％甲醇或乙醇浸提2～3次，每次冷浸48小时，电动搅拌机搅拌2～3小时，转速400～500r/min，过滤，合并滤液，减压回收醇至溶液比重为1.1，得莲子心醇浸提取物水溶液；
分离：取莲子心醇浸提取物水溶液，用弱极性溶剂萃取脱脂，水层用酸溶液调pH＝1～2，静置24h，过滤除去黄酮类化合物等成分，滤液用碱溶液调pH＝10～11，通过大孔吸附树脂柱吸附，水洗除杂，再用pH＝3的70～80％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，调至中性，减压回收乙醇，干燥，得莲子心总生物碱粗品；
纯化：经乙醇重结晶，得莲子心总生物碱；
通过该方法制备的莲子心总生物碱收率>1.0％，纯度>90％。
本发明用于脱脂的弱极性溶剂包括石油醚、乙醚、环己烷。
本发明所述酸溶液采用稀盐酸、稀硫酸或稀磷酸溶液。
本发明所述碱溶液采用NaOH、Na2CO3或KOH碱溶液。
本发明所述大孔吸附树脂柱的型号包括D101、D201、HPD100、D4020或AB8。
本发明制备方法得到的莲子心总生物碱在制备降血脂药物中的应用。
当本发明用于制备降血脂药物，口服或胃肠外给药均是安全的，在口服情况下，其可以任何常规形式给药，如颗粒剂、片剂、胶囊剂、丸剂、糖浆剂、口服溶液剂、口服乳剂等：当该药物肠胃外给药时，可采取任何常规形式，例如注射剂：如静脉内注射、软膏剂、经皮给药、吸入剂等。
本发明制备降血脂药物是由有效成分与固体或液体的赋形剂一起构成的，这里使用的固体或液体的赋形剂在本领域是众所周知的，下面举几个具体例子，散剂是内服的粉末剂，它的赋形剂有乳糖、淀粉、浆糊精、碳酸钙、合成或天然硫酸铝、氧化镁、硬脂酸镁，碳酸氢钠、干燥酵母等；溶液剂的赋形剂有水、甘油、1，2-丙二醇、单糖浆、乙醇、乙二醇、聚乙二醇、山梨糖醇等；软膏剂的赋形剂可以使用脂油，含水羊毛脂、凡士林、甘油、蜂腊、木腊、液体石腊、树脂、高级腊等组合成的疏水剂或亲水剂。
本发明的有益效果在于，莲子心总生物碱可用于制备降血脂药物，具有疗效显著的特点。有效物质的剂量可以根据服用方式，病人的年龄和体重及病情严重程度和其它类似的因素而改变，口服量为：30～50mg/次，每日二次：注射30～50mg/次，每日一次。
具体实施方式
实施例1
提取：将莲子心粉碎为粗粉，用8体积倍量75％甲醇浸提2次，每次冷浸48小时，电动搅拌机搅拌2小时，转速400r/min，过滤，合并滤液，减压回收醇至溶液比重为1.1，得莲子心醇浸提取物水溶液；
分离：取莲子心醇浸提取物水溶液，用石油醚萃取脱脂，水层用稀盐酸溶液调pH＝1，静置24h，过滤除去黄酮类化合物等成分，滤液用NaOH溶液调pH＝10，通过大孔吸附树脂柱D101吸附，水洗除杂，再用pH＝3的70％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，调至中性，减压回收乙醇，干燥，得莲子心总生物碱粗品；
纯化：经乙醇重结晶，得莲子心总生物碱；
通过该方法制备的莲子心总生物碱收率>1.0％，纯度>90％。
实施例2
提取：将莲子心粉碎为粗粉，用10体积倍量80％甲醇浸提3次，每次冷浸48小时，电动搅拌机搅拌2小时，转速450r/min，过滤，合并滤液，减压回收醇至溶液比重为1.1，得莲子心醇浸提取物水溶液；
分离：取莲子心醇浸提取物水溶液，用弱极性溶剂萃取脱脂，水层用稀盐酸调pH＝1.5，静置24h，过滤除去黄酮类化合物等成分，滤液用NaOH溶液调pH＝10.5，通过大孔吸附树脂柱D101吸附，水洗除杂，再用pH＝3的75％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，调至中性，减压回收乙醇，干燥，得莲子心总生物碱粗品；
纯化：经乙醇重结晶，得莲子心总生物碱；
通过该方法制备的莲子心总生物碱收率>1.0％，纯度>90％。
实施例3
提取：将莲子心粉碎为粗粉，用12体积倍量85％甲醇浸提3次，每次冷浸48小时，电动搅拌机搅拌3小时，转速500r/min，过滤，合并滤液，减压回收醇至溶液比重为1.1，得莲子心醇浸提取物水溶液；
分离：取莲子心醇浸提取物水溶液，用弱极性溶剂萃取脱脂，水层用稀盐酸溶液调pH＝2，静置24h，过滤除去黄酮类化合物等成分，滤液用NaOH溶液调pH＝11，通过大孔吸附树脂柱D101吸附，水洗除杂，再用pH＝3的80％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，调至中性，减压回收乙醇，干燥，得莲子心总生物碱粗品；
纯化：经乙醇重结晶，得莲子心总生物碱；
通过该方法制备的莲子心总生物碱收率>1.0％，纯度>90％。
在上述实施例1～3中，还能用乙醇浸提，脱脂的弱极性溶剂还能用乙醚、环己烷，酸溶液采用稀硫酸或稀磷酸溶液，碱溶液采用Na2CO3或KOH碱溶液，大孔吸附树脂柱的型号包括D201、HPD100、D4020或AB8，所进行替换的方式，本领域普通技术人员都可不经创造性劳动完成。
本发明制备方法得到的莲子心总生物碱在制备降血脂药物中的应用。
下边通过降血脂活性试验进一步说明本发明效果。
本试验分别选用小鼠和大鼠复制出与药物作用相关的药理试验动物模型，主要从降低血脂方面对莲子心总生物碱进行药效学方面的试验研究。
1、莲子心总生物碱对高脂血症小鼠血脂含量的影响：
材料与方法
动物
ICR小鼠，72只，雄雌各半，体重18-20g。购自吉林大学基础医学院动物实验中心，动物合格证号：SCXK-(吉)-2003-0001。
药品及试剂
莲子心总生物碱，性状：白色粉末，气微，味苦，批号：20131203，吉林大学再生医学科学研究所提供；血脂康胶囊，规格：300mg/粒，批号20130605，北京北大维信生物科技有限公司生产；胆固醇，规格：生化试剂，25g/瓶，批号：20130516，天津市光复精细化工研究所；胆酸钠，规格：生化试剂，批号：20130525，北京化学试剂公司；猪油，由本研究室提供；血清总胆固醇(TC)含量测定试剂盒，批号：20130501，中生北控生物科技股份有限公司；
甘油三酯(TG)含量测定试剂盒，批号：20131831，中生北控生物科技股份有限公司；高密度脂蛋白胆固醇(HDL–cho)含量测定试剂盒，批号：20130171，中生北控生物科技股份有限公司；低密度脂蛋白胆固醇(LDL–cho)含量测定试剂盒，批号：20130171，中生北控生物科技股份有限公司产品。
仪器
酶标仪，型号：PECAN A-5082，Austria SUNRISE公司产品。
方法
高脂饲料配制方法如下：参照文献[1]，在88.7％的基础饲料中加10％猪油、1％胆固醇和0.3％胆酸钠。将猪油加温溶化，加入胆固醇和胆酸钠，搅拌均匀后倒入饲料中，拌匀，加适量温水拌匀，平铺在方盘中，厚度约1.5cm，用壁纸刀划成2cm×3cm大小的小块，放置80℃恒温干燥箱中烘干。
配药方法：分别根据各组给药剂量、动物体重、给药天数计算出所需要量，精密称定，先加少量蒸馏水，研磨均匀，再加蒸馏水至所需浓度即可。
动物购入后适应环境3天，按体重随机分为：正常对照组；高脂模型组；阳性对照药血脂康胶囊组(240mg/kg)；莲子心总生物碱高剂量组(80mg/kg)、中剂量组(40mg/kg)和低剂量组(20mg/kg)；共6组，每组12只。雌雄各半。
实验过程中，正常对照组动物饲以常规饲料，其他各组动物均饲以高脂饲料。实验动物每天上午灌胃给药1次。灌胃体积均为20ml/kg。正常对照组及高脂模型组动物灌胃蒸馏水，给药组分别给予相应的药物溶液。连续给药2周，最后1次给药当晚，动物禁食不禁水16小时，次日眼球取血0.5ml，离心(3000r/min)分离血清；采用酶比色法测定血清总胆固醇(TC)含量、采用酶比色法测定血清甘油三酯(TG)含量、采用磷钨酸-镁沉淀法测定血清高密度脂蛋白胆固醇(HDL-cho)含量、采用聚乙烯硫酸沉淀法测定血清低密度脂蛋白胆固醇(LDL-cho)含量。指标数据以均数加减标准差表示，统计学处理方法采用组间t-检验。
结果与讨论
实验结果表明，小鼠在连续饲以高脂饲料造模2周后，模型组动物的血清TC、TG、LDL-cho含量均较正常对照组明显升高，TC含量正常对照组为3.38±0.51mmol/L，模型组为6.99±0.90mmol/L(P<0.01)；TG含量正常对照组为0.71±0.21mmol/L，模型组为0.87±0.22mmol/L(P<0.05)；LDL-cho含量正常对照组为0.31±0.29mmol/L，模型组为1.96±1.11mmol/L(P<0.01)；模型组动物的血清HDL-cho含量明显降低，正常对照组为4.10±1.71mmol/L，模型组为2.52±0.83mmol/L(P<0.05)；模型组动物的血清TC与HDL-cho含量的比值(TC/HDL-cho)明显升高，正常对照组为0.95±0.25，模型组为3.06±1.62(P<0.01)；结果表明高血脂症动物模型已形成。
给药两周后，莲子心总生物碱80mg/kg给药剂量组动物血清TC含量(5.35±0.76mmol/L)均明显低于高脂模型组(6.99±0.90mmol/L)(P<0.01)；给药组动物血清TG含量(0.49±0.14mmol/L)也较高脂模型组(0.87±0.22mmol/L)明显降低(P<0.01)；给药组动物血清HDL-cho含量(3.86±1.01mmol/L)较模型组(2.52±0.83mmol/L)明显升高，相应的给药组动物血清TC与HDL-cho含量的比值(1.53±0.41)也较模型组(3.06±1.62)降低(P<0.05)。
莲子心总生物碱40mg/kg给药剂量组动物血清TC、TG、LDL-cho、HDL-cho含量及TC/HDL-cho比值与模型组动物相比无显著差别；莲子心总生物碱20mg/kg给药剂量组动物血清TC、TG、LDL-cho、HDL-cho含量及TC/HDL-cho比值与模型组动物相比也无显著差别。
上述试验结果表明，莲子心总生物碱可明显降低高脂模型小鼠血清TC含量，升高血清HDL-cho含量，并使血清TC与HDL-cho含量的比值(TC/HDL-cho)也随之降低。
各组动物TC、TG、LDL-cho、HDL-cho含量及TC/HDL-cho比值见表1。
2、莲子心总生物碱对高脂血症大鼠血脂含量的影响：
材料与方法
动物Wistar大鼠，雄性,72只，体重170g～210g。购自吉林大学基础医学动物中心，动物合格证号：SCXK-(吉)-2003-0001。
药品及试剂
莲子心总生物碱，性状：白色粉末，气微，味苦，批号：20131203，吉林大学再生医学科学研究所提供；血脂康胶囊，规格：300mg/粒，批号20130605，北京北大维信生物科技有限公司生产；胆固醇，规格：生化试剂，25g/瓶，批号：20130516，天津市光复精细化工研究所；胆酸钠，规格：生化试剂，批号：20130525，北京化学试剂公司；猪油，由本研究室提供；血清总胆固醇(TC)含量测定试剂盒，批号：20130501，中生北控生物科技股份有限公司；甘油三酯(TG)含量测定试剂盒，批号：201391831，中生北控生物科技股份有限公司；高密度脂蛋白胆固醇(HDL–cho)含量测定试剂盒，批号：20130171，中生北控生物科技股份有限公司；低密度脂蛋白胆固醇(LDL–cho)含量测定试剂盒，批号：20130171，中生北控生物科技股份有限公司产品。
仪器：
酶标仪，型号：PECAN A-5082，Austria SUNRISE公司产品。
方法：
高脂饲料配制方法如下：参照文献(李仪奎，王钦茂，周金黄.中药药理实验方法学，上海：上海科学技术出版社，1991,6：398)，在88.7％的基础饲料中加10％猪油、1％胆固醇和0.3％胆酸钠。将猪油加温溶化，加入胆固醇和胆酸钠，搅拌均匀后倒入饲料中，拌匀，加适量温水拌匀，平铺在方盘中，厚度约1.5cm，用壁纸刀划成2cm×3cm大小的小块，放置80℃恒温干燥箱中烘干。
配药方法：分别根据各组给药剂量、动物体重、给药天数计算出所需要量，精密称定，先加少量蒸馏水，研磨均匀，再加蒸馏水至所需浓度即可。
动物购入后，先饲养观察，使其适应环境1周。动物剪尾取血，测TC；TG；HDL–cho和LDL–cho含量，根据血脂水平随机分为：正常对照组；高脂模型组；阳性对照药血脂康胶囊120mg/kg组；莲子心总生物碱设40mg/kg、20mg/kg和10mg/kg三个给药剂量组。共6组,每组12只。除第1组动物饲以常规饲料，作为正常对照外；其余2～6组均饲以高胆固醇饲料,投食量为：25g/鼠/天。各组动物每天ig给药一次，ig体积为10ml/kg；正常对照和高脂模型组动物每天灌胃等容量蒸馏水；连续给药2周。于末给药后，禁食(不禁水)16小时，剪尾取血，分离血清，测定血清总胆固醇(TC)甘油三酯(TG)；高密度脂蛋白胆固醇(HDL–cho)；低密度脂蛋白胆固醇(LDL–cho)含量和TC/HDL-cho比值。继续给药至第4周。于最后1次给药后，动物禁食(不禁水)16小时，剪尾取血，分离血清，同样测上述各项指标。所列数据以均数加减标准差表示；统计学处理方法采用组间t-检验。
结果与讨论
试验前，各组动物的血脂水平比较均匀，组间分布无明显性差异(P>0.05)。饲以高脂饲料2周后，模型组动物的血清TC、TG含量较正常对照组明显升高(均为P<0.01，P<0.05)，HDL-cho含量较正常对照组明显降低(P<0.05)，TC/HDL-cho较正常对照组明显降低(P<0.001)。说明此时高脂血症动物模型已经形成。莲子心总生物碱所设的三个给药剂量组中，40mg/kg剂量组动物血清TC含量明显低于高脂模型组(P<0.05)，20mg/kg和10mg/kg剂量组TC/HDL-cho较模型组明显降低(P<0.01)。继续饲以高脂饲料至第4周，40mg/kg、20mg/kg和10mg/kg三个剂量组动物的血清TC含量均明显低于高脂模型组(P<0.001、P<0.01和P<0.05)，40mg/kg和20mg/kg两个剂量组动物的血清TG含量均明显低于高脂模型组(P<0.05)。40mg/kg剂量组动物的血清HDL-cho含量明显高于高脂模型组(P<0.05)。相应的40mg/kg、20mg/kg和10mg/kg三个剂量组动物的血清TC/HDL-cho比值明显降低(P<0.001，P<0.01)。上述试验结果表明，莲子心总生物碱预防性给药4周，可明显抑制大鼠高脂血症的形成，可明显降低TC和TG含量，提高HDL-cho含量，使TC与HDL-cho含量的比值也随之降低。详细结果见表2～表4。

Claims (1)

1.一种莲子心总生物碱制备方法，其特征在于包括下列步骤：
提取：将莲子心粉碎为粗粉，用8～12体积倍量75～85％甲醇或乙醇浸提2～3次，每次冷浸48小时，电动搅拌机搅拌2～3小时，转速400～500r/min，过滤，合并滤液，减压回收醇至溶液比重为1.1，得莲子心醇浸提取物水溶液；
分离：取莲子心醇浸提取物水溶液，用石油醚剂萃取脱脂，水层用稀盐酸溶液调pH＝1～2，静置24h，过滤除去黄酮类化合物等成分，滤液用NaOH溶液调pH＝10～11，通过大孔吸附树脂柱吸附，所述大孔吸附树脂柱的型号是AB8，水洗除杂，再用pH＝3的70～80％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，调至中性，减压回收乙醇，干燥，得莲子心总生物碱粗品；
纯化：经乙醇重结晶，得莲子心总生物碱。
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