CN104303637B - 一种促进东方百合杂交种子萌发的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种促进东方百合杂交种子萌发的方法。本发明提供了一种促进百合杂交种子萌发的方法，包括如下步骤：1)将百合杂交种子的胚剪切去除其周围的胚乳和翅得到剩余部分的胚；2)培养所述剩余部分的胚，实现促进百合杂交种子萌发；本发明对加速东方百合育种过程提供了技术参考，对百合种子组培快繁具有一定的参考意义。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种促进东方百合杂交种子萌发的方法。
背景技术
百合(Lilium spp.)属多年生球根类植物，是国内外著名的观赏花卉。现在市场流行的四大类百合中东方百合所占栽培比例最大，属于百合杂种系中花朵最大最美丽的一个品种群。东方百合生产中的常规分球、分珠芽、鳞片扦插、鳞片包埋等繁殖方法，繁殖量较小，易造成种苗退化。百合生长周期较长，从种子到开花需2-3年的时间。组织培养不仅缩短百合生长周期、大大提高繁殖系数，还解决了种苗退化、带病毒多的问题。东方百合杂交种子自然萌发时间少则需30d，多则90-110d，容易引起种子发霉腐烂，且发芽不整齐、萌发率极低，制约着百合产业化发展的进程。常规采用的胚拯救方法，多为授粉60d后陆续有白色胚根长出，不仅操作繁琐，且对处理时期要求严格。
发明内容
为缩短百合杂交种子萌发时间，提高种子萌发力，使其出苗整齐，本发明提供一种促进百合杂交种子萌发的方法。
本发明提供的方法，包括如下步骤：
1)将百合杂交种子的胚剪切去除其周围的胚乳和翅得到剩余部分的胚；
2)培养所述剩余部分的胚，实现促进百合杂交种子萌发；
上述方法中，步骤2)中，所述培养所需的培养基为含有蔗糖的萌发培养基；
所述含有蔗糖的萌发培养基中的蔗糖终浓度为20-40g/l。
上述培养条件是光强1000-1200lx，光照时间12h，温度控制在(25±1)℃之间。
上述方法中，所述含有蔗糖的萌发培养基按照包括如下步骤的方法制备：将蔗糖、凝固剂、MS粉和水混合，得到萌发培养基，所述蔗糖在所述萌发培养基中的终浓度为20g/l、30g/l或40g/l，所述凝固剂在所述萌发培养基中的终浓度为9g/l；所述MS粉在所述萌发培养基中的终浓度为4.43g/l；
所述凝固剂具体为琼脂。
上述MS粉由具有如下质量份数的物质组成：1650质量份数NH4NO3、1900质量份数KNO3、440质量份数CaCl2·2H2O、370质量份数MgSO4·7H2O、170质量份数KH2PO4、0.83质量份数KI、6.2质量份数H3BO3、22.3质量份数MnSO4·4H2O、8.6质量份数ZnSO4·7H2O、0.25质量份数Na2MoO4·2H2O、0.025质量份数CuSO4·5H2O、0.025质量份数CoCl2·6H2O、27.8质量份数铁盐FeSO4·7H2O、37.3质量份数Na2-EDTA·2H2O、100质量份数肌醇、0.5质量份数烟酸、0.5质量份数盐酸吡哆醇、0.1质量份数盐酸硫胺素和2质量份数甘氨酸组成。
上述方法中，在步骤1)的剪切前，还包括如下步骤：将所述百合杂交种子在水中浸泡。
上述方法中，所述浸泡的时间为24h。
上述方法中，所述百合杂交种子为干种子。
上述方法中，所述百合杂交种子为东方百合杂交种子，所述东方百合杂交种子由‘卡萨布兰卡’和‘索邦’杂交得到的杂交子代种子或由‘马可波罗’和‘索邦’杂交得到的杂交子代种子。
本发明的另一个目的是提供一种用于促进百合杂交种子萌发的培养基。本发明提供的培养基，按照包括如下步骤的方法制备：将蔗糖、凝固剂、MS粉和水混合，得到萌发培养基，所述蔗糖在所述萌发培养基中的终浓度为20g/l-40g/l，所述凝固剂在所述萌发培养基中的终浓度为9g/l；所述MS粉在所述萌发培养基中的终浓度为4.43g/l
上述培养基中，所述蔗糖在所述萌发培养基中的终浓度为20g/l、30g/l或40g/l。
所述含有蔗糖的萌发培养基pH值为5.80-5.8。
上述培养基中，所述凝固剂为琼脂。
上述培养基的配置方法为：将各原料按配比溶于水，在100-120℃高温灭菌15-20min，冷却凝固即可。
本发明的实验证明，本发明以东方百合‘卡萨布兰卡’ב索邦’和‘马可波罗’ב索邦’杂交种子为试验材料，通过种子浸泡处理、切割处理以及不同蔗糖浓度处理，观察其对发芽势、萌发率及存活率的影响，筛选出最佳种子处理方法和最适培养基，种子切割处理能够缩短东方百合杂交种子的萌发时间，并且显著提高萌发率，切割处理的‘卡萨布兰卡’ב索邦’种子发芽势和萌发率均极显著地高于对照，发芽势达到75.56％，萌发率达到80.00％；‘马可波罗’ב索邦’种子的发芽势为100.00％，萌发率为100.00％。切割处理后的‘卡萨布兰卡’ב索邦’种子和‘马可波罗’ב索邦’种子的最适培养基均为MS+20g/l蔗糖+9g/l琼脂。本发明的方法提高了百合种子萌发力和整齐度，缩短萌发期，且简便，可操作性强，处理时间无严格要求，大大缩短了百合生长周期，增大了繁殖系数，达到了高效快繁育种的目的。本发明对加速百合育种过程提供了技术参考，对百合种子组培快繁具有一定的参考意义。
附图说明
图1为不同处理下的‘卡萨布兰卡’ב索邦’种子0d-98d下的萌发率
图2为不同处理下的‘马可波罗’ב索邦’种子0d-98d下的萌发率
图3为不同处理的生长图
A为马×索(切割)0天，15d，30d，60d
B为马×索(切割+浸泡)0天，15d，30d，60d
C为马×索(浸泡)0天，15d，30d，60d
D为马×索对照0天，15d，30d，60d
E为卡×索切割蔗糖浓度20、30、40(60d)
F为马×索切割蔗糖浓度20、30、40(60d)
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、剪切对促进东方百合杂交种子萌发的影响
1、样品的制备
2012年6月于北京市辐射中心种质资源圃分别以东方百合品种‘卡萨布兰卡’、马可波罗’为母本，‘索邦’为父本进行杂交授粉，10月采收杂交子代种子，4℃冷藏，得到样品。杂交亲本材料均购自荷兰，杂交后代种子来源于常规杂交授粉。
2、剪切处理
2013年选择其中颗粒饱满、胚清晰(在日光灯下可看到胚乳中间的细长部分)、成熟的杂交子代种子进行如下3种处理：
处理一(CK)：干种子，消毒滤干后，接入含有培养基(MS+30g/l蔗糖+9g/l琼脂)的三角瓶中，编号M1；
处理二：将干种子在自来水中浸泡24h，消毒滤干后，接入含有培养基(MS+30g/l蔗糖+9g/l琼脂)的三角瓶中，编号M2。
处理三：干种子先在自水中浸泡24h，再剪掉胚周围的胚乳和翅，将剩余部分的胚，消毒滤干后，接入含有培养基(MS+30g/l蔗糖+9g/l琼脂)的三角瓶中，编号M3。
处理四：剪掉干种子胚周围的胚乳和翅，将剩余部分的胚，消毒滤干后，接入含有培养基(MS+30g/l蔗糖+9g/l琼脂)的三角瓶中，编号M4。
上述每种处理分别采用‘卡萨布兰卡’ב索邦’的杂交子代种子和‘马可波罗’ב索邦’的杂交子代种子，每个杂交组合选取有胚种子240粒，每个处理15粒，重复三次，结果取平均值。
上述培养基为含有蔗糖的萌发培养基，其pH值为5.80-5.89，培养基配方为：MS粉4.43g/l、蔗糖30g/l、琼脂粉9g/l，配置方法为：将各原料按上述终浓度菌溶于水，在100-120℃高温灭菌15-20min，冷却凝固即可。
上述MS粉由具有如下质量份数的物质组成：1650质量份数NH4NO3、1900质量份数KNO3、440质量份数CaCl2·2H2O、370质量份数MgSO4·7H2O、170质量份数KH2PO4、0.83质量份数KI、6.2质量份数H3BO3、22.3质量份数MnSO4·4H2O、8.6质量份数ZnSO4·7H2O、0.25质量份数Na2MoO4·2H2O、0.025质量份数CuSO4·5H2O、0.025质量份数CoCl2·6H2O、27.8质量份数铁盐FeSO4·7H2O、37.3质量份数Na2-EDTA·2H2O、100质量份数肌醇、0.5质量份数烟酸、0.5质量份数盐酸吡哆醇、0.1质量份数盐酸硫胺素和2质量份数甘氨酸组成。
培养条件是光强1000-1200lx，光照时间12h，温度控制在(25±1)℃之间。
上述4种处理方式如下表1所示。
表1六种试验方法汇总表
统计种子萌发率和发芽势，评价百合种子的萌发力。
试验观察，接种的56d内种子萌发较整齐，因此，发芽势以接种56d前观察的发芽数为计量标准。
发芽势(％)＝56d的发芽数/接种数×100％
萌发率(％)＝萌发数/接种数×100％
存活率(％)＝存活数/萌发数×100％
利用Excel2007进行数据统计，利用SPSS14.0软件进行方差分析及多重比较，用Duncan式新复极差方法比较差异显著性，分析出六种试验方法的差异显著性。
浸泡及切割等处理方式对‘卡萨布兰卡’ב索邦’种子萌发的影响如表2和图1所示。
表2浸泡及切割处理对‘卡萨布兰卡’ב索邦’种子(-C×S)萌发的影响
从表2中可以看出，浸泡和切割处理均对‘卡萨布兰卡’ב索邦’种子萌发有显著影响，但其种子发芽势、萌发率以及存活率不同。
浸泡+切割处理的M3-C×S的发芽势达到42.22％，高于M4-C×S的31.11％、M2-C×S的13.33％以及对照的17.78％，形成极显著差异，四组数据的差异也说明不同处理方式发芽整齐度较低。M3-C×S处理的萌发率达到84.21％，高于M4-C×S的33.33％、M2-C×S的15.56％以及对照的27.59％，并形成极显著差异。试验结果表明，浸泡24h+切割处理种子可显著提高‘卡萨布兰卡’ב索邦’种子发芽势和萌发率。
对浸泡但不切割处理的M2-C×S、切割干种子处理的M4-C×S以及对照进行比较可知，其中发芽势M4-C×S>对照>M2-C×S，M4-C×S与对照形成显著性差异；而萌发率M4-C×S>对照>M2-C×S，同样M4-C×S与其他处理形成了显著性差异。
由此可以说明切割处理对‘卡萨布兰卡’ב索邦’种子的发芽势和萌发率的影响最大，浸泡处理对其发芽势并无影响，甚至萌发率低于CK的种子。
浸泡及切割等处理方式对‘马可波罗’ב索邦’种子萌发的影响如表3和图2所示：
表3浸泡及切割处理对‘马可波罗’ב索邦’种子(-M×S)萌发的影响
从表3可以看出，浸泡和切割处理均对‘马可波罗’ב索邦’种子萌发产生显著影响，但其种子的发芽势、萌发率以及存活率均有不同。
从发芽势比较来看，M4-M×S>M3-M×S>对照>M2-M×S，其中，切割处理的M4-M×S发芽势为71.11％，远远大于浸泡+切割处理的M3-M发芽势为42.22％、对照的0.005％以及浸泡处理的M2-M(0.005％)，形成极显著性差异。萌发率比较结果与发芽势相同，切割处理的萌发率与对照形成了极显著差异。由此可知，切割处理与浸泡和切割处理可以对‘马可波罗’ב索邦’种子的发芽势和萌发率形成显著性的增长，只进行浸泡处理的种子发芽势和萌发率不仅显著低于切割处理的种子，甚至低于CK。
综上所述可说明，切割处理能够显著提高东方百合的部分杂交种子的发芽势和萌发率，仅进行浸泡处理对其影响较小，甚至低于CK，最佳处理方式为M4。
实施例2、不同蔗糖浓度培养基对东方百合杂交种子萌发率的影响
配置三种不同蔗糖浓度的培养基，分别为MS+20g/l蔗糖+9g/l琼脂，MS+30g/l蔗糖+9g/l琼脂，MS+40g/l蔗糖+9g/l琼脂，种子处理方法为上述实施例1筛选得到的M4中的种子处理方法，接入不同蔗糖浓度的培养基，具体如下：
剪掉干种子胚周围的胚乳和翅，将剩余部分的胚，消毒滤干后，接入含有培养基(MS+20g/l蔗糖+9g/l琼脂)的三角瓶中，接到三角瓶中，编号M5；
剪掉干种子胚周围的胚乳和翅，将剩余部分的胚，消毒滤干后，接入含有培养基(MS+40g/l蔗糖+9g/l琼脂)的三角瓶中，接到三角瓶中，编号M6。
上述2种处理方式如表1所示，共6种处理生长图如图3所示。
每个杂交组合选取有胚种子240粒，每个处理15粒，重复三次。
培养基pH值5.8，平均每7d观察一次生长状况并统计数据。培养条件是光强1000-1200lx，光照时间12h，温度控制在(25±1)℃之间。
检测方法同上，将上述M5和M6与实施例1的M4统计比较如下：
不同蔗糖浓度对切割处理‘卡萨布兰卡’ב索邦’种子萌发的影响如表4和图1所示：
表4不同蔗糖浓度对切割处理‘卡萨布兰卡’ב索邦’种子(-C×S)的影响
从表4可以看出，三种蔗糖浓度的培养基均可使‘卡萨布兰卡’ב索邦’种子发芽，但其种子的发芽势、萌发率以及存活率有所不同。
从发芽势比较来看，M5-C×S>M6-C×S>M4-C×S，M5-C×S极显著高于M6-C×S和M4-C×S，分别为75.56％、66.67％和31.11％。从萌发率比较来看，M6-C×S和M5-×SC均与M4-C形成极显著差异。结果表明，如图1所示，蔗糖含量为20g/l的培养基可显著性提高‘卡萨布兰卡’ב索邦’种子发芽势和萌发率。
不同蔗糖浓度对切割处理‘马可波罗’ב索邦’种子萌发的影响如表5和图2所示，
表5不同蔗糖浓度对切割处理‘马可波罗’ב索邦’种子(-M×S)萌发的影响
从表5可以看出，三种培养基均能‘马可波罗’ב索邦’种子发芽。
从发芽势比较来看，蔗糖浓度为20g/l的M5-M×S的发芽势为100.00％，极显著高于其余两种培养基，其次是M6-M×S为75.56％，最次为M4-M×S，发芽势为71.11％。同时，从萌发率结果比较来看，M5-M×S的萌发率最高，为88.89％，如图2所示，说明MS+20g/l蔗糖+9g/l琼脂最适宜‘马可波罗’ב索邦’种子出苗及生长的初代培养基。
综合发芽势、萌发率以及存活率三个指标，各处理与对照来看，得到以下结论：
(1)利用自来水常温浸泡24h后的东方百合杂交种子，发芽势、萌发率等各项指标低于CK，但差异不明显。
(2)利用切掉干种子胚周围的胚乳和翅的方法处理后的东方百合杂交种子，各项指标均极显著高于CK。
(3)在进行不同蔗糖浓度处理后，最适宜‘卡萨布兰卡’ב索邦’种子和‘马可波罗’ב索邦’种子出苗及生长的初代培养基是MS+蔗糖20g/l+琼脂9g/l。
因此，最佳处理方式为M5(切割+MS+20g/l蔗糖+9g/l琼脂)。上述结果表明，通过清水处理24h的东方百合杂交种子并未顺利解除休眠，原因可能是浸泡时间过多或过少，也有可能是清水处理不能对其萌发产生影响。由于东方百合杂交种子最适蔗糖浓度的培养基相同，说明不同东方百合杂交种子对碳源的需求相同，这可能是由于其父本的基因型相同导致。
Claims (5)
1.一种促进百合杂交种子萌发的方法，包括如下步骤：
1）将百合杂交种子的胚剪切去除其周围的胚乳和翅得到剩余部分的胚；
2）培养所述剩余部分的胚，实现促进百合杂交种子萌发；
所述百合杂交种子为干种子；
步骤2）中，所述培养所需的培养基为含有蔗糖的萌发培养基；
所述含有蔗糖的萌发培养基按照包括如下步骤的方法制备：将蔗糖、凝固剂、MS粉和水混合，得到萌发培养基，所述蔗糖在所述萌发培养基中的终浓度为20 g/l、30 g/l 或40g/l，所述凝固剂在所述萌发培养基中的终浓度为9g/l；所述MS粉在所述萌发培养基中的终浓度为4.43g/l；
所述凝固剂为琼脂；
步骤2）培养条件是光强1000-1200lx，光照时间12h，温度控制在（25±1）℃之间；
所述百合杂交种子为东方百合杂交种子，所述东方百合杂交种子由 ‘卡萨布兰卡’和‘索邦’杂交得到的杂交子代种子或由‘马可波罗’和‘索邦’杂交得到的杂交子代种子。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述含有蔗糖的萌发培养基pH值为5.80-5.89。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：在步骤1）的剪切前，还包括如下步骤：将所述百合杂交种子在水中浸泡。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述浸泡的时间为24h。
5.一种用于促进权利要求1-4中任一所述百合杂交种子萌发的培养基，按照包括如下步骤的方法制备：将蔗糖、凝固剂、MS粉和水混合，得到萌发培养基，所述蔗糖在所述萌发培养基中的终浓度为20 g/l、30 g/l 或40g/l，所述凝固剂在所述萌发培养基中的终浓度为9g/l；所述MS粉在所述萌发培养基中的终浓度为4.43g/l；所述凝固剂为琼脂。
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| GR01 | Patent grant |