CN104302656B - 电子蛋白分级分离 - Google Patents

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Abstract

通过本文件描述了本发明的方面。在一些实施方式中，提供了设备。在一些实施方式中，所述设备包括被隔膜分隔为第一子腔室和第二子腔室的腔室，所述隔膜阻断或基本阻断了所述第一和第二子腔室之间流体的流动；且所述第一子腔室与第一电极电连通；所述第二子腔室与第二电极电连通；所述第一子腔室与第一离子注射器/提取器流体连通；所述第二子腔室与第二离子注射器/提取器流体连通；且所述第二子腔室包括出口。

Description

电子蛋白分级分离
相关专利申请的交叉参考
本申请要求2012年4月4日提交的美国临时专利申请号61/620,245以及2013年3月14日提交的美国专利申请号13/803,564的优先权，上述文献都通过引用纳入本文以用于所有目的。
发明背景
在多种情况下，需要进行蛋白纯化。然而，蛋白纯化通常是繁琐且耗时的。
发明内容
本发明的各方面描述于该文本中。
在一些实施方式中，提供了设备。在一些实施方式中，所述设备包括：
被隔膜分为第一子腔室和第二子腔室的腔室，所述隔膜阻断或基本阻断了第一和第二子腔室之间的液体流动；且其中
第一子腔室与第一电极电连通；
第二子腔室与第二电极电连通；
第一子腔室与第一离子注射器/提取器流体连通；
第二子腔室与第二离子注射器/提取器流体连通；且
且第二子腔室包括出口。
在一些实施方式中，第一电极与第一子腔室被第一分离膜分开且第二电极与第二子腔室被第二分离膜分开，所述分离膜能渗透小离子但不能渗透较大分子。
在一些实施方式中，第一离子注射器/提取器包括第一电极且第二离子注射器/提取器包括第二电极。
在一些实施方式中，第二子腔室小于第一子腔室。
在一些实施方式中，第一电极是阳极且第二电极是阴极。在一些实施方式中，第一电极是阴极且第二电极是阳极。
在一些实施方式中，注射器/提取器直接连接至对应的子腔室。在一些实施方式中，注射器/提取器经由管道或通道连接至对应的子腔室。
在一些实施方式中，第二子腔室还包括一个或多个进口。在一些实施方式中，隔膜包括一层交联聚合物，从而抑制流体扩散。在一些实施方式中，隔膜含有孔，该孔允许小于分子截留值的肽通过但基本阻断大于所述分子截留值的肽通过。在一些实施方式中，分子截留值是约20kDa。
在一些实施方式中，注射器/提取器各包括：
a.与子腔室流体连通并通过阴离子选择性膜与子腔室分开的隔室；和/或
b.与子腔室流体连通并通过双极膜与子腔室分开的隔室；和/或
c.与子腔室流体连通并通过阳离子选择性膜与子腔室分开的隔室。
在一些实施方式中，该设备包括：
被隔膜分为第一子腔室和第二子腔室的腔室，该隔膜阻断或基本阻断了第一和第二子腔室之间的液体流动；且其中
第一子腔室与第一电极电连通，第一电极通过第一分离膜与第一子腔室分开；
第二子腔室与第二电极电连通，第二电极通过第二分离膜与第二子腔室分开，分离膜能渗透小离子但不能渗透较大分子。
第一子腔室与第一质子/阴离子注射器/提取器和第一氢氧根/阳离子注射器/提取器流体连通；
第二子腔室与第二质子/阴离子注射器/提取器和第二氢氧根/阳离子注射器/提取器流体连通；且
且第二子腔室包括出口。
在一些实施方式中，第二子腔室小于第一子腔室。
在一些实施方式中，第一电极是阳极且第二电极是阴极。在一些实施方式中，第一电极是阴极且第二电极是阳极。
在一些实施方式中，注射器/提取器直接连接至对应的子腔室。在一些实施方式中，注射器/提取器通过管或通道连接至对应的子腔室。
在一些实施方式中，第二子腔室还包括一个或多个进口。
在一些实施方式中，隔膜包括一层交联聚合物，从而抑制流体扩散。在一些实施方式中，隔膜含有孔，孔允许小于分子截留值的肽通过但基本阻断大于所述分子截留值的肽通过。在一些实施方式中，分子截留值是约10、15、20、25或30kDa，例如10-30kDa。
在一些实施方式中，质子/阴离子注射器/提取器各包括
a.与子腔室流体连通并通过阴离子选择性膜与子腔室分开的第一隔室；和
b.与子腔室流体连通并通过双极膜与子腔室分开的第二隔室。
在一些实施方式中，氢氧根/阳离子注射器/提取器各包括：
a.与子腔室流体连通并通过阳离子选择性膜与子腔室分开的第三隔室；和
b.与子腔室流体连通并通过双极膜与子腔室分开的第四隔室。
还提供了包含本文所述设备的系统，该设备通过导线连接至电源，可选地，该系统还包括泵、UV检测器、pH计和/或电导计。
还提供了从样品中纯化目标蛋白或肽的方法。在一些实施方式中，该方法包括：
提供上文所述或本文他处所述设备；
将样品加载至第一子腔室或第一和第二子腔室，加载后第一和第二子腔室含有流体；
控制注射器/提取器以调节腔室中流体的pH使得样品的一些组分因pH调整而带电且一些组分不带电；
在第一和第二电极之间施加电压，从而使至少一些带电组分移动至第二子腔室中；以及
通过第二子腔室中的出口移除包含带电组分的第二腔室中的流体，从而将样品中的目标蛋白或肽与样品的至少一些其他组分分离。
在一些实施方式中，一种或多种目标蛋白或肽是移动至所述第二子腔室的带电组分，并在移出后收集该目标蛋白或肽。
在一些实施方式中，移动至第二子腔室的带电组分是污染物并弃去该污染物。
在一些实施方式中，样品仅加载至所述第一子腔室。
在一些实施方式中，样品加载至所述第一和第二子腔室。
在一些实施方式中，第一电极是阴极(负电荷)且第二电极是阳极(正电荷)，并且
控制包括调节流体的pH使其低于目标蛋白或肽的pI，使得目标蛋白或肽具有整体正电荷且样品的至少一些其他组分带有负电荷；且
施加电压导致带负电荷的组分移动至第二子腔室且目标蛋白或肽留在第一子腔室中；且
从第二子腔室中移除流体，该流体包含移动的组分，并在第二子腔室中可选地使用新流体代替移除的流体；并且，随后
控制注射器/提取器以调节腔室中流体的pH使其高于目标蛋白或肽的pI，使得目标蛋白或肽具有整体负电荷；
在第一和第二电极之间施加电压，从而使带负电荷的目标蛋白或肽移动至第二子腔室中；以及
通过第二子腔室中的出口移除并收集第二子腔室中的流体，该流体包含目标蛋白或肽，从而将样品中的目标蛋白或肽与样品的至少一些其他组分分离。
在一些实施方式中，第一电极是阳极(正电荷)且第二电极是阴极(负电荷)，并且
控制包括调节流体的pH使其高于目标蛋白或肽的pI，使得目标蛋白或肽具有整体负电荷且样品的至少一些其他组分带有正电荷；且
施加电压导致带正电荷的组分移动至第二子腔室且目标蛋白或肽留在第一子腔室中；且
从第二子腔室中移除流体，该流体包含移动的组分，并在第二子腔室中可选地使用新流体代替移除的流体；并且，随后
控制注射器/提取器以调节流体的pH使其低于目标蛋白或肽的pI，使得目标蛋白或肽具有整体正电荷；
在第一和第二电极之间施加电压，从而使带正电荷的目标蛋白或肽移动至第二子腔室中；以及
通过第二子腔室中的出口移除并收集第二子腔室中的流体，该流体包含目标蛋白或肽，从而将样品中的目标蛋白或肽与样品的至少一些其他组分分离。
在一些实施方式中，样品包含蛋白且隔膜含有孔，该孔允许小于分子截留值的肽通过但基本阻断大于截留值的肽通过，且
加载包括将样品加载至第一子腔室，
可选地，控制包括控制注射器/提取器以调节第一子腔室中的流体的pH；
向第一子腔室中加入第一蛋白酶，加入时的条件允许第一蛋白酶从蛋白中生成肽；
在第一和第二电极之间施加电压，从而使至少一些大小低于所述分子截留值的带电的肽移动至第二子腔室中。
在一些实施方式中，所述分子截留值是约10、15、20、25或30kDa，例如10-30kDa。
在一些实施方式中，所述方法还包括，
向第一子腔室中加入第二蛋白酶，加入时的条件允许第二蛋白酶从所述蛋白中生成肽；
在第一和第二电极之间施加电压，从而使至少一些大小低于所述分子截留值的带电的肽移动至第二子腔室中。
在一些实施方式中，所述方法包括，在加入第二蛋白酶之前或之后，调节第一子腔室中的流体的pH至对第二蛋白酶最优的pH。
在一些实施方式中，在加入第一蛋白酶前或后，所述方法包括在第一和第二电极之间施加电压，从而使至少一些带电的肽(如果存在)从所述样品中移至第二子腔室中。
在一些实施方式中，所述方法还包括在第二子腔室中收集肽。
附图简要说明
图1显示了本文所述设备的示例性实施方式。在两个电极(1和2)之间施加的电压可使带电分子朝合适的电极(阴极或阳极，取决于所带电荷)移动。可以移动带电分子，例如从第一子腔室(14)通过膜(8)至第二子腔室(15)。可使用4A、5A、6A、7A、4B、5B、6B和7B中描述的离子注射器/提取器调节并改变各子腔室的pH。其他膜(3A和3B)可保护子腔室中的溶液和组分，使其不接触电极。可选地，第一子腔室(14)可包括一个或多个出口(10)和进口(9)。类似地，第二子腔室(15)可包括一个或多个出口(11)和进口(12)。
图2显示了本文所述设备的示例性实施方式。在两个电极(1和2)之间施加的电压可使带电分子朝合适的电极(阴极或阳极，取决于所带电荷)移动。可以移动带电分子，例如从第一子腔室(14)通过膜(8)至第二子腔室(15)。在这一实施方式中，可使用4A、5A、6A、7A、4B、5B、6B和7B中描述的离子注射器/提取器调节并改变储器(16和17)中溶液的pH。随后可将溶液从储器(16)通过进口(9)移动至第一子腔室(14)中并从储器(17)通过进口(12)移动至第二子腔室(15)中。需要时，泵(13A和13C)可移动溶液。需要时，出口(10和11)可使溶液循环回储器中。需要时，泵(13B)可从外部来源泵入新鲜溶液。其他膜(3A和3B)可保护子腔室中的溶液和组分，使其不接触电极。
图3显示了质子注射器，包括与通道相邻的小隔室，其中浸有电极(例如Pt电极)，和将隔室与通道分隔的双极膜。该图并不旨在显示完整的设备，而是仅仅显示质子注射器与子腔室相连的可能方式。
图4显示了氢氧根注射器，包括与通道相邻的小隔室，其中浸有电极(例如Pt电极)，和将隔室与通道分隔的双极膜。该图并不旨在显示完整的设备，而是仅仅显示氢氧根注射器与子腔室相连的可能方式。
图5显示了向子腔室注射阴离子(所示的氯离子)和质子的隔室。该图并不旨在显示完整的设备，而是仅仅显示隔室与子腔室相连的可能方式。
图6显示了向子腔室注射阳离子(所示的钠离子)和氢氧根离子的隔室。该图并不旨在显示完整的设备，而是仅仅显示隔室与子腔室相连的可能方式。
图7显示了向子腔室注射质子同时从子腔室提取阳离子(所示的钠离子)的隔室。该图并不旨在显示完整的设备，而是仅仅显示隔室与子腔室相连的可能方式。
图8显示了向子腔室注射氢氧根离子同时从子腔室提取阴离子(所示的氯离子)的隔室。该图并不旨在显示完整的设备，而是仅仅显示隔室与子腔室相连的可能方式。
图9是实施例中所述设备的示意图。
图10是实施例中所述系统的示意图。
图11显示了用于移动带电分子通过如实施例中所述膜的设备。
发明详述
I.介绍
提供了设备，该设备允许通过pH依赖的电荷对样品进行分级分离，从而完成样品组分的纯化。所述设备提供了被膜(称作“隔膜”)分成至少两个子腔室的腔室，该膜基本阻断了子腔室之间的流体流动但允许一些或全部样品组分(例如蛋白、核酸等)在电流存在的情况下跨膜移动。这两个子腔室各自与电极电连通，从而可在电极之间并因此横跨两个子腔室施加电压。
可用样品加载一个或多个子腔室，并调节子腔室的pH使得样品中的一些组分带电。例如，组分的整体电荷取决于该组分的pI。如果pH高于pI，组分会具有整体负电荷，而如果pH低于pI，组分会具有整体正电荷。一旦跨电极施加电压，带正电荷的组分会朝负极(阴极)移动而带负电荷的组分会朝正极(阳极)移动。如果已知样品中目标分子的pI，可如本文详述的方法设计pH和电极以从样品的其他组分中纯化目标分子。
本文所述实施方式的优势在于包括了离子“注射器/提取器”(在下文中进一步讨论)，从而可以在不改变缓冲液等的情况下改变设备中溶液的pH。这将允许在纯化期间一次或多次改变pH，从而使用超过一次的pH“截留”对组分进行选择，或者在使用活性酶的实施方式中，将pH条件与酶进行匹配。不同组分的不同电荷允许使用电场通过电荷分离组分。因此，通过在该过程期间改变pH，可改变多种组分的电荷，从而进行多轮分离。例如，可将pH设置为略高于目标的pI(使得目标带负电荷)并使所有带正电荷的分子与目标分离。随后，可改变pH使其略低于目标的pI(使得目标带正电荷)并可除去所有带负电荷的组分，从而使除了与目标具有非常类似pI的任意组分之外的所有组分与目标分离。
该方法可用于多种目的。例如，该方法可用于通过使用具有特定分子量大小限制的膜选择特定大小的肽，或者从具有较高和/或较低pI的分子中选择某些pI的分子。
II.设备
图1显示了本发明设备的实施方式的基本设计。两个子腔室(14和15)一起形成一个腔室，其间由膜(8)分开。为便于说明，左侧的子腔室称作“第一”子腔室而右侧的子腔室称作“第二”子腔室，但需要时可将两个子腔室的方向反转。通常，如本文所用，第二子腔室是组分最终移动至其中并从中收集目标分子和/或除去废物分子的子腔室。该设备可被设计用于接收第一子腔室或第一和第二子腔室中的样品，此时第二子腔室用于收集。因此，在一些实施方式中，整个腔室可以是顶部开放的，例如具有可移除或铰接盖。因此，在一些实施方式中，需要时可从顶部加载样品。或者，或联合使用，第一和/或第二子腔室可具有一个或多个进口以导入样品。在一些实施方式中，第一和/或第二子腔室可具有一个或多个出口以从第二子腔室中排出流体。
膜(8)(即隔膜)将基本或完全阻断子腔室之间的流体流动，但允许样品组分和较小分子的跨膜移动，尤其在带电和存在电场时。例如，样品的蛋白和核酸组分可跨膜流动。膜的示例可包括，例如，低结合经修饰的纤维素膜(如聚磺酸酯膜)。在一些实施方式中，膜(8)可被一层交联的聚合物(如聚丙烯酰胺、琼脂糖等)覆盖以避免电场不存在时组分的跨膜扩散。如下所述，在一些实施方式中，膜可具有特定大小的孔以排除大于特定大小(“截留值”)的分子同时允许较小的分子通过。例如，在一些实施方式中，分子量截留值是约10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25kDa。
第一电极与第一子腔室电连通且第二电极与第二子腔室电连通。“电连通”指第一和第二电极能够产生跨两个子腔室(14,15)和隔膜(8)的电压。例如，在一些实施方式中，第一电极位于第一子腔室中或与其相邻，且第二电极位于第二子腔室中或与其相邻。
在一些实施方式中，一种膜(不同于分隔子腔室的膜(8)，在本文中称作“分离膜”)可将电极与子腔室内流体分开，从而避免样品组分接触电极(接触则可能使其变性)。在一些实施方式中，使电极与子腔室分开的膜具有例如约200、500、100、2000、3000、4000或5000Da的分子量截留值，从而允许小离子接触电极，但不允许较大的样品组分(如蛋白或肽)接触。
电极的方向(+/-)取决于所需要的结果。图1和2显示了(图左侧)与第一子腔室相邻的阴极(-)和(图右侧)与第二子腔室相邻的阳极(+)。然而，应理解可反转该方向使得阴极(+)与第一子腔室相邻且阳极(+)与第二子腔室相邻。如下所述，方向部分取决于目标和污染物的pI，以及污染物和待纯化目标分子的相对电荷。可将电极与控制器相连以控制跨电极电压以及可选的电流方向。
在一些实施方式中，子腔室具有基本相同的大小和/或可容纳相同体积的溶液。或者，在一些实施方式中，第一子腔室显著大于(容纳的体积多于)第二子腔室。
在一些实施方式中，该设备可以包含电导计、pH计或同时包含两者。这些计的精确位置可以根据需要变化。例如，可将pH计或电导计置于第一和/或第二子腔室中。来自这些计的信号可以传回中央电子控制器，从而可根据需要调节隔室电流以调节pH和电导率。可以通过电子控制器控制对各隔室对的电压和/或电流的独立电子控制，所述电子控制器可以包括计算机、微处理器等。
在一些实施方式中，可以包含泵来使得溶液移动通过子腔室，例如从储器通过子腔室，穿过隔室，至目的地。泵的精确位置可以根据需要变化，并且可以位于，例如，储器和隔室之间，隔室之间或目的地和隔室之间。在一些实施方式中，通过电渗泵送来循环液体。
两个子腔室中的每个都可包括控制子腔室中流体pH的机制。在一些实施方式中，所述机制可包括质子/阴离子注射器/提取器和氢氧根/阳离子注射器/提取器(下文中有更详细的描述)，其与子腔室相邻或流体连通。
在一些实施方式中，离子注射器/提取器与子腔室相邻(即直接相连)，从而直接影响子腔室中溶液的pH。这种实施方式如图1所示，其中举例而言，注射器/提取器隔室4A、6A、5A和7A与第一子腔室(14)相邻且注射器/提取器隔室4B、6B、5B和7B与第二子腔室(15)相邻。
在其他实施方式中，可放置注射器/提取器隔室使其与储器相邻且储器中的溶液可与子腔室中的溶液流体连通(例如经由管道)。这种实施方式如图2所示，其中举例而言，注射器/提取器隔室4A、6A、5A和7A与第一储器相邻且注射器/提取器隔室4B、6B、5B和7B与第二储器相邻，其中第一储器继而通过管道(9,10)与第一子腔室相连且第二储器通过管道(11,12)与第二子腔室相连。可选地，可使用一个或多个泵将溶液从储器移动至子腔室中(例如图2中的13A和13C)。如图2所示，可使用额外的进口(以及可选地额外的泵(13B))从外部来源提供新鲜溶液。在一些实施方式中，储器和/或子腔室可包括其他机制的搅拌棒，用于在多个区域搅拌和混合溶液。
如下文更详细讨论的那样，离子注射器/提取器可具有相关的电极以进行离子注射或提取。在一些实施方式中，离子注射器/提取器中相同的电极用作跨膜(通过电泳)移动带电分子的电极，所述膜分开第一和第二子腔室。在一些方面，可单独使用一个或多个离子注射器/提取器以控制pH和/或离子强度，同时不同的离子注射器/提取器也引导电流通过隔膜。在一种配置中，一个(或一组)注射器/提取器控制质子和/或羟基浓度(即pH)，可选地第二个(或第二组)注射器/提取器控制离子强度，而另一个(或另一组)注射器/提取器经设置以使得来自注射器/提取器控制中电极的电流通过选择性膜(即阳离子交换膜、阴离子交换膜、双极膜)和隔膜，同时膜之间的区域成为子腔室，例如用于收集纯化的带电分子。
因此，在一些实施方式中，最初可使用如下配置的离子注射器设置pH和/或离子强度：
步骤1：操作AEM的阳极和操作CEM的阴极(减少盐)；
步骤2：操作BPM注射质子的阳极和操作CEM的阴极(降低pH)；
步骤3：带电分子转移。两种配置(例如间歇转换)：
第一种配置(离子插入)：操作CEM的阳极和操作CEM和渗析膜的阴极；
第二种配置(离子去除)：操作AEM的阳极；操作CEM和渗析膜的阴极。
应理解也可使用其他配置，这取决于离子强度是需要增加、减少或在不同时间点增加和减少。
注射器/提取器
离子“注射器/提取器”指通过离子选择性的膜与子腔室或其他容器(如储器)分开一个或多个隔室，其中所述隔室各含有一个电极。例如，示例性注射器/提取器如图1和2的4A、4B、5A、5B、6A、6B、7A和7B所示。根据膜的特定离子选择性以及多个隔室中的电流方向(例如存在阳极和阴极的情况下)，可对隔室进行设计以注射质子、其他阳离子、氢氧根离子或其他阴离子，使其通过选择性膜进入相邻的子腔室。或者，如下文所解释的那样，还可设计隔室、膜和电流的方向将质子、其他阳离子、氢氧根离子或其他阴离子从子腔室通过选择性膜提取至隔室中。
基本的示例性设备配置包括用于包含与至少第一和第二隔室流体连通的本文所述子腔室，其中通过第一选择性膜将第一隔室与子腔室分开并且通过第二选择性膜将第二隔室与子腔室分开。选择性膜在允许某些离子(例如，阳离子或阴离子或质子和氢氧根离子)运动的同时抑制其他离子类型的跨膜运输。在许多实施方式中，第一和第二选择性膜具有不同的选择特性。选择性膜的示例包括，例如，阴离子选择性膜、阳离子选择性膜和双极选择性膜。第一和第二隔室各包括电极(在一个隔室中的阳极和在其他隔室中的阴极)以通过隔室和子腔室中的溶液形成电路。形成电路的两个隔室在本文中称为“隔室对”或“一对隔室”。在一些实施方式中，第三或其他额外隔室可以与该对相互作用，例如，一个隔室的阴极对于两个或更多个不同的含阳极隔室产生电流(反之亦然，其中有一个阳极和两个或更多个阴极)。根据电流的方向和将隔室与子腔室分开的选择性膜的类型，子腔室中的溶液会聚集质子、氢氧根离子、其他阴离子或阳离子，或者在一些配置中会将阳离子和/或阴离子转移至侧子腔室中。通过控制电流和配置，可以由此控制子腔室中溶液的pH和/或离子强度。
可以组合隔室对以获得需要的结果，其各自通过子腔室中的溶液形成单独的电路并且具有不同的选择性膜配置。例如，第一和第二隔室可以形成电路并且向溶液中注射氯阴离子和质子，而第三和第四隔室可以形成单独的电路并且向子腔室中的溶液中注射氢氧根和钠阳离子，从而提高离子强度，并且根据质子和氢氧根离子的相对流来改变pH。如下所述，许多其它配置都是可行的。出于方便在标记时使用“第一”、“第二”、“第三”等，但这并不旨在赋予任何其他含义。
膜通过形成将隔室内的溶液与子腔室分隔开的屏障来“分开”隔室与子腔室，例如，至少在子腔室内溶液的水平上分开。例如，在子腔室顶部存在开口(或者，具有可移开的顶盖)的实施方式中，膜可以被设计用来完全分隔隔室与子腔室，所述分隔至少达到子腔室和/或隔室内溶液的水平，或者达到指定的溶液加载最大水平。可以根据需要将膜设计成高于溶液的水平以避免从一部分到另一部分的意外转移(例如泼洒)。如果需要，可用固体材料(例如塑料)给膜“加框”，或者另行固定在子腔室和隔室之间。还可以用中性膜如透析膜来进一步补充离子特异性膜以防止，例如溶液中的分子与离子特异性或双极膜的接触。
电极可以由任何导体或半导体物质形成。例如，在一些实施方式中，一个或多个电极包含金属。在一些实施方式中，所述金属是锌、铜或铂。
A.离子注射器
可以设计多种不同的离子注射器。
国际专利申请公开号WO2009/027970描述了用于在一定环境(诸如电解质溶液、凝胶等)中产生质子或氢氧根离子局部浓度、质子或氢氧根浓度梯度以及所需质子或氢氧根浓度分布的方法和装置(本文中称为“质子/氢氧根注射器”)。国际专利申请公开号WO2011/021195和WO2011/021196描述了使用质子/氢氧根注射器的等电聚焦的方法和装置，并且还描述了数据的显示。
质子/氢氧根注射器技术可用于影响子腔室中溶液的pH。简言之，在一些实施方式中，质子/氢氧根注射器包含与子腔室相邻的隔室(所述隔室内含有电极)，以及将隔室与通道分隔的双极膜。参见例如图3-4。双极膜是离子交换模，其具有阳离子交换膜和阴离子交换膜接合在一起的结构，从而允许水分子分解为质子和氢氧根离子。在由双极膜分隔的隔室和通道之间施加的电压导致水分解，并注射质子或氢氧根离子进入通道。该技术的一些优势可包括，例如，无泡水解和将产生的离子直接注射至通道，从而缩短反应时间(例如，如果需要可短于1分钟)。
通过向阳极和阴极施加合适的电压从而在隔室和子腔室中穿过溶液的电流，带电分子可以由此移动。在一些实施方式中，可以向阳极或阴极隔室添加带电分子，并且随后施加电压，从而由使用者在确定的时间点上将带电分子递送至子腔室。
分子移动的方向取决于分子所带电荷和施加电压的极性。
可以通过例如，将隔室中包含阴极的第一隔室和将第一隔室与子腔室分开的阴离子选择性膜与包含具有阳极的第二隔室配对来实现非质子、非氢氧根离子从隔室向子腔室内的注射。该配置中，在阴极和阳极之间存在电流的情况下，第一隔室会注射第一隔室溶液中存在的阴离子并因此称作“阴离子注射器”。例如，如果隔室溶液包含氯离子，在阴极和阳极之间存在电流的情况下，氯离子会被转移通过阴离子选择性膜进入子腔室中。图5显示了这一方面的一个实施方式，其中在存在穿过顶部和底部腔室的电流的情况下，图的顶部隔室注射氯离子(图中所用的“顶部”和“底部”是指图的顶部和底部，并不必然是设备的顶部和底部)。应理解这种配置并不限于注射氯离子。任何存在并能够通过阴离子选择性膜的阴离子均能够从隔室转移到子腔室中。图5还显示了一个方面，其中第一隔室在电路中与第二隔室配对，通过双极膜将第二隔室与子腔室分开。在这个方面，第二隔室向子腔室中注射质子并且因此被称为“质子注射器”。
如图5所示，在阳极和阴极之间施加电压会导致水被双极膜分解(底部隔室)。质子被注射进子腔室中并且将子腔室中流动的溶液滴定至所需降低的pH。在分解过程中产生的氢氧根离子与由阳极上水解产生的质子重新结合。因为电流是穿过底部隔室的相同电流，阳极隔室中的pH被保持在其初始值上(在没有其他的电化学反应下)。由于电荷中性和将阴极隔室(所示的顶部)与子腔室分开的阴离子选择性膜，阴离子(例如，氯离子)被从阴极(顶部)隔室注射到子腔室中。因此，用HCl滴定图5中所示子腔室中的溶液，从而降低pH。该方面也示于图1和2，隔室4A-B和5A-B，前提是4A-B各包括阴极和阴离子选择性膜且5A-B各包括阳极和双极膜。
然而，具有阴离子选择性膜的腔室也可能将氢氧根离子注射进子腔室中。这可以通过，例如升高腔室内氢氧根离子浓度(即，升高pH)，从而在施加电流时使得较高浓度的氢氧根离子能移动到子腔室中(当腔室中的溶液是中性时，氢氧根离子的浓度是可忽略的)来实现。这个选择的一个实施方式是图5所示的配置，但是顶部腔室中的溶液是碱性的。
或者，可以通过例如，将隔室中包含阳极的第一隔室和将第一隔室与子腔室分开的阳离子选择性膜与第二隔室配对来实现非质子、非氢氧根离子从隔室向子腔室中的注射。在这种配置中，在阴极和阳极之间存在电流的情况下，第一隔室将向子腔室注射第一隔室溶液中存在的阳离子，并且因此被称为“阳离子注射器”。例如，如果隔室溶液包含钠阳离子，则钠阳离子将被转移穿过阳离子选择性膜进入子腔室中。这一方面的一个实施方式示于图6，其中在存在穿过顶部和底部腔室的电流的情况下，图中的顶部隔室注射钠离子。然而，应理解这种配置并不限于注射钠离子。任何存在并能够通过阳离子选择性膜的阳离子均能够从隔室转移到子腔室中。图6还显示了一个方面，其中第一隔室在电路中与第二隔室配对，通过双极膜将第二隔室与子腔室分开。在这个方面，第二腔室向子腔室中注射氢氧根离子并且因此被称为“氢氧根离子注射器”。该方面也示于图1和2，隔室6A-B和7A-B，前提是6A-B各包括阳极和双极膜且7A-B各包括阴极和阳离子选择性膜。
与图5所示的方面相反，在图6中，氢氧根离子被注射到子腔室中并且将子腔室中流动的溶液滴定至所需升高的pH。在分解过程中产生的质子与由阴极上水解产生的氢氧根离子重新结合。因为电流是穿过底部隔室的相同电流，在没有其他的电化学反应下，阴极隔室中的pH被保持在其初始值上。由于电荷中性和将阳极隔室(所示的顶部)与子腔室分开的阳离子选择性膜，阳离子(例如，钠离子)被从阳极(顶部)隔室注射到子腔室中。因此，用NaOH滴定图6中所示的子腔室中的溶液。
然而，具有阳离子选择性膜的腔室也可能将氢离子注射进子腔室中。这可以通过，例如升高腔室内氢离子浓度(即，降低pH)，从而在施加电流时使得较高浓度的氢离子能移动到子腔室中(当腔室中的溶液是中性时，氢离子的浓度是可忽略的)来实现。这个观点的一个实施方式是图6所示的配置，但是顶部腔室中的溶液是酸性的。
可以根据待实现的目标来组合任意数量的隔室电路对。在这些实施方式中，可以独立控制不同隔室对中的电极，使得可以根据需要向不同的对施加不同的电压或电流。
B.离子提取器
还提供了将离子从子腔室中的溶液转移到隔室中的隔室组合(即，作用为离子提取器)。
在一些方面，一对隔室从子腔室中提取非质子、非氢氧根离子到隔室中，同时从不同的隔室向子腔室中加入质子或氢氧根离子。这可以通过如下方式实现，例如，将隔室中包含阴极的第一隔室和将第一隔室与子腔室分开的阳离子选择性膜与具有阳极的第二隔室配对。在该配置中，第一隔室会提取子腔室中存在的阳离子并且将该阳离子转移到第一隔室中并且因此被称为“阳离子提取器”。例如，如果子腔室溶液包含钠离子，在阴极和阳极之间存在电流的情况下，钠离子会通过阳离子选择性膜从子腔室中转出。这一方面的一个实施方式示于图7，其中在存在穿过顶部和底部室的电流的情况下，图中的顶部隔室从子腔室中提取阳离子(所示的钠离子)。然而，应理解这种配置并不限于提取钠离子。任何存在并能够通过阳离子选择性膜的阳离子均能够从子腔室转移到隔室中。图7还显示了一个方面，其中第一隔室在电路中与第二隔室配对，通过双极膜将第二隔室与子腔室分开。在这个方面，第二腔室向子腔室中注射质子同时第一腔室提取钠阳离子。
或者，从子腔室中提取非质子、非氢氧根离子到隔室中同时从不同的隔室向子腔室中添加质子或氢氧根离子可通过如下方式实现，例如，通过将在隔室中包含阳极的第一隔室和将第一隔室与子腔室分开的阴离子选择性膜与第二隔室配对。在该配置中，第一隔室会提取子腔室中存在的阴离子并且将该阴离子转移到第一隔室中并且因此被称为“阴离子提取器”。例如，如果子腔室溶液包含氯离子，在阴极和阳极之间存在电流的情况下，氯离子会通过阴离子选择性膜从子腔室中转出。这一方面的一个实施方式示于图8，其中在存在穿过顶部和底部室的电流的情况下，图中的顶部隔室从子腔室中提取阴离子(所示的氯离子)。然而，应理解这种配置并不限于提取氯离子。任何存在并能够通过阴离子选择性膜的阴离子均能够从子腔室转移到隔室中。图8还显示了一个方面，其中第一隔室在电路中与第二隔室配对，通过双极膜将第二隔室与子腔室分开。在这一方面，第二腔室向子腔室中注射氢氧根离子。
III.方法
本文所述设备可用于纯化来自复杂(例如生物或其他)样品的一种或多种目标分子。该方法利用样品组分的不同电荷以使具有特定电荷的组分与中性组分和/或具有相反电荷的组分分离。可以控制组分的电荷，因为组分的电荷随着溶液pH变化。因此，通过控制pH，可以控制组分的电荷。例如，当组分的pI是pH时，组分的电荷是中性的。如果溶液的pH低于pI，则组分带正电荷。如果溶液的pH高于pI，则组分带负电荷。样品的不同组分通常具有不同pI，从而允许在特定条件下不同组分具有不同电荷。例如，如果分子A具有pIA且分子B具有pIB且pIA<pIB，且溶液的pH介于pIA和pIB之间，则分子A具有整体正电荷且分子B具有整体负电荷。通过向横跨分开两个子腔室的膜的电极(例如图1和2中标记的1和2)施加电压，带正电荷的组分会朝阴极移动且带负电荷的组分会朝阳极移动。由于分开两个子腔室的膜通常阻断了子腔室之间的流体流动但允许样品组分的移动，施加电压会使不同电荷的组分在子腔室中富集。
作为示例，样品仅充满在第一子腔室(14，图1)中且缓冲液充满第二子腔室，使用注射器/提取器调节两个子腔室中溶液的pH使得溶液中的一些组分带有负电荷，随后在电极(1和2)之间施加电压，使带负电荷的组分移动至第二子腔室(15)。如果移动至第二子腔室的组分是需要的(即是目标分子)，可将其收集并可选地对其进一步纯化等。或者，如果带负电荷的组分不是目标组分，则可移动以弃去第二子腔室所含物质。当然，相同方法可以相反的方式使用，即可控制pH以生成带正电荷的组分，将其移动至包含阴极的第二子腔室中并根据需要收集或移动以弃去。还应理解，当上述示例涉及仅将样品加载至第一子腔室时，在一些实施方式中，可将样品加载至全部两个子腔室中。
包括pH注射器/提取器的一个优势是可改变子腔室中溶液的pH并进行多轮纯化。例如，如果需要捕获具有特定pI的目标蛋白，可将腔室的pH调节至略低于目标蛋白的pI(例如低0.5个pH单位)。可施加电场使得第一子腔室电极是负极(阴极)且第二子腔室电极是正极(阳极)。pI低于该pH的蛋白会迁移至第二子腔室中并可收集或弃去，例如通过使用泵提供流动。随后，在一些实施方式中，将腔室中的pH调节至略高于感兴趣蛋白的pH(例如高0.5个pH单位)目标蛋白的pI。这会引起感兴趣的蛋白迁移至第二子腔室并可将其以比初始样品更纯和更浓缩的形式收集。可以在分离的最后或在进行分离时连续地洗脱第二子腔室中的蛋白。连续洗脱可基于蛋白的迁移率(电荷至大小)提供额外的分离维度。
所述方法还可用于蛋白、肽或其他样品组分的分级分离(在第一子腔室中含有带负电荷电极且第二子腔室中含有带正电荷电极的设备中)，具体方式为从低至高调节pH并将pI低于pH的组分移动至第二子腔室，随后调高pH并将下一个组分移动至第二子腔室。通过该方法，可捕获多个组分。
也可通过在第一子腔室中含有带正电荷电极且第二(收集)子腔室中含有带负电荷电极的设备中施加电场，从高pH开始并逐步降低pH并收集右腔室中的组分，从而实现分级分离。
或者，可通过连续改变腔室的pH并连续从第二子腔室中移除蛋白/肽实现连续分离。如此，可实现基于pI的连续分离。
在一些实施方式中，可在一个或多个子腔室中进行化学或酶促反应。例如，在一些实施方式中，该设备可用于设置特定酶或反应的最佳pH，或可进行改变以在不再需要进行第一反应后适应第二反应或酶。
在一些实施方式中，可选择产物的最佳大小。例如，可对分开两个子腔室的膜进行选择使其具有尺寸截留值，即阻断较大分子且较小分子可通过膜。作为一个示例，一些质谱仪能够对较大分子进行片段化且在20kDa范围最为有效。本文所述方法可用于通过选择具有20kDa截留值的膜富集约20kDa的肽，从而避免大量明显高于或低于目标大小的肽。
在一些实施方式中，将包含蛋白和/或肽并与一种或多种蛋白水解酶接触的样品置于第一子腔室中，其中分隔子腔室的膜是尺寸选择性的。一旦切割至截留大小，即可通过电场将肽移动至第二子腔室(其中不含酶)，从而允许特定大小的肽富集。在一些实施方式中，为第一子腔室选择酶的最佳pH并持续一段时间，随后改变pH以设置目标分子使其带有所需电荷，随后通过电场将目标分子移动至第二子腔室并进行收集。需要时，可加入不同的酶，可连续设置各酶的最佳pH，可选择在最佳pH改变之间移动合适大小的肽，从而在后续酶用于剩余的较大蛋白前移动足够小的肽使其通过膜。如上所述，例如，该过程允许研究者将酶处理样品的平均肽尺寸转换为较大尺寸(例如最高20kDa)，从而提高能够分析较大片段的质谱仪器的有效性，并提高质谱所测量蛋白序列的覆盖程度。
实施例
该实施例提供了促进任何类型带电分子(离子)进行数字调节的系统。该技术中，可使用具有双极膜的质子和氢氧根注射器注射质子和氢氧根离子。可使用离子交换膜导入和除去盐。通过电生成和修饰蛋白溶液的盐分布(salt profile)的能力为控制生物过程和代替现有的传统仪器开辟了新的方法。以下描述显示了盐调节技术是如何用于特定应用的。然而，应理解该描述不是对技术采取限制使其不能进行其他可能的应用。
这里所述的主申请旨在代替现有方法以处理色谱柱中洗出的蛋白。这类蛋白洗出于洗脱缓冲液中，所述洗脱缓冲液通常与后续步骤(如活性测试、结晶或其他纯化步骤)不相容。因此，需要在对蛋白进行任意额外操作前更换这些溶液。传统做法是，通过透析或离心实现该溶液调节。第一个方法的主要劣势在于完成缓冲液更换的时间过长。第二个方法的主要劣势是材料损失。此外，两种方法都具有“离线”使用的缺陷，即其未与色谱操作的仪器相连。相反，用户不得不收集从色谱洗脱中洗出的洗脱缓冲液并将其导入透析或离心设备中。这里描述的系统能够大幅度减少缓冲液更换所需时间并具有相对低的材料损失。此外，该系统由电驱动的事实使其能够非常容易地与色谱系统相连。在这类整合的“色谱调节系统”中，蛋白可通过数个柱(每次进入下一个柱时受到调节)并最终以经纯化的状态存在于任何所需缓冲液中。
系统说明
该系统中的操作单元包括5ml加工腔室和经由2个阳离子交换膜(CEM)、2个阴离子交换膜(AEM)和2个相反极性的双极膜(注射质子的BPM-H极和注射氢氧根离子的BPM-OH极)连接至该腔室的6个辅助储器，如表1和图9详述。
表1
储器 膜
1 BPM H
2 CEM
3 CEM
4 AEM
5 AEM
6 BPM OH
根据图10，该单元与剩余组分相连。电源连接了两个工作的辅助储器并驱动电流从一个储器通过加工腔室至另一个储器。为增强溶液混合并除去电流产生的热量，使溶液循环进出腔室。这可通过使用蠕动泵来实现，所述蠕动泵通过聚乙烯管(Tygon pipe)连接至腔室端口。沿着该圆形路径，连接有UV检测器、电导计和pH计以分别监控蛋白吸光度、盐浓度和pH水平。可选地，通过在加工腔室中放置3个磁力棒并将后者置于磁性板上进一步加强腔室内的混合。
通过用导线连接合适的辅助储器并使用合适溶液将其充满以控制pH和盐。例如，为插入H+离子，使用0.1M Na2SO4充满储器1和2(参见图9)。随后将阳极置于储器1中，将阴极置于储器2中，并施加例如50mA的电流。该设置将质子从BPM-H中注入腔室中并通过CEM将阳离子移出至储器2。或者，可将阴极与含有0.1M Na2SO4的储器4通过导线连接。在该情况下，阴离子(SO4-2)会通过储器4的AEM进入腔室。
插入缓冲液时，使用含有过量缓冲离子的溶液充满合适的辅助储器，并施加与其电荷相适应的电流。或者，由于缓冲离子的电荷是pH依赖的，可将缓冲溶液中的pH设置为这些分子具有所需电荷的水平。例如，如果需要插入Tris，则制备0.5M pH 7的这类缓冲液。由于Tris的pKa为8，将pH设为7可确保大部分的Tris分子处于带正电荷的状态。随后，向与阳极接触的储器2或3中插入缓冲液。阴极置于Na2SO4溶液中，在例如储器4内。该情况下，施加电流后，Tris会从阳极侧进入腔室且SO4-2会通过阴极进入。可选地，向储器中插入冰以改善容器的散热。
表2显示了多种可能的导线连接以及其相应的离子流。
系统操作如下：
1)将需要调节的溶液插入腔室中，并将合适的缓冲液插入储器中。
2)通过操作蠕动泵和磁力搅拌棒使溶液循环和混合。
3)通过对所选储器施加阳极和阴极设置线路。在电源中设置所需电流。
4)以特定延时施加电流。通常施加50-100mA，持续30-60分钟。在该阶段期间，每隔数分钟对pH计和电导计以及UV检测器进行读取以分别监控pH水平、盐浓度和蛋白吸光度。
5)盐调节完成后，关闭电流并将溶液排除出系统。
注：如下文所述，一些盐调节步骤涉及通过不同储器施加多重电流。这可以通过重复步骤3、4两次或更多次的方式在随后实现，每次针对不同的储器对。或者，这可以通过增加更多的电流供给器并用导线将其各自与不同储器对相连的方式在同时实现。
数据
插入并提取离子的能力在多种类型的盐和缓冲液上都得到了证实，总结于表3：
盐离子 缓冲液
磷酸盐 磷酸盐
Cl- HEPES
SO4-2 Tris
SDS MOPS
TFA 碳酸盐
咪唑
柠檬酸盐
使用这些能力，证实了一些洗脱缓冲液的盐调节。使用该系统调节的目标溶液是标准溶液，其用于蛋白储存。使用不同种类的蛋白进行这些方法，在各步骤前后检测所述蛋白的浓度和活性以检测其回收。所有溶液的体积都是5ml。
调节His标签洗脱缓冲液
初始溶液：20mM Tris缓冲液
500mM NaCl
500mM咪唑
pH 9.5
目标溶液：50mM Tris缓冲液
调节步骤：
步骤1–使pH水平下降至6(进行该步骤是为了使咪唑分子带电)
阳极位置：BPM-H(储器1)，在Na2SO4 0.1M中
阴极位置：CEM(储器2/3)，在Na2SO4 0.1M中
电流和持续时间：100mA，40分钟。
步骤2–除盐至50mM
阳极位置：AEM(储器5/6)，在Na2SO4 0.1M中
阴极位置：CEM(储器2/3)，在Na2SO4 0.1M中
电流和持续时间：100mA，40分钟。
步骤3–Tris插入
阳极位置：AEM(储器5/6)，在Tris 0.5M pH 7中
阴极位置：CEM(储器2/3)，在Na2SO4 0.1M中
电流和持续时间：50mA，40分钟。
蛋白回收：
细胞色素C-
初始浓度1mg/ml
蛋白回收率：80％-85％，根据280nm处的吸光度测量
脂酶-
初始浓度1mg/ml
蛋白回收率：100％，根据280nm处的吸光度测量
蛋白残留活性：>100％
抗兔igG-
初始浓度0.07mg/ml
蛋白回收率：85％，根据280nm处的吸光度测量
蛋白残留活性：88％，根据ELISA测试
使用中性物质调节溶液
除上文所述全部涉及移除和插入带电分子的系统能力外，进行了进一步改良以调节含不带电分子的蛋白溶液。我们利用蛋白是带电分子的事实，驱动其通过障碍(透析膜)、留下所有不带电分子，从而将其与中性物质分离。如图11所示，置于阴极储器中的新CEM膜限定了新的体积空间(“提取池”)，蛋白将会被提取至其中。朝向该膜，插入了具有300kD截留值的透析膜(斯派实验室(SPECTRUM LABS)，商品目录号131450)作为加工腔室的膜之一。为将中性分子与蛋白分离，跨加工腔室施加电流，引起蛋白移动以通过透析膜并沉降在提取池中，同时留下不带电分子。
我们通过从含500mM中性分子D-葡萄糖的小扁豆凝集素(Lentil Lectin)琼脂糖柱的洗脱缓冲液中提取细胞色素C证实了这一想法。该柱用于糖蛋白的纯化。
调节小扁豆凝集素琼脂糖柱洗脱缓冲液：
初始溶液：20mM Tris缓冲液
500mM NaCl
500mM葡萄糖
pH 9.4
提取池中的溶液：PBS缓冲液
调节步骤：
步骤1–除盐至50mM(进行该步骤是为了增强步骤3中的蛋白迁移)
阳极位置：AEM(储器4/5)，在Na2SO4 0.1M中
阴极位置：CEM(储器2/3)，在Na2SO4 0.1M中
电流和持续时间：100mA，40分钟。
步骤1–使pH水平下降至3(进行该步骤是为了建立带正电荷的蛋白)
阳极位置：BPM-H(储器1)，在Na2SO4 0.1M中
阴极位置：CEM(储器2/3)，在Na2SO4 0.1M中
电流和持续时间：100mA，3分钟。
步骤3–蛋白迁移至提取池。在该步骤中，我们使用了两条替代性导线以维持腔室内恒定的盐浓度。每隔数分钟转换导线。
第一种配置(离子插入)
阳极位置：CEM(储器2/3)，在Na2SO4 0.1M pH 7中
阴极位置：透析膜(储器2)，PBS中
电流和持续时间：50mA，3分钟。
第二种配置(离子去除)
阳极位置：AEM(储器5/6)，在Na2SO4 0.1M pH 7中
阴极位置：透析膜(储器2)，PBS中
电流和持续时间：150mA，15分钟
回收率：
细胞色素C-
初始浓度1mg/ml
蛋白回收率：初始量的64％，在提取池中。
初始量的19％留在了腔室中
17％损失。
葡萄糖–
提取池：10％
腔室：90％
术语“一个”或“一种”意在表示“一个(种)或多个(种)”。在述及步骤或要素时，其前导术语“包含”及其变化形式例如“包括”和“含有”旨在表示其它步骤或要素的增加是可任选且不被排除的。本说明书中引用的所有专利、专利申请和其它公开的参考材料都通过引用全文纳入本文中。

Claims (26)

1.一种设备，所述设备包含：
被隔膜分为第一子腔室和第二子腔室的腔室，所述隔膜阻断或基本阻断了所述第一和第二子腔室之间的液体流动；且
所述第一子腔室与第一电极电连通；
所述第二子腔室与第二电极电连通；
所述第一子腔室与第一隔室和第二隔室流体连通，所述第一隔室和第二隔室各自通过阴离子选择性膜、双极膜或阳离子选择性膜与所述第一子腔室隔开；
所述第一隔室具有第一阳极；
所述第二隔室具有第一阴极；
所述第一阳极和第一阴极通过第一隔室、第二隔室和第一子腔室内的第一溶液形成电路；
所述第二子腔室与第三隔室和第四隔室流体连通，所述第三和第四隔室各自通过阴离子选择性膜、双极膜或阳离子选择性膜与第二子腔室隔开；
所述第三隔室具有第二阳极；
所述第四隔室具有第二阴极；
所诉第二阳极和第二阴极通过第三隔室、第四隔室和第二子腔室内的第二溶液形成电路；且
所述第二子腔室包括出口。
2.如权利要求1所述的设备，所述隔室各自通过阴离子选择性膜或者通过阳离子选择性膜与它们对应的子腔室隔开，但不同时采用这两种膜。
3.如权利要求1所述的设备，所述第一电极与所述第一子腔室被第一分离膜隔开且所述第二电极与所述第二子腔室被第二分离膜隔开，所述分离膜能渗透小离子但不能渗透较大分子。
4.如权利要求1所述的设备，所述第二子腔室小于所述第一子腔室。
5.如权利要求1所述的设备，所述第一电极是第三阳极且所述第二电极是第三阴极。
6.如权利要求1所述的设备，所述第一电极是第三阴极且所述第二电极是第三阳极。
7.如权利要求1所述的设备，所述隔室直接连接至对应的子腔室。
8.如权利要求1所述的设备，所述隔室经由导管或通道连接至对应的子腔室。
9.如权利要求1所述的设备，所述第二子腔室还包括一个或多个进口。
10.如权利要求1所述的设备，所述隔膜包括一层交联聚合物，从而抑制流体扩散。
11.如权利要求1所述的设备，所述隔膜含有孔，允许小于分子截留值的肽通过但基本阻断大于分子截留值的肽通过。
12.如权利要求10所述的设备，所述分子截留值是20kDa。
13.一种从样品中纯化目标蛋白或肽的方法，所述方法包括
提供权利要求1-12中任一项所述的设备；
将所述样品加载至所述第一子腔室或所述第一和第二子腔室，加载后所述第一和第二子腔室含有流体；
控制所述第一阳极和第一阴极以及第二阳极和第二阴极以调节所述腔室中所述流体的pH至所述样品的一些组分因pH调整而带电且一些组分不带电；
在所述第一和第二电极之间施加电压，从而使至少一些带电组分移动至所述第二子腔室中；以及
通过所述第二子腔室中的所述出口移除包含所述带电组分的所述第二腔室中的所述流体，从而将所述样品中所述目标蛋白或肽与所述样品的至少一些其他组分分离。
14.如权利要求13所述的方法，一种或多种所述目标蛋白或肽是移动至所述第二子腔室的带电组分，并在移出后收集所述目标蛋白或肽。
15.如权利要求13所述的方法，移动至所述第二子腔室的所述带电组分是污染物并弃去所述污染物。
16.如权利要求13所述的方法，所述样品仅加载至所述第一子腔室。
17.如权利要求13所述的方法，所述样品加载至所述第一和第二子腔室。
18.如权利要求13所述的方法，所述第一电极是第三阴极(负电荷)且所述第二电极是第三阳极(正电荷)，并且
所述控制包括调节所述流体的pH使其低于所述目标蛋白或肽的pI，使得所述目标蛋白或肽具有整体正电荷且所述样品的至少一些其他组分带有负电荷；且
所述施加电压导致带负电荷的组分移动至所述第二子腔室且所述目标蛋白或肽留在所述第一子腔室中；且
移除流体，所述流体包含从所述第二子腔室中移出的组分，并可选地使用新流体在所述第二子腔室中代替移除的流体；并且，随后
控制所述第一阳极和第一阴极以及第二阳极和第二阴极以调节所述腔室中所述流体的pH使其高于所述目标蛋白或肽的pI，使得所述目标蛋白或肽具有整体负电荷；
在所述第一和第二电极之间施加电压，从而使带负电荷的所述目标蛋白或肽移动至所述第二子腔室中；以及
通过所述第二子腔室中的所述出口移除并收集所述第二子腔室中的所述流体，所述流体包含所述目标蛋白或肽，从而将所述样品中所述目标蛋白或肽与所述样品的至少一些其他组分分离。
19.如权利要求13所述的方法，所述第一电极是第三阳极(正电荷)且所述第二电极是第三阴极(负电荷)，并且
所述控制包括调节所述流体的pH使其高于所述目标蛋白或肽的pI，使得所述目标蛋白或肽具有整体负电荷且所述样品的至少一些其他组分带有正电荷；且
所述施加电压导致带正电荷的组分移动至所述第二子腔室且所述目标蛋白或肽留在所述第一子腔室中；且
移除流体，所述流体包含从所述第二子腔室中移出的组分，并可选地使用新流体在所述第二子腔室中代替移除的流体；并且，随后
控制所述第一阳极和第一阴极以及第二阳极和第二阴极以调节所述腔室中所述流体的pH使其低于所述目标蛋白或肽的pI，使得所述目标蛋白或肽具有整体正电荷；
在所述第一和第二电极之间施加电压，从而使带正电荷的所述目标蛋白或肽移动至所述第二子腔室中；以及
通过所述第二子腔室中的所述出口移除并收集所述第二子腔室中的所述流体，所述流体包含所述目标蛋白或肽，从而将所述样品中所述目标蛋白或肽与所述样品的至少一些其他组分分离。
20.如权利要求13所述的方法，所述样品包含蛋白且所述隔膜含有孔，所述孔允许小于分子截留值的肽通过但基本阻断大于所述截留值的肽通过，并且
所述加载包括将所述样品加载至所述第一子腔室，
可选地，所述控制包括控制所述第一阳极和第一阴极以及第二阳极和第二阴极以调节所述第一子腔室中所述流体的pH；
向所述第一子腔室中加入第一蛋白酶，加入时的条件允许所述第一蛋白酶由所述蛋白生成肽；
在所述第一和第二电极之间施加电压，从而使至少一些大小低于所述分子截留值的带电的肽移动至所述第二子腔室中。
21.如权利要求20所述的方法，所述分子截留值是10、15、20、25或30kDa。
22.如权利要求20所述的方法，所述方法还包括，
向所述第一子腔室中加入第二蛋白酶，加入时的条件允许所述第二蛋白酶由所述蛋白生成肽；
在所述第一和第二电极之间施加电压，从而使至少一些大小低于所述分子截留值的带电的肽移动至所述第二子腔室中。
23.如权利要求22所述的方法，所述方法包括，在加入所述第二蛋白酶之前或之后，调节所述第一子腔室中所述流体的pH至对所述第二蛋白酶最优的pH。
24.如权利要求20或22所述的方法，在加入所述第一蛋白酶之前，所述方法包括在所述第一和第二电极之间施加电压，从而使至少一些可能存在的带电的肽从所述样品中移动至所述第二子腔室中。
25.如权利要求20-23中任一项所述的方法，所述方法还包括在所述第二子腔室中收集所述肽。
26.如权利要求24所述的方法，所述方法还包括在所述第二子腔室中收集所述肽。
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