KR20050119128A - 세포내 성분, 및 그로부터 유래된 단백질의 분리 및 축적 - Google Patents

Abstract

본 발명은 세포내 소기관이 고도로 농축되고, 실질적으로 순수하며, 구조적 완전성과 기능이 잘 보존되도록 생물학적 샘플로부터의 세포내 소기관의 분리와 축적을 통한 프로테옴 분획화 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 프로테옴의 복잡성을 감소시키고 희소 단백질과 같은, 연구하기 어려운 단백질의 검출과 단리를 용이하게 하는 방법을 제공한다. 연속-흐름 초원심분리를 이용하여 생물학적 샘플로부터 세포내 소기관을 동시 분리 및 단리함으로써 생물학적 샘플의 프로테옴을 예비-분획화하는 본 발명의 방법은 또한 예를 들어, 로터 속도, 로터 크기, 로터 기하학과 같은 초원심분리 지수에 대한 조정을 통해 용이하고 효과적으로 규모화될 수 있다.

Description

세포내 성분, 및 그로부터 유래된 단백질의 분리 및 축적{SEPARATION AND ACCUMULATION OF SUBCELLULAR COMPONENTS, AND PROTEINS DERIVED THEREFROM}

본 발명은 일반적으로 프로테오믹스(proteomics) 분야 및 세포내 프로테옴(subcellular proteomes)을 이용할 수 있는 분야에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 프로테옴을 구성하는 단백질의 향상된 검출과 분석, 특히 희소(low-abundance) 단백질의 검출과 분석을 달성하기 위한 생물학적 샘플의 프로테옴의 분획화 방법에 관한 것이다. 추가 측면에서, 본 발명은 연속-흐름 초원심분리(continuous-flow ultracentrifugation)에 의해 어느 생물학적 샘플로부터 세포내 소기관의 상이한 타입의 동시 분리와 단리에 관한 것이다. 추가로, 본 발명의 방법은 단리된 세포내 소기관의 순도, 농축(enrichment), 축적 및 완전성(integrity) 및 그에 함유된 단백질을 제공함으로써, 세포내 프로테옴, 특히 희소 단백질을 연구하고 분석하기 위한 강화된 전략을 제공한다.

프로테오믹스는 세포 및(또는) 조직의 각각 및 모든 단백질에 대한 기능, 세포내 또는 세포외 위치, 상호작용, 활성 및 양의 상세한 지식과 이해를 통해 생물학적 현상 - 예를 들어, 질병, 세포 분화, 성장 주기 및 진화 - 를 이해하려고 시도한다. 그러한 이해는 예를 들어, 질병의 진단, 치료 및 예방을 크게 진전시킬 것이다. 프로테오믹스는 예를 들어 약물 발견, 전임상 및 임상 연구, 임상 진단학, 수의 의약, 법정의학, 농화학 및 생체치료학에서 응용가능성을 발견한다.

그러나, 유전체학 분야와 비교하여, 프로테오믹스는 상당히 더 높은 수준의 복잡성을 갖는 것으로 간주된다. 이 복잡성은 전형적으로 시간의 함수로서, 단백질 함량, 배치, 번역후 수식 및 단백질-단백질 상호작용에서의 동적 변화로부터 기인한다. 이들 변화는 개체, 조직, 세포 및 소기관 간에 변화하고 예를 들어, 성장, 분화, 노쇠, 환경적 변화와 질병에 반응하여 발생한다.

현재, 모든 수준의 프로테옴 조직을 충분히 다룰 수 있는 단일 전략은 없다. 더욱이, 예를 들어, 단백질 배치와 같은 동적 프로테옴 변화를 모니터링하는 것은 소기관 수준에서의 프로테옴 분석을 위한 특수한 기술을 요구한다.

세포내 분획화 기술은 전통적으로 소기관을 단리하고 특성분석하기 위하여 세포 생물학과 생화학에서 핵심적 방법 중에 있어왔다(Bonifacino 등(2000), Supplement 3-6, John Wiley ＆ Sons, Inc., NY). 이들 과정은 밀도 구배 원심분리, 자유-흐름 전기영동 및 리간드 친화도 크로마토그래피와 같은 다양한 분리 기술을 이용한다. 대부분의 경우, 세포내 소기관의 조제물은 상이한 공급원으로부터 제조된 단일의, 표적화된 소기관을 위해 최적화된다. 표적화된 소기관을 단리하는 것과는 별도로, 조제물의 나머지는 일반적으로 찌꺼기로 간주되고 폐기된다.

표적화된 소기관을 단리하는 일례는 Price 등((1973), Analytical Biochemistry 54: 239-246)에 기재되어 있으며, 여기에서 저자는 콜로이드성 실리카 구배에서 CF-6 로터에서의 연속-흐름 구역 원심분리에 의한 시금치 브리(spinach brie)로부터의 보전된(intact) 엽록체의 단리와 분리를 기재하고 있다. 저자는 상 대비 현미경과 엽록소 물질 단위 당 엽록체 특이적 단백질의 농도에 의해 뒷받침되는 엽록체의 회수를 보고하고 있다. 다른 예에서, Cline 및 Dagg((1978) Methodological Developments in Biochemistry, Longman, 61-70면)는 J-Ⅰ과 RK-Ⅱ와 같은 등밀도 밴딩 구역 로터를 갖는 연속 샘플-흐름을 이용하여 다른 식물 세포 성분으로부터 엽록체의 분리를 보고하고 있다.

세포내 수준에서 프로테옴의 동적 변화를 모니터링하는 다른 보고는 아래 언급되는 논문에 기재되어 있다.

Dreger 등((2003), Mass. Spec., 22: 27-56)은 예를 들어, 단백질 전좌(translocation) 현상과 같은, 소기관 수준에서의 동적 프로테옴 변화를 모니터링하는 것이 대부분의 분획화 기술이 단일 소기관 타입을 농축하도록 설계되어 있으므로 특히 어려운 작업이라고 보고하고 있다. 저자는 당업자에게 소기관-특이적 단백질 전좌의 규명을 제공하기 위하여 소기관의 적어도 두 타입을 동시에 모니터링하는 새로운 세포 분획화 기술을 개발하는 것이 필요하다고 보고하고 있다.

Dreger 등((2003) Eur. J. Biochem., 270: 589-599)은 몇몇 단백질이 특정 생리적 상태에서만 특정 세포내 구조와 관련되어 있을 수 있으므로 단백질 전좌 현상을 모니터링하는 향상된 기술에 대한 필요성을 보고하고 있다. 저자는 예를 들어, 시토졸 및 핵질 분획과 같은, 주요 세포 분획을 분리하는 것이 가능함을 진술하는 한편, 저자는 그들이 소기관을 농축하지 못하고, 그 결과, 소기관-특이적 단백질 전좌를 규명하지 못하므로 이들 연구는 당업자에게 동적 프로테옴 변화에 대해 제한된 정보를 제공함을 보고하고 있다.

부가적으로, Gerner 등((2000) J. Biol. Chem. 275: 39018-39026)은 TCP-1A 단백질의 세포 배치에 대한 Fas-유도된 고사의 영향을 분석하고 있다. 그러나, 이 연구는 당업자에게 시토졸에 있는 어느 특정 소기관이 TCP-1A 단백질을 획득하였는지에 관한 정보를 제공하지 못한다. 이 정보를 얻는 것은 특정 단백질 전좌 현상을 차단하거나 증진하는 것을 목적으로 하는 특정 치료법을 설계하는데 유용할 것이다.

유사한 연구가 Huber 등((2003) Circulation Research, 92: 962-968)에 의해 검토되었다. 이 최근 2003년 검토에서, 저자는 현재 기술 상태가 차등적 원심분리에 의해 세포를 시토졸, 핵 및 막과 같은 세 주요 성분으로 분획화하는 것을 허용함을 기재하고 있다. Gerner 등의 논문과 유사하게, 이들 연구는 소기관-특이적 단백질 배치의 동적 변화에 대한 정보를 제공하지 못한다.

현재, 소기관의 적어도 두 타입이 높은 순도와 보전성을 유지하면서 동시에 농축, 축적 및 분리되어, 예를 들어, 희소 단백질과 같은 단백질에 대한 검출 한계를 증가시킬 수 있는 세포내 분획화 기술을 개발할 필요성이 당업계에 여전히 존재한다. 또한 당업계에는 세포내 소기관의 서브타입이 충분한 양으로 축적되고 분리되며 정성적으로 분석됨으로써 세포내 소기관의 서브타입의 프로테옴 프로파일이 결정될 수 있는 분획화 기술을 개발할 필요성이 존재한다.

발명의 요약

본 발명의 일 측면은 샘플, 바람직하게는 생물학적 샘플로부터 세포내 소기관과 같은, 소기관의 분리와 축적에 관한 것이다. 소기관의 분리와 축적은 예를 들어, 연속-흐름 과정에 의한 분획화에 의해 수행된다. 연속-흐름 과정은, 다음으로, 원심분리기에 의해 발생되는 것과 같은, 원심력을 이용한다. 일 구체예에서, 연속-흐름 초원심분리기가 소기관을 분리하고 축적하는데 사용된다. 그러나, 다른 연속-흐름 과정이 사용될 수 있으며 본 발명은 초원심분리기의 사용으로 제한되지 않음이 이해된다. 소기관의 내용물은 분획화된다. 예를 들어, 소기관은 용해되고(lysed) 프로테옴이 그로부터 방출될 수 있다. 프로테옴으로부터의 단백질과 펩티드는 예를 들어, 크로마토그래피, 전기영동, 연속-흐름 원심분리기 또는 기타 당업계에 인식되어 있는 기술에 의해 분리될 수 있다. 분리된 단백질과 펩티드는 특성분석되고 예를 들어, 질량 분광측정법에 의해 정량적으로 분석될 수 있다. 그 후, 단백질은 동정되고, 가능한 경우, 특성분석되고 하류 응용을 위해 사용될 수 있다.

보다 구체적으로, 분리 및 축적된 세포내 소기관과, 분리 및 축적된 희소 단백질 모두 하류 응용에 사용될 수 있다. 그러한 응용은 예를 들어, 세포내 소기관 및(또는) 희소 단백질을 판매하고, 세포내 소기관 및(또는) 희소 단백질을 임대하고, 세포내 소기관 및(또는) 희소 단백질을 라이센싱하고, 세포내 소기관 및(또는) 희소 단백질에 대한 지적재산권 이익을 보호하고, 세포내 소기관 및(또는) 희소 단백질에 관한 정보를 임의로 제3자에게 제공될 수 있는 데이터베이스에 위치시키는 것을 포함한다.

이 배경기술에 대하여, 본 발명의 일 구체예에 따라, a) 샘플로부터 소기관을 방출시키고; b) 소기관을 연속-흐름 원심분리기 내의 밀도 구배로 도입하고; c) 소기관의 적어도 두 타입이 밀도 구배 내에서 이동하기에 충분한 원심력을 적용하고; d) 세포내 소기관의 적어도 두 타입을 이용할 수 있도록 밀도 구배로부터 세포내 소기관의 적어도 두 타입을 수집하는 단계를 갖는, 소기관을 포함하는 샘플로부터 소기관을 농축하고 축적하는 방법이 제공된다.

본 발명의 다른 구체예에서, a) 소기관을 포함하는 샘플로부터 소기관을 방출시키고; b) 소기관을 연속-흐름 원심분리기 내의 밀도 구배에 도입하고; c) 원심력을 적용하여 밀도 구배 내에서 소기관을 농축하고 축적시키고; d) 밀도 구배로부터 소기관을 수집하고; e) 소기관을 용해하여 프로테옴을 형성하고; f) 프로테옴으로부터 희소 단백질을 수집하는 단계를 갖는, 소기관으로부터 희소 단백질을 축적하는 방법이 제공된다.

본 발명의 추가 구체예에서, a) 균질화물 중 샘플로부터 세포내 소기관의 적어도 두 타입을 방출시키고; b) 균질화물을 밀도 구배 상에 연속적으로 흘려보내고 원심력을 소기관의 적어도 두 타입이 밀도 구배에서 소기관의 적어도 두 타입 각각이 구배 밀도와 각 소기관의 부력 밀도가 실질적으로 동일하도록 밀도 구배의 위치로 진입하거나 이동하기에 충분한 양으로 적용하고; c) 밀도 구배로부터 소기관의 적어도 두 타입을 단리하는 단계를 갖는, 생물학적 샘플로부터 소기관의 적어도 두 타입을 분리하는 방법이 제공된다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, a) 조직이나 세포 물질로부터 생물학적 샘플을 얻고; b) 조직 재료를 균질화하거나 세포 물질을 용해하여 소기관 균질화물을 형성하고; c) 소기관 균질화물을 밀도 구배를 갖는 연속-흐름 초원심분리기에 공급하고; d) 소기관의 적어도 두 타입이 밀도 구배 내에서 이동하고 축적하도록 원심력을 적용하고; e) 소기관의 적어도 두 타입을 이용하기 위하여 밀도 구배로부터 소기관의 적어도 두 타입을 수집하는 단계를 갖는, 생물학적 샘플로부터 소기관의 적어도 두 타입을 농축하고 축적하는 방법이 제공된다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, a) 세포내 소기관을 포함하는 샘플로부터 세포내 소기관을 방출시키고; b) 세포내 소기관을 연속-흐름 원심분리기 내의 밀도 구배에 도입하고; c) 세포내 소기관이 밀도 구배 내에서 이동하고 축적하도록 원심력을 적용하고; d) 밀도 구배로부터 세포내 소기관을 수집하고; e) 세포내 소기관을 용해하여 프로테옴 현탁액을 형성하고; f) 프로테옴 현탁액으로부터 희소 단백질을 수집하고; g) 희소 단백질을 판매하고, 희소 단백질을 임대하고, 희소 단백질을 라이센싱하고, 희소 단백질에 대한 지적재산권 이익을 보호하고, 희소 단백질에 관한 정보를 데이터베이스에 위치시키고, 데이터베이스에 있는 희소 단백질에 관한 정보를 검토하는 것으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 과정에서 희소 단백질을 이용하는 단계를 갖는, 세포내 소기관으로부터 희소 단백질을 축적하는 방법이 제공된다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, a) 생물학적 샘플을 원심분리기로 도입하고, 원심분리기는 분리된 층으로 분리되도록 적합화된 밀도 구배 용액을 포함하고, 각각의 층은 보유능력(holding capacity)을 가지며; b) 생물학적 샘플을 연속 모드로 원심분리하여 밀도 구배 용액 내의 분리된 층에서 축적되고 정제된 세포내 소기관을 제조하고, 여기에서 각각의 세포내 소기관의 적어도 두 타입은 밀도 구배 용액 내의 별도의 분리된 층 내에서 이동하고, 세포내 소기관의 적어도 두 타입은 적어도 두 분리된 층의 보유능력 또는 바로 그 미만의 농도로 축적되며, 적어도 두 축적된 세포내 소기관이 실질적으로 보전된 것인 단계를 갖는, 세포내 소기관을 포함하는 생물학적 샘플로부터 세포내 소기관을 정제하고 축적하는 방법이 제공된다.

본 발명의 다른 추가 구체예에서, 연속-흐름 초원심분리기를 이용하여 생물학적 샘플로부터 세포내 소기관을 그로부터 희소 단백질을 단리하고 검출하기 위해 충분한 수율과 순도로 수득하는 단계를 갖는, 세포내 소기관을 축적하는 방법이 제공된다.

본 발명의 다른 구체예에서, 연속-흐름 초원심분리기를 이용하여 생물학적 샘플로부터 세포내 소기관의 적어도 두 상이한 타입을 그로부터 희소 단백질을 단리하고 검출하기 위해 충분한 수율과 순도로 수득하는 단계를 포함하는, 세포내 소기관의 적어도 두 상이한 타입을 축적하는 방법이 제공된다.

본 발명의 다른 추가 구체예에서, a) 제1 시점에서 생물학적 샘플로부터 세포내 소기관의 적어도 두 타입을 방출시키고; b) 세포내 소기관의 적어도 두 타입을 연속-흐름 초원심분리기 내의 밀도 구배에 도입하고; c) 세포내 소기관의 적어도 두 타입이 밀도 구배 내에서 이동하도록 원심력을 적용하고; d) 밀도 구배로부터 세포내 소기관의 적어도 두 타입을 수집하고; e) 세포내 소기관의 적어도 두 타입으로부터 단백질을 단리하고 정제하여 제1 시점에서 세포내 소기관의 적어도 두 타입의 프로테옴 프로파일을 결정하고; f) 제2 시점에서 제2 생물학적 샘플로부터 세포내 소기관의 적어도 두 타입을 방출시키고; g) 단계 b) 내지 d)를 반복하고; h) 세포내 소기관의 적어도 두 타입으로부터 단백질을 단리하고 정제하여 제2 시점에서 세포내 소기관의 적어도 두 타입의 프로테옴 프로파일을 결정하고; i) 제1 및 제2 시점에서 프로테옴 프로파일을 분석하여 프로테옴 프로파일의 변화를 시간의 함수로서 검출하는 단계를 갖는, 세포내 소기관의 적어도 두 타입의 프로테옴 프로파일을 시간의 함수로 분석하는 방법이 제공된다.

본 발명의 다른 추가 구체예에서, (a) 제1 생물학적 샘플의 제1 및 제2 소기관에서 전좌 단백질의 상대적 양을 결정하고, 제1 생물학적 샘플은 제1 시점에서 단리되고, 제1 생물학적 샘플을 제1 및 제2 소기관을 균질화물로 방출하기에 충분한 조건 하에서 균질화하고, 제1 및 제2 소기관은 각각 세포내 프로테옴을 포함하며, 균질화물을 연속-흐름 초원심분리기 내의 밀도 구배에 도입하고, 제1 및 제2 소기관이 밀도 구배 내에서 이동하도록 균질화물에 원심력을 적용하고, 밀도 구배로부터 제1 및 제2 소기관을 분리하고, 제1 및 제2 소기관의 세포내 프로테옴을 가용화하고, 제1 생물학적 샘플의 제1 및 제2 소기관에서 전좌 단백질을 검출하고, 제1 생물학적 샘플의 제1 및 제2 소기관에서 검출된 전좌 단백질의 수준을 측정하는 단계를 포함하며; b) 제2 생물학적 샘플의 제1 및 제2 소기관에서 전좌 단백질의 상대적 양을 결정하고, 제2 생물학적 샘플은 제2 시점에서 단리되고 상기 단계를 반복하며; c) 각각의 시점에서 단리된 각각의 생물학적 샘플에 대한 제1 및 제2 소기관에서 검출된 전좌 단백질의 측정된 수준을 비교함으로써 전좌 단백질의 전좌 과정을 시간의 함수로 분석하는 단계를 갖는, 생물학적 샘플의 전좌 단백질의 전좌 과정을 분석하는 것으로서, 전좌 과정은 생물학적 샘플의 제1 소기관에서 제2 소기관으로 시간의 함수로서 전좌 단백질의 세포내 이동에 관한 것이고, 시간의 함수는 적어도 두 시점을 갖는, 방법이 제공된다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, a) 생물학적 샘플로부터 세포내 소기관 및 그의 서브타입을 방출시키고; b) 세포내 소기관과 그의 서브타입을 연속-흐름 초원심분리기 내의 밀도 구배에 도입하고; c) 세포내 소기관과 그의 서브타입이 단일 실행(run)에서 밀도 구배 내에서 이동하고 축적하도록 원심력을 적용하고; d) 밀도 구배로부터 세포내 소기관과 그의 서브타입을 수집하고 그로부터 단백질을 수득하는 단계를 갖는, 세포내 소기관 및 그의 서브타입으로부터 단백질을 수득하는 방법이 제공된다.

본 발명의 이들 및 다른 구체예들이 아래 본 발명의 상세한 설명에 제공되거나 그로부터 자명하다.

예로써 제공되지만, 본 발명을 기재된 특정 구체예로만 제한하도록 의도되지 않는, 아래 상세한 설명은 첨부 도면과 결합하여 가장 잘 이해될 수 있다:

도 1은 본 발명의 일 구체예, 소기관의 분리 및 축적방법을 도시한 플로 차트이다.

도 2는 단백질 특성분석 및 정량 방법을 도시한 플로 차트이다.

도 3은 랫트 간에 대해 수집된 분획에서의 미토콘드리아, 소포체, 골지 및 원형질막의 백분율을 도시한다.

도 4는 랫트 간에 대해 수집된 분획에서 미토콘드리아, 소포체, 골지 및 원형질막의 농축을 도시한다.

도 5는 (1) 소포체(76.3％), (2) 미토콘드리아(72.6％), (3) 골지체(89.3％), 및 (4) 원형질막 조제물에 대한 백분율(％) 완전성을 도시한다.

도 6은 랫트 간 세포의 조 추출물 샘플과 본 발명의 방법에 의해 제조된 소포체 분획의 소기관 함량과 미세구조를 비교한 투과 전자 현미경사진을 도시한다.

도 7은 HeLa 세포에 대해 수집된 분획에서의 미토콘드리아, 소포체, 골지 및 원형질막의 백분율을 도시한다.

도 8은 HeLa 세포에 대해 수집된 분획에서 미토콘드리아, 소포체, 골지 및 원형질막의 농축을 도시한다.

도 9는 본 발명의 방법에 의한 특정 소기관의 농축 수준을 도시한다.

도 10은 도 7에 나타낸 각각의 분획에 대해 정량화된 신호를 도시한다.

도 11은 균질화 및 원심분리된 HeLa 세포의 수집된 원심분리-후 분획에 대한 백분율 슈크로스 함량을 도시한다.

도 12는 조 추출물(CE) 샘플과 소포체 분획(ER)에 대한 2D 젤 전기영동 분석의 비교를 도시한다.

도 13은 HeLa 세포 조 추출물, 골지 분획 및 원형질막 분획의 2D 젤 전기영동 분석의 결과를 도시한다.

도 14는 도 13의 스팟 12, 13 및 14에 대한 질량 분광측정 데이터를 도시한다.

도 15는 랫트 간 세포 조 추출물과 소포체 분획의 2D 젤 전기영동 분석의 결과를 보여준다.

도 16은 랫트 간 세포 조 추출물과 미토콘드리아 분획의 2D 젤 전기영동 분석의 결과를 보여준다.

도 17은 랫트 간 세포 조 추출물과 골지 분획의 2D 젤 전기영동 분석의 결과를 보여준다.

도 18은 랫트 간 세포 조 추출물과 원형질막 분획의 2D 젤 전기영동 분석의 결과를 보여준다.

도 19는 본 발명의 방법에 관한 정보를 제3자에게 제공하기 위한 플로 차트를 보여준다.

도 20은 본 발명의 방법으로부터 나오는 지적재산권을 보호하기 위한 플로 차트를 보여준다.

도 21A와 21B는 본 발명의 방법으로부터 얻은 펩티드 서열을 이용하는 상동성 검색의 결과를 보여준다.

도 22A와 22B는 2D-젤 분석을 이용한 단백질의 검출한계와 단백질 카피 수에 대해 상대적인, 단백질 검출 한계에 도달하기 위해 요구되는 생물학적 재료의 예상량을 보여준다. 도 22A와 22B는 각각 세포와 조직에 관한 것이다.

이들 및 다른 구체예가 아래 상세한 설명에 의해 개시되거나, 그로부터 자명하고 그에 의해 포함된다.

도 1과 2에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 일 구체예는 조직 또는 세포의 형태로 생물학적 샘플을 수득하고; 조직을 균질화하고(거나) 세포를 용해하여 균질화물을 제공하고; 임의로 정화하여 예를 들어, 핵과 같은, 특정 물질을 분리하고; 균질화물을 그 안에 밀도 구배를 갖는 연속-흐름 초원심분리기에 공급하고; 균질화물에 원심력을 적용하여 보전된 소기관을 분리 및 축적하고; 소기관을 수집하고; 소기관을 추가 하류 과정에 사용하는 것을 포함한다. 하나의 그러한 하류 과정은 소기관을 용해하여 프로테옴을 방출시킴으로써 소기관으로부터 희소 단백질을 수득하고; 그로부터 희소 단백질을 분리 및 축적하고; 희소 단백질을 특성분석, 정량 및 가능한 경우, 동정하고; 희소 단백질을 추가 하류 공정에 이용하는 것을 포함한다.

샘플 수득. 도 1에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 방법은 당업자에게 알려진 어느 방법을 이용하여 어느 공급원으로부터 단리되거나 수득된, 당업자에게 알려진 어느 생물학적 샘플, 또는 생물학적 샘플을 포함하는 어느 샘플에 적용될 수 있다.

본 발명의 목적을 위해, "생물학적 샘플", "생물학적 표본" 또는 "생물학적 물질"이나 당업자에게 알려진 어느 다른 유사한 변형과 동일한 의미를 가질 수 있는, "생물학적 재료"는 예를 들어, 전체 세포, 세포 추출물, 조직, 균질화된 세포나 조직, 단백질 용액, 예를 들어 소기관이나 소기관 서브타입과 같은, 세포내 구조 또는 당업자가 생물학적 재료로 간주하는 어느 다른 재료를 포함하는, 당업자에게 알려져 있는 어느 타입의 생물학적 재료를 말한다. 생물학적 재료는 또한 예를 들어, 소기관이나 소기관 서브타입과 같은, 그에 첨가된 생물학적 재료를 포함하는, 예를 들어, 인삼염 완충액과 같은, 예를 들어, 비-생물학적 용액과 같은, 어느 용액, 혼합물, 현탁액, 물질, 완충액, 또는 유사한 것 중 하나일 수 있다. 보다 구체적으로, 본 발명의 생물학적 재료는 예를 들어, 어느 원핵생물이나 진핵생물; 척추동물이나 무척추동물; 또는 예를 들어 동물, 포유류, 인간, 새, 말, 어류, 설치류, 곤충, 또는 식물 등과 같은 어느 유기체, 또는 그들의 어느 조합을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는, 어느 알려진 유기체나 그의 일부나 바이러스로부터 유래된, 예를 들어, 기관, 체액, 혈액, 혈청, 혈장, 타액, 누액, 분변, 뇨, 정액, 점액, 조직, 조직 균질화물, 세포 추출물 또는 척수액과 같은, 살아있거나 죽은, 어느 알려진 공급원으로부터 수득될 수 있다.

일 구체예에서, 생물학적 샘플은 세포이다. 본 발명에 따른 "세포"는 통상적인 생물학적 의미에서 독립적 복제를 할 수 있는 최소의, 막-결합체로 의미된다. 더 넓은 의미로, 세포는 진핵성 또는 원핵성일 수 있다. 또한, 세포는 다세포 유기체, 조직, 세포 또는 조직 배양물, 세포 배양물 중의 바이러스-감염된 세포, 또는 어느 생물학적 샘플로부터 수득될 수 있음이 이해될 것이다. 세포, 특히 진핵 세포가 예를 들어, 소기관과 다른 세포내 구조를 포함하는, 세포내 구조를 함유함이 추가로 이해될 것이다.

본 발명에서 동일한 의미를 갖는, "소기관"과 "세포내 소기관"은 통상적인 생물학적 의미로 당업자에 의해 이해된다. 소기관은 세포의 구성성분을 형성하고 전형적으로 특징적인 기능을 수행하는 어느 타입의 복잡한 구조를 포함한다. 본 발명은 예를 들어 미토콘드리아, 엽록체, 퍼옥시솜, 골지체, 소포체, 핵, 프로테오솜, 리보솜 및 예를 들어, 활면 및 조면 미토콘드리아, 초기 및 후기 소포체, 또는 당업자에 의해 이해되거나 발견가능한 특정 소기관의 어느 서브타입이나 아집단과 같은 어느 알려지거나 알려지지 않은 소기관의 서브타입과 같은, 당업자에게 알려진 어느 생물학적 샘플로부터의 어느 소기관을 착안한다.

본 발명에 따르면, 소기관 "서브타입" 또는 "아집단"은 그 동일한 집단의 소기관의 동일한 타입의 나머지로부터 어느 방식으로 구별되는 세포에서 특정 소기관 집단의 하위-부분을 말할 수 있다. 예를 들어, 소기관 서브타입은 예를 들어, 소기관의 전체 크기와 형상, 소기관의 밀도, 발현되는 특징적 단백질 집단, 소기관 막의 조성, 또는 당업자에게 알려진 어느 다른 생리적 또는 형태적 구별에 기초한 차이를 포함한다. 일부 소기관은 "소기관 막"이라 불리는 막을 함유한다.

또한 소기관은 예를 들어, 생체분자의 특징적 세트, 특히 세포의 전체 프로테옴의 서브세트로서 세포의 전체 단백질 정원(complement)의 서브세트를 구성하는 단백질의 특징적 세트를 가짐이 이해될 것이다. 예를 들어, 소기관이나 세포, 조직이나 게놈의 전체 단백질 정원의 서브세트를 형성하는 그들 단백질과 같은, 세포내 구조와 연관된 단백질의 서브세트는 "세포내 프로테옴"으로 언급될 수 있다. 소기관의 특정 경우에 있어서, 소기관-특이적 단백질 - 소기관 막 내 및(또는) 그에 직접 또는 간접적으로 결합, 통합 또는 부착된 그들 단백질 - 과 관련된 세포내 프로테옴은 "소기관 프로테옴"으로 언급될 수 있다. 소기관 서브타입은 그 소기관을 포함하는 소기관들의 일부 또는 모든 각각의 나머지 서브타입의 결합으로부터 형성되는 프로테옴으로부터 구별될 수 있도록 그 조성에서 독특한 프로테옴을 가질 수 있다.

당업자는 용어 "프로테옴"의 조어가 일반적으로, 프로테옴을 "게놈, 세포 또는 조직에 의해 발현되는 모든 단백질"로 정의한, 맥과이어 대학(오스트레일리아)의 마크 윌킨스에게 일임됨을 이해할 것이다. 예를 들어, 본 발명의 목적을 위해, 용어 프로테옴은 전체 단백질 정원을 가리키고 게놈, 세포, 조직 또는 소기관의 모든 발현 단백질을 포함한다. 그것으로서, 프로테옴은 예를 들어, 세포의 성장 및(또는) 분화 단계, 내부 및 외부 환경 인자, 질병 인자 및 당업자에게 알려진 어느 다른 인자와 같은, 다양한 상이한 인자에 따라 변화할 수 있는 게놈, 세포 또는 조직에 의해 발현되는 단백질의 동적 컬렉션으로 생각되어질 수 있다.

일부 경우, 예를 들어, 미토콘드리아와 엽록체와 같은 특정 소기관이 염색체-함유 소기관과 관련된 단백질의 일부를 발현할 수 있는 그들 자신의 염색체를 함유함이 이해될 것이다. 그러나, 당업자는 소기관 프로테옴을 구성하는 대다수의 단백질이 세포의 염색체에 의해 발현되고 예를 들어, 전좌와 액포 전달과 같은, 다양한 기작을 통해 관심있는 소기관으로 수송됨을 이해할 것이다.

본 발명의 목적을 위하여, 용어 "프로테오믹스"는 예를 들어, 유기체, 기관, 조직, 세포외 공간, 세포 또는 소기관, 또는 그들의 어느 조합에서 모든 단백질의 실체, 양, 구조 및 생화학적 및 세포적 기능을 포함하는 성질과, 이들 성질이 공간, 시간 및 생리적 상태에서 어떻게 변화하는지를 확립하기 위한 노력을 말한다. 추가로 프로테오믹스는 공간, 시간 및 생리적 상태에 대한 관점으로, 예를 들어, 단백질 발현 프로파일, 번역후 수식, 세포내 배치, 및 단백질-단백질 상호작용과 같은, 단백질의 많은 특징적 성질과 행동의 특성분석을 통해 세포 과정의 성질을 조사하는 것으로 이해될 것이다. 프로테오믹스는 단백질의 동정과 정량뿐 아니라 그들의 배치, 수식, 상호작용, 활성 및 궁극적으로 그들의 기능의 결정을 포함한다.

생물학적 샘플의 균질화/용해. 도 1을 다시 참조하면, 일단 생물학적 샘플이 수득되면, 생물학적 샘플은 균질화되고(거나) 용해된다. 균질화 단계의 산물은 전형적으로 균질화물이라 언급된다. 균질화물은 당업계에 인식된 바와 동일한 의미를 갖는 것으로 의미된다. 따라서, 균질화물은 생물학적 샘플의 균질화 및(또는) 용해 후 생물학적 샘플의 형태이다. 균질화 및(또는) 용해의 방법은 아래에서 추가로 설명된다.

균질화 및(또는) 용해에 사용되는 방법과 재료는 당업계에 일반적으로 알려져 있다. 본 발명에 따르면, 용어 "균질화"와 예를 들어 균질화하다나 균질화하는과 같은 관련 용어는 조직을 구성하는 세포와 세포외 물질과 같은, 더 작고 더 균일한 성분으로의 조직의 파쇄를 달성하기 위한 당업자에 의해 사용되는 다양한 기술 중 어느 것을 가리킬 수 있다. 예를 들어, 조직의 균질화는 세포가 서로로부터 또한 어느 세포외 물질로부터 분리되고(거나) 탈착되도록 조직을 개개 세포로 파괴하는 것을 가리킬 수 있다. 용어 균질화 및(또는) 용해는 또한 세포, 예를 들어, 조직의 세포를 그들의 세포내 구성성분으로 파쇄하는 단계를 가리킬 수 있다. 따라서, 본 발명에 따르면, 균질화된 조직이나 균질화 및(또는) 용해된 세포는 예를 들어, 소기관을 포함하는, 세포내 성분의 방출을 가져올 수 있다. 예를 들어, 소기관과 같은, 세포로부터의 세포내 성분의 "방출"에 의해, 세포내 성분이 더 이상 세포 또는 원형질 막에 의해 국한된 채로 남아있지 않음이 의미된다.

당업자는 조직 및(또는) 세포의 파쇄를 수행하기 위해 이용가능한 다양한 접근법을 이해할 것이다. 용해 및(또는) 파쇄가 예를 들어, 소기관과 같은, 세포내 성분이 방출되도록 세포막의 파쇄를 가져올 수 있음이 이해될 것이다. 균질화 및(또는) 용해 조건은 소기관 막의 파쇄를 최소화하면서 세포막이 파쇄되도록 조정될 수 있다. 소기관 막의 용해를 최소화하면서 세포막의 용해를 달성하기 위한 이들 조건을 조정하는 방법은 알려져 있고 예를 들어, Current Protocols in Cell Biology(1999), Ed. J. S. Bonifacino 등 및 Subcellular Fractionation: A Practical Approach(1997), Ed. J. M. Graham 등에서 발견될 수 있다.

본 발명은 예를 들어, 어느 화학-기초, 기계-기초, 압력-기초, 또는 온도-기초한 기술과 같은, 당업자에게 알려져 있거나 이용가능해질 수 있는 생물학적 샘플을 균질화하고(거나) 용해하는 어느 기술을 착안한다. 예를 들어, 그러한 방법은 세포 및(또는) 조직을 주사기의 볼-베어링의 좁은 환과 금속 블록("볼-베어링 균질화기")을 통해 통과시켜 세포 및(또는) 조직에 액체 전단력을 적용하거나; 세포 및(또는) 조직을 작은 구멍을 통한 고압 하에 두거나; 세포 및(또는) 조직을 고압 하에서 질소 기체에 노출시킨 후 예를 들어, 주사기 밸브와 같은, 니들 밸브를 통하도록 하거나; 세포막을 파쇄하기 위하여 세포를 초음파처리하거나; 세포 및(또는) 조직을 예를 들어, 트윈-20이나 나트륨도데실설페이트("SDS")와 같은, 계면활성제와 접촉시키거나; 조직 및(또는) 세포를 예를 들어, 0.1 몰의 슈크로스 용액과 같은, 예를 들어 등삼투 매질, 저삼투 매질과 같은, 삼투압을 제공하는 용액과 접촉시키거나; 조직 및(또는) 세포를 조직 블렌더(웨어링(Waring)™ 블렌더, 웨어링 래보라토리, CT와 같은)로 도입하거나; 상기 방법의 어느 조합이나 당업자에게 알려진 어느 다른 부가적 방법을 포함할 수 있다.

당업자는 어느 생물학적 재료(예를 들어, 심장, 췌장, 샘, 근육, 뼈, 신장, 피부, 간, 폐, 뇌, 또는 혈액, 또는 기타 기관, 및 예를 들어, 조직 배양 세포, 세포 배양 세포, 또는 현탁액 중 어느 타입의 세포를 포함하는, 특정 공급원의 세포와 같은)로부터의 특정 공급원 및(또는) 타입의 조직이 특정 조직 및(또는) 세포를 위해 설계된 기술이나 과정에 따라 균질화될 수 있음을 이해할 것이다. 예를 들어, 간 세포는 그 특정 타입의 세포의 균질화나 용해를 위해 설계된 균질화 방법을 가질 것이다. 많은 세포 및 조직 균질화 및(또는) 세포 용해 기술에 관한 정보는 예를 들어, Sambrook J. 등, Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2판, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press와 같은 상업적으로 입수가능한 핸드북에서 확인될 수 있다.

용어 "실질적으로 보전된"은 균질화 및(또는) 용해 후 또는 예를 들어, 연속-흐름 원심분리 과정과 같은 연속-흐름 과정 동안이나 후에 소기관이 세포 및(또는) 조직으로부터 방출되는 단계를 포함하는, 본 발명의 방법 중 어느 단계나, 본 발명의 방법 중 어느 다른 단계에서, 세포내 성분, 특히 소기관의 완전성의 상대적 정도를 가리킨다. 소기관이 실질적으로 보전적인지 여부는 예를 들어, 소기관-특이적 마커의 정량적 효소 어세이, 소기관-특이적 마커에 대한 웨스턴 블랏, 또는 예를 들어 투과 전자 현미경(TEM)과 같은 현미경을 이용한 시각적 조사에 의한 것과 같이, 당업자에게 알려진 어느 방법에 의해 결정될 수 있다. 현미경 사용에 있어서, 당업자는 어느 생물학적 공급원으로부터의 소기관의 어느 및 모든 타입 및(또는) 세포 또는 조직 타입의 형태적 특성과 특징을 이해하며 특정 형태적 특성에 기초하여 특정 소기관이 보전적인지 여부를 판단하는 방법을 이해할 것이다.

일 구체예에서, 소기관 완전성은 효소적으로 측정될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 방법에 따른 미토콘드리아의 조제물과 같은, 관심있는 소기관 조제물은 예를 들어, 원심분리되어 완전한 소기관이나 예를 들어, 소기관 단편과 같은, 그의 일부를 포함할 수 있는, 불용성 부분을 펠렛화할 수 있다. 상등액은 관심있는 단편화된 소기관으로부터 방출된, 어느 가용성 단백질 및(또는) 효소를 포함하는, 어느 가용성 성분을 함유한다. 다음으로, 예를 들어, 관심있는 특정 소기관에 특이적인 효소와 같은, 소기관-특이적 마커의 상대적 수준이나 양이 소기관 펠렛과 잔존 상등액 분획 둘다에 관하여 측정될 수 있다. 펠렛화된 소기관은 소기관-특이적 마커를 측정하거나 검출하기 전에 용해되어야만 할 수 있음이 이해될 것이다.

당업자는 상이한 세포내 소기관이 특정 소기관의 농축 인자를 결정하기 위하여 항체로 검출, 어세이 또는 프로브될 수 있는 상이하고 구별되는 "소기관-특이적 마커"를 가짐을 이해할 것이다. 예를 들어, 시토크롬-c 옥시다제 및(또는) Tom20(18 kDa)이 미토콘드리아를 검출하는데 사용될 수 있고; 베타-헥소스아미니다제 및(또는) 베타-갈락토시다제는 리소좀을 검출하는데 사용될 수 있으며; 퍼옥시다제가 엔도솜을 검출하는데 사용될 수 있고; 알칼라인 포스포디에스테라제 Ⅰ 및(또는) NaKATPase(150 kDa)가 원형질막을 검출하는데 사용될 수 있으며; 알파-만노시다제 Ⅱ 및(또는) GM130(130 kDa) 및(또는) P115(115 kDa)가 골지체를 검출하는데 사용될 수 있고; 카탈라제가 퍼옥시솜을 검출하는데 사용될 수 있으며; 락타제 데하이드로게나제가 시토졸 분획을 검출하는데 사용될 수 있고; RNA 및(또는) BiP/GRP78(78 kDa)이 조면 소포체를 검출하는데 사용될 수 있다. 바람직하게는, 미토콘드리아-특이적 Tom20(18 kDa), 소포체-특이적 BiP/GRP78(78 kDa), 원형질막-특이적 NaKATPase(150 kDa), 골지-특이적 GM130(130kDa) 및 골지-특이적 P115(115 kDa)에 대한 항체가 예를 들어, 웨스턴 블랏팅과 면역블랏팅과 같은, 당업자에게 알려진 어느 적당한 수단을 이용하여 본 발명의 원심분리된 생물학적 샘플의 분획에서 특정 소기관의 존재를 검출하고 정량하는데 사용될 수 있다. 이들 항체는 BD 바이오사이언시즈(CA), 스트레스젠(빅토리아, BC 캐나다)과 같은 상업적 공급원과, 학계로부터 수득될 수 있다.

따라서, 소기관 조제물을 가용성(상등액) 및 불용성(고체 펠렛) 분획으로 분리하고, 두 분획에서 소기관-특이적 마커를 어세이하거나 검출한 후, 두 분획으로부터의 상대적 수준이나 양을 비교함으로써 완전성이 측정된다. 일반적으로, 불용성 분획에 함유된 소기관-특이적 마커의 더 높은 상대적 수준(가용성 분획에 비해)은 소기관 완전성의 더 높은 정도에 해당함이 이해될 것이다. 바람직하게는, 본 발명은 소기관을 용해하는 단계 전에 본 발명의 방법의 어느 단계에서 소기관의 약 60％, 70％, 80％ 또는 90％ 이상과 동일하거나 그보다 큰 보전성을 착안한다.

일 구체예에서, 소기관 완전성은 불용성 분획에 대해 측정된 소기관-특이적 마커의 상대량을 두 분획에서의 소기관-특이적 마커의 상대량의 합으로 나누고 100으로 곱하여 백분율(％) 보전성(또는 완전성)을 산출함으로써 계산될 수 있다. 예를 들어, 미토콘리아 조제물은 원심분리되어 미토콘드리아의 펠렛(및 파쇄되고(거나) 용해되어 예를 들어, 미토콘드리아-특이적 마커를 포함하는, 가용성 미토콘드리아 단백질과 같은, 소기관내 가용성 물질을 방출한 미토콘드리아와 같은 미토콘드리아의 단편)과 파쇄 및(또는) 용해된 소기관의 가용성 성분을 포함하는 상등액을 형성한다. 그런 다음 미토콘드리아-특이적 단백질 및(또는) 효소(Tom20과 같은, 미토콘드리아 마커)의 상대적 수준이 가용성 및 불용성 분획 모두에 대해 결정될 수 있다. 그런 다음 불용성 분획의 미토콘드리아 마커의 양을 불용성 및 가용성 분획 모두의 미토콘드리아 마커 양의 합으로 나누고 100으로 곱하여 보전된 미토콘드리아를 함유하는 미토콘드리아 조제물의 상대적 비율을 반영하는 백분율을 얻음으로써 백분율 완전성이 계산될 수 있다.

완충액이 균질화 과정 중 일반적으로 사용됨이 당업자에 의해 이해될 것이다. 본 발명은 예를 들어, 트리톤-X, 나트륨도데실설페이트(SDS) 등과 같은 계면활성제, 예를 들어, 염화나트륨과 같은 염, 예를 들어, 단백분해효소 K와 같은 단백분해효소, DNA 및 RNA 분해 효소의 저해제, 및 균질화 완충액에서 이용하기에 적당한 어느 다른 부가적 성분을, 예를 들어, 포함하는 당업자에게 알려진 어느 적당한 완충액을 착안한다. 당업자는 완충액의 조성이 생물학적 샘플의 타입 및(또는) 공급원에 의존할 수 있음을 이해할 것이다.

임의의 정화 단계. 도 1을 다시 참조하면, 균질화물이 보전된 소기관을 포함하는, 생물학적 샘플의 세포 및(또는) 조직 균질화물은 전형적으로 핵과 같은 특정 세포내 성분을 제거하기 위하여 "정화"된다. 핵은 전형적으로 예를 들어, 다른 소기관과 같은, 샘플 중 다른 성분이 구배에 진입하는 것을 차단한다. 따라서, 핵은 본 발명의 연속-흐름 원심분리 과정 이전에 샘플로부터 제거될 수 있다.

원심분리를 포함하지만, 이로 제한되지 않는, 핵의 제거를 위해 적당한 어느 방법이 본 발명에 의해 착안될 수 있다. 예를 들어, 원심분리기를 이용하여 균질화물을 정화하기 위하여, 예를 들어 약 500×g 내지 약 40,000×g와 같은, 적당한 상대적 원심력(RCF)(×g)의 회분 또는 분석 원심분리기와 같은, 당업자에게 알려진 어느 원심분리기가 사용될 수 있다. 원심분리기는 예를 들어, 원심력을 균질화물에 적용하여, 잔여 소기관은 아닌, 핵이 원심분리기 튜브의 일단, 예를 들어, 원심분리기 튜브의 바닥을 향해 이동하도록 유발함으로써 핵을 분리한다. 일 구체예에서, 당업계에 알려져 있는 저속 정화 원심분리기가 균질화물을 정화하는데 사용될 수 있다. 저속 정화 원심분리기는 연속-흐름 원심분리기일 수 있다.

원심분리기. 도 1에 나타낸 바와 같이, 일단 생물학적 샘플이 균질화되고(거나) 세포가 용해되면, 균질화물 및(또는) 그로부터 유래된 산물은 연속-흐름 원심분리기 내의 밀도 구배로 도입된다.

본 발명의 목적을 위하여, "연속-흐름 원심분리기"는 샘플 재료가 입구를 통해 로터로 도입되고, 로터 내에 있는 동안 구배와 접촉하도록 하고, 출구를 통해 나가도록 하는, 입구와 일반적으로 출구를 갖는 로터를 가질 수 있는 원심분리기나 초원심분리기의 타입이다. 연속-흐름 원심분리기는 반-연속-흐름 원심분리기를 포함할 수 있다.

연속-흐름 원심분리기와 연속-흐름 원심분리기 로터의 어느 알려진 배열이 본 발명에 의해 착안된다. 예를 들어, 샘플이 입구를 통해 연속적으로 또는 간헐적으로 도입되고 출구를 통해 연속적으로 또는 간헐적으로 방출될 수 있도록 연속-흐름 로터는 입구나 입구와 출구를 가질 수 있다. 로터는 또한 출구 없이 입구를 가져, 샘플이 로터로 연속적으로 도입되지만, 연속적으로 방출되지 않도록 할 수 있다. 로터가 회전하고 있는 경우, 구배는 미리 형성되거나 미리 확립될 수 있다. 출구로부터 방출되는 샘플은 또한 입구를 통해 로터로 연속적으로 또는 간헐적으로 재순환하거나 재도입되어 구배에 걸쳐 샘플 재료의 다중 "통과"를 제공할 수 있다. 본 발명은 소기관을 농축하고 축적하기에 충분한 구배 상의 어느 수의 통과를 착안한다.

구배는 로터가 회전을 계속하는 동안 운전의 말기에 연속-흐름 원심분리기의 로터로부터 분리될 수 있다. 그 대신, 신선한 구배 재료가 움직이고 있는 로터에 가해질 수 있다. 일단 새로운 구배가 로터에서 확립되면, 다른 생물학적 샘플의 균질화물과 같은, 다른 생물학적 샘플이 로터로 도입되어 구배와 접촉하도록 할 수 있다. 이 의미에서 - 연속-흐름 원심분리기의 운전이 그 안에 분리된 제1 생물학적 샘플을 갖는 제1 구배가 로터가 회전하거나 순환하고 있는 동안 분리되고 로터가 회전을 계속하고 있는 동안 제2 생물학적 샘플의 분리를 위해 신선한 부피의 구배 재료로 교체되도록 하는 - "연속-흐름 모드"라 명명된다. 연속-흐름 모드는 단지 제1 및 제2 구배를 가하고 분리하는 것으로 제한되기 보다는, 예를 들어, 원심분리기의 로터를 폐쇄하거나 중단할 필요 없이, 로터가 회전을 계속하는 동안 어느 수의 생물학적 샘플을 연속적으로 모두 분리하기 위하여 어느 수의 구배가 연속적으로 가해지고 원심분리기 로터로부터 분리될 수 있다.

본 발명은 추가로 생물학적 샘플의 균질화물과 같은 본 발명의 생물학적 샘플이 수동, 자동, 또는 반자동 방식으로 연속-흐름 원심분리기로 로딩될 수 있음을 착상한다. 예를 들어, 어느 적절한 센서나 전자기기를 포함하는, 로봇공학 시스템이 생물학적 샘플의 연속-흐름 원심분리기의 로터로의 자동 또는 반자동 로딩을 달성하기 위하여 적당한 방식으로 사용될 수 있다. 생물학적 샘플의 로딩에 부가하여, 구배 재료는 또한 수동, 자동 또는 반자동 방식으로 연속-흐름 원심분리기의 로터로 도입될 수 있고 자동 또는 반자동화된 시스템의 제어 및(또는) 프로그래밍을 위해 어느 적당한 로봇공학, 센서, 전자기기, 또는 컴퓨터 시스템 및(또는) 소프트웨어를 사용할 수 있다.

적당한 연속-흐름 원심분리기의 예는 모델 KⅡ, PKⅡ 및 RK를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 알파 바서만, 아이엔씨.(웨스트콜드웰, NJ)에 의해 제조된 것들이다. 어느 대표적 로터 모델은 AW K3-3200, AW PK3-1600, AW PK3-800, AW PK3-400, AW PK3-200 및 AW PK3-100을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 더 크거나 작은 부피의 로터가 본 발명의 범위 내에 속하는 것으로 생각된다.

다른 연속-흐름 원심분리기가 본 발명에 의해 사용될 수 있다. 이들은 예를 들어, 벡크만 CF32Ti, 벡크만 JCF-Z-스탠다드 코어, 벡크만 JCF-Z 스몰 펠렛 코어, 벡크만 JCF-Z 라지 펠렛 코어, 벡크만 Z60, 소르발 SS34/KSB, 소르발 TZ-28/GK, 소르발 TCF-32(940 ㎖ 코어를 갖는 P32CT), 소르발 TCF-32 및 예를 들어, 원심분리기 CC40, CP40Y, C40CT2-H, C40CT 및 CP60Y와 같은, 히타치에 의해 제조된 것들을 포함한다. 히타치 원심분리기는 켄드로에 의해 배포된다.

다른 구체예에서, 연속-흐름 초원심분리기는 속도 구역 초원심분리기이다. 구역 로터 조립물이 다년간 사용되어 왔고 상당한 문헌이 그 주제에 대해 이용가능하다. 구역 로터에 관한 정보는 대부분의 정제 핸드북과 생화학 교과서에 포함되어 있다. 구체적 정보는 모두 여기에 참조에 의해 도입되는, Anderson, An Introduction to Particle Separations in Zonal Centrifuges(National Cancer Institute Monograph No. 21, 1966); Anderson, Separation of Sub-Cellular Components and Viruses by Combined Rate and Isopycnic Zonal centrifugation(National Cancer Institute Monograph No. 21, 1966); 및 Anderson, Preparative Zonal Centrifugation, in Methods of Biochemical Analysis(1967)에서 확인될 수 있다.

본 발명의 목적을 위해, 원심분리기 "실행(run)"은 샘플이 원심분리기에 의해 가공될 때까지, 어떠한 수의 통과, 예를 들어, 1회 통과(샘플의 재순환이 없음), 2회 통과(샘플이 1회 재순환됨), 3회 통과(샘플이 2회 재순환됨) 등을 포함하여, 이미 작동하고 있고 미리 형성된 구배를 갖거나 정지된 로터로 샘플이 가해지는 순간을 가리킨다. 통과는 로터가 정지되거나 느려지지 않도록 수행될 수 있다. 추가로, 샘플은 또한 어느 시간 동안 계속적으로 재순환될 수 있다. 또한 원심분리기 실행이 일정 또는 가변 속도로 발생할 수 있음이 착상된다.

일 구체예에서, 본 발명에 의해 사용되는 원심분리기 실행은 단일 실행일 수 있다. 예를 들어, 세포내 소기관 및 그의 서브타입의 이동, 분리 및 축적은 하나의 원심분리기 실행에서 수행된다.

전형적으로, 연속-흐름 초원심분리기 실행의 준비와 수행은 수동으로 수행되거나, 예를 들어, 컴퓨터에 의해 자동화되거나, 수동으로 수행되는 것과 자동화되는 것의 조합일 수 있다. 바람직하게는, 컴퓨터와 소프트웨어가 원심분리기를 제어하고 원심분리 프로토콜을 계산하기 위해 사용된다. 그러한 컴퓨터와 소프트웨어는 운전자에게 제어 스크린에 "실시간"으로 디스플레이되는 운전 지수를 제공한다. 자동화된 프로그램은 또한 미리 저장된 파일로부터 또는 제어 스크린을 통해 수동으로 실행될 수 있다.

일 구체예에서, 각각의 원심분리기 실행 동안, 세트 지수, 실행 지수 및 알람 상태의 온-라인 데이터 모니터링과 기록이 행해지고 시스템 메모리에 다운로드된다. 그러한 다운로딩은 또한 외부 데이터 저장 위치로 향해질 수 있다.

컴퓨터-자동화되거나, 수동-수행되거나, 둘다의 결합인, 분리 프로토콜은 전형적으로 많은 변수의 조작을 포함한다. 그러한 변수는 예를 들어, 표적 소기관의 물리적 특성; 구배의 형성; 및 실행 지수의 계산을 포함한다.

분리 프로토콜을 결정하는데 유용한 표적 소기관의 물리적 특성은 예를 들어, 표적 소기관의 침강 계수(S_20ω) 및 부력 밀도를 포함한다. 그러한 값은 예를 들어, 시행착오적 실험의 수를 줄이는데 유용하다(Rickwood 등, Centrifugation Essential Data, BIOS Scientific Publishers Limited 1994, 발행자 J Wiley ＆ Sons; Preparative Centrifugation: A Practical Approach, D Rickwood 편집, Oxford University Press 1921; 및 Methods in Enzymology, Vol. 182: Guide to Protein Purification, Murray P. Deutscher 편집, Academic Press 1990을 참조하라).

분리 프로토콜은 또한 전형적으로 구배의 지식을 포함한다. 구배는 밀도 구배를 포함하지만, 이로 제한되는 것은 아니다. 다음으로, 밀도 구배는 예를 들어, 연속 구배, 불연속 구배 또는 단계 구배일 수 있다. 구배 재료의 선택은 예를 들어, 산물, 불순물 안정성 및 산물 밀도에 의존한다. 보편적으로 사용되는 구배 재료는 당업자에게 알려져 있고 상업적으로 입수하거나 당업자에 의해 제조될 수 있는 어느 적당한 구배 재료를 포함한다. 구배 재료는 예를 들어, 염화세슘(CsCl), 황산세슘(Cs₂S0₄), 타르타르산 칼륨 또는 브롬화칼륨과 같은, 알칼리 금속 용액; 예를 들어, 슈크로스, 만니톨 또는 글리세롤과 같은 비전해질 용질; 예를 들어, 피콜(Ficoll)® 400(화이자, CT)과 같은 다당류; 예를 들어, 메트리자미드, 니코덴쯔(Nycodenz)®(니코메드, 아이엔씨., NJ), 요오딕사놀(Iodixanol)® 또는 옵티프랩(Optiprep)®과 같은 요오드화된 비전해질; 퍼콜(Percoll)®(폴리비닐피롤리돈으로 코팅된 콜로이드성 실리카)(화이자, CT), 또는 당업자에게 알려진 어느 다른 적당한 재료를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.

비록 부식성이지만, 알칼리 금속으로 이루어진 구배가 낮은 점도를 갖는 높은 밀도를 창출할 수 있음이 이해될 것이다. 예를 들어, 구배 재료로 빈번하게 사용되는 염화세슘은 전형적으로 대략 1.9 g/㎤ 이하의 높은 밀도를 얻을 수 있다. 다른 예에서, 브롬화칼륨이 또한 승온, 예를 들어 25 ℃에서만, 높은 밀도를 형성할 수 있다. 그러한 승온은 관심있는 단백질의 안정성과 양립할 수 없을 수 있다.

위에 언급된 구배의 예는 니코덴쯔®, 옵티프랩®, 요오딕사놀® 및 슈크로스를 포함한다. 슈크로스는 경제적인 구배 재료이고 대부분의 운전을 위해 충분한 밀도 범위를 이용한다(대략 1.3 g/㎤ 이하). 슈크로스 구배의 점도는 산물을 밴딩하기 위해 사용되는 가파른 구배의 형성이나, 다르게는, 동일한 로터에서 넓은 산물 용량을 창출하는 것을 허용한다. 가파른 구배는 전형적으로 예를 들어, 비표적 단백질의 진입을 최소화하고자 하면, 연속 흐름 운전을 위해 효율적이다. 슈크로스의 점도는 또한 연속 흐름 로터에서 장기간 가파른 구배를 형성하는데 바람직한 속성이다. 반대로, CsCl과 같은 저-점도 용액은 점도를 증가시키고 연속-흐름 실행 동안 구배 침식을 최소화하기 위하여, 글리세롤과 같은 고-점도 재료의 첨가를 필요로 할 수 있다.

본 발명은 어느 농도 프로파일을 갖는 어느 타입의 구배를 사용하는 것을 착상한다. "농도 프로파일"은 그들 간의 수평, 수직, 사선 또는 어느 방향의 구배에 대해 수직인 경로를 따라 구배 매질 또는 재료의 농도 변화로 당업자에 의해 알려져 있을 것이다. 그것으로서, 구배는 "선형 구배, "볼록 구배", "오목 구배" 또는 "불연속 구배" 또는 당업자에게 알려져 있는 어느 다른 적당한 형태일 수 있다.

슈크로스는 바람직한 밀도 구배 재료이다. 표 1은 슈크로스 밀도 구배를 이용하여 균질화된 생물학적 샘플에 함유된 미토콘드리아, 소포체, 원형질막 및 골지체를 분리하기 위한 이론적 분리 요건을 기재하고 있다.

균질화된 생물학적 샘플에 대한 이론적 분리 요건

구성성분	양	슈크로스 중 밴딩 *	밀도 범위	분리 조건
미토콘드리아	세포 단백질의 16％세포 단백질의 16％	42.5％	1.19 g/㎤1.17-1.21 g/㎤	5,000×g, 10 분10,000×g, 25 분
소포체	세포 단백질의 5％세포 단백질의 24％	37％***	1.16 g/㎤***1.06-1.23 활면1.18-1.23 조면	100,000×g, 120 분150,000×g, 50 분
원형질막	세포 단백질의 2％균질화물의 0.4-2.5％	37％	1.16 g/㎤1.12-1.14	80,000×g, 60 분100,000×g, 60 분
골지	세포 단백질의 1％	33 내지 36％**	1.14 내지 1.15 g/㎤1.12-1.16	100,000×g, 55 분150,000×g, 20 분

* 슈크로스 테이블을 이용한 밀도 데이터로부터 유래

** 단계 구배에 기초

*** 원형질막과 유사한 밴딩에 기초

상기하고 여기에 정의된 바와 같이, 연속-흐름 원심분리기 실행은 많은 통과를 포함할 수 있다. 예를 들어, 균질화된 생물학적 샘플은 본 발명의 연속-흐름 원심분리기를 2회 통과할 수 있다. 제1 통과는 20 ㎖/분(1.2 ℓ/시)의 유속을 이용하는 PK-3-800 로터에서 20,000 RPM으로 수행될 수 있다. 그것으로서, 487 스베드베리(Svedberg's)(S) 이상의 재료가 구배로 진입할 것으로 예상된다. 아래 지수가 제1 실행을 위해 사용될 수 있다:

G 힘 코어	24,379×g
볼	29,562×g
K 인자	121.94
펠렛화 시간	15.00 분
통과시간	20.00 분
스베드베리 값	487 S

다음으로 제2 통과가 40,000 RPM에서 수행될 수 있다. 그것으로서, 122S 이상의 재료가 구배로 진입할 것으로 예상되었다. 아래 지수가 제2 실행을 위해 사용될 수 있다.

G 힘 코어	97,515×g
볼	118,250×g
K 인자	30.49
펠렛화 시간	15.00 분
통과시간	20.00 분
스베드베리 값	122 S

다르게는, 제2 통과가 20 ㎖/분(1.2 ℓ/시)의 유속을 이용하는 PK-3-800 로터에서 35,000 RPM으로 수행될 수 있다. 그것으로서, 159 S 이상의 재료가 구배로 진입할 것으로 예상된다. 아래 지수가 그러한 대체 통과를 위해 사용될 수 있다:

G 힘 코어	74,660×g
볼	90,535×g
K 인자	39.82
펠렛화 시간	15.00 분
통과시간	20.00 분
스베드베리 값	159 S

특정 RPM 값에서 원심분리를 수행하기 위해 사용되는 시간 길이는, 다음으로, 전형적으로 재료의 스베드베리 상수에 의존하는, 특정 재료가 펠렛화되는지 여부를 결정한다. 예를 들어, 35,000 RPM의 PK-3-800 로터를 사용하면, 53S 이상의 재료가 전형적으로 45 분후에 펠렛화한다. 120 분의 경우, 19.9S 이상의 재료가 전형적으로 펠렛화한다. 두 경우에서, 코어와 볼의 RCF 값은 각각 74,660×g 및 90,535×g이다.

아래 나타낸 바와 같이, 소기관, 예를 들어, 미토콘드리아, 원형질막, 소포체 및 골지체의 알려진 이론적 침강 범위에 기초하여, 펠렛화에 요구되는 시간이 예측될 수 있다. 예를 들어, 미토콘드리아, 원형질막, 소포체 및 골지체의 알려진 침강 범위는 아래와 같다: 각각; 10,000 내지 50,000 S; 50 내지 1,000 S 및 100,000 내지 500,000 S; 1 내지 5,000 S; 및 1,000 내지 10,000 S.

상이한 속도에서 소기관을 펠렛화하는데 필요한 시간이 결정될 수 있다. 예를 들어, 20 ㎖/분 샘플 유속의 PK-3-800에서 20,000 RPM의 원심분리에 기초하여, 아래 성분을 펠렛화하는 시간이 아래 표에 나타내어져 있다:

구성성분	스베드베리 상수	펠렛화 시간(분)	포획률
미토콘드리아	10 000 S	0.73	100％
미토콘드리아	50 000 S	0.15	100％
P.M.	50 S	146.33	0％
P.M.	1 000 S	7.32	100％
P.M.	100 000 S	0.07	100％
P.M.	500 000 S	0.01	100％
E.R.	1 S	7316	0％
E.R.	5 000 S	1.46	100％
골지	1 000 S	7.32	100％
골지	10 000 S	0.73	100％

다음으로 35,000 RPM에서, 20 ㎖/분 샘플 유속의 PK-3-800 로터에서 아래 구성성분을 펠렛화하는 시간은 아래와 같다:

구성성분	스베드베리 상수	펠렛화 시간(분)	포획률
P.M.	50 S	224.29	0％
E.R.	1 S	11214	0％

다르게는, 40,000 RPM에서, 20 ㎖/분 샘플 유속의 PK-3-800 로터에서 아래 구성성분을 펠렛화하는 시간은 아래와 같다:

구성성분	스베드베리 상수	펠렛화 시간(분)	포획률
P.M.	50 S	36.58	0％
E.R.	1 S	1829	0％

특정 스베드베리 상수를 갖는 특정 성분을 밴딩하는 시간이 결정될 수 있다. 예를 들어, 아래 표에 나타낸 바와 같이 PK-3-800 로터에서 45 분의 제1 통과와 120 분의 제2 통과를 이용하여 35,000 RPM에서의 원심분리에 기초하여 예측될 수 있다. 표는 또한 밴딩이 45 분 및 120 분 통과 후 완료되는지 여부를 보여준다.

구성성분	스베드베리 상수	밴딩 시간(분)	밴딩 완료 45 분/120 분
미토콘드리아	10 000 S	0.24	예/예
미토콘드리아	50 000 S	0.05	예/예
P.M.	50 S	47.78	아니오/예
P.M.	1 000 S	2.39	예/예
P.M.	100 000 S	0.02	예/예
P.M.	500 000 S	0.005	예/예
E.R.	1 S	2389	아니오/아니오
E.R.	5 000 S	0.48	예/예
골지	1 000 S	2.39	예/예
골지	10 000 S	0.24	예/예

일 구체예에서, 여기에서 착안된 연속-흐름 초원심분리기는 규모화가능한 분리를 제공하기 위해 상이한 기하학을 갖는 상이한 크기의 로터와 함께 이용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 연속-흐름 초원심분리기는 예를 들어, 15-인치 또는 30-인치 로터와 같은, 상이한 크기의 로터로 배열될 수 있다. 본 발명에서 사용되는 로터의 기하학이 가공될 수 있는 샘플의 부피, 침강 경로의 좁음 및 분리를 위해 요구되는 총 저항 시간에 영향을 미칠 수 있음이 이해될 것이다. 추가로, 본 발명에 의해 착안된 연속-흐름 초원심분리기 로터는 구배가 로딩 위치(수평 위치)로부터 운전 위치(수직 위치)로 또한 다시 로딩 위치로 이동하여 산물 수집을 가능하게 하는 "재배향 구배 양식"으로 운전할 수 있다. 본 발명에 의해 착안된 로터를 사용하는 동안, 샘플 재료의 흐름 경로는 코어의 중심 부분을 통해 어느 말단(상단 또는 하단)에서 로터로 진입하고, 그런 다음 길고 가느다란 관 축을 통해 흘러 부착된 산물 라인이나 튜브로 나갈 수 있다.

다른 구체예에서, 규모 분리가 동일한 로터 길이를 이용하지만 로터 코어의 배열을 바꾸어 부피를 감소시키거나 증가시켜 수행된다. 예를 들어, 여기에서 참조에 의해 도입되는 동시계류 중인 미국출원 제09/995,054호에 기재되어 있는 바와 같이, 방법은 전형적으로 방사상으로 돌출된 "핀(fins)"을 갖는 것들과 같은, 상이한 디자인의 코어를 사용하는 것을 포함한다. 일 구체예에서, 핀 치수의 변화는 로터 코어에 의해 대체되는 부피를 변조한다. 예를 들어, 규모 축소는 보통 핀 크기를 최대화하여, 원심분리기 실행에 이용가능한 부피를 감소시킴으로써 성취된다. 다음으로, 규모 확대는 전형적으로 핀 크기를 최소화하여 원심분리기 실행에서 더 많은 부피를 허용함으로써 얻어진다.

예를 들어, 알파 바서만, 아이엔씨.에 의해 제조된 것들과 같은, 상이한 크기의 로터를 이용하여 규모 분리를 수행하기 위하여, 많은 지수가 전형적으로 고려된다. 이들 지수는 볼의 R_max, 코어의 R_min, 볼의 ×g-력, 코어의 ×g-력, 펠렛화 시간, 통과 시간, K 인자 및 샘플 유속을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 그러한 지수는 분리되는 입자의 스베드베리 값에 의존할 수 있다.

예를 들어, 1,000 S의 입자에 대한 분리 지수가 알파 바서만, 아이엔씨.에 의해 제조된 것들과 같은, 로터에 대해 아래 기재되어 있다. 센티미터로 된 로터 R_max(최대 지름), 센티미터로 된 로터 R_min(최소 지름) 및 초원심분리기(UCF) 로터 최대 속도(rpm)가 전형적으로 알려져 있고 로터의 제조자에 의해 상술되어 있으며 여기에 참조에 의해 도입된다. 또한 로터 부피(㎖)와 로터의 최대 유속(ℓ/시 또는 ㎖/분)이 제조자로부터 쉽게 입수가능함이 당업자에게 알려져 있으며 여기에 참조로서 도입된다.

계산되는 지수는 로터 상대적 원심력(RCF)(×g)이다(Rickwood, 1994를 참조하라). RCF는 아래 등식을 이용하여 계산될 수 있다: RCF = 11.18×R×(Q/1,000)²(여기에서 RCF = 상대적 원심력(×g), R = 지름(㎝), 및 Q = 속도(분당 회전)). 예를 들어, 1,000 S의 입자는 아래 지수에 기초하여 PK3-800 로터에서 분리될 수 있다: R_max 6.6 ㎝, R_min 5.45 ㎝, 로터 최대 속도 40,500 rpm. 계산은 아래와 같다:

RCF = 11.8×6.6×(40,500/1,000)²

RCF = 73.788 1,640.25

RCF = 12,1030.76×g

RCF = 121,000×g

유사하게, 5.45 ㎝의 R_min 값을 갖는 로터에 대해, RCF는 99,900×g로 계산될 수 있다.

계산되는 다른 지수는 K 인자의 함수인, 실행의 지속시간이다. 실행의 지속시간은 전형적으로 "실행 시간" 또는 "침강 시간"으로 언급된다. 1,000 S 입자에 대한 실행 지속시간을 결정하기 위하여, 로터의 K 인자가 문헌으로부터 결정되거나 아래와 같이 계산될 수 있다:

K = (2.53×10¹¹/Q²) L_N(R_MAX/R_MIN)

예를 들어, 1,000 S 입자에 대한 PK3-800 로터(R_max 6.6 ㎝, R_min 5.45 ㎝)의 K 인자와 40,500 RPM의 로터 최대 속도는 아래와 같이 계산될 수 있다:

K = (2. 53×10¹¹ / 40 500²) L_N(6.6/5.45)

K = (2.53×10¹¹ / 40 500²) L_N(6.6/5.45)

154.244 0.19145

K= 29.53.

K는 또한 대체 속도에 대해서 계산될 수 있다. 예를 들어, 35,000 rpm 또는 20,000 rpm의 속도에서, 아래 식이 전형적으로 사용된다:

K_new = K(Q_max/Q_new)²

Q_max - 로터 최대 속도(분당 회전)

Q_new - 새로운 세트 속도(분당 회전).

따라서, 20,000 rpm의 속도에서 K 인자를 계산하기 위하여:

K_new = K(Q_max/Q_new)²

K_new = 29.53(40500/20000)²

K_new = 29.53×4.100

K_new = 121.

유사하게, 35,000 rpm의 세트 속도에 대한 K 인자는 39로 계산된다.

K 인자 결정 시, 실행 시간이 그런 다음 계산될 수 있다. 예를 들어, 침강 시간(T)이 아래와 같이 계산될 수 있다:

T= K/S

T - 침강 시간(시간)

S - 침강 계수(S).

따라서, 20,000 rpm 속도의 PK3-800 로터에서 원심분리된 1,000 S 입자에 대해, 실행 시간은 아래와 같이 계산될 수 있다:

T = K/S

T = 121/1000

T = 0.121 시간

T = 7분 16초.

다른 구체예에서, 실행 시간은 대체 방법으로 계산될 수 있다. 보다 구체적으로, 아래 식이 측정가능한 원심분리기 실행에서 제2 로터에 대한 실행 시간을 결정하는데 사용될 수 있다:

T_로터2 = T_로터1×(K_로터1/K_로터2)

여기에서 T_로터1은 제1 로터에 대한 침강 시간이고, T_로터2는 제2 로터에 대한 침강 시간이며, K_로터1은 제1 로터에 대한 K 인자이고, K_로터2는 제2 로터에 대한 K 인자이다.

계산될 수 있는 또 다른 지수는 샘플 유속이다. 샘플 유속은 침강 시간(T)의 함수이고 아래와 같이 계산된다:

F= V_F/T

F - 유속(ℓ/시)

V_F - 관통 부피(ℓ)

T - 침강 시간

PK3-800 로터는 전형적으로 50％의 관통 부피를 갖는다. 따라서, 20,000 RPM에서 운전하는 1,000 S 입자에 대해, 유속은 아래와 같이 계산될 수 있다:

F = V_F/T

F = 0.4/0.121

F = 3.3 ℓ/시

F = 55 ㎖/분.

본 발명의 일 구체예에서 원심분리기 실행 동안, 소기관은 밀도 구배 내에서 농축되고 축적된다(축적되는 것은 증폭되는 것도 의미할 수 있다). 일 구체예에서, 소기관의 적어도 2 이상의 타입 및(또는) 그의 서브타입이 연속-흐름 초원심분리기에 의한 밀도 구배에서 농축되고 축적된다. 다른 구체예에서, 소기관의 적어도 2 이상의 타입이 구배가 소기관의 적어도 2 이상의 타입으로 포화될 때까지 축적된다. 본 발명의 연속-흐름 방법은 우수하게도 소기관의 적어도 2 이상의 타입 및(또는) 그의 서브타입, 예를 들어, 소기관의 적어도 2 이상의 타입 및(또는) 그의 서브타입에 존재하는 알려지고(거나) 동정되지 않은 희소 단백질을 단리하고 동정하기에 충분한 양으로 축적한다. 본 발명의 연속-흐름 방법은 또한 생물학적 샘플에서 소기관 집단의 전체 프로테옴에 관하여 덜 복잡한 프로테옴을 갖는 소기관의 대량의 특정 서브타입의 축적과 농축을 허용한다.

본 발명의 목적을 위하여, "농축"은 생물학적 샘플 중의 동일한 소기관이나 단백질에 대해 상대적으로, 정규화된 조건 하에서 측정된 바, 구배 중의 위치에서 소기관 또는 그의 단백질의 배수의 증가(예를 들어, 1.1×, 2×, 5×, 10×, 50× 등)로 정의된다. 보다 일반적인 용어로, 농축은 원래 생물학적 샘플 중의 동일한 소기관이나 복수의 소기관의 상대적 양과 비교하여 특정 구배 분획 중의 소기관이나 복수의 소기관의 상대적 양의 증가에 관한 것이다. 농축은 또한 소기관 타입들을 소기관 타입의 밀도에 상응하는 밀도 구배의 분리된 구획으로 분리하는 점에서 균질화물에 있는 두 소기관 집단의 정제의 형태이다.

구배 중 특정 위치, 특히 특정 구배 분획에 있는 소기관이나 그의 단백질의 농축을 결정하기 위한 보편적 접근법은 이미 언급된 것들과 같은, 소기관-특이적 마커에 대한 웨스턴 분석을 수행하는 것이다. 특히, 웨스턴 분석은 전형적으로 본 발명의 분리 및 축적 방법으로부터 나오는 관심있는 구배 분획과 상응하는 원래 생물학적 샘플 둘다의 정규화된 양(예를 들어, 재료의 표준화 및(또는) 비교할만한 양)을 이용하여 수행된다. 그런 다음 농축은 관심있는 구배 분획 중의 측정된 소기관-특이적 마커의 상대량을 상응하는 원래 생물학적 샘플 중의 양으로 나누어 계산된다.

예를 들어, 제1 단계로서, 관심있는 구배 분획과 원래 상응하는 생물학적 샘플의 총 단백질 농도는 예를 들어, 브래드포드 또는 라우리 단백질 어세이와 같은, 공지된 기술을 이용하여 정규화된다. 그러한 어세이를 위한 시약과 재료는 공지의 과정에 따라 당업자에 의해 제조되거나(예를 들어, Current Protocols in Biochemistry, John Wiley ＆ Sons, Inc., 1999, Juan S. Bonifacino 편집) 또는 상업적 공급원(예를 들어, 퀴아젠, 아엔씨., CA)로부터 구입할 수 있다. 구배 분획과 원래 생물학적 샘플 둘다의 총 단백질 농도의 결정은 단백질, 특히 예를 들어, 막 단백질과 같은, 그 중의 불용성 단백질을 가용화하는 단계를 포함한다. 가용화 단계는 전형적으로 예를 들어, SDS나 트리톤-X와 같은 적당한 계면활성제를 포함한다. 일단 단백질이 각각의 샘플에서 가용화되면, 잔여 막 재료 및(또는) 찌꺼기와 같은, 불용성 재료는 원심분리에 의해 펠렛화되고 가용화된 단백질을 함유하는 잔여 상등액은 분리된다. 그런 다음 상등액의 단백질 농도가 위에서 언급한 브래드포드 및 라우리 방법과 같은, 표준 방법을 이용하여 측정된다.

제2 단계로서, 구배 분획의 상등액과 상응하는 원래 생물학적 샘플의 비교할만한 - 균등할 수 있는 - 양이 예를 들어, 폴리아크릴아미드와 같은, 적당한 단백질-분리 재료를 이용하여 동일하거나 상이한 장치에서 별도로 전기영동된다. 전형적으로, 일차원 폴리아크릴아미드 젤 전기영동이 사용된다.

분리된 단백질은 예를 들어, 니트로셀룰로스와 같은, 적당한 지지 매질(예를 들어, "블랏 페이퍼")로 블랏팅하는 당업계에 인식된 기술에 의해 옮겨진다. 다음에, 소기관-특이적 마커의 상대량이 당업계에 인식된 웨스턴 분석 기술에 의해 결정될 수 있다. 전형적으로 웨스턴 분석에서, 소기관-특이적 마커에 특이적인 일차 항체는 일차 항체가 블랏 상에 존재하는 소기관-특이적 마커의 양에 직접적으로 비례하는 양으로 소기관-특이적 마커에 결합하는 적당한 시간에 걸쳐 블랏 페이퍼 상의 분리된 단백질과 반응하도록 허용된다.

그런 다음 일차 항체의 상대량이 예를 들어, 제1 항체에 특이적인 제2 항체를 도입하고 검출하는 것과 같은, 어느 적당한 수단에 의해 측정된다. 일차 및(또는) 이차 항체는 예를 들어, 형광 분자, 효소 또는 크로모포어와 같은, 검출가능한 부위에 공유적으로 결합될 수 있다. 효소의 경우, 발색 또는 형광 기질과 같은, 검출가능한 효소 기질이 일차 및(또는) 이차 항체를 검출하는데 사용될 수 있다. 그런 다음 블랏 상에 존재하는 일차 및(또는) 이차 항체의 양은 픽셀과 같은 디지털 형태로 측정되고 나타내어질 수 있다.

예를 들어, 미토콘드리아-함유 분획 중 미토콘드리아의 농축은 관심있는 미토콘드리아 분획과 상응하는 원래 생물학적 샘플로부터의 정규화된 양의 단백질 중에서 미토콘드리아-특이적 마커의 상대량을 측정하여 웨스턴 블랏 분석에 의해 결정될 수 있다. 구배 분획과 원래 생물학적 샘플 중의 미토콘드리아-특이적 마커의 검출은 형광-표지된 일차 및(또는) 이차 항체를 통해 블랏 상에 존재하는 항체의 형광 신호를 검출하고 정량화하는 디지털 영상화 및(또는) 사진의 사용을 통해 검출될 수 있다. 몰레큘라 다이나믹스, 아엔씨.(CA)로부터 입수가능한 것들과 같은, 일차 및(또는) 이차 항체의 형광 신호의 강도를 검출하고 측정하는 어느 당업계에 인식된 장치 및(또는) 컴퓨터 소프트웨어가 사용될 수 있다.

디지털 신호의 수 및(또는) 강도는 블랏 상의 일차 및(또는) 이차 항체의 상대량에 상응하고, 다음으로 블랏 상의 소기관-특이적 마커의 상대량에 상응하며, 다음으로 샘플 중 관심있는 소기관의 상대량에 상응한다. 농축은 관심있는 구배 분획으로부터 측정된 소기관-특이적 마커의 상대량의 원래 생물학적 샘플로부터 측정된 것에 대한 비율로 정의된다.

소기관은 본 발명의 방법에 따른 연속-흐름 원심분리기 실행 동안 농축되고 축적된다. 예를 들어, 위에서 설명된 바와 같이, 밀도 구배는 생물학적 샘플을 도입하기 전에 연속-흐름 원심분리기의 로터에서 확립될 수 있다. 그것으로서, 구배 재료가 연속-흐름 로터로 가해진 후 구배를 확립하기에 충분한 속도로 원심분리될 수 있다. 일단 구배가 확립되면, 그런 다음 생물학적 샘플이 로터가 회전을 계속하는 동안 로터로 도입될 수 있다. 이미 설명한 바와 같이, 생물학적 샘플은 전형적으로 생물학적 샘플의 균질화물이고 소기관, 시토졸 성분 및 가능한 막 단편을 함유한다. 임의로 생물학적 샘플을 연속-흐름 원심분리기의 로터로 도입하기 전에, 생물학적 샘플은 이미 설명된 바와 같이, 세포 찌꺼기나 핵과 같은, 큰 입자화된 물질을 제거하기 위하여 정화될 수 있다.

이미 설명된 바와 같이, 생물학적 샘플은 연속적 방식으로 연속-흐름 원심분리기의 회전하고 있는 로터로 도입될 수 있다. 예를 들어, 생물학적 샘플은 로터가 회전을 계속하고 있는 동안 로터로 공급된다. 로터의 속도는 생물학적 샘플이 첨가되는 동안 일정하게 유지되거나 증가 또는 감소될 수 있다. 샘플은 연동 펌프를 포함하지만, 이로 제한되지 않는, 어느 적당한 수단을 이용하여 로터로 도입될 수 있다. 추가로 이미 설명된 바와 같이, 로터로의 샘플의 도입은 어느 적당한 수동, 자동 또는 반자동 방식으로 수행될 수 있고 어느 적당한 로봇공학 및(또는) 컴퓨터 제어 시스템의 사용을 포함할 수 있다. 또한, 예를 들어, 로터에 있는 구배 재료 부피 보다 작거나, 그와 같거나, 그 보다 큰 어느 부피를 포함하는, 어느 적당한 부피의 생물학적 샘플이 로터로 도입될 수 있다.

생물학적 샘플이 로터에 진입하고 그를 통해 흐르기 시작하면, 그 안에 있는 밀도 구배와 접촉하게 된다. 밀도 구배는 근위 말단이 원위 말단 보다 낮은 밀도에 있는 근위 말단과 원위 말단을 갖는다. 구배의 근위 말단으로부터 원위 말단으로 이동하면서, 구배는 특정 밀도 프로파일에 따라 밀도가 증가한다. 이미 설명된 바와 같이, 구배의, 농도 프로파일로도 언급될 수 있는, 밀도 프로파일은 예를 들어, 선형, 볼록형 또는 오목형일 수 있다. 밀도 구배는 또한 각각의 구획이 제1 밀도에 있는 근위 말단과 제2 밀도에 있는 원위 말단을 갖고 제2 밀도가 제1 밀도 보다 큰 상이한 "구획"을 포함하는 것으로 간주될 수 있다.

생물학적 샘플의 특정 성분이 구배에 진입하는지 여부는 연속-흐름 원심분리기에 의해 사용되는 지수 뿐만 아니라 성분의 물리적 특성에 의해서도 결정될 수 있다. 예를 들어, 성분의 침강 값과 부력 밀도와, 예를 들어, 로터에서의 RCF(×g)와 생물학적 샘플의 유속과 같은, 원심분리 지수를 포함하는, 그러한 물리적 특성은 여기에 이미 설명되어 있다. RCF(×g)와 유속을 포함하는, 원심분리 지수는 구배로의 상이한 성분의 진입에 영향을 미치기 위하여 원심분리기의 운전 동안 증가되거나 감소될 수 있다. 원심분리기의 지수, 특히 RCF(×g)는 생물학적 샘플의 도입 동안을 포함하여, 연속-흐름 원심분리기의 운전에 걸쳐 변화될 수 있다.

일단 생물학적 샘플이 구배의 근위 말단에 진입하면, 원심분리 과정에 의해 성분에 적용되는 원심력은 성분이 밀도 구배를 통해 성분의 부력 밀도와 침강 계수를 포함하는, 성분의 물리적 특성에, 부분적으로, 의존하는 속도로 이동하도록 유발한다. 성분은 등밀도점에 도달할 때까지 구배를 통해 이동하고 그의 부력 밀도에 기초하여 농축된다.

원심분리기 실행 동안, 생물학적 샘플의 성분을 축적하기 위하여, 이미 설명된 바와 같이, 추가의 생물학적 샘플이 원심분리기로 도입될 수 있다. 예를 들어, 미토콘드리아와 그의 서브타입이 그들의 부력 밀도와 동일한 구배의 구획에서 농축될 때, 미토콘드리아와 그의 서브타입을 함유하는 더 많은 생물학적 샘플의 원심분리기로의 첨가는 구배의 그 구획에서 미토콘드리아와 그의 서브타입의 축적을 가져온다.

소기관 수집. 도 1에 나타내어진 바와 같이, 일단 원심분리기 실행이 완료되면, 구배로 이동한 소기관이 수집된다. 소기관을 수집하는 어느 당업계에 인식된 기술은 본 발명의 범위 내에 속한다. 예를 들어, 소기관은 수동, 자동 또는 그들의 어느 결합으로, 구배의 부피측정 분획을 분리함으로써 수집되고, 예를 들어, 샘플 튜브와 같은, 용기로 저장 및(또는) 위치될 수 있다. 예를 들어 구배 총 부피의 1/10,000, 1/1,000, 1/100 또는 1/10, 또는 그의 어느 다른 적당한 부피와 같은, 어느 적당한 분획 부피가 착상된다. 부피측정 분획은 동일하거나 상이한 부피일 수 있다. 추가로, 일단 수집되면, 상이한 부피측정 분획은 함께 합쳐질 수 있다.

분획은 또한 특정된 밀도 범위에 기초하여 수집될 수 있다. 일 구체예에서, 분획은 제1 및 제2 밀도 점이 상이한, 제1 밀도 점과 제2 밀도 점 사이와 그들을 포함하는 구배 재료로 간주될 수 있다. 예를 들어, 분획으로서, 10％ 내지 15％ 슈크로스 사이와 그들을 포함하는 모든 구배 재료를 수집할 수 있다. 특정 분획의 구배 밀도는 예를 들어, DMA 4500, RXA 156 또는 RXA 170(안톤 파르, 게엠베하, 오스트리아)과 같은, 상업적으로 이용가능한 굴절 지수 분석기를 이용하여 예상되거나 측정될 수 있다.

구배 분획의 수집을 위한, 자동, 반자동 또는 수동의 어느 다른 방법이 착상되며 본 발명의 범위 내에 있다. 구배로부터의 분획 수집을 위한 자동 또는 반자동 시스템으로, 본 발명은 어느 적당한 센서, 전자기기 또는 다른 유용하고(거나) 필요한 구성요소를 포함하는, 어느 적당한 로봇공학 시스템을 착안한다. 자동 또는 반자동 분획 수집기로 언급될 수 있는, 구배 분획을 수집하기 위한 자동 또는 반자동 시스템은 또한 어느 적당한 소프트웨어나 컴퓨터 시스템을 이용하여 제어되고(거나) 프로그램될 수 있다. 자동 및 반자동 분획 수집기는 자립형 장치이거나, 다른 구체예에서, 내장형 장치로서 연속-흐름 원심분리기와 통합될 수 있다.

소기관의 분석. 도 1에 따르면, 일단 소기관이 수집되면, 소기관은 당업계에 인식된 방법에 의해 분석된다. 예를 들어, 수집된 분획에 있는 소기관은 예를 들어, 웨스턴 블랏 분석, 효소 어세이, 소기관-특이적 마커에 특이적인 형광-표지된 항체를 이용하는 면역형광 현미경, 및 예를 들어, 전자 현미경을 포함하는, 현미경이나, 어느 다른 알려진 방법을 포함하는, 당업계에 알려진 어느 적당한 방법론을 이용하여 동정되고(거나) 특성분석될 수 있다. 이들 방법에 의해, 예를 들어, 분획의 소기관 조성이 예를 들어, 분획에 존재하는 소기관의 상이한 타입의 상대량에 관하여, 측정되고 특성분석될 수 있다. 예를 들어, 분획에 대한 웨스턴 블랏 분석을 수행하고 예를 들어, 미토콘드리아, 소포체, 원형질막 및 골지와 같은, 소기관-특이적 마커의 존재에 대해 시험함으로써, 분획을 구성하고 있는 이들 소기관의 각각의 상대량을 측정할 수 있다. 전기한 프로토콜에 대한 정보는 예를 들어, Bonifacino 등에 의해 편집된 Current Protocols in Cell Biology, John Wiley ＆ Sons, Inc., 1999나, Juan S. Bonifacino에 의해 편집된, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley ＆ Sons, Inc., 1999와 같은, 상업적으로 입수가능한 문헌에서 발견될 수 있다.

또한, 소기관의 완전성은 예를 들어, 정량적 효소 어세이, 소기관-특이적 마커 단백질에 대한 웨스턴 블랏 및 전자현미경 실험과 같은, 당업계의 어느 적당한 방법에 의해 결정될 수 있다. 투과 전자 현미경(TEM)이 소기관을 동정하고 소기관의 기능과 일반적으로 상호연관될 수 있는, 그들의 형태(예를 들어, 크기, 형상, 구조적 조직 및 밀도)를 통한 소기관의 완전성을 정성적으로 특성분석하는데 사용될 수 있다. 환언하면, 더 높은 정도의 완전성을 갖는 소기관은 일반적으로 더 보전된 기능을 가질 것이다.

소기관 응용. 본 발명에 의해 얻어진 소기관은 프로테오믹스에서도, 다른 분야에서도 사용될 수 있다. 그러한 다른 분야는 유전체학, 신경화학, 면역화학, 생화학, 조직학, 식물학, 식물 생화학, 물리 인류학, 법정의학 및 병리학, 및 그들의 결합을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 당업자는 어떻게 소기관이 이들 분야에서 사용될 수 있는지 이해할 것이다. 추가로, 본 발명의 방법에 의해 얻어진 소기관은 예를 들어, 인간, 동물, 가축 및 애완동물 관리 분야에서 유용한, 진단제, 의약, 화학물질 및 백신을 개발하는데 사용될 수 있다.

단백질 특성분석 및 정량화. 도 2는 소기관에 존재하는 단백질의 특성분석과 정량에 관한 것이다. 세포의 프로테옴은 상이한 세포내 소기관 타입과 구조로 나누어지므로 본 발명의 방법에 따른 관심있는 세포내 소기관 및 다른 세포내 구조의 분리, 농축 및 축적은 생물학적 샘플의 프로테옴을 "예비-분획화"하는 방법으로 생각될 수 있다. 따라서, 일단 소기관이 분리 및 정제되면, 보전된 전체 생물학적 샘플의 프로테옴이 프로테옴하 구성성분으로 효과적으로 분획화된다. 본 발명의 방법은 생물학적 샘플의 프로테옴의 복잡성을 감소시키고 프로테옴의 단백질 구성성분의 추후 분석을 용이하게 한다.

소기관 용해. 도 2에 나타내어진 바와 같이, 축적된 소기관은 당업계에 알려진 어느 기술에 의해 용해된다. 용해는 전형적으로 소기관의 내용물을 방출하기에 충분한 방식으로 소기관의 막을 파쇄하기 위해 수행된다. 소기관의 내용물은 예를 들어, 소기관의 프로테옴을 포함한다.

단백질과 펩티드 분리. 일단 세포내 소기관의 농축, 축적 및 용해가 달성되면, 분리된 소기관의 각각의 단백질 성분(예를 들어, 각 소기관의 세포내 프로테옴)은 희소 단백질과 같은, 관심있는 단백질의 검출을 용이하게 하기 위하여 분석될 수 있다. 소기관의 세포내 프로테옴과 같은, 단백질과 펩티드의 큰 집단을 분석하는 상이한 방법이 당업계에 알려져 있다. 당업자는 본 발명의 범위를 벗어나지 않으면서 가장 적절한 단백질 단리 및 정제기술을 선택할 수 있다.

특정 방법의 일례는 2-차원(2D) 젤 전기영동이다. 세포내 프로테옴과 같은, 복잡한 단백질 용액의 2-차원 젤 전기영동은 폴리펩티드의, 전형적으로 당업계에서 분해되는(resolved) 것으로 언급되는, 분리된 양식을 가져오며, 그런 다음 그들의 실체에 대해 추가로 조사될 수 있다. 예를 들어, 웨스턴 블랏팅이 특정 항체로의 프로빙을 통해 특정 타입, 클래스 또는 특정 단백질 또는 그의 단편을 동정하는데 사용될 수 있다. 부가적으로, 생성되고 질량 분광계에 의해 검출된 결과 펩티드 단편의 분자량 프로파일을 질량 분광측정 데이터베이스나 전체-게놈 데이터베이스나 전체-게놈 서열이나 폴리펩티드 데이터베이스에 포함된 정보와 비교함으로써 질량 분광측정법이 젤에 있는 분해된 단백질의 실체를 결정하는데 사용될 수 있다.

검출 및 동정 과정은 자동 또는 반자동화될 수 있다. 또한, 로봇공학이나 당업자에게 알려진 고처리량 장치가 사용될 수 있다.

단백질을 연구하는데 유용한 다른 기술은 예를 들어, HPLC, FPLC 등을 이용하는, 정상 또는 역 상과 같은 액체 크로마토그래피; 크기 배제 크로마토그래피; 고정화된 금속 킬레이트 크로마토그래피; 친화도 크로마토그래피; 어느 다른 크로마토그래피 방법; 단백질 결합 분석; 효모 2-하이브리드 분석; 3-차원 구조 연구; 1D 및 2D와 같은 젤 전기영동; 및 가장 최근에는, 단백질/폴리펩티드 마이크로어레이 및 바이오인포메틱스를 포함한다.

단백질과 펩티드를 분리하는 본 발명의 범위 내의 다른 기술은 "MudPIT"로도 언급되는, 다차원 액체 크로마토그래피("MDLC")이다. MudPIT는 프로테옴에서 상이하고, 부분적으로 겹치는, 단백질의 세트를 동정하기 위하여 2-차원 젤 전기영동의 대안으로 사용된다. 2-차원 젤 전기영동과 같이 최초 단백질 분리 단계를 사용하는 대신, 소기관에 대해 농축된 구배 분획과 같은, 생물학적 샘플의 완전한 프로테옴은 먼저 트립신으로 분해된다. 결과로서 생성된 펩티드의 복잡한 혼합물은 강력한 음이온 교환(SAX)과 역상(RP) 칼럼의 결합을 이용하여 MDLC에 의해 분해되고, 분리된 펩티드는 탠덤 질량 분광계(MS/MS)로 분석된다. 펩티드의 MS/MS로부터 얻어진 정보는 그런 다음 단백질 실체를 예측하는데 사용된다.

프로테옴 분석은 전형적으로 2D-GE의 고-분해능 분리 기술을 매트릭스-보조 레이저 탈착-이온화("MALDI") 질량 분광측정법의 고감수성 동정 기능과 결합함으로써 수행된다. 이 결합에 기초한 몇몇 전략이 개발되었다. 가장 최근에, ESI/MS/MS에 기초한 접근법이 프로테옴 분석을 위한 보충적 또는 대안적 기술로서 출현하였다. 그러한 접근법은 복합적인 샘플의 전체 단백분해효소 분해 후 하나 이상의 반복적 인-라인 크로마토그래피 단계를 이용한 단백분해효소 혼합물의 부분적 분리에 이어서, 보통 전자분무 이온화 경계면을 통한, MS/MS를 이용하는 펩티드의 분석을 포함한다. 데이터를 얻는데 사용되는 전략과 독립적으로, 얻어진 값을 특정 데이터베이스 내의 모든 단백질로부터 유래된 트립신에 의해 생긴 펩티드에 대해 이론적으로 계산된 것들과 매치하기 위하여 분해된 펩티드의 실험적으로 수득된 덩어리가 데이터베이스-검색 프로그램으로 도입된다.

단백질과 펩티드의 특성분석과 정량. 도 2를 다시 참조하면, 본 발명으로부터 유래된 희소 단백질과 같은 단백질과 펩티드를 특성분석하고 정량하는 기술은 예를 들어, 어느 알려진 생화학적 접근법, 효소 어세이, 항체 면역반응, 리간드 분석, 단백질/펩티드 질량 분광측정, 기질 분석, 또는 그들의 결합을 포함한다. 단백질의 기능을 검증하는데 사용되는 실험의 타입은 전형적으로 예상되는 단백질의 기능에 관한 지식에 의존하고 그에 의해 좌우된다.

일 구체예에서, 단백질 수준의 상대적 정량화는 예를 들어, 넌리니어 다이나믹스(Nonlinear Dynamics)로부터의 포레틱스 2D 에볼루션(Phoretix 2D Evolution)과 같은 컴퓨터 소프트웨어를 이용하는 디지털화된 버전의 젤 영상에서 단백질/펩티드 스팟의 강도를 비교함으로써 2D 젤로부터 얻어질 수 있다. 동위원소-코드된 친화성 택((ICAT)(어플라이드 바이오시스템즈, CA)과 같은 2D 젤을 포함하지 않는 다른 방법이 사용될 수 있다.

ICAT 방법은 단백질과 반응하는 중질 및 경질 버전의 시약을 사용한다. 이 "동위원소 코딩"에 부가하여, 시약은 정제를 용이하게 하기 위하여, 시스테인 설프하이드릴 그룹과 반응하는, 화학 그룹, 요오도아세트아미드와, 친화성 택, 바이오틴을 갖는다. ICAT 실험은 전형적으로 하나의 프로테옴을 경질 버전의 시약과 다른 프로테옴을 중질 버전과 반응시키는 것을 포함한다. 그런 다음 표지된 프로테옴은 서로 합해지고 적당한 워크플로 장치를 이용하여 분석된다. 예를 들어, 분석되고 있는 펩티드 혼합물의 복잡성을 줄이기 위해 트립신에 의해 제조된 표지된 펩티드는 비표지된 펩티드로부터 친화도 정제된다. 친화도-정제된 펩티드는 그런 다음 분리되고 MS에 의해 분석된다.

ICAT-표지된 펩티드의 질량 스펙트럼은 전형적으로 중질 및 경질 시약의 질량 차이와 동일한 질량이 상이한 이온 쌍을 함유한다. 펩티드는 동일한 질량 스펙트럼에서 측정되고 있으므로, 두 프로테옴에 있는 펩티드와 따라서 단백질의 상대적 정량화를 얻는 것이 가능하다. ICAT는 2-차원 젤 전기영동에 따르지 않는 프로테옴이나 서브-프로테옴을 정량하는데 유용하다.

단백질 동정. 당업자에게 이용가능한 어느 동정 또는 분석 기술이 본 발명에 의해 수득된 단백질과 펩티드를 동정하는데 사용될 수 있다. 단백질을 동정하고 연구하는데 유용한 기술은 예를 들어, 질량 분광측정, 공-면역침전, 친화도 크로마토그래피, 단백질 결합 분석, 효모 2-하이브리드 분석, 3-차원 구조 연구 및 가장 최근에는, 단백질/폴리펩티드 마이크로어레이 및 바이오인포메틱스를 포함한다. 보다 보편적인 동정 기술의 일부는 MALDI와 결합된 2D-GE; ESI/MS-MS; 및 보통 전자분무 이온화 경계면을 통한, 탠덤 질량 분광측정(MS-MS)을 포함한다.

일 구체예에서, 본 발명은 여기에서의 방법에 의해 축적된 소기관으로부터, 실질적으로 순수한 형태로 단백질을, 특히 하나 이상의 희소 단백질을 단리하고 정제한다. 예를 들어, 희소 단백질은 본 발명의 2-차원 폴리아크릴아미드 젤과 같은, 폴리아크릴아미드 젤로부터 분리되고, 표준 기술을 이용하여 그로부터 정제될 수 있다. 희소 단백질은 또한 예를 들어, 관심있는 특정 희소 단백질에 특이적인 항체를 이용하는 면역침전이나 면역친화도 크로마토그래피와 같은, 다른 당업계에 인식되어 있는 기술을 이용하여 정제될 수 있다. 추가로 여기에서 더욱 상세히 설명되는 바와 같이, 관심있는 희소 단백질을 코딩하는 유전자가 클로닝되고 숙주 유기체에서 발현되며, 당업계에 인식되어 있는 기술을 이용하여 단리되고 정제될 수 있다.

본 발명의 희소 단백질은 어느 특정 클래스에 제한되는 것으로 의미되지 않는다. 희소 단백질은 세포에서 그들의 상대적 양이나 카피 수에 기초하여 그 자체로 분류될 수 있다. 예를 들어, 전형적인 세포는 적어도 10⁴개의 독특한 단백질 종을 갖고 카피 수에 관하여 10배 범위의 "동적 범위"(즉, 10² 카피 미만 내지 10⁷ 초과)를 갖는, 약 10⁹개의 단백질 분자를 갖는 것으로 알려져 있다. "동적 범위"는 세포에 있는 단백질이 가장 낮은 카피 수에서 가장 높은 카피 수를 나타내는 범위이다. 세포에 있는 약 9,000개의 단백질이 세포당 1,000 카피 미만으로 존재하고 "희소 단백질"로 알려져 있다. 세포에 있는 희소 단백질의 합은 일반적으로 세포 질량의 약 3％ 미만을 구성한다. 예를 들어, 티로신 키나제는 세포당 30-40 카피의 범위로 존재한다. 추가로, 어느 희소 단백질은 약 피코몰(pM) 또는 10^-9 내지 약 펨토몰(fM) 또는 10^-12 농도, 예를 들어 약 10^-9, 약 10^-12, 또는 약 10^-9 미만의 농도로 존재할 수 있다.

희소 단백질은 일반적으로 공지의 단백질 분석 장치 및(또는) 방법을 이용하여 검출하기 어렵다. 예를 들어, 2D 젤 전기영동의 컨텍스트에 있는 희소 단백질은 낮은 카피 수 및(또는) 그들의 더 우세한 단백질과의 중첩에 기초하여 "스팟"(젤 상에서 전기영동적으로 분리된 폴리펩티드)으로 검출하기 어려울 수 있다. 본 발명은 기지 또는 미지의, 세포내 또는 세포외(간질 공간에 있는 단백질, 신경전달물질 및 신호 단백질과 같은)의 어느 희소 단백질, 심지어 세포당 약 750, 500, 250 또는 100 카피, 또는 심지어 세포당 약 1 카피로 존재하는 희소 단백질을 착상한다.

특성분석된 기지 및 미지 단백질의 단백질 응용.

다시 도 2를 참조하면, 희소 단백질과 같은, 본 발명의 방법에 의해 수득된 단백질을 이용하는 많은 방법이 있다. 예를 들어, 본 발명의 방법에 의해 수득된 단백질은 예를 들어, 인간, 동물, 가축 및 애완동물 관리 분야에 유용한, 진단제, 의약, 화학물질 및 백신을 개발하는데 사용될 수 있다.

본 발명의 일 응용은 생물학적 샘플의 두 세트 사이 또는 시간의 함수로서 프로테옴 변화를 분석하는 방법을 제공한다. 시간은 생검과 같은, 생물학적 샘플이 채취되는 점에 관한 것이다. 이 구체예에서, 세포내 소기관의 적어도 두 타입이 생물학적 샘플로부터, 전형적으로 당업계에 인식되어 있는 균질화 또는 용해 과정에 의해, 방출된다. 세포내 소기관의 적어도 두 타입은 그런 다음 연속-흐름 초원심분리기 내의 밀도 구배로 도입된다. 세포내 소기관의 적어도 두 타입이 밀도 구배 내에서 이동하도록, 바람직하게는 약 100,000×g 이상의, 원심력이 적용된다. 일 구체예에서, 원심분리는 단일의 실행으로 수행된다. 원심분리 후, 세포내 소기관의 적어도 두 타입이 밀도 구배로부터 수집된다. 세포내 소기관의 적어도 두 타입으로부터의 단백질은 그런 다음 단리되고 정제되어 세포내 소기관의 적어도 두 타입의 프로테옴 프로파일을 제1 시점에 결정한다. 이 과정은 또한 세포내 소기관의 단일 타입으로 수행될 수 있다.

제2 생물학적 샘플이 제공되고 세포내 소기관의 적어도 두 상이한 타입이 그로부터 방출된다. 그런 다음 세포내 소기관의 적어도 두 타입은 연속-흐름 초원심분리기 내의 밀도 구배로 도입되고; 세포내 소기관의 적어도 두 타입이 밀도 구배 내에서 이동하도록, 원심력이 바람직하게는 단일 실행으로, 적용된다.

원심분리 후, 세포내 소기관의 적어도 두 타입이 밀도 구배로부터 수집된다. 세포내 소기관의 적어도 두 타입으로부터의 단백질이 분리되고 정제되어 세포내 소기관의 적어도 두 타입의 프로테옴 프로파일을 제2 시점에서 결정한다. 과정의 이 부분은 또한 소기관의 한 타입으로 수행될 수 있다. 마지막으로, 제1 및 제2 시점에서의 프로테옴 프로파일이 당업계에 인식되어 있는 기술에 의해 분석되어 프로테옴 프로파일을 시간의 함수로서 검출한다. 그러한 발명은 예를 들어, 질병 상태의 분석에서와 개체나 개체의 상이한 그룹의 프로테옴 프로파일을 비교할 때 응용가능성을 발견한다.

다른 단백질 응용 구체예에서, 단백질 전좌 현상이 본 발명의 방법을 이용하여 분석될 수 있다. 보다 구체적으로, 전좌 과정은 시간의 함수로서의 전좌 단백질 및(또는) 전좌 단백질들의 세포내 및(또는) 세포간 이동에 관한 것이다. 제1 생물학적 샘플의 소기관의 제1 및 제2 타입에서 전좌 단백질의 상대량이 먼저 결정된다. 과정은 예를 들어, 제1 및 제2 소기관이 각각 세포내 프로테옴을 포함하는, 제1 및 제2 소기관을 균질화물로 방출하기에 충분한 조건 하에서 제1 생물학적 샘플을 균질화하는 것을 포함한다. 그런 다음 균질화물은 연속-흐름 초원심분리기 내의 밀도 구배로 도입된다. 제1 및 제2 소기관이 밀도 구배 내에서 이동하도록 원심력이 균질화물에 적용된다. 제1 및 제2 소기관이 밀도 구배로부터 분리되고, 제1 및 제2 소기관의 세포내 프로테옴이 이어서 가용화된다. 가용화 후, 제1 생물학적 샘플의 제1 및 제2 소기관에서 전좌 단백질이 그런 다음 검출되고 검출된 전좌 단백질의 수준이 측정된다.

제2 생물학적 샘플은 제1 생물학적 샘플의 라인에 따라 유사하게 가공된다. 즉, 제2 생물학적 샘플은 제1 및 제2 소기관이 각각 세포내 프로테옴을 포함하는, 제1 및 제2 소기관을 균질화물로 방출하기에 충분한 조건 하에서 균질화된다. 그런 다음 제2 생물학적 샘플로부터의 균질화물은 연속-흐름 초원심분리기 내의 밀도 구배로 도입된다. 제1 및 제2 소기관이 밀도 구배 내에서 이동하도록 원심력이 균질화물에 적용된다. 제1 및 제2 소기관이 밀도 구배로부터 분리되고, 제1 및 제2 소기관의 세포내 프로테옴이 이어서 가용화된다. 가용화 후, 제2 생물학적 샘플의 제1 및 제2 소기관에서 전좌 단백질이 그런 다음 검출되고 검출된 전좌 단백질의 수준이 측정된다.

제1 및 제2 생물학적 샘플의 전좌 단백질 및(또는) 전좌 단백질들이 검출되고 측정된 후, 전좌 과정이 분석된다. 예를 들어, 시간의 함수로서의 전좌 단백질의 전좌 과정이 제1 및 제2 시점에서 각각의 생물학적 샘플에 대한 제1 및 제2 소기관에서 검출된 전좌 단백질의 측정된 수준을 비교함으로써 결정된다.

본 발명은 추가로 도 19(A)(3-4)에 표시된 바와 같이, 소기관 단백질의 분석과 분리 및 그의 희소 단백질의 검출 및(또는) 동정에 관한 정보가 동일하거나 다른 사용자에 의해 나중 시점에 접근되는 데이터베이스에 제공되거나, 전송되거나, 저장될 수 있음을 착상한다. 본 발명은 프로테옴의 단백질을 분리하거나 희소 단백질을 검출하는 방법 동안 생성되거나 수집된 어느 데이터가 제3자에게 전송되거나 전달될 수 있음을 착상한다. 예를 들어, 2-차원 젤 상의 분해된 단백질의 양상에 관한 영상 데이터나 젤의 분해된 단백질의 발현의 상이한 수준에 관한 정보는 예를 들어, 전자우편이나, 인터넷이나 네트워크로, 제3자에게, 데이터베이스로 또는 그로부터, 실험실, 개인 또는 연구 그룹에게 전자적으로 전송될 수 있다. 데이터는 또한 월드 와이드 웹이나 다른 글로벌 통신 네트워크와 같은, 네트워크로 전자적으로 전송(예를 들어, 포스팅)될 수 있다.

당업자는 본 발명의 데이터베이스가 많은 상이한 형태 및(또는) 구조를 가질 수 있고 정보의 전자적 저장과 검색을 위한 어느 알려진 프로토콜을 이용할 수 있음을 이해할 것이다. 본 발명은 추가로 상업적 목적을 위해 데이터베이스에 대한 접근을 제공하는 것을 착상한다. 접근은 월드 와이드 웹과 같은, 글로벌 통신 네트워크를 통한 전자적 접근일 수 있다.

일단 희소 단백질이 질량 분광측정법에 의해서와 같이, 본 발명에 의해 착상된 검출방법에 의해 동정되면, 단백질이나 단백질 단편의 완전한 아미노산 서열이 전체-게놈 서열 데이터베이스로부터 수득될 수 있다. 본 발명은 추가로 비교 서열 분석 방법에 의해 관심있는 희소 단백질의 추정 기능의 결정을 착상한다. 그러한 방법은 당업계에 널리 알려져 있고 관심있는 아미노산 서열(예를 들어, "질문 서열")을 데이터베이스에 포함된 아미노산 서열과 비교하여 기능이 이미 알려진 유사한 서열을 갖는 폴리펩티드를 동정하기 위한 알고리즘을 사용하는, 데스크탑 컴퓨터나 워크스테이션 상에 국소적으로 이용가능하거나 월드 와이드 웹과 같은 네트워크를 통해 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어에 관한 것이다. 이 일반적 접근법은 "상동성 검색"으로 확인될 수 있다. 상동성 검색은 질문 서열의 기능을 확고하게 동정하는 것이 아니라 단지 특정 서열이 동일하거나 유사한 기능을 공유할 가능성을 확립할 뿐이다. 예를 들어 희소 단백질과 같은, 관심있는 단백질의 기능을 추가로 확인하거나 검증하기 위하여 실험이 수행될 수 있다.

따라서, 본 발명의 희소 단백질은 예를 들어 젠뱅크, 스위스-프롯 및 프로틴 데이터 뱅크 등과 같은, 다양한 데이터베이스의 단백질 서열에 대한 비교 서열 분석(예를 들어, 상동성 검색)에 기초하여 예상되는 기능으로 지정될 수 있다. 아미노산 서열의 문맥에서 용어 "백분율 동일성"은 최대 일치를 위해 정렬될 때 동일한 두 서열에서의 잔기를 말한다. 서열 유사성이나 동일성을 측정하는데 사용될 수 있는 당업계에 알려져 있는 많은 상이한 알고리즘이 있다. 예를 들어, 폴리펩티드 서열이 NCBI BLASTp 및(또는) FASTA, GCG 버전 6.1의 프로그램을 사용하여 비교될 수 있다. FASTA는 질문 및 검색 서열 사이에 최상 중복 부분의 정렬과 백분율 서열 동일성을 제공한다.

다르게는, DNA나 RNA의 문맥에서, 뉴클레오티드 서열 유사성 또는 상동성 또는 동일성은 NCBI에서 이용가능한 마이어와 밀러("Optimal Alignments in Linear Space", CABIOS 4, 11-17, 1988)의 "정렬" 프로그램을 이용하여 결정될 수 있다. 예를 들어, 뉴클레오티드 서열에 관하여, 용어 "유사성" 또는 "동일성" 또는 "상동성"은 두 서열 사이의 상동성의 정량적 척도를 가리키고자 의도된다. 백분율 서열 유사성은 (N_ref - N_dif)*100/N_ref(여기에서, N_dif는 정렬 시 두 서열에 있는 동일하지 않은 잔기의 총 수이고 N_ref는 서열 중 하나에 있는 잔기 수이다)로 계산될 수 있다. 따라서, DNA 서열 AGTCAGTC는 서열 AATCAATC와 75％의 서열 유사성을 가질 것이다(N_ref = 8; N_dif = 2). 다르게 또는 부가적으로, 서열에 관한 "유사성"은 두 서열 중 더 짧은 것에 있는 뉴클레오티드의 수로 나눈 동일한 뉴클레오티드를 갖는 위치의 수를 말하며, 여기에서 두 서열의 정렬은 예를 들어, 20 뉴클레오티드의 윈도우 크기, 4 뉴클레오티드의 단어 길이 및 4의 갭 패널티를 이용하는, 윌버와 립만 알고리즘(Wilbur and Lipman, 1983 PNAS USA 80:726)에 따라 결정될 수 있고, 정렬을 포함하는 서열 데이터의 컴퓨터-보조된 분석과 해석은 상업적으로 이용가능한 프로그램(예를 들어, 인텔리제네틱스™ 스위트(Intelligenetics™ Suite), 인텔리제네틱스, 아이엔씨., CA)을 이용하여 수행될 수 있다. RNA 서열이 DNA 서열과 유사하거나, 서열 동일성 정도를 갖는다고 말해질 때, DNA 서열에 있는 티미딘(T)은 RNA 서열에 있는 우라실(U)과 같은 것으로 간주된다.

일단 추정되거나 예상되는 기능이 관심있는 특정 단백질, 특히 희소 단백질에 대해 확인되면, 특허출원이 작성되고 적절한 국내 및(또는) 국제 특허청에 출원될 수 있다. 출원은 예를 들어, 기능이 상동성 검색으로부터 예측되는 관심있는 단백질에 관한 것이다. 청구범위는 예를 들어, 관심있는 단백질의 아미노산 서열, 그의 예상되는 기능에 기초한 그의 유용성, 또는 관심있는 단백질을 코딩하는 DNA를 운반하는 어느 클로닝 벡터나 발현 벡터에 대한 것일 수 있다.

도 19(C)(8)에 나타내어진 바와 같이, 본 발명은 추가로 희소 단백질과 같은, 관심있는 단백질의 예상되는 기능을 검증하는 것을 착상한다. 검증은 생화학, 면역학, 생리화학, 단백질 구조 및 유전학적 기술을 이용하여 수행될 수 있으며, 그 중 어떠한 것도 당업자에게 알려져 있다. 일 구체예에서, 도 19(B)(7)에 나타낸 바와 같이, 본 발명은 관심있는 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 클로닝하는 것을 착상한다. 상이한 전략이 관심있는 단백질을 코딩하는 유전자, 유전자 단편, 또는 뉴클레오티드 서열을 클로닝하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 축퇴 뉴클레오티드 프로브가 관심있는 단백질의 서열에 기초하여 제조되고 DNA의 코딩 조각을 운반하는 플리스미드나 벡터 클론에 대해 DNA 또는 cDNA 라이브러리를 스크린하는데 사용될 수 있다. 다른 예에서, 관심있는 DNA를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 관심있는 단백질의 서열에 기초하는 프라이머를 이용하는 PCR에 의해 증폭될 수 있다. 추가로, 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 전사 제어 부위를 얻기 위하여 클로닝 단계가 이어서 수행될 수 있다. 뉴클레오티드 서열은 생물학적 샘플의 원래 공급원 뿐만 아니라, 유사한 서열을 공유하는 생물학적 샘플의 다른 공급원으로부터 수득될 수 있다.

코딩 뉴클레오티드 서열이 클로닝되면, 그것은 추가로 발현벡터로 조작되어, 숙주 세포에서 발현되고, 단리된 후 추가로 관심있는 단백질의 기능을 실험에 의해 측정하고 확인하기 위하여 분석될 수 있다. 따라서, 검출된 희소 단백질과 같은, 본 발명의 폴리펩티드는 재조합적으로 생산되고 단세포 숙주에서 발현될 수 있다. 숙주에서 외래 DNA 서열의 높은 발현 수준을 얻기 위하여, 서열은 일반적으로 선택된 숙주에서 기능적인 전사 및 번역 발현 제어 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다. 바람직하게는, 발현 제어 서열과 관심있는 유전자는 추가로 선별 마커를 포함하는 발현 벡터에 포함될 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열은 신호 서열을 코딩하거나 하지 않을 수 있다. 발현 숙주가 진핵세포이면, 일반적으로 성숙 당단백질이 진핵 숙주로부터 분비되도록 신호 서열이 코딩되는 것이 바람직하다.

아미노 말단 메티오닌은 본 발명의 조성물 중의 발현된 폴리펩티드에 존재하거나 하지 않을 수 있다. 말단 메티오닌이 발현 숙주에 의해 절단되지 않으면, 원하는 경우, 표준 기술에 의해 화학적으로 제거될 수 있다.

광범위하게 다양한 발현 숙주/벡터 결합이 본 발명의 약제학적 조성물 및 백신에 사용되는 WNV 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열에 사용될 수 있다. 진핵 숙주를 위해 유용한 발현 벡터는 예를 들어, SV40, 소 파필로마 바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 사이토메갈로바이러스 및 렌티바이러스를 포함하는 레트로바이러스로부터의 발현 제어 서열을 포함하는 벡터를 포함한다. 세균 숙주를 위해 유용한 발현 벡터는 pBluescript®, pGEX-2T, pUC 벡터, colE1, pCR1, pBR322, pMB9 및 그들의 유도체, pET-15를 포함하는, E. 콜라이로부터의 것들과 같은, 세균 플라스미드, RP4와 같은 더 넓은 숙주 범위 플라스미드, 파지 DNA들, 예를 들어, 파지 람다와 다른 파지의 수많은 유도체, 예를 들어, λGT10 및 λGT11를 포함한다. 효모 세포를 위해 유용한 발현 벡터는 2μ 플라스미드와 그의 유도체를 포함한다. 곤충 세포를 위해 유용한 벡터는 pVL941을 포함한다.

부가적으로, 작동가능하게 연결될 때 DNA 서열의 발현을 제어하는 서열인, 광범위하게 다양한 발현 제어 서열 중 어느 것이 본 발명의 조성물에 사용되는 폴리펩티드를 발현하기 위하여 이들 벡터에 사용될 수 있다. 그러한 유용한 발현 제어 서열은 상기 발현 벡터의 구조 유전자와 관련된 발현 제어 서열을 포함한다. 유용한 발현 제어 서열의 예는 예를 들어, SV40 또는 아데노바이러스의 초기 및 후기 프로모터, lac 시스템, trp 시스템, TAC 또는 TRC 시스템, T3 및 T7 프로모터, 파지 람다의 주 오퍼레이터와 프로모터 부위, fd 외피 단백질의 제어 부위, 3-포스포글리세레이트 키나제나 다른 해당 효소의 프로모터, 산 포스파타제의 프로모터, 예를 들어, Pho5, 효모-교배 시스템의 프로모터 및 원핵 또는 진핵 세포 또는 그들의 바이러스의 유전자의 발현을 제어하는 것으로 알려진 다른 구성적 및 유도성 프로모터 서열, 및 그들의 다양한 결합을 포함한다.

용어 "숙주 세포"는 재조합 DNA 분자가 도입되는 하나 이상의 세포를 말한다. 본 발명의 숙주 세포는 세균, 효모, 동물, 곤충 및 식물 세포를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 숙주 세포는 단세포이거나, 액체 배양물, 단일층 등으로 조직 배양에서 성장될 수 있다. 숙주 세포는 또한 조직으로부터 직접 또는 간접적으로 유래될 수 있다.

광범위하게 다양한 단세포 숙주 세포가 본 발명의 약제학적 조성물에 사용되는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열을 발현하는데 유용하다. 이들 숙주는 E. 콜라이 균주, 슈도모나스, 바실러스, 스트렙토마이세스, 진균, 효모, 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda)(SF9)와 같은 곤충 세포, CHO와 마우스 세포와 같은 동물 세포, COS 1, COS 7, BSC 1, BSC 40 및 BMT 10과 같은 아프리카 녹색 원숭이 세포와, 인간 세포와, 식물 세포와 같은, 주지의 진핵 및 원핵 숙주를 포함할 수 있다.

숙주 세포는 핵산이 세포외 환경으로부터 세포로 전좌될 때 핵산에 의해 "형질전환"된다. 핵산을 세포로 도입하는 어느 방법이 사용될 수 있다; 여기에서 다르게 표시하지 않으면, 용어는 핵산을 세포로 전달하는 어느 특정 방법도, 어느 특정 세포 타입이 전달 대상임도 함축하지 않는다.

"발현 제어 서열"은 유전자 발현(즉, 전사, RNA 형성 및(또는) 번역)을 조절하는 핵산 서열이다. 발현 제어 서열은 예를 들어, 선택된 숙주 세포나 유기체(예를 들어, 원핵 및 진핵 숙주 사이), 전사 단위의 타입(예를 들어, RNA 폴리머라제가 서열을 인식해야만 하는), 유전자가 정상적으로 발현되는 세포 타입(및 다음으로, 그 세포 타입에 정상적으로 존재하는 생물학적 인자)에 따라 변화할 수 있다.

"프로모터"는 하나의 그러한 발현 제어 서열이고, 여기에 사용된 바, 하류(3') 핵산 서열의 전사를 제어, 조절하고(거나) 지시하는 핵산 서열의 어레이를 말한다. 여기에 사용된 바, 프로모터는 폴리머라제 Ⅱ 타입 프로모터의 경우, TATA 요소와 같은, 전사의 개시 위치 가까이에 필요한 핵산 서열을 포함한다.

"구성적" 프로모터는 대부분의 환경 및 발생 조건 하에서 활성인 프로모터이다. "유도성" 프로모터는 적어도 하나의 환경 또는 발생 조건 하에서 불활성이고 그 조건을 변화시킴으로써 스위치 "온"될 수 있는 프로모터이다. "조직 특이적" 프로모터는 유기체의 어느 조직 타입에서는 활성이지만, 동일한 유기체로부터의 다른 조직에서는 그러하지 않다. 유사하게, 발생적으로 조절되는 프로모터는 숙주 유기체의 모두가 아닌 일부 발생 단계 동안 활성이다.

발현 제어 서열은 또한 전사 개시 위치로부터 수천 염기쌍 만큼 위치될 수 있는 원위의 인핸서나 리프레서 요소를 포함한다. 그들은 또한 RNA 형성(예를 들어, 캡핑, 스플라이싱, 3' 말단 형성 및 적절한 경우, 폴리-아데닐화); 번역(예를 들어, 리보솜 결합 위치); 및 번역후 수식(예를 들어, 글리코실화, 인산화, 메틸화, 프레닐화 등)에 요구되는 서열을 포함한다.

용어 "작동가능하게 연결된"은 발현 제어 서열이 제2 서열에 상응하는 핵산의 전사를 지시하는, 핵산 발현 제어 서열(프로모터, 또는 전사 인자 결합 위치의 어레이와 같은)과 제2 핵산 서열 사이의 기능적 연결을 말한다.

물론 모든 벡터와 발현 제어 서열이 여기에 언급된 폴리펩티드를 발현하는데 똑같이 잘 기능하지는 않음이 이해되어야만 한다. 모든 숙주도 동일한 발현 시스템으로 똑같이 잘 기능하지는 않을 것이다. 그러나, 당업자는 과도한 실험 없이 본 발명의 범위를 벗어나지 않으면서 이들 벡터, 발현 제어 서열 및 숙주 중에서 선택할 수 있다. 예를 들어, 벡터를 선택하는데 있어서, 숙주는 벡터가 그 안에서 복제되어야 하므로 전형적으로 고려되어야 한다. 벡터의 카피 수, 그 카피 수를 제어하는 능력, 존재하는 경우, 통합을 제어하는 능력 및 항생제나 다른 선별 마커와 같은, 벡터에 의해 코딩되는 어느 다른 단백질의 발현도 고려되어야 한다.

발현 제어 서열을 선택하는데 있어서, 다양한 인자가 또한 고려되어야 한다. 이들은 예를 들어, 프로모터 서열의 상대적 강도, 그의 제어가능성 및 특히 잠재적인 이차 구조에 관한 본 발명에 기재된 펩티드의 DNA 서열과 그의 적합성을 포함한다. 단세포 숙주가 선택된 벡터와 그들의 적합성, 약제학적 조성물에 사용되는 당단백질을 코딩하는 DNA 서열에 의해 코딩되는 산물의 독성, 그들의 분비 특성, 폴리펩티드를 정확하게 접는 그들의 능력, 그들의 발효 또는 배양 요건, 및 그들로부터 DNA 서열에 의해 코딩되는 산물의 정제의 용이성을 고려하여 선택되어야 한다.

이들 지수 내에서, 당업자는 발효 상의 또는 다른 대규모 배양 중의 약제학적 조성물에 사용되는 산물을 코딩하는 DNA 서열을 발현하는 다양한 벡터/발현 제어 서열/숙주 조합을 선택할 수 있다.

본 발명에 기재된 폴리펩티드는 발효 또는 세포 배양으로부터 단리되고 여기 다른 곳에 기재된 다양한 통상적 방법 중 어느 것을 이용하여 정제될 수 있다. 당업자는 본 발명의 범위를 벗어나지 않으면서 가장 적절한 단리 및 정제 기술을 선택할 수 있다. 폴리펩티드가 막 결합되거나 지단백질인 것으로 추정되면, 그것은 그러한 단백질에 대해 당업계에 알려진 방법을 이용하여, 예를 들어, 다양한 적당한 계면활성제 중 어느 것을 이용하여 단리될 수 있다.

일단 관심있는 단백질의 기능이 실험에 의해 알려지거나 검증되면, 예를 들어, 관심있는 희소 단백질과 같은, 관심있는 단백질, 그의 아미노산 서열, 그의 기능 및(또는) 생물학적 활성, 이에 따른 뉴클레오티드 서열 및 이에 따른 뉴클레오티드 서열을 갖는 클로닝 벡터와 발현 벡터에 대한 국내 또는 국제 특허를 출원하여 보호될 수 있는 가치있는 지적재산권을 소유할 수 있다. 특히, 관심있는 단백질의 검증된 기능은 국내 또는 국제 특허를 획득하기 위한 유용성 요건을 진정으로 확립할 수 있다. 위 단계로부터 생성된 정보, 특히 희소 단백질과 같은, 관심있는 단백질의 검증된 기능은 또한 예를 들어, 제약 회사, 생명공학 회사, 데이터베이스 서비스, 바이오인포메틱스 회사, 또는 사립 또는 공립 연구소와 같은, 제3의 사용자에게 배포되거나 전송될 수 있다. 본 발명은 도 20(C)(11-12)에 표시된 바와 같이, 소기관 단백질의 분석과 분리 및 그의 희소 단백질의 검출 및(또는) 동정에 관한 정보가 동일하거나 다른 사용자에 의해 나중에 접근되는 데이터베이스로 제공, 전송 또는 저장될 수 있음을 착상한다.

본 발명은 추가로 데이터를 전송하는, 예를 들어, 팩시밀리, 전자우편, 전화 또는 월드 와이드 웹과 같은 글로벌 통신 네트워크와 같은, 디지털 수단에 의해 각각 전송된, 동정된 단백질의 아미노산 서열이나 동정된 단백질을 코딩하는 핵산 분자, 특정 소기관이나 소기관들의 질병-관련 프로테옴 프로파일에 관한 정보, 예를 들어, 약물과 같은, 특정 자극 적용 시 특정 소기관이나 소기관들의 프로테옴 프로파일에서의 변화에 관한 정보를 개시하는 방법을 포함한다. 예를 들어, 데이터는 구독이나 그에 대한 선별/보안 접근에 의한 것과 같은, 웹사이트 포스팅을 통하고(거나) 전자우편을 통하고(거나) 전화, IR, 라디오, 텔레비전 또는 다른 주파수 신호를 통하고(거나), 케이블 및(또는) 위성 전송을 통한 전자 신호를 통하고(거나), 디스크, 컴팩트 디스크(CDs), 컴퓨터, 하드 드라이브, 또는 전자적 형태로 정보를 포함하는 다른 장치의 전송, 및(또는) 기록된 형태의 정보의 전송, 예를 들어, 팩시밀리 전송 등을 통해 전송될 수 있다. 따라서, 본 발명은 본 발명에 따라 수행하고 그로부터의 정보를, 예를 들어, 나중에 추가로 일부 또는 모든 데이터나 정보를 예를 들어, 치료제와 같은 제품의 제조, 어세이 및 진단 시험 등에 사용하는 1 이상의 당사자에게; 전송하는 사용자를 포함한다. 본 발명은 디스크, CD들, 컴퓨터, 또는 본 발명의 방법 및(또는) 방법의 사용으로부터의 정보를 포함하는 데이터나 정보를 저장하거나 받거나 전송하기 위한 다른 장치나 수단을 포함한다. 따라서, 본 발명은 여기에 논의된 바와 같은 방법을 수행하고 그의 결과를 전송하는 것을 포함하는 정보를 전송하는 방법을 포함한다.

또 여전히, 본 발명은 여기에서의 방법이나 소기관, 단백질, 화합물, 조성물 또는 그로부터 유래된 산물의 일부 또는 전부를 수행하거나 사용하고, 그의 결과나 결과들을 우수하게는 보상, 예를 들어, 요금과 교환하여, 통신하거나 전송하거나 누설하는 것을 포함하여 사업을 하는 방법을 포함한다. 우수하게는, 정보의 통신, 전송 또는 누설은 전자적 수단, 예를 들어, 인터넷이나 전자우편, 또는 여기에 논의된 어느 다른 전송 수단을 통한다. 따라서, 본 발명은 소기관, 단백질, 조성물, 화합물, 및 그로부터 유래된 산물, 및 본 발명의 방법을 포함하는 사업 방법을 포함한다.

따라서, 제1 당사자, "고객"은 예를 들어 여기에 언급된 전송 수단 중 어느 것을 통해, 제2 당사자, "판매자"의 정보 - 이미 준비된 정보 또는 검출된 희소 단백질의 특정 아미노산 서열에 관하여 특별히 주문된 정보 - 를 신청할 수 있고, 예를 들어 정보를 인터넷을 통해서와 같이 전자적 수단을 통해 신청한다. 판매자는 그 정보를 예를 들어, 여기에 언급된 전송 수단 중 어느 것을 통해, 우수하게는 인터넷(예를 들어 보안 또는 구독 또는 선별 접근 웹사이트)이나 전자우편과 같은, 전자적 수단을 통해 전송할 수 있다. 정보는 신청에 답하여 여기에서의 방법의 일부 또는 전부를 수행하거나 여기에서의 방법의 사용으로부터, 또는 여기에서의 방법의 일부 또는 전부를 수행하고, 여기에서의 방법의 일부 또는 전부를 수행하거나 여기에서의 알고리즘의 사용으로부터 정보의 라이브러리를 생성하는 것으로부터 나올 수 있다. 그런 다음 신청을 만족시키는 것은 라이브러리에 대한 고객 접근을 허용하거나 신청에 답하는 라이브러리로부터의 데이터를 선별하는 것에 의할 수 있다.

따라서, 본 발명은 또 추가로 여기에서의 방법이나 장치를 수행하거나 이용하는 것으로부터의, 예를 들어, 전자적 형태(위에서 논의된 전송의 형태와 같은)의 정보 컬렉션을 포함한다.

본 발명은 본 발명과 그의 많은 장점의 보다 나은 이해를 제공하는 아래 예시적, 비제한적 실시예에 의해 부가적으로 설명된다.

아래 실시예는 본 발명에 따른 다양한 구체예를 예시하기 위하여 기재된다. 그러나, 아래 실시예는 어떤 식으로든지 본 발명을 제한하는 것으로 의미되지 않는다.

실시예 1. 간 조직으로부터의 미토콘드리아, 골지, 소포체 및 원형질막의 동시 단리, 정제 및 농축

간 균질화. 대략 100 g의 랫트 간을 조직 단리 전 밤새 절식시킨 웅성 위스타 랫트(150-200 g)로부터 수획하였다. 웨어링 블렌더(10 초 저속, 10 초 고속 및 10 초 저속)를 이용하여 5 부피의 균질화 완충액(로슈로부터의 무-EDTA 프로테아제 저해제 칵테일로 보충된 0.5 M 슈크로스, 20 mM HEPES-KOH, 5 mM MgCl₂)에서 간을 균질화하였다. 균질화 후, 탈핵(post-nuclear) 상등액을 4-5000×g에서 10 분간 원심분리에 의해 수득하였다. 제1 탈핵 회전 후, 상등액을 조심스럽게 따랐다. 탈핵 상등액을 동일 부피의 희석 완충액(20 mM HEPES-KOH, pH 7.2, 5 mM MgCl₂)을 첨가하여 등장 조건으로 평형화하였다.

연속-흐름 초원심분리. 연속 흐름 원심분리를 위해, 슈크로스 구배를 PK3-800 로터에서 확립한 후 랫트 간 균질화물을 기계로 공급하였다. 대략 20 ㎖/분의 유속을 사용하고 PKⅡ를 제1 통과를 위해 처음에 20,000 rpm에서 그런 다음 제2 통과를 위해 최대 속도, 40,000 rpm에서 운전하였다. 용출액으로부터부터의 샘플을 포획하고 나중에 표적 소기관에 대한 포획 효율을 결정하기 위하여 분석하였다. 모든 균질화물을 시스템에 공급하여 그들의 밴딩 밀도에 도달한 후 소기관에게 부가적인 시간을 주었다. 로터를 제어 정지시키고 로터 내용물을 25 ㎖ 수적으로 바닥으로부터 빼냈다.

다른 실험에서, PK3-800 로터를 완충액(250 mM 슈크로스, 20 mM HEPES-KOH, pH 7.2, 5 mM MgCl₂)으로 충전하고 로터를 10,000 rpm에서 회전시켜 공기를 시스템으로부터 제거하였다. 라인을 통한 흐름을 300 ㎖/분까지 증가시키고 공기가 시스템으로부터 제거될 때까지 로터를 통한 흐름을 수회 반전시켰다. 로터를 정지시키고 구배 재료(예를 들어, 슈크로스)를 펌프하여 로터 부피의 절반(대략 400 ㎖)을 충전하였다.

로터를 자동 운전 하에 최대 속도(35,000 rpm 또는 40,000 rpm)로 가속하였다. 구배 형성 중 완충액의 흐름이 대략 40 ㎖/분으로 계속되도록 하였다. 일단 균질화물 풀이 가공 준비가 되면, 로터 속도를 20,000 rpm으로 감소시켰다. 균질화물을 20 ㎖/분에서 공급하고 용출물을 수집하고 샘플을 추후 분석을 위해 보관하였다.

공급물을 완충액으로 다시 바꾸고 로터 속도를 35,000 또는 40,000으로 증가시켰다. 그런 다음 20,000 rpm 공급물에서 수집된 용출액을 PKⅡ로 20 ㎖/분으로 재공급하였다. 용출액을 수집하고 샘플을 추후 분석을 위해 보관하였다.

공급물을 다시 완충액을 바꾸고 라인을 세정하였다. 그런 다음 흐름을 중지시키고 로터에 있는 물질이 45 분 또는 2 시간 동안 밴드화하도록 하였다. 로터를 제어 중지시키고 분획을 즉시 수집하였다. 수적을 제조하고 -80 ℃에 저장하였다. 사용 수적을 즉각적인 분석을 위해 4 ℃에서 유지하였다.

원심분리 후 소기관의 동정. 원심분리 후, 단리된 소기관의 완전성, 분리 및 농축을 웨스턴 블랏팅, 효소 어세이 및 전자 현미경에 의해 결정하였다. 이들 실험의 결과는 도 3-6에 요약되어 있다.

도 3은 상이한 슈크로스 구배 분획에서 미토콘드리아, 골지, 소포체 및 원형질막 및 그들의 서브타입의, 상기한 바와 같은 이들 소기관의 분리 및 축적 후, 상대적 분포를 보여준다. 도의 X 축은 소기관 내용물에 대해 측정된 각각의 분획에 해당한다. Y 축은 이들 소기관 및 그들 서브타입의 각각에 대해 조사된 구배 범위 내에서 집단에 대해 상대적인, 상응하는 슈크로스 구배 분획에서 검출된, 이들 네 소기관과 그들의 서브타입의 백분율을 표시한다. Y2 축은 구배의 각각의 상응하는 분획에 대한 슈크로스의 백분율을 보여준다. 도 3은 구배에서 분리되고 잘 경계지워진 위치에서의 이들 소기관 및 그들의 서브타입 각각의 분포를 나타낸다.

도 4는 슈크로스 구배의 상이한 분획에서 미토콘드리아, 골지, 소포체 및 원형질막 및 그의 서브타입의, 상기한 바와 같은 이들 소기관의 분리 및 축적 후, 상대적 농축을 보여준다. 도의 X 축은 상대적 소기관 마커 반응에 대해 측정된 각 분획에 해당한다. Y 축은 이들 소기관 및 그 서브타입 각각에 대해 조사된 구배 범위 내에서 집단에 대해 상대적인, 상응하는 슈크로스 구배 분획에서 검출된, 이들 네 소기관 및 그 서브타입의 상대적 소기관 마커 반응(픽셀)을 나타낸다. Y2 축은 구배의 각각의 상응하는 분획에 대한 슈크로스의 백분율을 보여준다. 도 4는 본 발명의 방법을 이용하여 구배에서 분리되고 잘 경계지워진 위치에서의 이들 소기관 및 그들의 서브타입 각각의 상대적 농축을 보여준다.

도 5는 단리된 소기관의 높은 완전성 수준 - 당업계에 전형적으로 나타난 값 초과의 - 을 보여준다. 데이터는 소포체, 미토콘드리아, 골지체 및 원형질막, 및 그 서브타입이 각각 76.3％(소포체), 72.6％(미토콘드리아), 89.3％(골지) 및 72.7％(원형질막)의 완전성 수준을 획득하였음을 보여준다. 완전성은 본 발명의 소기관 조제물의 가용성 및 불용성 상 사이의 소기관-특이적 효소 활성 수준을 비교함으로써 결정되었다. 불용성 분획(소기관)의 효소 활성을 가용성(상등액) 및 불용성 분획 모두에 대해 결정된 총 효소 활성에 대해 상대적으로 비교하였다.

소포체의 완전성을 정량적 효소 어세이, 소기관-특이적 마커 단백질에 대한 웨스턴 블랏 및 전자 현미경 실험에 의해 총괄적으로 결정하였다. 특히, 펠렛과 상등액을 소기관-특이적 마커 효소와 단백질에 대해 동시에 어세이하였다. >60％ 수준의 펠렛에서의 마커 검출은 보전성/완전성의 지표이다. 반대로, 상등액에서 마커 단백질의 검출은 소기관의 외부 주변이 손상되었다는 표시이다. 웨스턴 블랏을 위해, 순도 결정방법에 사용된 것과 동일한 항체를 소기관-특이적 마커를 검출하는데 사용하였다. 즉, 항-BiP/GRP78 항체(BD 바이오사이언시즈)를 소포체를 검출하는데 사용하였다.

투과 전자 현미경(TEM)을 또한 소기관의 완전성을 기능과 상관되어 있는, 그들의 형태(크기, 형상, 구조적 조직)를 통해 정성적으로 특성분석하는데 사용하였다. 전자 현미경에 의해 소기관 보전성을 결정하기 위하여, 분획화 과정으로부터의 샘플을 추가 조작으로부터의 가능한 손상을 방지하기 위하여 원심분리기 실행 직후 수집하였다. 샘플을 각각의 소기관에 대한 문헌에서 보고된 예상 밀도에 기초하여 선별하였다. 선별된 분획을 펠렛화하고 0.1 M 인산염 완충액, pH 7.4 중의 4％ 포름알데히드, 1％ 글루타르알데히드 용액에서 고정하고 표본화를 위해 필요할 때까지 4 ℃에 저장하였다. 샘플을 포매, 절편화, 우라닐아세테이트와 시트르산납으로 염색하고 짜이스(Zeiss) 전자 현미경을 이용하여 관찰하였다.

도 6은 상기 분획화 방법 후 조 추출물 샘플과 소포체 분획의 TEM을 비교한다. 조 추출물의 TEM과 비교하여, ER 분획에 존재하는 세포내 구조가 거의 모두 소포체임을 알 수 있다. 이 관찰은 본 발명의 분획화 방법에 의해 수득된 높은 정도의 순도와 농축을 정성적으로 예증하는 것이다. 추가로 검사 시, 정량적으로 결정된 높은 수준의 보전성(도 2)과 일치하게, 조 및 ER 샘플 모두에서 소기관의 미세구조는 외관상 잘 보전되어 있다.

실시예 2. HELA 세포로부터의 프로테옴 분석을 위한 미토콘드리아, 소포체, 골지 및 원형질막의 동시 단리, 정제 및 농축

HeLa 세포를 중탄산나트륨(암레스코, #0865), 10％ 우태아혈청(파라곤 바이오서비시즈, #30101121) 및 50 ㎍/㎖ 겐타마이신(암레스코, #0304)으로 보충된 조클릭(Joklik) 변형 SMEM(시그마, #61100-103)에서 배양하였다. 200 ℓ 생물반응기로의 접종을 위해 세포를 롤러 병으로부터 40 ℓ 완전-제어 생물반응기로 규모확장하였다. 반응기를 1.0×10⁵ 세포/㎖의 밀도로 접종하였다.

3 일후, 세포를 반응기로부터 수획하고 접선 흐름 여과에 의해 8 리터의 부피로 농축하고, 이어서 2000 rpm에서 12 분간 원심분리하였다. 세포 펠렛을 세척하고 DPBS(인비트로젠, #14190-136)에 재현탁한 후 2000 rpm에서 12 분간 다시 원심분리하였다. 상등액을 분리하고 세포 펠렛을 30 g 수적으로 -80 ℃에 저장하였다.

HeLa 세포 펠렛을 -80 ℃ 저장물로부터 분리하였다. 펠렛을 해동하고, 풀링하고 다운스(Dounce) 균질화기(25 스트로크)를 이용하여 5 부피의 균질화 완충액(0.25 M 슈크로스, 20 mM HEPES-KOH, pH 7.2, 5 mM MgCl₂, 로슈로부터의 무-EDTA 프로테아제 저해제 칵테일)에서 균질화하였다. 균질화 후, 탈핵 상등액을 4000×g에서 10 분간 원심분리에 의해 수득하였다. 제1 탈핵 회전 후, 상등액을 따랐다. 그 후 블렌더(10 초 저속, 10 초 고속 및 10 초 저속)와 위에 사용된 것과 동일한 원심분리 지수를 이용하여 핵 펠렛을 재가공하여 제2 탈핵 상등액을 생성시켰다. 제2 탈핵 상등액을 따르고 제1 탈핵 상등액과 합쳤다. 결과로 생긴 풀링된 균질화물을 소기관의 분획화를 위해 PKⅡ에 사용하였다. 조 균질화물의 수적을 추후 분석을 위해 -80 ℃에서 저장하였다.

특정 분획의 총 소기관 함량을 측정하고 분획 간에 비교하기 위하여, 각 샘플의 굴절 지수를 아베 굴절계를 이용하여 결정하였다. 백분율(％) 슈크로스를 굴절 지수 측정으로부터 계산할 수 있다. 다르게는, 그것은 CRC Handbook of Chemistry and Physics(Ed. R. Weast, CRC Press Inc., 58판)와 같은 참고서에 있는 백분율 슈크로스로의 굴절 지수의 전환 표를 통해 얻을 수 있다. 도 11은 균질화 및 원심분리된 HeLa 세포의 수집된 원심분리-후 분획에 대한 백분율 슈크로스 함량을 도시한다. 이 도면은 도 7 및 8(하기함)과 이 실시예에 예시된 분획에 직접 관련된 것이다.

단리된 소기관의 보전성과 농축을 시험하기 위하여, 단리된 분획을 전자 현미경 분석, 웨스턴 블랏팅 및 석시네이트 데하이드로게나제 효소 어세이의 결합에 가하였다.

소기관 단리물의 보전성을 시험하기 위하여, 분획화로부터의 샘플을 추가 조작으로부터의 가능한 손상을 막기 위하여 실행 직후 수집하였다. 샘플을 각각의 소기관에 대한 문헌에서 보고된 예상 밀도 범위에 기초하여 선별하였다. 선별된 분획을 펠렛화하고 0.1 M 인산염 완충액, pH 7.4 중의 4％ 포름알데히드, 1％ 글루타르알데히드 용액에서 고정하고 표본화를 위해 필요할 때까지 4 ℃에 저장하였다. 샘플을 포매, 절편화, 우라닐아세테이트와 시트르산납으로 염색하고 짜이스 전자 현미경을 이용하여 관찰하였다.

웨스턴 블랏팅과 효소 어세이를 표준화하기 위하여, 소기관-함유 분획의 단백질 농도를 브래드포드 어세이(바이오-래드, #500-0006)에 의해 결정하였다. 샘플을 실온에서 5 분간 쿠마시 시약으로 인큐베이션하고 흡광도를 측정하였다(595 ㎚). 표준 곡선을 BSA(피어스, #23210)를 이용하여 만들었다.

소기관-함유 분획의 단백질 농도를 결정한 후, 각 분획을 기지의 소기관-특이적 마커에 대한 항체를 이용하는 웨스턴(면역블랏) 블랏에 의해 스크리닝하여 분획을 그들의 소기관 조성에 대해 확인하였다. 동일 량의 소기관-함유 분획으로부터의 단백질 추출물을 폴리아크릴아미드 젤 전기영동에 의해 분해한 후 적절한 항체를 이용하여 소기관-특이적 마커를 검출하였다. 예를 들어, 항-Tom20 항체(BD 바이오사이언시즈)를 미토콘드리아를 검출하는데 사용하고, 항-GM130/P115 항체(BD 바이오사이언시즈)를 골지를 검출하는데 사용하고, 항-BiP/GRP78 항체(BD 바이오사이언시즈)를 소포체를 검출하는데 사용하고, 항-NaKATPase 항체(아이오와 대학)를 원형질막을 검출하는데 사용하였다.

폴리아크릴아미드 젤 전기영동을 수행하기 위하여, 샘플을 1.0 ㎜×10 웰 또는 1.5 ㎜×15 웰, 4-12％ 비스-트리스 구배 미니젤(인비트로젠, #NP0335 또는 NP0323)로 로딩하기 전에 4×NuPAGE SDS 샘플 완충액(인비트로젠, #NP0007) 및 50 mM DTT와 혼합하였다. 샘플을 MES SDS 영동 완충액을 이용하여 150 V에서 대략 40 분간 전기영동하였다. 총 단백질 분석을 위해, 젤을 40％ 메탄올, 10％ 아세트산 중의 쿠마시 블루에서 0.5 시간 동안 염색하고 이어서, 10％ 메탄올, 10％ 아세트산 용액에서 탈염색하였다. 면역반응성 밴드를 ECL 검출기(#RPN2108, ECL 웨스턴 블랏팅 분석 시스템, 아머샴, 아이엔씨.)를 이용하여 검출하고 코닥 디지털 사이언스 1D 영상 부분석 소프트웨어(코닥)를 이용하여 정량하였다.

웨스턴 블랏팅에 부가하여, 효소 어세이, 예를 들어, 석시네이트 데하이드로게나제 효소 어세이를 수행하여 회수된 분획의 단리된 소기관의 완전성을 추가로 측정하였다. 이들 실험을 위해, 각 50 ㎕ 샘플의 소기관 분획을 0.05 M 인산염 완충액, pH 7.5 중의 석신산나트륨(시그마, #S2378) 0.01 M 용액 0.3 ㎖로 인큐베이션하였다. 37 ℃에서 10 분간 인큐베이션한 후, 0.05 M 인산염 완충액, pH 7.50 중의 p-요오도니트로테트라졸륨 바이올렛(INT)(시그마, #I8377) 2.5 ㎎/㎖ 용액 0.1 ㎖를 가하였다. 튜브를 37 ℃에서 10 분간 인큐베이션하였다. 반응을 5:5:1(v,v,w) 비율의 에틸아세테이트:에탄올:트리클로로아세트산 1.0 ㎖를 가하여 중지시켰다. 490 ㎚에서 흡광도를 측정하기 전에 튜브를 15,000 rpm에서 1 분간 원심분리하였다. 이들 실험의 결과는 도 7-11에 요약되어 있다.

도 7은 상이한 슈크로스 구배 분획에서 미토콘드리아, 소포체 및 원형질막 및 그들의 서브타입의, 상기한 바와 같은 이들 소기관의 분리 및 축적 후, 상대적 분포를 보여준다. 도의 X 축은 소기관 내용물에 대해 측정된 각각의 분획에 해당한다. Y 축은 이들 소기관 및 그들 서브타입의 각각에 대해 조사된 구배 범위 내에서 집단에 대해 상대적인, 상응하는 슈크로스 구배 분획에서 검출된, 이들 세 소기관과 그들의 서브타입의 백분율을 표시한다. Y2 축은 구배의 각각의 상응하는 분획에 대한 슈크로스의 백분율을 보여준다. 도 7은 구배에서 분리되고 잘 경계지워진 위치에서의 이들 소기관 및 그들의 서브타입 각각의 분포를 나타낸다.

도 8은 슈크로스 구배의 상이한 분획에서 미토콘드리아, 소포체 및 원형질막 및 그의 서브타입의, 상기한 바와 같은 이들 소기관의 분리 및 축적 후, 상대적 농축을 보여준다. 도의 X 축은 상대적 소기관 마커 반응에 대해 측정된 각 분획에 해당한다. Y 축은 이들 소기관 및 그 서브타입 각각에 대해 조사된 구배 범위 내에서 집단에 대해 상대적인, 상응하는 슈크로스 구배 분획에서 검출된, 이들 세 소기관 및 그 서브타입의 상대적 소기관 마커 반응(픽셀)을 나타낸다. Y2 축은 구배의 각각의 상응하는 분획에 대한 슈크로스의 백분율을 보여준다. 도 8은 본 발명의 방법을 이용하여 구배에서 분리되고 잘 경계지워진 위치에서의 이들 소기관 및 그들의 서브타입 각각의 상대적 농축을 보여준다.

실시예 3: HELA 세포를 이용한 비교 농축 연구

위 실시예 2에 제시된 실험 조건을 참조하면서, 아래 데이터에 따라 비교 농축을 연구하였다.

도 9와 10은 본 발명의 방법에 의해 달성된 농축의 상대적 수준을 보여준다. 농축은 다른 분획이나 분획화 전 생물학적 샘플의 원래 조 추출물에 존재하는 신호/활성에 대해 관심있는 특정 분획으로부터의 신호/활성을 대비하는 소기관-특이적 마커 및(또는) 효소의 웨스턴 블랏이나 효소 어세이를 이용하여 정성적으로 결정될 수 있다. 상대적 농축은 다른 소기관 분획에 대해 상대적인 소기관 분획 중의 마커 단백질의 축적에 기초하여 결정될 수 있다. 추가로, 농축은 관심있는 소기관에 대한 소기관-특이적 마커 효소의 다른 분획이나 조 균질화물 중의 동일한 마커 효소의 활성에 대해 상대적인 활성에 의해 측정될 수 있다. 도 9는 각 생물학적 샘플 분획으로부터의 항-NaKATPase 항체에 의해 측정된 NaKATPase의 웨스턴 블랏을 보여준다.

도 10은 각 샘플 분획으로부터의 NaKATPase의 측정된 수준을 보여준다. 도 9와 10의 비교는 분획 14와 15가 가장 높은 수준의 NaKATPase를 가짐을 보여준다. NaKATPase는 원형질막에 대한 소기관-특이적 마커이므로, 데이터는 분획 14와 15가 가장 높은 농도의 원형질막을 가짐을 암시한다.

소기관 완전성과 농축을 웨스턴 블랏팅 및(또는) 효소 어세이에 의해 결정하기 위하여, 단백질 함량을 브래드포드 기초 어세이(바이오-래드, #500-0006)에 의해 결정하였다. 샘플을 실온에서 5 분간 쿠마시 시약으로 인큐베이션하고, 흡광도를 측정하였다(595 ㎚). 표준 곡선을 BSA(피어스, #23210)를 이용하여 만들었다.

웨스턴 블랏팅 전에, 샘플을 1.0 ㎜×10 웰 또는 1.5 ㎜×15 웰, 4-12％ 비스-트리스 구배 미니젤(인비트로젠, #NP0335 또는 NP0323)로 로딩하기 전에 4×NuPAGE SDS 샘플 완충액(인비트로젠, #NP0007) 및 50 mM DTT와 혼합하였다. 샘플을 MES SDS 영동 완충액을 이용하여 150 V에서 대략 40 분간 전기영동하였다. 총 단백질 분석을 위해, 젤을 40％ 메탄올, 10％ 아세트산 중의 쿠마시 블루에서 0.5 시간 동안 염색하고 이어서, 10％ 메탄올, 10％ 아세트산 용액에서 탈염색하였다.

폴리아크릴아미드 젤 전기영동을 수행하기 위하여, 샘플을 1.0 ㎜×10 웰 또는 1.5 ㎜×15 웰, 4-12％ 비스-트리스 구배 미니젤(인비트로젠, #NP0335 또는 NP0323)로 로딩하기 전에 4×NuPAGE SDS 샘플 완충액(인비트로젠, #NP0007) 및 50 mM DTT와 혼합하였다. 샘플을 MES SDS 영동 완충액을 이용하여 150 V에서 대략 40 분간 전기영동하였다. 총 단백질 분석을 위해, 젤을 40％ 메탄올, 10％ 아세트산 중의 쿠마시 블루에서 0.5 시간 동안 염색하고 이어서, 10％ 메탄올, 10％ 아세트산 용액에서 탈염색하였다. 면역반응성 밴드를 ECL 검출기(#RPN2108, ECL 웨스턴 블랏팅 분석 시스템, 아머샴, 아이엔씨.)를 이용하여 검출하고 코닥 디지털 사이언스 1D 영상 분석 소프트웨어(코닥)를 이용하여 정량하였다. 석시네이트 데하이드로게나제 효소 어세이를 위하여, 각 50 ㎕의 균질화물을 0.05 M 인산염 완충액, pH 7.5 중의 석신산나트륨(시그마, #S2378) 0.01 M 용액 0.3 ㎖로 인큐베이션하였다. 37 ℃에서 10 분간 인큐베이션한 후, 0.05 M 인산염 완충액, pH 7.5 중의 p-요오도니트로테트라졸륨 바이올렛(INT)(시그마, #I8377) 2.5 ㎎/㎖ 용액 0.1 ㎖를 가하였다. 튜브를 37 ℃에서 10 분간 인큐베이션하였다. 반응을 5:5:1(v,v,w) 비율의 에틸아세테이트:에탄올:트리클로로아세트산 1.0 ㎖를 가하여 중지시켰다. 490 ㎚에서 흡광도를 측정하기 전에 튜브를 15,000 rpm에서 1 분간 원심분리하였다.

실시예 4. 2D 젤 전기영동 및 질량 분광측정에 의한 소기관 분획의 세포내 프로테옴의 분석은 새로운 단백질을 밝힌다

실시예 1과 2에 의해 제공된 분획의 소기관의 세포내 프로테옴을 2D 젤 전기영동과 질량 분광측정에 의해 추가로 분석하였다. 세포내 소기관 프로테옴을 분석하기 위하여, 단백질을 2-차원 젤 전기영동("2D-GE")에 의해 분리하였다. 2D-GE가 복잡한 단백질 혼합물을 분리하기 위한 강력한 접근법임은 당업자에 의해 이해될 것이다. 전기장 내의 모든 단백질은 그들의 형태, 분자크기 및 전기 전하에 의존하는 정해진 거리로 이동한다. 2D-GE는 단백질의 고-분해능 분리를 허용하기 위하여 이들 지수 중 뒤의 두 개를 사용한다. 제1 차원에서, 등전 촛점화가 단백질을 그들의 등전점에 기초하여 분리하는데 사용된다. 제2 차원에서, SDS 폴리아크릴아미드 젤 전기영동이 단백질을 그들의 분자량에 따라 분획화하는데 사용된다. 그 결과는 X 및 Y 좌표로 지정된 단백질 스팟의 어레이이다.

여기서, 소기관 용해에 잇따른 소기관 단백질 추출물의 분리를 2D-GE에 의해 수행하고 검출은 쿠마시 블루, 은 염색이나 사이프로 루비(Sypro Ruby)™(몰레큘라 프로브)를 이용하였다. 2D-GE 젤 상에서 분획화된 소기관 단백질 추출물을 비분획화된 조 추출물에 대해 상대적으로 비교하고, 모두 쿠마시 블루, 은 또는 사이프로 루비™로 염색하였다. Z3™ 소프트웨어(컴퓨젠)나 프로제네시스(Progenesis)™ 소프트웨어(넌리니어)를 이용하여 2D 젤의 디지털 영상을 만들고 주석을 달았다. 생성된 영상을 포개어 공통적인 새로운 스팟, 특히 희소 단백질을 동정하였다.

등전 촛점화 단계를 전체 pH 범위(3-10)에 걸쳐 바이오-래드 7 ㎝ IPG 스트립을 이용하여 수행하였다. 그 후 SDS PAGE를 분자량 표준과 함께 미리 만든 NuPAGE 4-12％ 비스-트리스 줌(ZOOM) 젤을 이용하여 수행하였다. 샘플을 이중으로 운전하고 하나의 젤은 쿠마시로 두번째 젤은 은으로 염색하였다. 소기관 분획과 조 균질화물을 2-D 젤 매개자를 이용하여 질량 분광측정에 가하고 MALDI에 의해 분석하였다.

도 12는 실시예 1의 랫트 간 조직의 조 추출물(A)과 소포체 분획(B)의 단백질 스팟 양상을 비교한 것이다. 조 추출물 젤에 비하여, 소포체 젤은 유의하게 더 높은 프로테옴 함량, 즉 더 많은 수의 가시적 및(또는) 검출가능 단백질 또는 폴리펩티드 스팟을 나타낸다.

소포체 분획의 분석에 대한 도 12에 나타낸 2D 젤 결과에 부가하여, 유사한 2D 젤 분석을 미토콘드리아, 원형질막 및 골지체를 함유하는 분획에 대해 수행하였다(결과 미도시). 결과 2D 젤을 질량 분광측정에 의해 추가로 분석하였다. 도 12(A)의 젤과, 미토콘드리아, 원형질막 및 골지체 분획의 젤의 많은 스팟을 질량 분광측정에 의해 분석하였다. 각 스팟에 대해 결정된 결과적인 펩티드 프로파일을 예를 들어, 젠뱅크와 스위스-프롯과 같은 공지의 펩티드 프로파일 데이터베이스에 대해 비교하여, 존재하는 경우, 단백질 스팟의 실체를 결정하였다.

결과는 조 추출물의 2D 젤에는 존재하지 않거나 검출가능하지 않았던 많은 단백질이 미토콘드리아, 소포체, 골지체 및 원형질막 분획에서 검출될 수 있음을 보여주었다. 추가로, 각 소기관 분획의 2D 젤 상에서 발견된 단백질은 광범위한 분자량, 즉 약 80-125 kD의 고분자량에서 약 20 kD 미만의 저분자량까지를 갖는 것으로 확인되었다. 따라서, 결과는 본 발명의 방법이 어느 특정 분자량에 대해 편향되거나 제한되지 않음을 암시한다. 출발 생물학적 재료의 2D 젤 상에서는 관찰될 수 없었고 소기관-함유 분획의 2D 젤 상에서 낮은 강도의 것이었던 많은 단백질 스팟을 질량 분광측정에 의해 분석하였다. HeLa 세포(결과 미도시)와 랫트 간 조직 모두로부터의 샘플을 조사하였다. 랫트 간 조직에 대해 조사된 단백질 스팟 중, 약 50％가 스위스-프롯에 기탁된 단백질과 일치하는 것으로 밝혀졌다. 또한 단백질 스팟의 약 50％의 동일성을 서열 분석과 젠뱅크에 있는 공지 서열과의 비교를 통해 확인하였다. 필요한 경우, 비-랫트 데이터베이스에 대해 상동성 검색을 수행하였다. 랫트 간 조직으로부터의 결과는 도 21A와 21B에 나타내어져 있다.

현존하는 데이터베이스의 공지 단백질과 일치하는 단백질의 실체에 기초하여, 본 발명의 방법은 대사 효소, 프로테오솜 성분, 번역 인자, 수용체, 면역 성분(보체) 및 리보솜 단백질을 포함하는, 다양한 단백질을 검출하였다.

실시예 5. 2D 젤 전기영동과 질량 분광측정에 의한 골지와 원형질막 분획의 세포내 프로테옴의 분석은 펩티딜-프롤릴 시스-트랜스 이소머라제(사이클로스포린 A-결합 단백질)의 번역 후 또는 기타 변이체의 검출을 입증한다

HeLa 조 추출물뿐 아니라, 실시예 2에 따른 HeLa 세포로부터 단리된 골지체와 원형질막을 함유하는 별도의 분획을 2D 젤 전기영동과 질량 분광측정으로 분석하였다. 분획을 용해시켜 소기관-함유된 단백질을 방출시켰다. 브래드포드 어세이(바이오-래드, #500-0006)를 사용하여 골지 샘플, 원형질막 샘플 및 조 추출물 샘플에 있는 단백질의 농도를 결정하였다. 다음에, 위에 개괄된 바와 같이, 2D 젤 전기영동을 각 샘플로부터의 동량의 단백질에 대해 수행하였다. 이미 설명된 바와 같이, 2D 젤을 적절히 염색하여 단백질 스팟을 가시화한 후 프로제네시스™ 소프트웨어(넌리니어)에 의해 영상화하였다.

도 13B는 조 추출물, 골지 분획 및 원형질막 분획의 2D 젤 전기영동의 결과를 보여준다. 각각은 세 개개 2D 젤로부터 삼중으로 제공된다. 도 13A는 골지 샘플 3의 확대와 단백질 스팟 12, 13 및 14에 대한 점수를 나타낸다. 스팟 12, 13 및 14는 골지와 원형질막 분획 둘다에서 보이는 것 같다; 그러나, 동일한 스팟이 조 추출물 샘플에서는 명확하게 나타나지 않는다. 그것으로서, 스팟 12, 13 및 14는 희소 단백질을 나타내는 것 같다.

질량 분광측정을 스팟 12, 13 및 14에 대해 그 안에 있는 단백질을 동정하기 위하여 수행하였다. 도 14는 각 펩티드 스팟에 대한 질량 분광측정 데이터를 보여준다. 표는 각 스팟에 대해 검출된 펩티드 단편의 서열(좌에서 우로 N-말단에서 C-말단 방향을 나타냄)과 각 단편의 평균 분자량을 수록하고 있다. 도 14를 조사하면, 스팟 12, 13 및 14의 각각이 동일한 단백질이라는 것과 일치하는, 동일하거나 실질적으로 중복되는 펩티드 단편이 검출됨을 알 수 있다. 따라서, 각각의 단백질은 젤의 꼭대기로부터 그들의 동일한 이동 거리와 일치하는, 동일하거나 실질적으로 동일한 분자량이다. 그러나, 2D 젤 전기영동은 단백질을 이차원으로, 즉 분자량에 기초하여 하나의 차원으로 전하에 기초하여 다른 차원으로 분해하므로, 단백질의 전체 전하는 그들이 전기영동에 의해 분해되는 정도로 상이해야만 한다. 따라서, 이 관찰은 단백질 스팟 12, 13 및 14가 동일한 단백질의 세 상이한 번역후 또는 기타 변이체 형태임을 암시한다. 아마도, 한 스팟은 비수식된 단백질 산물을 나타내고 나머지 스팟은 두 독특한 번역후 수식되거나 아미노산 치환된 변이체를 나타낸다. 아마 세개 모두가 구별되는 변이체를 나타낸다.

결과는 본 발명의 두 장점을 입증한다. 첫째, 결과는 희소 단백질, 예를 들어, 조 추출물에서는 검출될 수 없지만 본 발명의 방법에 의해 제조된 소기관 분획에서는 검출되는 단백질의 검출에서 증가된 감도를 보여준다. 둘째, 결과는 본 발명의 분획화 방법이 프로테옴의 복잡성 중 많은 것이 단백질 번역 중이나 후에 발생하는 다수의 단백질 수식 - 예를 들어, 효소 활성, 용해도 및 안정성과 같은, 단백질 특성을 변화시키는 작용을 하는 - 으로부터 유래된다고 가정하면 장점인, 희소 단백질의 상이한 변이체의 증진된 분리와 검출을 제공한다.

실시예 6. 2D 젤 전기영동 및 질량 분광측정에 의한 다양한 소기관 분획의 세포내 프로테옴의 분석

2-차원 젤 전기영동을 본 발명의 방법에 따라 제조된 다양한 소기관 분획에 대해 수행하였다. 결과 젤을 적절하게 염색하고 이미 기재한 바와 같이 프로제네시스™ 소프트웨어에 의해 영상화하였다. 질량 분광측정을 복수의 단백질 스팟에 대해 이전과 같이 수행하였다. 각 단백질 스팟에 대해 동정된 결과 펩티드 단편을 젠뱅크와 스위스-프롯을 포함하는, 현존하는 데이터베이스에 함유된 단백질 서열과 비교하였다.

도 15, 도 16, 도 17 및 도 18은 각각 소포체, 미토콘드리아, 골지 및 원형질막에 대한 결과를 보여준다. 각 도면에서, 패널 A는 각각의 소기관 분획에 대한 분해된 세포내 프로테옴의 완전한 2D 젤 영상을 보여준다. 완전한 조 추출물 젤은 나타내어져 있지 않다. 원은 질량 분광측정에 의해 검출된 단백질 스팟의 위치를 표시한다. 또한 각 도면에 대해, 패널 B는 세 개개 2D 젤에 대해 삼중으로 패널 A에서의 젤의 국소화된 부분을 보여준다. 패널 B의 꼭대기 줄은, 또한 세 개개 2D 젤로부터 삼중으로 나타내어진, 조 추출물 2D 젤의 상응하는 국소화된 패널을 보여준다.

조 추출물과 소기관 분획 2D 젤의 국소화된 영상의 비교로부터, 수많은 단백질 스팟이 소기관 분획 패널에서 보이지만 조 추출물 패널에서는 존재하지 않음을 알 수 있다. 특히, 각각의 소기관의 2D 젤에 존재하지 않는, 단백질 스팟이 각각의 소기관 분획 젤 영상에 대해 동그라미되어 있다. 따라서, 이것은 소기관 분획 젤에서 발생하는 단백질 스팟이 조 추출물 샘플에서는 검출불가능한 단백질임을 암시한다. 패널 A에서, 각 도면의 젤의 각 스팟을 이미 설명된 바와 같이, 질량 분광측정에 의해 분석하였다.

이 실시예는 본 발명의 분획화 방법이 본 발명의 방법에 의해 제조된 세포내 분획에서, 상응하는 조 추출물에서는 검출되지 않는, 단백질의 검출을 제공함을 입증한다.

실시예 7. 추가 프로테옴 비교 연구를 위한 건강하고 병든 췌장 조직으로부터의 소포체와 원형질막의 동시 단리, 정제 및 농축

췌장 균질화. 이들 실험을 위해, 20마리의 건강한 위스타 랫트와 당뇨 위스타 랫트(각각 150-200 g)를 단두, 해부 및 췌장 수획 전에 밤새 절식시킨다. 5 부피의 균질화 완충액에서 췌장(총 100 그램)을 균질화하고 웨어링 블렌더를 이용하는 기계적 전단 방법에 의해 균질화시킨다.

균질화 후, 균질화물을 4-10,000×g에서 10-20 분간 원심분리하여 탈핵 상등액을 수득한다. 그런 다음 상등액을 프로테아제 저해제가 보충된 동일 부피의 희석 완충액을 첨가하여 등장 조건으로 조정한다.

연속 흐름 초원심분리. 랫트 췌장 균질화물을 그 안에 미리 확립된 슈크로스 구배를 갖는 PK3-800 로터로 공급한다. 대략 10-30 ㎖/분의 유속을 사용하고 PKⅡ를 제1 통과를 위해 처음에 15,000-25,000 rpm에서 그런 다음 제2 통과를 위해 최대 속도, 40,500 rpm에서 운전한다. 원심분리 운전의 끝에, 로터 내용물을 25 ㎖ 분획으로 로터의 바닥으로부터 빼낸다. 각 분획으로부터의 샘플을 분석하여 ER과 원형질막과 같은, 표적 소기관에 대한 포획 효율을 결정한다.

단리된 소기관의 완전성과 농축을 웨스턴 블랏팅, 효소 어세이 및 전자 현미경에 의해 결정한다. 이들 실험을 위해, 원형질막과 ER을 함유하는 분획을 용해하고 그 안의 단백질 함량을 브래드포드 어세이(바이오-래드, #500-0006)에 의해 결정한다. 샘플을 실온에서 5 분간 쿠마시 시약으로 인큐베이션하고 흡광도를 595 ㎚에서 측정한다. 표준 곡선을 BSA(피어스, #23210)를 이용하여 만든다.

원형질막 및 ER-함유 분획의 단백질 농도를 결정한 후, 샘플을 1.0 ㎜×10 웰 또는 1.5 ㎜×15 웰, 4-12％ 비스-트리스 구배 미니젤(인비트로젠, #NP0335 또는 NP0323)로 로딩하기 전에 4×NuPAGE SDS 샘플 완충액(인비트로젠, #NP0007) 및 50 mM DTT와 혼합한다. 샘플을 MES SDS 영동 완충액을 이용하여 150 V에서 대략 40 분간 전기영동한다. 총 단백질 분석을 위해, 젤을 40％ 메탄올, 10％ 아세트산 중의 쿠마시 블루에서 0.5 시간 동안 염색하고 이어서, 10％ 메탄올, 10％ 아세트산 용액에서 탈염색한다.

원형질막 검출을 위해 항-NaKATPase 항체를 소포체 검출을 위해 항-BiP/GRP78을 이용하는 웨스턴 블랏에 의해 각 분획을 스크리닝함으로써 소기관 조성의 농축에 대해 분획을 측정한다. 분획을 ECL 검출기(#RPN2108, ECL 웨스턴 블랏팅 분석 시스템, 아머샴, 아이엔씨.)를 이용하여 특성분석하고 코닥 디지털 사이언스 1D 영상 부분석 소프트웨어를 이용하여 정량한다.

단리된 소기관의 완전성을 측정하기 위하여, 투과 전자 현미경(TEM)을 사용한다.

전자 현미경에 의해 소기관 보전성을 결정하기 위하여, 분획화 과정으로부터의 샘플을 추가 조작으로부터의 가능한 손상을 방지하기 위하여 원심분리기 실행 직후 수집한다. 샘플을 ER과 원형질막에 대한 문헌에서 보고된 예상 밀도에 기초하여 선별한다. 선별된 분획을 펠렛화하고 0.1 M 인산염 완충액, pH 7.4 중의 4％ 포름알데히드, 1％ 글루타르알데히드 용액에서 고정하고 표본화에 필요할 때까지 4 ℃에 저장한다. 선별 후, 샘플을 포매, 절편화, 우라닐아세테이트와 시트르산납으로 염색하고 짜이스 전자 현미경을 이용하여 관찰한다.

부가적으로, 소기관 완전성과 보전성을 결정하기 위하여, 석시네이트 데하이드로게나제 효소 어세이를 수행한다. 이들 실험을 위해, 각 50 ㎕ 샘플의 소기관 분획을 0.05 M 인산염 완충액, pH 7.5 중의 석신산나트륨(시그마, #S2378) 0.01 M 용액 0.3 ㎖로 인큐베이션한다. 37 ℃에서 10 분간 인큐베이션한 후, 0.05 M 인산염 완충액, pH 7.5 중의 p-요오도니트로테트라졸륨 바이올렛(INT)(시그마, #I8377) 2.5 ㎎/㎖ 용액 0.1 ㎖를 가한다. 튜브를 37 ℃에서 10 분간 인큐베이션한다. 반응을 5:5:1(v,v,w) 비율의 에틸아세테이트:에탄올:트리클로로아세트산 1.0 ㎖를 가하여 중지시킨다. 490 ㎚에서 흡광도를 측정하기 전에 튜브를 15,000 rpm에서 1 분간 원심분리하였다.

인슐린 수용체가 건강한 랫트 대 당뇨 랫트의 췌장 조직에 있는 원형질막이나 ER에 위치하는지 여부를 결정하기 위하여, 단리된 소기관을 용해하고 결과 단백질을 실시예 9에 설명된 바와 같이 2-D PAGE 분석에 가한다. 그런 다음, 인슐린 수용체의 위치를 확인하기 위하여 건강한 랫트와 당뇨 랫트에 대한 젤을 비교한다.

실시예 8. 당뇨 랫트의 말레산 로지글리타존 처리 전후의 인슐린 수용체의 세포 배치 분석

말레산 로지글리타존(GSK, 아반디아(Avandia)로도 알려진)은 당 제어를 위해 Ⅱ형 당뇨 환자에게 투여되는 주지의 약물이다. 이 약물의 작용에 내재하는 분자적 기초는 알려져 있지 않고 최근 연구는 인슐린 분비와 인슐린 수용체 양과 신호전달의 변화에서 로지글리타존의 역할을 연루시켰다(Diabetes, 52권, 1943-1948, 2003). 이 실시예는 로지글리타존의 분자적 기초, 특히, 인슐린 수용체의 세포 배치를 변화시키는 이 약물의 역할을 추가로 규명하기 위한 본 발명의 사용을 예시한다.

이들 실험을 위해, 성체 위스타 랫트를 케이지 당 4 마리의 그룹으로 가두고 먹이와 물에 바로 접근할 수 있게 한다. 동물의 일반적인 건강에 영향을 미치는 어떠한 약물 처리도 계획되지 않는다. 말레산 로지글리타존을 음수 중에서 랫트에게 투여한다. 처리 끝에, 랫트를 단두하여 죽인다. 췌장(총 100 그램)을 약물 처리되거나 되지 않은, 대략 20마리의 당뇨 랫트로부터 수획한다. 로지글리타존 처리되지 않는 당뇨 랫트를 대조로 사용한다.

췌장 균질화. 로지글리타존 처리 전후의 랫트로부터의 췌장을 웨어링 블렌더를 이용하여 기계적 전단 방법에 의해 균질화한다. 균질화 후, 균질화물을 4-10,000×g에서 10-20 분간 원심분리하여 탈핵 상등액을 수득한다. 그런 다음 상등액을 프로테아제 저해제가 보충된 동일 부피의 희석 완충액을 첨가하여 등장 조건으로 조정한다.

결과 SⅠ 균질화물을 재가공하여 상기한 바와 동일한 파쇄 및 동일한 원심분리 조건을 이용하여 제2 탈핵 상등액을 생성한다. 제2 탈핵 상등액을 등장 조건으로 평형화하고 PKⅡ(알파 바서만) 원심분리기를 위한 공급 재료로 사용한다.

연속-흐름 초원심분리. 이들 실험을 위해, 슈크로스 규배를 PK3-800 로터에 확립한 후 랫트 췌장 균질화물을 원심분리기로 공급한다. 대략 10-30 ㎖/분의 유속을 사용하고 PKⅡ를 제1 통과를 위해 처음에 15,000-25,000 rpm에서 그런 다음 제2 통과를 위해 최대 속도, 40,500 rpm에서 운전한다. 용출액으로부터의 샘플을 포획하고 추가 분석하여 ER과 원형질막에 대한 포획 효율을 결정한다. 이들 소기관에게 모든 균질화물이 시스템에 공급된 후 그들 밀도에 도달할 때까지 부가적인 시간을 제공한다. 로터를 제어 정지시키고 내용물을 25 ㎖ 수적으로 바닥으로부터 빼낸다.

원심분리 후, 단리된 ER과 원형질막의 보전성과 농축을 실시예 7에 기재된 바와 같이 웨스턴 블랏팅, 효소 어세이 및 전자 현미경에 의해 결정한다.

로지글리타존 처리 전후의 인슐린 수용체의 세포 배치에서의 차이를 결정하기 위하여, 단리된 소기관을 용해하고 추가로 실시예 9에 기재된 2-D PAGE에 가한다.

실시예 9: 2D 젤 전기영동에 의한 원형질막과 ER 프로테옴의 분석

실시예 7과 8에 의해 제공되는 분획의 ER과 원형질막의 세포내 프로테옴을 2D 젤 전기영동에 의해 추가로 분석한다. 세포내 프로테옴을 분석하기 위하여, 단백질을 2-D 젤 전기영동에 의해 분리한다. 소기관 용해에 잇따른, ER 및 원형질막 추출물의 분리는 2D-PAGE에 의해 수행하고 검출은 쿠마시 블루, 은 염색이나 사이프로 루비(몰레큘라 프로브즈)에 의한다. Z3 소프트웨어(컴퓨젠)나 프로제네시스 소프트웨어(넌리니어)를 이용하여 2D 젤의 디지털 영상을 생성하고 주석을 단다. 결과 영상을 인슐린 수용체에 상응하는 스팟을 동정하기 위하여 겹친다.

따라서, ER과 원형질막의 단백질 스팟 양상을 분석하고 로지글리타존 처리 전후의 당뇨 췌장 조직에서 인슐린 수용체 배치를 건강한 췌장 조직에서의 인슐린 수용체 배치와 비교한다.

이 실시예는 PKⅡ 시스템에 의해 수득된 세포내 분획을 2D 젤 전기영동과 결합하는 것이 어떻게 당업자가 세포내 프로테오믹스의 주요 목표 중 하나를 달성하도록, 즉 단백질 전좌 현상을 모니터링하도록, 하는지를 예시한다.

실시예 10. 단백질을 검출하는데 필요한, 세포에서 그의 카피 수에 대해 상대적인, 생물학적 재료의 이론적 양의 예상

도 22A와 22B는 본 발명의 연속-흐름 과정을 이용하는 장점을 예시한다. 예를 들어, 도면은 세포에서 단백질의 카피수와 관련하여 50 ng의 검출 한계에 도달하는데 전형적으로 필요한 출발 생물학적 재료의 특정 양에 요구되는 축적 배수를 표시한다. 일 구체예에서, 1×10(9) 세포의 출발 생물학적 재료가 주어진 도 22A를 참조하면, 세포당 단일 카피로 발생하는 단백질을 위해 50 ng의 검출 한계에 도달하기 위해 세포 수에서 819-배의 증가를 사용하는 것이 필요할 것이다.

***

당업자는 여기에 설명된 본 발명의 구체예에 대한 수많은 균등물을 과도한 실험 없이 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 모든 그러한 균등물은 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 간주되며 아래 청구범위에 의해 포함된다.

다르게 설명되지 않으면, 여기에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자에 의해 보편적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 여기에 설명된 것들과 유사하거나 균등한 방법과 재료가 본 발명을 실시하거나 시험하는데 사용될 수 있을지라도, 적당한 방법과 재료는 아래 설명된다. 모든 간행물, 특허출원, 특허 및 기타 여기에 언급된 참조문헌은 그들 전체로 참조에 의해 도입된다. 저촉하는 경우, 용어의 설명을 포함하여, 본 명세서가 우선할 것이다. 또한, 재료, 방법 및 실시예는 단지 설명적일 뿐이며 제한하고자 하는 것은 아니다.

비록 본 발명의 바람직한 구체예와 그의 변형이 여기에 상세히 설명되어 있지만, 본 발명은 그들 정확한 구체예와 변형으로 제한되지 않고, 다른 변형과 변화가 첨부된 청구범위에 정의된 바와 같은 본 발명의 요지와 범위를 벗어나지 않으면서 당업자에 의해 수행될 수 있음이 이해되어야 할 것이다.

관련 출원/특허 및 참조에 의한 도입

2003년 3월 19일에 출원된 미국 가출원 제60/455,767호와 2003년 12월 19일에 출원된 미국 출원 제10/741,313호에 대해 우선권을 주장한다. 2001년 11월 27일에 출원된 미국 출원 제09/995,054호를 참조로 한다.

본문에 인용된 각각의 출원 및 특허와, 각각의 출원 및 특허에 인용된 각각의 문헌이나 참조문헌(각 등록특허의 계류 중을 포함; "출원 인용 문헌")과, 이들 출원 및 특허 중 어느 것에 대응하고(거나) 그로부터 우선권을 주장하는 각각의 PCT 및 외국 출원이나 특허와, 각각의 출원 인용 문헌에서 인용되거나 참조된 각각의 문헌은 이로써 명시적으로 참조에 의해 여기에 도입된다. 보다 일반적으로, 본문에서 인용된 문헌이나 참조문헌과 각각의 이들 문헌이나 참조문헌("여기에-인용된 참조문헌")과, 각각의 여기에-인용된 참조문헌에 인용된 각각의 문헌이나 참조문헌(어느 제조자의 설명서, 지시서 등)은 이로써 명시적으로 여기에 참조에 의해 도입된다.

Claims (39)

1. a) 샘플로부터 소기관을 방출시키는 단계;

   b) 소기관을 연속-흐름 원심분리기 내의 밀도 구배로 도입하는 단계;

   c) 소기관의 적어도 두 타입이 밀도 구배 내에서 이동하기에 충분한 원심력을 적용하는 단계; 및

   d) 밀도 구배로부터 소기관의 적어도 두 타입을 수집하는 단계

   를 포함하는, 소기관을 포함하는 샘플로부터 소기관을 수집하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 소기관이 소기관의 서브타입을 포함하는 것인 방법.
3. 제1항에 있어서, 샘플이 생물학적 샘플인 방법.
4. 제3항에 있어서, 생물학적 샘플이 기관, 체액, 혈액, 혈청, 혈장, 타액, 누액, 분변, 뇨, 정액, 점액, 조직, 조직 균질화물, 세포 추출물, 또는 척수액 또는 그들의 배합물을 포함하는 것인 방법.
5. 제1항에 있어서, 연속-흐름 원심분리기가 연속-흐름 초원심분리기인 방법.
6. 제1항에 있어서, 연속-흐름 원심분리기가 구역 로터를 포함하는 것인 방법.
7. 제1항에 있어서, 수집된 소기관의 적어도 두 타입을 소기관을 판매하고, 소기관을 임대하고, 소기관을 라이센싱하고, 소기관에 대한 지적재산권 이익을 보호하고, 소기관에 관한 정보를 데이터베이스에 위치시키거나 데이터베이스에 위치된 소기관에 관한 정보를 검토함으로써 이용하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
8. 제1항에 있어서, 밀도 구배가 염화세슘, 황산세슘, 비전해질 용질, 다당류, 요오드화된 비전해질 및 폴리비닐피롤리돈으로 코팅된 콜로이드성 실리카로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것인 방법.
9. 제1항에 있어서, 방출 단계가 균질화 및(또는) 용해를 포함하는 것인 방법.
10. 제1항에 있어서, 소기관의 적어도 두 타입 각각이 부력 밀도를 갖고, 원심력이 소기관의 적어도 두 타입 각각이 각 부력 밀도와 실질적으로 동일한 구배 밀도에서의 밀도로 이동하도록 유발하기에 충분한 것인 방법.
11. 제1항에 있어서, 소기관의 적어도 두 타입이 단일 실행으로 밀도 구배 내에서 이동하는 것인 방법.
12. 제1항에 있어서, 수집된 소기관의 적어도 두 타입이 적어도 약 60 퍼센트 보전된 것인 방법.
13. 제1항 또는 제10항에 있어서, 소기관의 적어도 두 타입을 용해시켜 단백질을 함유하는 프로테옴(proteome)을 형성하고; 프로테옴으로부터 단백질을 수집하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
14. 제13항에 있어서, 수집된 단백질이 희소(low-abundance) 단백질인 방법.
15. 제14항에 있어서, 수집된 단백질이 세포 당 약 100 카피 미만의 양으로 세포에 존재하는 것인 방법.
16. 제15항에 있어서, 수집된 단백질이 세포 당 약 1 카피의 양으로 존재하는 것인 방법.
17. 제1항 또는 제10항에 있어서, 소기관의 적어도 두 타입이 밀도 구배에서 농축되고 축적되는 것인 방법.
18. 제5항에 있어서, 연속-흐름 초원심분리기가 약 100 ㎖ 내지 약 8 리터의 부피 용량을 갖는 로터를 포함하는 것인 방법.
19. 검출가능한 양의 희소 단백질을 함유하기에 충분한 양의 소기관 타입이 수집되는 경우에, 소정의 소기관 타입이 검출가능한 양의 희소 단백질을 함유하기에 충분한 양으로 밀도 구배의 구획 내에 농축되고 축적되기에 충분한 양으로 원심력을 적용하면서 소기관 집단을 연속-흐름 원심분리기 내의 밀도 구배로 도입하는 단계를 포함하는, 소기관 집단으로부터 희소 단백질을 수득하는 방법.
20. 제19항에 있어서, 소기관 집단을 밀도 구배로 도입하기 전에, 생물학적 샘플을 균질화하고(거나) 용해한 생물학적 샘플로부터 소기관 집단을 방출시키는 추가 단계를 포함하는 방법.
21. 제19항에 있어서, 희소 단백질을 수집하는 추가 단계를 포함하는 방법.
22. 제21항에 있어서, 희소 단백질의 수집이 소기관의 용해를 포함하는 것인 방법.
23. 제22항에 있어서, 희소 단백질이 실질적으로 순수한 형태로 단리되는 것인 방법.
24. 제19항 또는 제21항에 있어서, 밀도 구배에 원심력을 연속적으로 적용하는 동안 소기관 집단을 연속적으로 또는 간헐적으로 도입하는 방법.
25. 제24항에 있어서, 희소 단백질을 판매하고, 희소 단백질을 임대하고, 희소 단백질을 라이센싱하고, 희소 단백질에 대한 지적재산권 이익을 보호하고, 희소 단백질에 관한 정보를 데이터베이스에 위치시키거나 데이터베이스에 위치된 희소 단백질에 관한 정보를 검토함으로써 희소 단백질을 이용하는 추가 단계를 포함하는 방법.
26. a) 생물학적 샘플을 균질화하고(거나) 세포 물질을 용해하여 균질화물을 형성하는 단계;

    b) 밀도 구배를 함유하는 회전 연속-흐름 초원심분리기에 연속적으로 또는 간헐적으로 균질화물을 공급 및 재순환시키는 단계;

    c) 세포내 소기관의 적어도 두 타입 각각이 밀도 구배 내의 위치에서 농축되고 축적되도록, 초원심분리기의 밀도 구배로 공급하는 단계 동안과 상기 단계 후에 원심력을 적용하는 단계; 및

    d) 세포내 소기관의 적어도 두 타입 각각을 밀도 구배에서 그 각각의 위치로부터 수집하는 단계

    를 포함하는, 생물학적 샘플로부터 소기관의 적어도 두 타입을 분리하는 방법.
27. 복수의 소기관 타입을 함유하는 생물학적 샘플을 회전 연속-흐름 초원심분리기를 통해 통과시켜, 단일 소기관 타입으로부터 희소 단백질을 단리하고 검출하기에 충분한 양으로 단일 소기관 타입을 생물학적 샘플로부터 농축하고 축적하는 단계를 포함하는, 소기관 타입을 수득하는 방법.
28. 제27항에 있어서, 희소 단백질이 세포 당 약 100 카피 미만으로 세포에 존재하는 것인 방법.
29. 제28항에 있어서, 희소 단백질이 세포 당 약 10 카피 미만으로 세포에 존재하는 것인 방법.
30. 제28항에 있어서, 희소 단백질이 세포 당 약 1 카피로 세포에 존재하는 것인 방법.
31. a) 제1 소기관을 함유하는 제1 소기관 타입과 제2 소기관을 함유하는 제2 소기관 타입을 적어도 함유하되, 상기 제1 및 제2 소기관이 각각 부력 밀도를 갖고, 상기 제1 및 제2 소기관 타입이 서로 상이한 것인 제1 생물학적 샘플을 수득하는 단계;

    b) 제1 생물학적 샘플로부터 제1 및 제2 소기관을 방출시키는 단계;

    c) 제1 소기관이 밀도 구배 내에서 밀도 구배의 밀도가 제1 소기관의 부력 밀도와 실질적으로 동일한 제1 위치로 이동하기에 충분하고 제2 소기관이 밀도 구배 내에서 밀도 구배의 밀도가 제2 소기관의 부력 밀도와 실질적으로 동일한, 제1 위치와 동일하거나 상이할 수 있는 제2 위치로 이동하기에 충분한 원심력을 적용하면서 제1 및 제2 소기관을 연속-흐름 원심분리기 내의 밀도 구배로 도입하는 단계;

    d) 제1 및 제2 소기관을 수집하는 단계;

    e) 제1 소기관으로부터 제1 단백질을 단리하고, 제2 소기관으로부터 제2 단백질을 단리하는 단계; 및

    f) 제1 단백질과 제2 단백질의 프로테옴 프로파일을 분석하는 단계

    를 포함하는, 소기관의 적어도 두 상이한 타입의 프로테옴 프로파일을 분석하는 방법.
32. 제31항에 있어서,

    a) 제3 소기관을 함유하는 제3 소기관 타입과 제4 소기관을 함유하는 제4 소기관 타입을 적어도 함유하되, 상기 제3 및 제4 소기관이 각각 부력 밀도를 갖고, 상기 제3 및 제4 소기관 타입이 서로 상이한 것인 제2 생물학적 샘플을 수득하는 단계;

    b) 제1 및 제2 소기관 대신 제3 및 제4 소기관을 이용하여 제31항의 단계 b), c) 및 d)를 반복하는 단계;

    c) 제3 소기관으로부터 제3 단백질을 단리하고, 제4 소기관으로부터 제4 단백질을 단리하는 단계; 및

    d) 제3 단백질과 제4 단백질의 프로테옴 프로파일을 분석하는 단계

    를 추가로 포함하는 방법.
33. 제32항에 있어서, 제1 소기관 타입이 제3 소기관 타입과 동일하고 제2 소기관 타입이 제4 소기관 타입과 동일한 것인 방법.
34. 제33항에 있어서, 제1 소기관의 프로테옴 프로파일을 제3 소기관과 비교하고, 제2 소기관의 프로테옴 프로파일을 제4 소기관과 비교하는 방법.
35. 제34항에 있어서, 제1 생물학적 샘플을 제1 시점에 공급원으로부터 수득하고, 제2 생물학적 샘플을 제2 시점에 동일 공급원으로부터 수득하는 것인 방법.
36. 제35항에 있어서, 동일 공급원이 하나 이상의 생존 숙주인 방법.
37. 제36항에 있어서, 동일 공급원이 하나의 생존 숙주인 방법.
38. (a) 생물학적 샘플을 제1 시점에,

    ⅰ) 제1 단백질을 포함하는 소정 밀도의 제1 소기관을 균질화물로 방출시키기에 충분한 조건 하에서 제1 생물학적 샘플을 균질화하고;

    ⅱ) 균질화물을 회전 연속 흐름 초원심분리기의 밀도 구배로 도입하고;

    ⅲ) 제1 소기관이 밀도 구배 내에서 제1 소기관의 밀도와 실질적으로 동일한 밀도 구배의 위치로 이동하도록 초원심분리기로부터의 원심력을 균질화물에 적용하고;

    ⅳ) 밀도 구배로부터 제1 소기관을 분리하고;

    ⅴ) 제1 생물학적 샘플의 제1 소기관에 있는 제1 단백질을 검출하고 특성분석함으로써, 생물학적 샘플의 제1 소기관에서 단백질을 수득하는 단계;

    b) 제2 시점에 수득된 생물학적 샘플을 이용하여 상기 (a)(ⅰ) 내지 (a)(ⅴ)의 단계를 수행하는 것을 포함하여, 제2 시점에서 수득한 생물학적 샘플로부터의 제2 소기관에서 제1 타입과 동일한 단백질 타입인 제2 단백질을 수득하는 단계; 및

    c) 제1 및 제2 단백질의 위치를 비교하는 단계

    를 포함하는, 제1 시점 및 제2 시점에서 제1 및 제2 소기관을 함유하는 생물학적 샘플에서 단백질의 전좌(translocation)를 분석하는 방법.
39. 제38항에 있어서, 제1 소기관이 복수의 제1 소기관을 포함하고, 제2 소기관이 복수의 제2 소기관을 포함하며, 제1 단백질이 복수의 제1 단백질을 포함하고, 제2 단백질이 복수의 제2 단백질을 포함하는 것인 방법.