CN104293961B - 用于检测scz相关基因多态性的引物及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于检测SCZ相关基因多态性的引物及试剂盒，本发明基于AUTS2基因多态性位点与SCZ的相关性，设计了用于扩增包含AUTS2基因多态性位点的特异引物对，并提供了包含该引物对的检测用试剂盒，可用于SCZ的预防、辅助诊断和治疗，还可用于新药研发。

Description

用于检测SCZ相关基因多态性的引物及试剂盒

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种预测精神分裂症易感性的试剂，更具体地说是用于测定与精神分裂症的易感性相关的人AUTS2基因单核苷酸多态性的引物以及含有该引物的试剂盒，可用于疾病的辅助诊断、治疗和新药开发。

背景技术

精神分裂症(SCZ)是一种复发率高、致残率高的慢性迁延性疾病，以基本个性改变，思维、情感、行为的分裂，精神活动与环境不协调为主要特征，一般没有意识和智能障碍，为一种功能性疾病。据世界卫生组织统计，全球精神分裂症的终身患病率约为3.8‰～8.4‰，欧洲、美洲和东南亚地区的平均患病率分别为5.0‰、4.2‰和3.7‰。我国的调查数据显示，城市地区患病率为7‰，农村为4.26‰。该病多起病于青壮年，患者劳动能力显著丧失，给社会和家庭造成沉重的负担，并占用大量的医疗卫生资源，所造成的社会经济负担居各种疾病的前列。

目前，导致精神分裂症的确切病因尚不清楚。既往大量研究表明，精神分裂症在家系研究、双生子研究中呈现高度遗传一致性，寄养子研究发现精神分裂症母亲所生子女从小寄养在正常家庭中，成年后仍有较高的患病率。可见，遗传因素可能在精神分裂症的发病中起着重要的作用。

随着分子遗传学研究技术的进展，现已发现了许多跟精神分裂症相关的染色体区域和候选基因。在人类孟德尔遗传数据库的数据中，通过连锁和关联研究定位的精神分裂症易感位点所在的染色体有5，11q，6p23，22q11，6q，8p22-p21，13q32，18p，1q42，15q15，10q22，1p，15q13-q14，2q32.1，22q13.3，7q36.3，2p16.3。相关的易感基因有MTHFR(1p36)，NOS1AP(1q23)，RGS4(1q23)，CHI3L1(1q32)，DISC1(1q42)，NRXN1(2p16.3)，ZNF804A(2q31)，ERBB4(2q33)，SYN2(3p25)，ALS2CL(3p21)，DRD3(3q13)，KPNA1(3q21)，PMX2B(4p13)，SPATA5(4q28)，CLINT1(5q33)，DRD1(5q35.1)，DTNBP1(6p22.3)，NOTCH4(6p21)，LAMA2(6q22)，ABCA13(7p12.3)，TPH1(11p15.3-p14)，BDNF(11p13)，APOE(19q13)等。从目前的研究来看，SCZ的易感基因有很多，但是关于位于7号染色体的AUTS2基因(NC_000007.14)多态性与SCZ的关系未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供用于检测SCZ相关基因多态性的引物及试剂盒。

为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：

通过提取人基因组DNA，测定受试者的AUTS2基因内含子区(rs6943555)碱基多态性位点的基因型，发现该多态性位点与受试者对精神分裂症的易感性密切相关：AUTS2基因型为T/T纯合子时，受试者的易感性最低；AUTS2基因型为T/A杂合子时，受试者的易感性较高；AUTS2基因型为A/A纯合子时，受试者的易感性最高。

根据以上发现，本发明提供了一种分离核酸，具有SEQ.ID.NO.1所示的碱基序列，在第163位为T，该核酸序列为AUTS2基因内含子4部分序列。本发明提供了一对引物，分别具有如SEQ.ID.NO.2和SEQ.ID.NO.3所示的碱基序列，长度分别为21和33bp，而且可以特异性地扩增出含有SEQ.ID.NO.1所示序列中第163位的SNP的扩增产物，所述的引物分别为：

上游引物F1：TGGGTGTTGGAAGAGTTTTGA(如SEQ.ID.NO.2所示)；

下游引物R1：ATACAGTATACATAAACATTGGAAAAGAGGGAA(如SEQ.ID.NO.3所示)。

本发明提供了一种检测SCZ易感性的诊断试剂盒，其中包含有引物F1和R1以及用于PCR扩增检测的试剂盒的其他试剂、缓冲液等。检测扩增产物与SEQ.ID.NO.l所示序列第163位相比是否存在变异时，所需的化学试剂还包括限制性内切酶等。本发明试剂盒中的全部组分、含量、来源如下：

本发明试剂盒供10人份检测应用，其组分、含量和来源包括：

125μL 2×PCR MasterMix(RUNDE，主要组成：0.1U Taq Polymerase/μL；500μMdNTP each；20mM Tris-HCl(pH 8.3)；100mM KCL；3mM MgCl₂)；

10μmol/μL Fl(SEQ.ID.NO.2)和10μmol/μL R1(SEQ.ID.NO.3)各10μL；

1.5mL纯水；

20μL 10×限制性内切酶反应缓冲液(Fermentas)；

5μL(10unit/μL)限制性内切酶Hinf1(Fermentas)。

试剂盒的保存温度为-20℃。

试剂盒的使用方法如下：

l)通过PCR扩增AUTS2基因的内含子4部分片段

制备混合液：向PCR管中加入1μL提取自受测人的基因组DNA溶液(50ng/μL)、12.5μL 2×PCR MasterMix、1μL F1、1μL R1(F1和R1分别为有义引物和反义引物)，接着，加入纯水，使总体积为25μL。PCR扩增的反应过程为：95℃5分钟，进入循环程序95℃0.5分钟，60℃0.5分钟，72℃0.5分钟，进行35个循环，最后72℃7分钟。反应完成后，将5μL反应产物在2％的琼脂糖凝胶上电泳检测，如扩增了196bp的片段，获得了单一条带，即为扩增成功。

2)通过用限制性内切酶处理PCR反应产物测定AUTS2基因的多态性。向10μL上述扩增成功的PCR反应产物中加入2μL 10×限制性内切酶反应缓冲液、0.5μL限制性内切酶Hinf1，纯水补足至20μL，37℃水浴中消化过夜。之后，在2.5％的琼脂糖凝胶上电泳。

3)多态性定型：用限制性内切酶Hinf1处理后，在第163位碱基是A等位基因时，出现165bp和31bp(由于条带太小，检测不到)的条带。如为T等位基因时，仅出现196bp一个条带。

本发明可用于测定来源于人的基因组DNA，样品没有限制，如体液(血液、腹水和尿液)、组织细胞〔肝组织、皮肤组织，肌肉组织)、毛发等。通过提取和纯化这些样品可制备基因组DNA。

本发明的优点是：本发明利用首次阐明的AUTS2基因多态性位点与SCZ的相关性，提供了一种基于PCR-RFLP检测SCZ易感性的引物和试剂盒，可用于SCZ的预防、辅助诊断和治疗，还可以用于新药研发。

附图说明

图1为经引物扩增后产物的酶切图谱；

图1中：1、3、6、7、8、11为T/A杂合型；2、10、12为A/A纯合型；4、5、9为T/T纯合型；M表示marker。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步描述，但并非对本发明的限制。

1、血液样本收集和基因组DNA的提取

按DSM-IV Axis I Disorders标准明确诊断入选病例，共计收集来自陕西省的无亲缘关系SCZ患者410例，平均年龄35.2岁±11.4岁，其中男性204例，同地区的健康对照志愿者435例，平均年龄37.6岁±10.8岁，其中男性192例。所有受检者均为汉族，且签署知情同意书，这一研究也得到了本单位伦理委员会批准。

根据下列方法，用人外周血制备基因组DNA：(1)将1mL抗凝贮冻血液于室温解冻后移入离心管中，加入1mL磷酸缓冲盐溶液(PBS)，混匀，12000rpm离心10min(4℃)，倾去含裂解红细胞的上清。重复一次。用500μLDNA提取液混悬白细胞沉淀，37℃水浴温育1h。(2)将上述DNA提取液混悬白细胞，37℃水浴温育1h后，加入10mg/mL蛋白酶K 10μL，上下转动混匀，液体变粘稠。56℃水浴过夜，裂解细胞，消化蛋白。保温过程中，应不时上下转动几次，混匀反应液。(3)第二天，反应液冷却至室温后，加入等体积的饱和酚溶液，温和地上下转动离心管10min，直至水相与酚相混匀成乳状液。12000rpm离心10min，用大口吸管小心吸取上层粘稠水相，移至另一离心管中。重复酚抽提一次。加等体积的氯仿：异戊醇(24：1)，上下转动混匀，12000rpm离心10min，用大口吸管小心吸取上层粘稠水相，移至另一离心管中。重复一次。(4)加0.1倍体积的3mol/L醋酸钠(pH 5.2)和2倍体积的冷无水乙醇，轻轻倒置混匀，即有乳白色云絮状DNA出现。用玻璃棒小心挑取云絮状的DNA，转入另一1.5mL离心管中，加70％乙醇500μL，以12000rpm离心5min。洗涤DNA，弃上清，去除残留的盐。重复一次。室温挥发残留的乙醇，但不要让DNA完全干燥。加水20μL溶解DNA，置于摇床平台缓慢摇动，DNA完全溶解通常需12～24h。制成的DNA液-20℃冰箱保存备用。

2、AUTS2基因SNP与SCZ的相关

统计方法：利用SPSS 18.0软件中Pearson卡方检验计算AUTS2基因多态性的等位位点，基因型频率，Hardy-weinberg平衡检测，统计学的显著性水平设定为P<0.05。采用单因素Logistic回归分析计算SCZ的患病风险OR值及其95％置信区间(CI)。

结果

1)健康人AUTS2基因多态性分布

测定了435个健康人的基因多态性，发现225人有T的纯合子(51.7％)，165人有T和A的杂合子(37.9％)，45人有AA的纯合子(10.4％)。

2)SCZ病人AUTS2基因多态性分布

测定410个病人的基因多态性，发现171人有T的纯合子(41.7％)，207人有T和A的杂合子(50.5％)，32人有A的纯合子(7.8％)。

3)SCZ病例和健康对照组比较

SCZ病例和健康对照组AUTS2基因上的rs6943555等位位点对为T/A多态性的频率分布详见表1。

表1 AUTS2基因rs6943555位点的基因型和等位基因频率风险性在SCZ和健康正常人群中的比较

由表1可见，AUTS2基因SNP位点(rs6943555)的T等位位点，即在其DNA互补链上为A等位位点，当突变为A，互补链上为T时，在患者群体中的基因型分布频率与正常人有显著性差别(P＝0.001)。表明这是SCZ患病的一个较高风险的等位基因。与SCZ显著相关的SNP(rs6943555)位点，位于AUTS2基因内含子4，可能通过相邻连锁的功能SNP而发挥作用。

3、SNP的检测

本发明采用PCR-RFLP对AUTS2基因的内含子4SNP位点(rs6943555，其等位位点对为T/A)进行检测。

l)引物的确定定位在AUTS2基因内含子4。特异性引物如下：

F1(SEQ.ID.NO.2)：

5’--TGGGTGTTGGAAGAGTTTTGA--3'

R1(SEQ.ID.NO.3)：

5’--ATACAGTATACATAAACATTGGAAAAGAGGGAA--3'

2)通过PCR扩增AUTS2基因内含子4部分片段，全长196bp

制备混合液，加入制备的人基因组DNA溶液(50ng/μL)1μL、12.5μL2×PCRMasterMix以及10μmol/μL Fl(SEQ.ID.NO.2)和10μmol/μL R1(SEQ.ID.NO.3)各1μL。接着，加入纯水，使总体积为25μL。反应在95℃5分钟，进入循环95℃0.5分钟，60℃0.5分钟，72℃0.5分钟，进行35个循环，最后72℃7分钟。反应完成后，将5μL PCR反应液在2％的琼脂糖凝胶上电泳获得了单一的条带(196bp)，观察在BioRad成像仪，应用Gel Doc2000程序。

3)通过用限制性内切酶处理PCR反应产物测定AUTS2基因多态性，向10μL上述PCR反应液中加入2μL 10×限制性内切酶反应缓冲液、0.5μL限制性内切酶Hinf1，并在37℃消化过夜。此后，在2.5％的琼脂糖凝胶上电泳。多态性的测定为：用限制性内切酶Hinf1处理后，在第163个碱基是A等位基因时，出现165bp和31bp(由于片段太小，检测不到)的条带。如为T等位基因时，仅出现196bp一个条带，参见图1。

4、检测试剂盒

制备检测SCZ相关风险的试剂盒，包含有可扩增出AUTS2基因SNP(rs6943555)位点的引物对，及PCR-RFLP相应试剂，成分和含量如下(供10人份检测应用)，于-20℃保存：

125μL 2×PCR MasterMix(RUNDE)；

10μmol/μL Fl(SEQ.ID.NO.2)和10μmol/μL R1(SEQ.ID.NO.3)各10μL；

1.5mL纯水；

20μL 10×限制性内切酶反应缓冲液(Fermentas)；

5μL(10unit/μL)限制性内切酶Hinf1(Fermentas)。

本发明建立的检测AUTS2基因多态性的核酸序列和SCZ相关位点检测引物和试剂盒，具有高的灵敏度，可特异性地应用于SCZ基因诊断。

本发明可用于分析人常染色体7q11区的AUTS2基因上的SNP(rs6843555)的T等位位点，即在其DNA互补链上为A等位位点，应用在对SCZ的辅助性诊断和对个体SCZ患病风险进行评估。以利于开展SCZ的早期干预和治疗。

利用本发明阐述的AUTS2基因rs6843555位点碱基变异，作为生物标志物之一，可用作药物设计的分子靶标的筛选，以帮助寻找具有调节AUTS2表达的活性分子，促进SCZ新药开发。

本发明基于AUTS2基因SCZ相关的新突变点，只需要少量DNA样品就足以测定AUTS2基因的多态性，可以用于测定SCZ相关基因多态性的基因诊断中。

Claims (3)

1.用于检测精神分裂症相关AUTS2基因rs6943555位点多态性的引物在制备用于检测精神分裂症的易感性的试剂盒中的应用，其特征在于：所述引物为两个，分别如SEQ.ID.NO.2和SEQ.ID.NO.3所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：该试剂盒包括10μL 10μmol/μL引物Fl、10μL 10μmol/μL引物R1、125μL 2×PCR MasterMix、20μL 10×限制性内切酶反应缓冲液以及5μL 10unit/μL限制性内切酶Hinf1，所述Fl如SEQ.ID.NO.2所示，R1如SEQ.ID.NO.3所示。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述试剂盒供10人份检测应用，试剂盒的保存温度为-20℃。