CN108676870A

CN108676870A - 与tia易感性相关的fmo3基因snp的检测方法、检测试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN108676870A
Application number: CN201810720723.7A
Authority: CN
Inventors: 张宝; 贺雅毅; 张倩; 阎春霞; 李少卿; 杨婧思
Original assignee: Xian Jiaotong University
Current assignee: Xian Jiaotong University
Priority date: 2018-06-29
Filing date: 2018-06-29
Publication date: 2018-10-19
Anticipated expiration: 2038-06-29
Also published as: CN108676870B

Abstract

本发明提供一种与TIA易感性相关的FMO3基因SNP的检测方法、检测试剂盒及其应用。利用如SEQ.ID.NO.2和SEQ.ID.NO.3所示的特异性核酸引物，及如SEQ.ID.NO.4所示的UEP引物对SNP位点rs1736557进行扩增，采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱对SNP位点rs1736557进行基因分型，本发明还涉及SNP位点rs1736557的检测试剂盒。本发明为TIA易感性鉴定提供了新的途径，为抗甲状腺药物临床实验对象的选择提供了实验依据。

Description

与TIA易感性相关的FMO3基因SNP的检测方法、检测试剂盒及其应用

技术领域

本发明属于制药领域，具体涉及一个与抗甲状腺药物引起的粒细胞缺乏(Antithyroid drug-induced agranulocytosis，TIA)易感性相关的FMO3基因单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)位点rs1736557及其应用。

背景技术

甲状腺机能亢进症(Hyperthyroidism)是因甲状腺腺体产生过多的甲状腺激素引起的以神经、循环、消化等系统兴奋性增高和代谢亢进为主要表现的疾病总称，简称甲亢。2010年我国一项流行病学调查显示甲状腺机能亢进症患病率为1.1％。其治疗手段主要有3种，包括抗甲状腺药物(Antithyroid drug,ATD)、放射碘治疗¹³¹I及手术治疗。3种方法均能减少甲状腺激素合成，从而达到治疗甲亢的目的。目前国内多首先采用抗甲状腺药物(ATD)，主要使用丙硫氧嘧啶(PTU)等治疗，常见的副作用包括皮肤瘙痒或者皮疹、关节肌肉疼痛和发热，其发生率约为5％，患者大多症状轻微，对症处理或停药后一般很快就缓解。而严重的不良反应包括中性粒细胞胞质抗体阳性的血管炎、粒细胞缺乏(简称粒缺)等，发生率为0.2％～0.5％。粒细胞缺乏症是指静脉血中性粒细胞计数<0.5×10⁹/L，红细胞和血小板通常不减少，伴或不伴有感染发热的临床综合症。ATD导致粒缺(TIA)虽然罕见，但却是最严重的不良反应，病死率及致残率高，早期发现未及时采取积极有效措施的，可危及生命，临床医务和药物开发人员对TIA应给予足够重视。

近年来国内外学者对TIA的发生机制进行了大量的研究，涉及到遗传易感性、免疫抑制、药物对骨髓毒性作用以及过敏因素等，虽然机制尚未完全明了，但免疫遗传因素与之密切相关的观点已得到了共识。

人类主要组织相容性抗原(MHC)系统即人类白细胞抗原(HLA)系统，位于6号染色体短臂6p21.31上，由一群密切连锁的基因组成，多数基因与免疫功能相关。日本学者Tamai等研究发现人类白细胞抗原(HLA)DRB1^＊08032等位基因与药物导致的粒细胞减少症之间存在明显的相关性，提示TIA的出现存在遗传易感性。但这仅是通过对已知与免疫反应有关的基因进行筛选研究得出的结论，还不能以此预测TIA的易患人群。有研究发现，TIA可以突然发生，即使每周进行血液白细胞总数和中性粒细胞计数的监测，仍不能预测所有的病例。

随后基因组的计划不断向前发展，针对TIA的分子遗传学研究也快速发展，而且不断有研究报道新的候选基因，从目前的研究来看，TIA的易感基因多位于6号染色体的HLA区域。

人类1号染色体(1q24.3)的FMO3基因上的不同SNPs与个体鱼腥味综合症、药物代谢有一定关系(巩政,王旗.黄素单加氧酶3的基因多态性及其在药物代谢和毒性中的作用[J].中国中药杂志,2015,40(14):2701-2705.)，但是关于FMO3(黄素单加氧酶3)基因SNP与TIA的关系未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种与TIA易感性相关的FMO3基因SNP的检测方法、检测试剂盒及其应用，通过对于SNP位点rs1736557的序列分型，可用于筛查TIA易感性人群，可应用于抗甲状腺药物临床研究、开发中。

为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：

本发明提供一种检测SNP位点rs1736557的特异性核酸引物(PCR扩增引物)，具有SEQ.ID.NO.2和SEQ.ID.NO.3所示的碱基序列，利用上述引物(SEQ.ID.NO.2和SEQ.ID.NO.3)可特异性地扩增得到源自人的一段分离核酸，其对应于FMO3基因参考序列(NC_000001.11)的部分如SEQ.ID.NO.1所示，在第44位为G，该段核酸序列定位于FMO3基因外显子6区域内。

本发明还提供一种检测SNP位点rs1736557的特异性核酸引物(单碱基扩展引物，UEP引物)，如SEQ.ID.NO.4所示，以便特异性扩增出该SNP位点的扩增产物，并用于SNP分型检测(基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱)。

本发明还提供一种检测SNP位点rs1736557的方法，包括以下步骤：

1)提取样本(人)的基因组DNA，以提取的基因组DNA为模板，利用特异性核酸引物(SEQ.ID.NO.2和SEQ.ID.NO.3)PCR扩增FMO3基因的部分片段；

2)以步骤1)的扩增产物为模板，利用UEP引物(SEQ.ID.NO.4)进行单碱基延伸；

3)检测步骤2)的延伸产物，得到样本SNP位点rs1736557的分型数据(例如基因型)。

优选的，PCR扩增的反应条件：95℃2min；95℃0.5min，55℃0.5min，72℃1min，45个循环；72℃5min。PCR反应体系包括：0.625μL 10×TaqBuffer，0.1μL 25mM dNTP，0.03μL100μM的PCR引物Mix(含SEQ.ID.NO.2及SEQ.ID.NO.3)，0.325μL 25mM终浓度的MgCl₂，0.1μL5U/μL Hotstar Taq DNA聚合酶，及2μL模板DNA(即浓度为50ng/μL人基因组DNA)。

优选的，单碱基延伸的反应条件：94℃30s；94℃5s，(52℃5s，80℃5s，内部循环5次)，外部循环40次；72℃180s。单碱基延伸反应体系包括：0.2μL 10×iPlex Buffer，0.2μLiPlex Termination，0.056μL 100μM终止引物UEP，以及0.041μL iPlex Enzyme。

优选的，所述步骤3)具体为：将延伸产物经树脂纯化后，上样至SpectroCHIP芯片；通过MALDT-TOF Mass Spectrometry进行质谱检测。

优选的，步骤1)的扩增产物经过SAP纯化后再进行单碱基延伸。

优选的，SAP纯化反应条件：37℃40min，85℃5min。SAP纯化反应体系包括：0.17μL10×SAP Buffer，及0.3μL 1U/μL SAP酶。

本发明还提供了一种检测SNP位点rs1736557的试剂盒，该试剂盒包括序列如SEQ.ID.NO.2及SEQ.ID.NO.3所示的PCR扩增引物以及UEP引物，UEP引物序列如SEQ.ID.NO.4所示。

优选的，所述的试剂盒还包括组成上述PCR反应体系、SAP纯化反应体系及单碱基延伸反应体系的试剂。

本发明还提供了上述检测方法、试剂盒的应用，利用该试剂盒可以对SNP位点rs1736557进行检测，确定SNP位点rs1736557的基因型。通过提取样本的基因组DNA进行SNP位点rs1736557的基因分型，其中在rs1736557上具有G等位基因的个体为TIA易感人群，在rs1736557上不具有G等位基因的(基因型为A/A)的个体为TIA非易感人群。

优选的，FMO3基因SNP位点rs1736557的基因型为A/A纯合子时，TIA的易感性最高；FMO3基因SNP位点rs1736557的基因型为A/G杂合子时，TIA的易感性较高；FMO3基因SNP位点rs1736557的基因型为G/G纯合子时，易感性最低。

本发明的有益效果体现在：

本发明针对FMO3基因在基因组处于不保守区(位于1号染色体长臂24区)，rs1736557位点两端突变位点较多，故引物设计时考虑位点两端存在多点突变情况，结合实际扩增效率，设计出特异性引物(PCR扩增引物等)。本发明中基于所设计引物序列可以特异、高效的检测FMO3基因SNP位点rs1736557的分型数据，通过提取人基因组DNA，测定FMO3基因rs1736557多态位点的基因型，发现该多态位点与人对TIA的易感性密切相关，从而可以为抗甲状腺药物的临床实验筛选并提供更为精准的实验对象样本，降低药物开发风险，同时为研究TIA分子机制提供了新的思路、途径和手段。

附图说明

图1为分型结果MS图谱。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步描述，所述实施例用于对发明内容进行解释，但并非对本发明的限制。

(一)血液样本收集和基因组DNA的提取

用人外周血制备基因组DNA的步骤如下：

(1)将1mL抗凝贮冻血液于室温解冻后移入离心管中，加入1mL磷酸缓冲盐溶液(PBS)，混匀，12000rpm离心10min(4℃)，倾去含裂解红细胞的上清；重复一次。

(2)用500μL DNA提取液混悬白细胞沉淀，37℃水浴温育1h，加入10mg/mL蛋白酶K10μL，上下转动混匀，液体变粘稠。56℃水浴过夜，裂解细胞，消化蛋白。保温过程中，应不时上下转动几次，混匀反应液。

(3)第二天，反应液冷却至室温后，加入等体积的饱和酚溶液，温和地上下转动离心管10min，直至水相与酚相混匀成乳状液。12000rpm离心10min，用大口吸管小心吸取上层粘稠水相，移至另一离心管中；重复酚抽提一次。加等体积的氯仿:异戊醇(24:1)，上下转动混匀，12000rpm离心10min，用大口吸管小心吸取上层粘稠水相，移至另一离心管中；重复一次。

(4)加0.1倍体积的3mol/L醋酸钠(pH 5.2)和2倍体积的预冷无水乙醇，轻轻倒置混匀，即有乳白色云絮状DNA出现。用玻璃棒小心挑取云絮状的DNA，转入另一1.5mL离心管中，加70％乙醇500μL，以12000rpm离心5min(洗涤DNA)。弃上清，以去除残留的盐；重复一次。室温挥发残留的乙醇，但不要让DNA完全干燥。加TE液50μL溶解DNA，置于摇床平台缓慢摇动，DNA完全溶解通常需12-24h。制成的DNA液-20℃冰箱保存备用。

(二)SNP的识别确定

根据SNP的序列信息(例如，FMO3基因SNP位点rs1736557在参考序列第6880位)，设计PCR反应和单碱基扩展引物(即UEP引物)，并在生物工程(上海)有限公司合成。合成后的引物与样品DNA进行PCR反应和单碱基延伸，反应产物在SequenomiPLEX仪器(Sequenom公司)上进行SNP基因分型。具体实验流程如下：

(1)引物设计

多重反应自动设计PCR引物(设计完成时间：2017年3月)：

上游引物：5`-ACGTTGGATGGGCATCAAGCCATAGTTTTC-3`(如SEQ.ID.NO.2所示)；

下游引物：5`-ACGTTGGATGAATTTACCGACAGCCATCTC-3`(如SEQ.ID.NO.3所示)。

Gold单碱基延伸引物(设计完成时间：2017年3月)：

5`-AATATTGCATTCATCTGCTTCA-3`(如SEQ.ID.NO.4所示)

(2)PCR反应

(A)按照表1中试剂配制PCR反应液

表1.PCR反应液Mix(单位：μL)

(B)5μL PCR反应体系：取3μL PCR反应液Mix加入到384孔板的每个孔中，按照96孔板至384孔板加样表的顺序用8道排枪将96孔板DNA样品(模板)转移至384孔板中，每孔2μL，配成5μL的反应体系，2000转离心1min后放入ABI9700PCR仪中进行PCR扩增。

(C)PCR反应程序

表2.循环参数

(3)SAP纯化反应

(A)用1.5mL EP管中按照表3中试剂配制SAP酶Mix

表3.SAP酶Mix(单位：μL)

(B)将Mix平均分布于8孔连排管，轻轻揭开384孔板封口膜，用8道排枪取2μL的Mix加入到每个孔中。取新的封口膜用刮板将侧边和四个角封紧。2000转离心1min后，在PCR仪中进行SAP酶消化。

(C)SAP酶消化程序(参见表4)

表4.循环参数

温度(℃)	时间(min)	周期
			37	40	1
85	5	1
			25	∞	1

(4)单碱基延伸反应

(A)在1.5mL EP管中按照表5中试剂配制单碱基延伸反应Mix：

表5.单碱基延伸反应Mix(单位：μL)

(B)将Mix平均分布于8孔连排管中，轻轻揭开封口膜，用8道排枪取2μL的Mix加入到每个孔中。取新的封口膜将384孔板的侧边和四个角封紧，2000转离心1min后，在ABI9700PCR仪中进行单碱基延伸反应。

(C)单碱基延伸反应(参见表6)

表6.循环参数

(5)将反应产物经树脂纯化后，取10μL，SpectroCHIP芯片上样；

(6)通过MALDT-TOF Mass Spectrometry进行质谱检测，并获取SNP分型数据。

(7)结果判定

参见图1，分型结果是按照不同基因型的分子大小差异直接给出的。

利用Taqman方法和直接测序，检测相同样本，基因分型结果相同。

(三)FMO3基因SNP位点rs1736557与TIA的相关性

3.1统计方法

利用SPSS 18.0软件中Pearson卡方检验计算FMO3基因rs1736557位点的基因型频率，Hardy-weinberg平衡检测，统计学的显著性水平设定为P<0.05。采用单因素Logistic回归分析计算TIA的患病风险0R值及其95％置信区间(CI)。

3.2结果

按GD标准明确诊断入选病例，共计收集来自陕西省的无亲缘关系TIA个体29例，平均年龄44.17岁±14.15岁，其中男性3例，同地区的健康对照志愿者140例，平均年龄37.27岁±11.2岁，其中男性41例。所有受检者均为汉族，且签署知情同意书，也得到了本单位伦理委员会批准。

1)健康人FMO3基因多态性分布

按以上(一)、(二)中方法测定140个健康人的基因多态性，发现在SNP位点rs1736557有96人为G的纯合子(68.6％)，39人为G和A的杂合子(27.9％)，5人为A的纯合子(3.5％)。

2)TIA个体FMO3基因多态性分布

按以上(一)、(二)中方法测定29个TIA个体(即表现出TIA的个体)的基因多态性，发现在SNP位点rs1736557有12人为G的纯合子(41.4％)，15人有G和A的杂合子(51.7％)，2人为A的纯合子(6.9％)。

3)TIA人群和健康对照组比较

TIA人群和健康对照组比较FMO3基因rs1736557位点G/A多态性的频率分布，详见表7。

表7.rs1736557位点的基因型和等位基因频率风险性

由表7可见，FMO3基因第外显子6的SNP位点(rs1736557)的G等位基因，当突变为A，在TIA人群中的基因型分布频率与健康对照组有显著差别(P＝0.007)，等位基因频率与健康对照组亦有显著差别(P＝0.008)。表明rs1736557是与TIA显著相关的SNP位点。

本发明建立的检测FMO3基因rs1736557位点多态性的方法，具有高的灵敏度和特异性，仅需要少量DNA样品就足以测定FMO3基因的多态性，方法简便、快速，结果准确、明了。除了以上(一)中提取来源于血液的人的基因组DNA，对其他样品来源，如体液(腹水和尿液)、组织细胞(肝组织、皮肤组织，肌肉组织)、毛发等的DNA同样适用。

本发明的应用例证：

(1)本发明可用于分析人染色体1q24.3FMO3基因的rs1736557位点(FMO3基因第6880位碱基变异)的基因型，分型数据可以用于鉴定个体TIA易感性，为抗甲状腺药物临床实验提供精准的实验个体。

(2)根据本发明检测rs1736557位点的基因分型结果，判定TIA易感人群，可对未表现出TIA临床症状的Graves病人进行筛查，应用于对Graves病人是否具有TIA易感性的评判。

(3)位于rs1736557多态性位点附近的DNA序列还存在不少SNP位点，这些SNP位点可进一步分析，将对研究TIA的发生、发展机制起到一定作用。

序列表

<110> 西安交通大学

<120> 与TIA易感性相关的FMO3基因SNP的检测方法、检测试剂盒及其应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 103

<212> DNA

<213> Homo sapiens, human

<400> 1

acgttggatg aatttaccga cagccatctc tgactggttg tacgtgaagc agatgaatgc 60

aagattcaag catgaaaact atggcttgat gcccatccaa cgt 103

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 2

acgttggatg ggcatcaagc catagttttc 30

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 3

acgttggatg aatttaccga cagccatctc 30

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 4

aatattgcat tcatctgctt ca 22

Claims

1.一种检测SNP位点rs1736557的方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)提取人的基因组DNA，以提取的基因组DNA为模板，利用如SEQ.ID.NO.2和SEQ.ID.NO.3所示的引物PCR扩增FMO3基因的部分片段；

2)以步骤1)的扩增产物为模板，利用如SEQ.ID.NO.4所示的引物进行单碱基延伸；

3)检测步骤2)的延伸产物，得到SNP位点rs1736557的分型数据。

2.根据权利要求1所述一种检测SNP位点rs1736557的方法，其特征在于：所述PCR扩增的反应条件为：95℃2min；95℃0.5min，55℃0.5min，72℃1min，45个循环；72℃5min。

3.根据权利要求1所述一种检测SNP位点rs1736557的方法，其特征在于：所述单碱基延伸的反应条件为：94℃30s；94℃5s后按照52℃5s及80℃5s进行内部循环5次，外部循环40次；72℃180s。

4.根据权利要求1所述一种检测SNP位点rs1736557的方法，其特征在于：所述步骤3)具体包括以下步骤：将单碱基延伸产物经树脂纯化后利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱进行基因型检测。

5.根据权利要求1所述一种检测SNP位点rs1736557的方法，其特征在于：所述步骤1)的扩增产物经过SAP纯化后再进行单碱基延伸。

6.根据权利要求5所述一种检测SNP位点rs1736557的方法，其特征在于：所述SAP纯化的反应条件为：37℃40min，85℃5min。

7.一种检测SNP位点rs1736557的试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括序列如SEQ.ID.NO.2及SEQ.ID.NO.3所示的PCR扩增引物以及如SEQ.ID.NO.4所示的单碱基扩展引物。

8.一种如权利要求1所述的检测SNP位点rs1736557的方法在抗甲状腺药物临床实验中的应用。

9.一种如权利要求7所述的检测SNP位点rs1736557的试剂盒在抗甲状腺药物临床实验中的应用。

10.根据权利要求8或9所述的应用，其特征在于：通过对SNP位点rs1736557的基因型进行检测，选择在rs1736557上具有G等位基因的个体作为抗甲状腺药物临床实验的对象。