CN104293779A - 诱导型异源双链产生子的改进 - Google Patents

诱导型异源双链产生子的改进 Download PDF

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Abstract

本发明发现，通过修饰诱导型异源双链产生子(IHG)分子，以便使识别标记自与待进行基因型分型的多态性位点直接相邻的核苷酸位点分隔开，能够改善异源双链条带的分辨。出乎意料地是，发现当使用所述的修饰IHG分子时，可显著地改善诱导型异源双链的分辨。

Description

诱导型异源双链产生子的改进
本申请是2005年10月10日提交的题为“诱导型异源双链产生子的改进”的中国专利申请200580034310.4的分案申请。
技术领域
本发明涉及诱导型异源双链产生子(induced heteroduplex generator，IHG)分子，其提供了对现有技术中已知的此类分子的改进。本发明进一步涉及用于在本发明改进的IHG和靶基因组DNA序列之间形成诱导型异源双链的方法，以及涉及所述的诱导型异源双链用于对动物(例如哺乳动物)、植物、病毒或细菌的DNA、通常是人DNA中的突变进行基因型分型(genotyping)的分析方法。因此，本发明可被用于，例如，关于与遗传性疾病相关的基因中的多态性和突变(例如囊性纤维化(CFTR基因)、苯丙酮酸尿症(PAH基因)、镰刀形红细胞病和β-地中海贫血病(HBB基因)，以及致癌基因和肿瘤抑制基因中的体细胞突变。本发明也涉及包含本发明的诱导型异源双链产生子的试剂盒，所述试剂盒可用于分析基因组DNA序列的方法中。
背景技术
在生物体的基因组中检测DNA序列变异的能力(为了方便起见，以下简称“多态性”，但没有限制作用)，已经成为诊断疾病和病症中、以及预测对治疗方案的反应中的重要工具。使用早期变异检测法，越来越可能在身体表现症状之前就诊断和治疗、甚至预防疾病或病症的发生。而且，变异检测法可成为有用的研究工具，因为它可导致发现病症的遗传基础，而所述的病症原因迄今不为人所知或被认为是非遗传性的。
序列变异可以是很多不同的形式。例如，可以通过在基因的特定位点上将一个或多个核苷酸残基取代为数目相同的其它核苷酸来产生变异。另一个实例是在基因的特定位点上缺失一个或多个核苷酸。另一个实例是在基因的特定位点上插入一个或多个额外的核苷酸。也可以是取代、缺失和插入的组合。序列变异的常见类型是单核苷酸多态性或SNP。SNP涉及在基因的特定位点上一个核苷酸残基对另一个核苷酸的取代。虽然每个SNP仅涉及一个核苷酸，但是单个基因可包含很多SNP。
鉴定物种或者该物种的个体的特定基因是否含有序列变异，称为基因型分型。所以，全长测序是实现基因型分型的方法，但其耗时耗力并且效率极低。
在现有技术中已知的可选择性基因型分型法利用了所谓的诱导型异源双链产生子(以前也称为通用异源双链产生子，并在下文中用术语“IHG”来指代)。它们是模拟基因组DNA序列的合成DNA序列，但其含有与在基因组DNA内已知的多态性位点相对的核苷酸位置上和(在现有技术中)与之相邻的(即直接相邻)核苷酸位置上遗传工程化引入的受控的核苷酸取代、缺失、插入或其组合(统称为“识别标记(identifier)”)。为了检测基因组DNA中的序列变异，分别用相同的基因座特异性PCR引物来扩增IHG和基因组DNA序列，随后通过加热和缓慢冷却来使相应的PCR产物彼此杂交来产生DNA异源双链。然后，例如通过非变性的聚丙烯酰胺微型胶电泳，来分辨(resolve)所产生的异源双链。根据在IHG和基因组DNA之间错配的数目、类型和位置，产生以不同速率迁移的不同异源双链，因此产生了不同等位基因的特征性条带图。
下列参考文献论述了诱导型异源双链产生子的用途：
1.Bidwell,JL,Clay,TM,Wood,NAP,Pursall,MC,Martin,AF,Bradley,BA andHui,KM(1993)Rapid HLA-DR-Dw and DP matching by PCR fingerprinting and relatedDNA heteroduplex technologies,pp99-116in:Handbook of HLA Typing Techniques[EdsKM Hui&JL Bidwell]CRC Press:Boca Raton,Florida.
2.Wood,N,Tyfield,L,Bidwell,J(1993)Rapid classification of phenylketonuriagenotypes by analysis of heteroduplexes generated by PCR-amplifiable synthetic DNA.Human Mutation2:131-137.
3.Bidwell,JL,Wood,NAP,Tyfield,LA,Clay,TM,Culpan,D,Evans,JM,Pursall,MC,Bradley,BA(1993)Universal heteroduplex generators:reagents for genotyping ofHLA and of human diseases.Molecular Bases of Human Diseases(Ed.E.E.PoIIi).pp27-34.Elsevier/North-Holland,Amsterdam.
4.Wood,N,Standen,G,Hows,J,Bradley,B,Bidwell,J.(1993)Diagnosis ofsickle cell disease with a universal heteroduplex generator.Lancet342:1519-1520.
5.Bidwell,JL,Wood,NAP,Clay,TM,Pursall,MC,Culpan,D,Evans,J,Bradley,BA,Tyfield,LA,Standen,G,Hui,KM(1994)DNA heteroduplex technology.In:Chrambach,A,Dunn,MJ,Radola,BJ(Eds),Advances in Electrophoresis,Volume7,pp311-351.VCH Press,Weinheim.
6.Clay,TM,Cuplan,D,Howell,WM,Sage,DA,Bradley,BA,Bidwell,JL.(1994)UHG crossmatching:a comparison with PCR-SSO typing in the selection of HLA-DPB1-compatible bone marrow donors.Transplantation58:200-207.
7.Bidwell,JL.(1994)Advances in DNA-based HLA-typing methods.Immunology Today15:303-307.
8.Tyfield,LA,Stephenson,A,Bidwell,JL,Wood,NAP1Cockburn,F,Harvie,A,Smith,I.(1994)Mutation analysis of the phenylalanine hydroxylase gene usingheteroduplex analysis with synthetic DNA constructs.Acta Paediatrica83:47-48.
9.Savage,DA,Wood,NAP,Bidwell,JL,Hui,KM.(1995)HLA-DRB1*01subtyping by heteroduplex analysis.Tissue Antigens45:120-124.
10.Wood,N,Standen,G,Murray,EW,Lillicrap,D,Holmberg,L,Peake,IR,Bidwell,J.(1995)Rapid genotype analysis in type2B von Willebrand's disease using auniversal heteroduplex generator.Brit J Haematol89:152-156.
11.Wood,N,Standen,G,Old,J,Bidwell,J.(1995)Optimisation and properties of aUHG for genotyping of haemoglobins S and C.Hum Mutation5:166-172.
12.Savage,DA,Wood,NAP,Bidwell,JL,Fitches,A,Old,JM,Hui,KM.(1995)Detection of b-thalassaemia mutations using DNA heteroduplex generator molecules.BritJ Haematol90:564-571.
13.Tyfield,LA,Zschocke,J,Stephenson,A,Cockburn,F,Harvie,A,Bidwell,JL,Wood,NAP,Hunt,LP.(1995)Discordant phenylketonuria phenotypes in one family:the relationship between genotype and clinical outcome is a function of multiple effects.JMed Genet32:132-136.
14.Wood,NAP,Bidwell,JL.(1996)UHG:heteroduplex and universalheteroduplex generator analysis.In:Laboratory protocols for mutation detection(edLandegren,U),pp105-112.Oxford University Press for the Human Genome Organisation.
15.Wood,N,Bidwell,J.(1996)Genetic screening and testing by inducedheteroduplex formation.Electrophoresis17:247-254.
16.Wood,N,Standen,GR,Bowen,DJ,Cumming,A,Lush,C,Lee,R,Bidwell,J.(1996)UHG-based mutation screening in type2B von Willebrand's disease:-A-detectionof a candidate mutation Ser547Phe.Thrombosis&Haemostasis75:363-367.
17.Savage,DA,Tang,JP,Wood,NAP,Evans,J,Bidwell,JL,Wee,JLK,Oei,AA,Hui,KM(1996)A rapid HLA-DRB1*04subtyping method using PCR and DNAheteroduplex generators.Tissue Antigens47:284-292.
18.Jack,D,Bidwell,J,Turner,M,Wood,N.(1997)Simultaneous genotyping forall three known structural mutations in the human mannan-binding lectin gene.HumanMutation9:41-46.
19.Culpan,D,Standen,GR,Wood,N,Mazurier,C,Gaucher,C,Bidwell,JL(1997)Rapid mutation screening in Type2A von Willebrand's disease using universalheteroduplex generators.Brit J Haematol96:464-469.
20.Bowen,D,et al(1997)Genetic diagnosis of Factor V Leiden usingheteroduplex technology.Thrombosis and Haemostasis77:119-122.
21.Jackson,HA,Bowen,DJ,Worwood,M(1997)Rapid genetic screening forhaemochromatosis using heteroduplex technology.Br J Haematol98:856-859.
22.Tyfield,LA,Stephenson,A,Cockburn,F,Harvie,A,Bidwell,JL,Wood,NAP,PiIz,DT,Harper,P,Smith,I(1997)Sequence variation at the phenylalanine hydroxylasegene in the British Isles.Am J Hum Genet60:388-396.
23.Enayat,MS,Theophilus,BDM,Hill,FGH,Rose,PE1Culpan,D,Bidwell,J,Standen,GR(1998)A new candidate mutation(K755E)causing Type2A Von Willebrand'sdisease identified by UHG analysis.Br J Haematol79:240.
24.Culpan,D,Goodeve,A,Bowen,DJ,Standen,G,Bidwell,J(1988)Rapidgenotypic diagnosis of type2A von Willebrand's disease by heteroduplex analysis.Clin.Lab.Haem20:177-178.
25.Bowen,DJ,Standen,GR,Mazurier,C,Gaucher,C,Cumming,A,Keeney,S,Bidwell,J(1998)Type2N von Willebrand disease:rapid genetic diagnosis of G2811A(R854Q),C2696T(R816W),T2701A(H817Q)and G2823T(C858F)-detection of a novelcandidate type2N mutation:C2801T(R854W).Thromb Haemost80:32-36.
26.Morse,HR,Olomolaiye,OO,Wood,NAP,Keen,LJ and Bidwell,JL(1999)Induced heteroduplex genotyping of TNFa,IL-Ib,IL-6and IL-10polymorphismsassociated with transcriptional regulation.Cytokine11:789-795.
27.Wood,NAP,Thompson,SC,Smith,RM,Bidwell,JL(2000)Identification ofhuman TGF-b1signal(leader)sequence polymorphisms by PCR-RFLP.J ImmunolMethods234:117-122.
28.Bidwell,JL,Olomolaiye,00,Keen,LJ,Wood,NAP,Morse,HR,Laundy,GJ,Thompson,SJ(2000)Cytokine gene polymorphism.In:Human Blood Cells:Consequences of Genetic Polymorphism(Ed.King,M-J),pp375-400.Imperial CollegePress,London.
29.Wood,NAP,Keen,LJ,Tilley,LA,Bidwell,JL(2001)Determination ofcytokine regulatory haplotypes by induced heteroduplex analysis of DNA.J ImmunolMeth249:191-198.
30.Spink,CF,Keen,LJ,Middleton,PG,Bidwell,JL(2004)Discrimination ofsuballeles present at the TNFd microsatellite locus using Induced Heteroduplex Analysis.Genes and Immunity5:76-79.
31.Smith AJP,Keen LJ,Wood NAP,Elson CJ,Bidwell JL(2004)Haplotypeanalysis of IL1A,IL1B,IL1RN and IL1R1promoter SNPs.In:HLA2002.BlackwellMunksgaard,Denmark.
32.PhD thesis of NAP Wood dated November1995entitled"An Investigation ofthe Potential of Universal Heteroduplex Generators in Identification of Point MutationsWithin DNA",held in the library of the University of Bristol.
WO-A-93/19201和GB-A-2338062也涉及利用IHG技术进行的基因型分型。
上述专利文件及其它参考文献在此作为参考被引用以用于任何目的。
然而，应当注意：在本PCT专利申请的每个指定国中，上述专利文件及其它参考文献的内容并不一定是现有技术，因为现有技术状态是根据本国法律来进行判断的。因此，本文所引用的任何特定文件，对于目前该申请所包含的任何权利要求，或者通过将来的修正来引入的、或在任何后续申请或分案申请所包含或引入的、或在以该PCT专利申请为基础所提交的任何其它相应申请或进一步申请中所包含的或被引入的任何权利要求，都不认为是现有技术。
虽然利用IHG进行基因型分型简单易用，并且操作快速可靠，但仍期望能改进异源双链条带的分辨(resolution)，以便更容易地辨别等位基因特征性图谱。这将有助于，例如，缩短凝胶电泳时间。
发明概述
根据本发明，已经发现通过修饰IHG分子，以便使识别标记自与待进行基因型分型的多态性位点直接相邻的位置间隔开，可改善异源双链条带的分辨。出乎意料地发现，当使用这种修饰的IHG分子时，可显著改善诱导型异源双链的分辨。
因此，根据本发明的第一个方面，提供了一种IHG，其是包含至少一个对应于基因组DNA序列中的已知多态性位点的核苷酸位置的合成DNA序列，其特征在于：相对于所述基因组序列而言，所述合成DNA序列在与所述对应于已知多态性位点的核苷酸位置间隔至少一个碱基的距离的核苷酸位置处包含至少一个核苷酸替换、缺失和/或插入(本文称为：“识别标记”)，且其中位于所述对应于多态性位点的核苷酸位置与所述核苷酸替换、缺失和/或插入之间的核苷酸相对于所述基因组序列而言是未改变的，并且其中在所述基因组序列包含多个已知的多态性位点的情况下，识别标记与对应于每一个已知的多态性位点的核苷酸位置间隔至少一个碱基的距离。
根据本发明的IHG分子优选适合用于在基因组DNA的已知的多态性位点上检测一个或多个已知多态性(例如：遗传突变)，更具体地是适合用于IHG检测方法，其中就分辨异源双链的步骤(例如通过电泳)之后的条带分离而言，上述的IHG检测方法与其中IHG识别标记不与对应于所述已知的多态性位点的所述核苷酸位置间隔开的相应方法比较，可显著改善诱导型异源双链的分辨。
应当理解：本文所用的术语“已知的多态性位点”具体涉及利用IHG分子进行具体研究的多态性位点。基因组(野生型)DNA序列中的多态性位点是该DNA序列中相应于基因的已知等位基因变体中的遗传改变的位点的位置。这种遗传改变的位点可以是单碱基取代、插入或缺失，或连续的两个或多个取代、插入、添加或其组合。
应当理解：本文所用的用语“核苷酸位置”在其范围内包括核苷酸序列的任何相关的基因座，根据情况的需要，比如，举例来说，核苷酸序列的区域，核苷酸序列的区域被缺失的基因座，在核苷酸序列的区域之间的点，以及核苷酸序列的个别碱基。
举例来说，在多态性位点包含位于等位基因变体中的单碱基改变的情况下，IHG包含对应于该多态性位点的单核苷酸位置，而IHG分子中的识别标记从该核苷酸位置被移开至少一个碱基。在多态性位点包含连续三个碱基改变的情况下，IHG包含对应于所述多态性位点的三个连续核苷酸位置，并且IHG分子中的识别标记从这组三个核苷酸位置被移开至少一个碱基。
在另一个实例中，在多态性位点包含位于等位基因变体中的单碱基缺失的情况下，IHG包含对应于所述多态性位点的单核苷酸位置，并且IHG分子中的识别标记从该核苷酸位置被移开至少一个碱基。在多态性位点包含三个连续碱基缺失的情况下，IHG可包含对应于该多态性位点的三个连续核苷酸位置，并且IHG分子中的识别标记从这组三个核苷酸位置的序列中被移开至少一个碱基。
在更进一步的实例中，在多态性位点包含位于等位基因变体中的单碱基插入的情况下，IHG包含跨越所述多态性位点的一对核苷酸位置，并且IHG分子中的识别标记从这些核苷酸位置被移开至少一个碱基。在多态性位点包含三个连续碱基插入的情况下，IHG可包含跨越该多态性位点的五个核苷酸位置，并且IHG分子中的识别标记从这组三个核苷酸位置被移开至少一个碱基。
多态性位点可包含连续取代、插入或缺失的组合。在所有情况下，识别标记与对应于所述多态性位点的连续元件的该组核苷酸位置间隔至少一个碱基。
根据本发明的第二个方面，提供了用于在靶基因序列及其相对应的IHG分子之间形成诱导型异源双链的方法，所述方法包含：
(a)提供IHG分子群体；
(b)提供靶基因序列群体；以及
(c)在适于形成异源双链的条件下将(a)和(b)的相应群体进行组合；
其中IHG分子符合本发明的第一个方面。
可通过扩增IHG和靶基因序列来获得IHG分子和靶基因序列的群体。一种众所周知的适宜扩增方法是PCR。
在本发明的方法方面，可在适当的支持物上分辨诱导型异源双链(例如通过电泳)，然后分析来确定靶基因序列的基因型。与其中IHG识别标记不与对应于已知多态性位点的核苷酸位置间隔开的相应方法比较，根据本发明所形成的诱导型异源双链的分辨，特别是例如通过电泳分离异源双链的步骤之后的条带的分离，是改善的、优选是显著改善的。
根据本发明的第三个方面，提供本发明第一个方面的IHG分子用于改善诱导型异源双链在合适支持物上(例如通过电泳)的分辨的用途，与其中IHG识别标记不与对应于已知多态性位点的核苷酸位置间隔开的相应方法比较，本发明可改善所述分辨。分辨改善可以是异源双链所对应的条带在支持物上的分离得到改善。
因此本发明的方法可用来预测人类对象将易感于与设计的IHG所针对的多态性有关的特定遗传学状况或病症的可能性。因此，在另一个方面，本发明涉及用于预测与特定基因型有关的特定状况或病症的存在、不存在、存在或不存在的可能性、或其严重度的方法。在这种方法中，可从个体获得核酸样品，并且必要时，可研究多态性位点的特性直至所需要的理解水平。通常这要求一个特定碱基或碱基序列的存在或不存在可与特定的遗传病症或状况有关。然后可以基因组DNA序列中多态性位点的知识为基础来构建本发明的第一个方面的IHG。使用这种IHG，实施根据本发明第二个方面的方法，和/或使用根据本发明的第三个方面的IHG，并且对所分辨的诱导型异源双链进行分析来预测个体中特定状况或病症的的存在、不存在、存在或不存在的可能性、或其严重度。
根据本发明的第四个方面，提供了一种试剂盒，其包含根据本发明第一个方面的IHG、适于IHG的正向和反向引物，并任选地包含对照DNA序列与使用说明书。
附图简述
提供的附图仅仅用于解释说明，而不是用于限制本发明的范围。
图1举例说明：使用现有技术中的IHG(IHG0)和本发明的IHG(IHG1、IHG2和IHG3)，对IL-10基因的启动子的"-1082"多态性进行基因型分型中所得到的异源双链图。
图2举例说明：使用现有技术中的IHG(IHGO)和本发明的IHG(IHG1和IHG2)，对肿瘤坏死因子(TNF)基因的启动子的"-238"多态性进行基因型分型的异源双链图。
发明详述
根据本发明，相对于基因组序列而言，合成DNA序列在与对应于已知多态性位点的核苷酸位置间隔至少一个碱基的距离的核苷酸位置处包含至少一个核苷酸替换、缺失和/或插入，且其中位于所述对应于多态性位点的核苷酸位置与所述核苷酸替换、缺失和/或插入之间的核苷酸相对于所述基因组序列而言是未改变的。在基因组序列包含多个已知的多态性位点的情况下，识别标记与对应于每一个已知的多态性位点的核苷酸位置间隔至少一个碱基的距离。
核苷酸取代、缺失和/或添加距离对应于已知多态性位点的核苷酸位置的间隔优选最多达约十个碱基，更优选最多达约八个碱基，例如从1到约6个碱基，最优选选自1、2、3、4、5或6中任何数目的碱基。当有两个或更多个已知的多态性位点时，优选最多达10个碱基的间隔涉及的是与识别标记最接近的多态性位点。
根据本发明的一个具体实施方式，通过分析受试者，通常是受试人的遗传物质来确定其基因的特定位点上的特定单核苷酸多态性(SNP)相关的基因型。包含SNP的基因至少具有两个等位基因，其在本文中指作为参照等位基因和等位基因变体。已经任意指定了参照的等位基因(原型或野生型等位基因)，它通常对应于保藏于GenBank或TIGR的具有给定登录号的基因的核苷酸序列。等位基因变体在基因中的SNP位点或多个SNP位点中每一个含有核苷酸变体(即：与参照等位基因的相应位点不同的核苷酸)。
在使用IHG技术进行基因型分型中，从受试者处获得核酸样品，扩增含有多态性位点的基因节段来提供携带基因节段序列的扩增子群体。一般地，使用位于所述基因节段两侧翼区的引物对，通过PCR实施扩增该基因节段。选择适合的引物，这些引物对所研究的基因节段具有特异性。选择引物来扩增长度在大约90到400个碱基的基因节段，优选长度是大约100到150个碱基对。一般优选多态性位点位于基因节段的中心区域，即大约在基因节段的中间三分之一区域。众所周知，基因节段的PCR扩增将产生双链扩增子群体。可在WO93/19201中得到用于PCR扩增的方法的更多细节。
当检测的核酸是哺乳动物基因组DNA时，从个体或其它希望研究的具有特定特征的基因型的对象处获得DNA的样品。(术语“个体”意指包括胎儿。)可从所有有核细胞中提取DNA。一般地，为了方便，从外周血液细胞中获得DNA。可从胎盘细胞或羊水中获得胎儿DNA。DNA的其它来源包括毛囊、干尸等。可通过任何适当的方法分离DNA，例如通过Miller等人所描述的快速盐析法(Miller,S.,Dykes,D.和Polesky,H.(1988)"A simple salting out procedure for extracting DNA from humannucleated cells"；Nucl.Acids Res.16:1215)。另外，可以mRNA反转录成的cDNA的形式来分离DNA。
也提供了IHG分子群体，其具有对应于所述基因节段的、但被修饰的序列，如此处所述修饰引入了受控的核苷酸取代、缺失、添加或其组合。一般地，通过扩增例如使用PCR，来制备IHG组。再者，可在WO93/19201中得到用于PCR扩增的方法的更多细节。选择用于PCR的引物来扩增IHG分子。PCR扩增将产生双链IHG扩增子群体。IHG优选在长度上与所考虑的基因节段基本上相同(不考虑IHG的任何必要的插入或缺失的碱基)，或可能是不同的长度，例如比基因节段更短或更长。然而，如果基因节段和IHG具有不同的长度(不考虑IHG的任何必要的插入或缺失的碱基)，则必须在基因节段和IHG的扩增群体之间有足够的重叠度以允许形成异源双链。分别用于扩增IHG和基因节段的引物可以是相同的或不同的。但是，一般地使用相同的引物，可得到具有基本上相同长度的扩增IHG和基因节段(不考虑IHG的任何必要的插入或缺失的碱基)。如在WO93/19201中所教导的，可标记引物。
可在相同的或分开的小管中完成基因节段和IHG的PCR扩增(分别是“混合的”或“分开的”PCR)。优选分开地进行扩增，然后把基因节段和IHG的扩增群体组合或集中以便使异源双链的形成得以进行。
例如在WO-A-93/19201中所述，首先加热IHG和基因节段的组合群体以便将双链DNA分开成单链DNA，然后冷却来允许异源双链形成，从而完成在IHG和包含多态性位点的基因节段的组合之间的异源双链的形成。
根据影响它们表观分子量而不是其实际分子量的分子构象来分离形成的异源双链。这可能通过例如电泳来实现。一般在不会完全变性核酸的凝胶中进行分离，例如非变性聚丙烯酰胺凝胶。在实现所需的异源双链的分辨程度的条件下进行电泳。分离"表观尺寸"(由其不同分子构象所引起)的差异小至大约10bp双链的分辨程度通常是足够的。也可在凝胶中电泳分子量标记物(size marker)来用于评估泳动性并从而评估双链的表观尺寸。另外，或可替代性地，还可以利用PCR来分开扩增具有与所研究基因的已知等位基因相对应的序列的对照DNA分子，并使之与所使用的IHG形成异源双链，然后在凝胶中电泳所得的样品以便在凝胶上为所产生的不同异源双链来提供标记物。
异源双链的分布，即其分辨图谱是等位基因特异性的。然后可显示该分辨图谱或PCR指纹。在PCR引物已经被标记的情况下，可显示该标记。将携带分离的标记双链的底物与检测标记存在的试剂相接触。在未标记PCR引物的情况下，将携带PCR指纹的底物与例如溴化乙锭或SYBRTM绿(购自Molecular Probe)相接触，并在紫外光下显示核酸片段；或者，可用银染法来显示异源双链。
以上论述对以本领域众所周知的方式如何发展利用IHG技术进行基因型分型的技术进行了一般概括。通过提供修饰的IHG分子，本发明提供了对现有技术的改进，其中所述IHG分子中的所谓的“识别标记”被从对应于所研究的多态性位点的位置移开。如上所述，对IHG的DNA序列进行修饰，从而在与对应于已知多态性位点的核苷酸位置间隔至少一个碱基的距离的核苷酸位置处，引入至少一个核苷酸的取代、缺失和/或插入，而在所述对应于多态性位点的核苷酸位置与所述核苷酸取代、缺失和/或插入之间的位置上的核苷酸则相对于所述基因组序列而言是未改变的。
所提供的IHG分子可以是双链或单链DNA分子。如果该分子长度小于大约150bp，优选使用单链DNA。在下面的论述中，术语“碱基”和“碱基对”都被使用；它们并未严格地仅指IHG的单链或双链形式之一，而是以适当的已知修饰形式适用于两种中的任一形式。在根据本发明的方法中，使用例如PCR来扩增初始分子。按照惯例，和如此处所使用的，指的是IHG的“编码”链的序列。在IHG中，“编码”链对应于基因组DNA的编码链，其中设计IHG来模拟所述基因组DNA。“对应”意指除了能引起有意错配、并因此导致形成诱导型异源双链的有意的缺失、取代和/或添加以外，IHG具有基因组DNA序列，而所设计的IHG用来有效模拟所述基因组DNA序列。特别需要注意的是：在研究区域外，IHG序列与基因组DNA的序列之间的精确杂交一致性对于实施本发明而言并不重要，本发明也不因此受到限制。如果在IHG和基因组DNA之间的相应序列之间存在变异，则仍可获得可行的系统。实际上，在某些情况下，期望在IHG和基因组DNA之间构建的有意错配，例如在分辨所得的异源双链中产生特定期望的效果。当然，这种有意的错配不会大到阻止有效杂交来形成异源双链。
在IHG中，在对应于多态性位点的位置上的核苷酸，可能与野生型基因组DNA的核苷酸相同，或与等位基因变体的核苷酸相同。
本发明可适合于在给定基因节段中探查多于一个的多态性位点。因此，例如当基因节段包含两个或多个彼此相对接近的多态性位点时(例如彼此在大约300碱基对之内)，可设计IHG来鉴定不同的等位基因的组合，并因此包含相应于每个多态性位点的“识别标记”序列。在IHG包含两个或多个构建了有意错配的位点的情况下，异源双链条带的可能模式的数目将增加，但是理论上，通过利用适当的对照数据可分析和解释任何等位基因组合的条带模式。
当识别标记是碱基对缺失，并且设计IHG以引入单个错配位点时，该缺失可能是与基因组DNA序列相关的单个缺失或一连串碱基对缺失。一般地，缺失DNA的长度从1到大约10个碱基对，例如从大约2到大约6个碱基对。
当识别标记是碱基对取代，并且设计IHG以引入单个错配位点时，该取代可能是与基因组DNA序列相关的单个取代或一连串碱基对取代。一般地，取代DNA的长度从1到大约10个碱基对，例如从大约2到大约6个碱基对。
当识别标记是碱基对插入，并且设计IHG以引入单个错配位点时，该插入可能是与基因组DNA序列相关的单个插入或一连串碱基对插入。一般地，插入DNA的长度从1到大约10个碱基对，例如从大约2到大约6个碱基对。
当IHG包含两个或多个错配位点时，每个识别标记长度至少是一个碱基对，一般地在1到大约5个碱基对之间，例如在长度上大约2或3个碱基对。在两个或多个识别标记中间缺失、取代或插入的组合长度可达到基因组靶总长度的10％，一般是基因组靶总长度的3％。
识别标记也可由相对于基因组序列的缺失、取代或插入的组合所组成。
目前，优选修饰是碱基对插入。优选的插入物是相同的碱基序列，例如一连串A或G核苷酸，最优选一连串A核苷酸。但是，插入物可以是不同碱基的组合。
可通过现有技术中众所周知的方法来人工合成本发明的IHG分子，例如参见WO93/19201中所述。
本发明的实施方式
实施例1
本实施例举例说明了本发明在检测IL-10基因中的-1082多态性中的应用。
如下所示为用于-1082多态性PCR的引物序列：
正向引物：AATCCAAGACAACACTACTAAGGC
反向引物：CTGGATAGGAGGTCCCTTAC
依照现有技术合成了具有如下序列的第一个IHG(IHG0)：
IHG0
AATCCAAGACAACACTACTAAGGCTTGTTTGGGAGA*AAAAGGGGAAGTAGGGATAGGTAAGAGGAAAGTAAGGGACCTCCTATCCAG
用粗体和星号(*)所指示的"A"残基是多态性的位点。下划线强调的四个“A”残基串表示插入残基的序列，其当作“识别标记”。
也合成了依照本发明的IHG分子，如下：
IHG1
AATCCAAGACAACACTACTAAGGCTTGTTTGGGAGA*GAAAAGGGAAGTAGGGATAGGTAAGAGGAAAGTAAGGGACCTCCTATCCAG
IHG2
AATCCAAGACAACACTACTAAGGCTTGTTTGGGAGA*GGAAAAGGAAGTAGGGATAGGTAAGAGGAAAGTAAGGGACCTCCTATCCAG
IHG3
AATCCAAGACAACACTACTAAGGCTTGTTTGGGAGA*GGGAAAAGAAGTAGGGATAGGTAAGAGGAAAGTAAGGGACCTCCTATCCAG
除了四个识别性“A”残基的序列已经分别从多态性位点移开了1、2或3个碱基(向右，如图所示)之外，IHG1、IHG2和IHG3具有与IHG0相同的序列。
在20μl总反应体积中进行PCR扩增，其包含100ng基因组DNA或IHG、0.5U Taq聚合酶(Advanced Biotechnologies)、5μM的各种引物(正向和反向的)、1.5mM MgCl2、200μM的各种dNTP、67mM Tris-HCl(pH8.8)、16mM(NH4)2SO4和0.01％Tween。在MJ-PTC-100热循环仪(GRI,Braintree,UK)上进行PCR优化。基因组DNA和IHG的PCR参数如下：在95℃预变性5分钟，随后32个循环的95℃下30秒钟、55℃下1分钟、72℃下30秒钟，再在72℃下最终延伸5分钟。
组合并杂交配对PCR产物。
杂交配对的参数是：95℃下2分钟，随后初始控制冷却步骤到65℃(温度变化速率＝1.0℃/s)，并保持1分钟。加入第二个控制冷却步骤至45℃(温度变化速率＝0.1℃/s)，并保持1分钟，最后的保温步骤在6℃。
在15％的非变性聚丙烯酰胺凝胶(National Diagnostics，Hull，英国)中利用“三倍宽(triple wide)”微型胶系统(30cm×8cm；CBS Scientific Company，Del Mar,美国)来分辨异源双链，其中凝胶组成为37.5:1(w/v丙烯酰胺:双丙烯酰胺)。在300V下电泳90分钟。用含0.5μg/ml溴化乙锭的1×Tris硼酸盐EDTA(TBE)缓冲液对凝胶进行后染色(post-stain)，并使用302nm UV透视仪进行检测。使用EDAS120系统(Kodak)得到分析用的图象。
获得的结果如图1所示。可见，当将识别标记从多态性位点移开后(而非与多态性位点直接相邻)(即IHG1、IHG2和IHG3)，异源双链条带的分离得到了改善。通过聚丙烯酰胺凝胶产生了异源双链条带的更大的分离，这使得能够在缩短的凝胶电泳时间内鉴定等位基因，因为等位基因的特异性图谱更易于辨别。在本实验中，IHG2获得了条带的最适分离和等位基因特异性图谱的最适辨别。
实施例2
本实施例举例说明了本发明在检测肿瘤坏死因子(TNF)基因启动子-238多态性中的应用。使用下列引物和IHG分子来进行实施例1相同的实验步骤：
TNF左侧引物：GTTCAGCCTCCAGGGTCCTACACA
TNF右侧引物：GGGATTTGGAAAGTTGGGGACACA
IHG0
GTTCAGCCTCCAGGGTCCTACACACAAATCAGTCAGTGGCCCAGAAGACCCCCCTCAGAATCG*AAAAGAGCAGGGAGGATGGGGAGTGTGAGGGGTATCCTTGATGCTTGTGTGTCCCCAACTTTCCAAATCCC
用粗体和由星号(*)所指示的"G"残基是TNF中-238SNP的位点。下划线强调的四个“A”残基列表示插入残基的序列，其当作“识别标记”。
还合成了如下的本发明的IHG分子：
IHG1
GTTCAGCCTCCAGGGTCCTACACACAAATCAGTCAGTGGCCCAGAAGACCCCCCTCAGAATCG*GAAAAAGCAGGGAGGATGGGGAGTGTGAGGGGTATCCTTGATGCTTGTGTGTCCCCAACTTTCCAAATCCC
IHG2
GTTCAGCCTCCAGGGTCCTACACACAAATCAGTCAGTGGCCCAGAAGACCCCCCTCAGAATCG*GAGAAAACAGGGAGGATGGGGAGTGTGAGGGGTATCCTTGATGCTTGTGTGTCCCCAACTTTCCAAATCCC
除了四个识别性“A”残基的序列已经分别从多态性位点移开了2或3个碱基(向右，如图所示)以外，IHG1和IHG2具有与IHG0相同的序列。
杂交配对的参数是：95℃下2分钟，随后初始控制冷却步骤到65℃(温度变化速率＝1.0℃/s)，并保持1分钟。在45℃插入第二个控制冷却步骤(温度变化速率＝0.1℃/s)，并保持1分钟，最后的保温步骤在6℃。
图2显示了使用三个不同IHG试剂的两个基因组DNA样品杂交配对的结果，一个是GG变体，另一个是GA变体。显示了在该基因座的三个可能基因型中的两个。泳道1和泳道2显示两个基因组DNA样品与IHG0杂交配对的结果--该IHG试剂具有由与多态性位点直接相邻的4个“A”残基所组成的识别标记。当相同的两个基因组DNA样品与IHG1和IHG2杂交配对(具有分别位于与多态性位点距离2和3个碱基位置的识别标记)时，泳道2-3和泳道4-5显示了所获得的异源双链带型。结果显示将识别性"A"残基移到距离多态性位点2个碱基处，具有有益的效果，与跟IHG0杂交配对相比，更容易辨别跟IHG1杂交配对所获得的等位基因-特异性的带型。当将识别标记移到距离多态性位点3个碱基处时，未发现条带的分离得到进一步的增加。在该情况下，以IHG1获得了最佳分离。
上述内容概括地描述了本发明，而非进行限制。对于本领域普通技术人员来说是显而易见的变化和修饰，都包含在本申请和后续专利的范围中。

Claims (35)

1.一种IHG，其是包含至少一个对应于基因组DNA序列中的已知多态性位点的核苷酸位置的合成DNA序列，其特征在于：相对于所述基因组序列而言，所述合成DNA序列在与所述对应于已知多态性位点的核苷酸位置间隔至少一个碱基的距离的核苷酸位置处包含至少一个核苷酸替换、缺失和/或插入，且其中位于所述对应于多态性位点的核苷酸位置与所述核苷酸替换、缺失和/或插入之间的核苷酸相对于所述基因组序列而言是未改变的。
2.根据权利要求1中所述的IHG，其中在基因组DNA序列中的多态性位点是单核苷酸多态性(SNP)。
3.根据权利要求1或2中所述的IHG，其中相对于所述基因组序列而言，所述合成DNA中所包含的至少一个核苷酸取代、缺失和/或插入包括一个或多个碱基的插入。
4.根据权利要求3中所述的IHG，其中相对于所述基因组序列而言，所述合成DNA中所包含的至少一个核苷酸取代、缺失和/或插入由一个或多个碱基的插入组成。
5.根据权利要求3或4中所述的IHG，其中插入是一连串相同的碱基的插入。
6.根据权利要求5中所述的IHG，其中所述相同的碱基是A核苷酸。
7.根据权利要求6中所述的IHG，其中所述相同的碱基是G核苷酸。
8.根据权利要求1或2中所述的IHG，其中相对于所述基因组序列而言，所述合成DNA中所包含的至少一个核苷酸取代、缺失和/或插入包括一个或多个碱基的缺失。
9.根据权利要求8中所述的IHG，其中相对于所述基因组序列而言，所述合成DNA中所包含的至少一个核苷酸取代、缺失和/或插入由一个或多个碱基的缺失组成。
10.根据前述权利要求中任何一项所述的IHG，其中所述合成DNA序列是单链的。
11.根据权利要求1到9中任何一项所述的IHG，其中所述合成DNA序列是双链的。
12.根据前述权利要求中任何一项所述的IHG，其中在不考虑IHG中的任何插入或缺失的碱基的情况下，所述合成DNA序列的长度与所研究的基因组DNA的基因节段基本上相同。
13.根据权利要求1到11中任何一项所述的IHG，其中在不考虑IHG中的任何插入或缺失的碱基的情况下，所述合成DNA序列的长度不同于所述研究的基因组DNA的基因节段的长度。
14.包含多个根据上述权利要求中任何一项所述的IHG的IHG群体。
15.根据权利要求14中所述的IHG群体，其中群体是利用PCR扩增的产物。
16.DNA异源双链，其包含与包含所述已知多态性位点的基因组DNA杂交的权利要求1到13中任何一项所述的IHG分子。
17.根据权利要求16中所述的DNA异源双链的群体。
18.一种用于在靶基因序列和对应于所述靶基因序列的IHG分子之间形成诱导型异源双链的方法，所述的方法包括：
(a)提供根据权利要求14或权利要求15中所述的IHG群体；
(b)提供所述靶基因序列群体；以及
(c)在适于异源双链形成的条件下将(a)和(b)的相应群体进行组合。
19.一种用于对靶基因序列进行基因型分型的方法，包括通过根据权利要求18中所述的方法形成诱导型异源双链，在适当的支持物上分辨所述诱导型异源双链，并且分析所分辨的诱导型异源双链来确定靶基因序列的基因型。
20.根据权利要求19中所述的方法，其中利用电泳来进行诱导型异源双链的分辨。
21.一种预测生物体例如人或其它哺乳动物受试个体易感于与特定基因型相关的特定遗传状况或病症的可能性的方法，该方法包含：根据权利要求19或权利要求20，对被认为与遗传状况或病症有关的生物体靶基因序列进行基因型分型，并且分析基因型分型的结果来预测生物体中所述特定状况或病症的存在或不存在、存在或不存在的可能性、或严重程度。
22.根据权利要求21的方法，其中在基因的特定位置上针对特定的单核苷酸多态性(SNP)来进行基因型分型。
23.一种试剂盒，包含根据权利要求14或权利要求15中所述的IHG群体、和用于所述IHG的正向和反向引物。
24.根据权利要求23中所述的试剂盒，其还包含对照DNA序列和/或使用说明书。
25.根据权利要求23或权利要求24中所述的试剂盒，用于根据权利要求19到22中任何一项所述的方法。
26.一种用于对IL-10基因的启动子中的“-1082”多态性进行基因型分型的IHG，其具有以下序列：
AATCCAAGACAACACTACTAAGGCTTGTTTGGGAGAGAAAAGGGAAGTAGGGATAGGTAAGAGGAAAGTAAGGGACCTCCTATCCAG。
27.一种用于对IL-10基因的启动子中的"-1082"多态性进行基因型分型的IHG，其具有以下序列：
AATCCAAGACAACACTACTAAGGCTTGTTTGGGAGAGGAAAAGGAAGTAGGGATAGGTAAGAGGAAAGTAAGGGACCTCCTATCCAG。
28.一种用于对IL-10基因的启动子中的"-1082"多态性进行基因型分型的IHG，其具有以下序列：
AATCCAAGACAACACTACTAAGGCTTGTTTGGGAGAGGGAAAAGAAGTAGGGATAGGTAAGAGGAAAGTAAGGGACCTCCTATCCAG。
29.一种用于对肿瘤坏死因子基因中的“-238”多态性进行基因型分型的IHG，其具有以下序列：
GTTCAGCCTCCAGGGTCCTACACACAAATCAGTCAGTGGCCCAGAAGACCCCCCTCAGAATCGGAAAAAGCAGGGAGGATGGGGAGTGTGAGGGGTATCCTTGATGCTTGTGTGTCCCCAACTTTCCAAATCCC。
30.一种用于对肿瘤坏死因子基因中的“-238”多态性进行基因型分型的IHG，其具有以下序列：
GTTCAGCCTCCAGGGTCCTACACACAAATCAGTCAGTGGCCCAGAAGACCCCCCTCAGAATCGGAGAAAACAGGGAGGATGGGGAGTGTGAGGGGTATCCTTGATGCTTGTGTGTCCCCAACTTTCCAAATCCC。
31.一种基本上如实施例和附图所述的IHG或其群体。
32.一种基本上如实施例和附图所述的DNA异源双链或其群体。
33.一种基本上如实施例和附图所述的、用于在靶基因序列和对应于所述靶基因序列的IHG分子之间形成诱导型异源双链的方法。
34.一种基本上如实施例和附图所述的、用于对靶基因序列进行基因型分型的方法。
35.一种基本上如实施例和附图所述的、预测生物体例如人或其它哺乳动物受试个体对于与特定基因型相关的特定遗传状况或病症的易感性的方法。
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Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB2435326A (en) * 2006-02-15 2007-08-22 Cell Analysis Ltd Heteroduplex analysis of non-human analytes
NZ607326A (en) 2010-08-27 2015-01-30 Universitaetsklinikum Muenster Means and methods for the detection of a predisposition of a female subject to recurrent pregnancy loss (rpl), preeclampsia (pe) and/or fetal growth restriction (fgr)
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Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5352402A (en) * 1989-10-23 1994-10-04 Nissei Asb Machine Co., Ltd. Method and apparatus for manufacturing biaxially oriented, thermally stable, blown containers
GB9206567D0 (en) * 1992-03-25 1992-05-06 Univ Bristol Dna analysis
JPH10175252A (ja) * 1996-12-19 1998-06-30 Tahara:Kk 延伸吹込成形用射出プリフォームの温度調節方法及びその装置
GB9809063D0 (en) * 1998-04-29 1998-06-24 Univ Wales Medicine Heteroduplex analysis

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CAROLINA BELLI等: "A single, multiplex analysis for all relevant activating NRAS gene mutations using heteroduplex generators", 《BRITISH JOURNAL OF HAEMATOLOGY》 *
NIGEL WOOD等: "Genetic screening and testing by induced heteroduplex formation", 《ELECTROPHORESIS》 *
方向明等: "白介素－10基因多态性与术后脓毒症发生发展的相关研究", 《中国危重病急救医学》 *
顾绍庆等: "肿瘤坏死因子-α基因多态性与乙型肝炎病毒宫内感染易感性的关系", 《中华肝脏病杂志》 *

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