CN117625776A - 检测先天性扩心病发生风险的物质及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了检测先天性扩心病发生风险的物质及其应用,所述物质包括引物:5’‑TAATTAGTGAGCTTGTCACAAACTA‑3’;5’‑TGGAGCAATAAAGTTTGAAGAACTT‑3’。本发明提供的突变基因DMD新位点(c.31+1G>T,rs398123923)可以作为临床辅助诊断的生物标志物,对携带者进行风险评估,对先天性扩心病的早期诊断,筛查、辅助筛查或者辅助临床判断具有重要意义。基于突变基因DMD新位点(c.31+1G>T,rs398123923)的试剂开发的试剂,能够将携带c.31+1G>T突变的患者和正常人群区分开,可以为受试者提供优生优育指导和遗传咨询。
Description
技术领域
本发明属于生物遗传学技术领域,公开了与先天性扩心病发生风险相关的一个新的突变位点及其检测方法,该位点位于DMD基因,发生的突变为c.31+1G>T,rs398123923。
背景技术
先天性扩心病是一种罕见的心脏疾病,婴儿出生时就患有。它导致心脏的左心室和/或右心室扩大,使心脏无法有效泵血,最终可能导致患者因心力衰竭而死亡。通过使用高通量测序技术,研究人员已经鉴定出与先天性扩心病相关的多个基因,然而,仍有许多先天性扩心病患者无法明确致病基因,新的致病基因有待被发现。为此,需要优化现有基因检测方法,提供新的与先天性扩心病发病风险相关的基因和突变位点。
发明内容
针对现有问题的不足,本发明的目的是提供一种先天性扩心病风险相关DMD基因突变位点。
本发明解决其技术问题采用的技术方案是:
第一方面,本发明提供一个先天性扩心病风险相关DMD基因突变位点(c.31+1G>T,rs398123923)。
具体地,本发明通过对先天性扩心病患者及其家系成员进行分析,结果发现,该突变位点位于DMD基因肌肉特异性转录本亚型的第一外显子和第一内含子的接头处。其基因型在不同物种中具有高度的保守性。该位点位于第一内含子的供体序列上,RNA SplicerAI模型预测结果提示该位点引起DMD基因肌肉亚型转录本的剪切位点后移,导致移码突变,使得M亚型Dstrophin蛋白的表达完全缺失。即如果Sanger测序结果显示rs398123923位点检测到等位基因G则为野生型,如果检测到等位基因T则为突变型,提示被检者可能具有先天性扩心病的发病风险。
具体地,所述DMD基因的核苷酸序列如SEQ ID No:1所示;所述DMD基因编码的蛋白如SEQ ID No:2所示。
第二方面,本发明保护检测DMD基因突变位点的物质在制备筛查或辅助筛查先天性扩心病的产品中的应用。
第三方面,本发明保护检测DMD基因突变位点的物质在制备诊断或辅助诊断先天性扩心病的产品中的应用。
第四方面,本发明保护检测DMD基因突变位点的物质在制备预测先天性扩心病患病风险的产品中的应用。
在具体的实施方案中,所述突变位点为c.31+1G>T,rs398123923。
优选的,如果Sanger测序结果显示rs398123923位点检测到等位基因G则为野生型,如果检测到等位基因T则为突变型。
在具体的实施方案中,所述产品包括系统,所述系统包括试剂和/或仪器,所述试剂包括芯片、试剂或试剂盒。
在具体的实施方案中,所述物质包括检测DMD基因或基因片段的引物。
优选的,所述引物如下:
前引物:5’-TAATTAGTGAGCTTGTCACAAACTA-3’;
后引物:5’-TGGAGCAATAAAGTTTGAAGAACTT-3’。
第五方面,本发明保护一种检测先天性扩心病的产品,所述产品包括如下任一种:
(B1)检测编码DMD突变位点的基因或基因片段的引物;
(B2)含有(B1)引物的检测试剂;
(B3)含有(B1)引物或(B2)检测试剂的试剂盒。
在具体的实施方案中,所述引物如下:
前引物:5’-TAATTAGTGAGCTTGTCACAAACTA-3’;
后引物:5’-TGGAGCAATAAAGTTTGAAGAACTT-3’。
第六方面,本发明提供一种检测先天性扩心病的方法,包括如下步骤:
(1)收集被检者血液、组织等,提取基因组DNA。
(2)配制PCR体系,并进行扩增。
PCR引物如下:5’-TAATTAGTGAGCTTGTCACAAACTA-3’(前引物),5’-TGGAGCAATAAAGTTTGAAGAACTT-3’(后引物)。
PCR反应程序设定如下:95℃预变性5min;95℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸20s,共35循环。72℃终延伸5min。
(3)Sanger测序。
将步骤(2)中得到的PCR产物进行Sanger测序,对突变位点进行基因分型。
结果分析:如果Sanger测序结果显示rs398123923位点检测到等位基因G则为野生型,如果检测到等位基因T则为突变型,提示被检者可能具有先天性扩心病的发病风险。
有益效果
本发明有益效果如下:
本发明提供的突变基因DMD新位点(c.31+1G>T,rs398123923)可以作为临床辅助诊断的生物标志物,对携带者进行风险评估,对先天性扩心病的早期诊断,筛查、辅助筛查或者辅助临床判断具有重要意义。基于突变基因DMD新位点(c.31+1G>T,rs398123923)的试剂开发的检测试剂盒,能够将携带c.31+1G>T突变的患者和正常人群区分开,可以为受试者提供优生优育指导和遗传咨询。
附图说明
图1为先天性扩心病患者家系图谱。
图2为全外显子测序结果致病突变筛选流程图。
图3为(A)c.31+1G>T,rs398123923突变位点位于DMD基因M亚型第一外显子和第一内含子的接头处;在不同物种中具有高度保守性(B)。
图4为突变对不同转录本亚型的影响。(A)DMD基因各种转录本的起始位置;(B)该突变位点可能引起第一内含子的剪切位点后移;(C)生物信息工具预测该位点对肌肉亚型M型转录本的影响;(D)生物信息工具预测该位点对脑亚型C型转录本的影响。
图5为实施例1患者检测到的DMD c.31+1G>T变异。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明做进一步详细说明。所用试剂或者仪器设备未注明生产厂商的,均视为可以通过市场购买的常规产品。
试剂来源:PCR预混液:2×Taq MasterMix(Dye Plus),购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司,货号:P112-AA。扩增用引物均委托金斯瑞生物科技股份有限公司合成。血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(离心柱型):购自天根生化科技(北京)有限公司,Cat.#DP304-03。
实施例1:致病突变点位DMD(c.31+1G>T,rs398123923)验证实验
在临床诊断为扩心病患者及其家属自愿签署知情同意书的前提下,寄送5-10mL人类全血EDTA抗凝样本,建立病历资料库,详细记录患者病情、家系情况等资料。本研究已得到本单位伦理委员会批准。
S1、提取基因组DNA:对患者的人类全血EDTA抗凝样本进行全基因组DNA的提取,采用天根生化科技(北京)有限公司血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(离心柱型),操作步骤按照产品说明书进行。对DNA的浓度和纯度进行检测,作为PCR扩增的模板DNA。
S2、准备PCR反应体系:该PCR反应体系用于扩增包含目的基因位点在内的一段DNA序列,其组成为:PCR预混液25μL、正向引物(10μM)2μL、反向引物(10μM)2μL、模板DNA<1000ng,加ddH2O补至50μL。所用的正、反向引物信息如下:
正向引物:5’-TAATTAGTGAGCTTGTCACAAACTA-3’;
反向引物:5’-TGGAGCAATAAAGTTTGAAGAACTT-3’。长度:171bp。
S3、扩增目的片段:将反应体系混合,在PCR仪上进行目的基因片段的扩增反应,扩增程序为:95℃预变性5min;95℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸20s,共35循环。72℃终延伸5min。
S4、PCR产物的检测:取2μL的PCR产物,使用2%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物,选用500bp Marker作为参考,检测验证扩增产物为预期的大小。
S5、使用Applied Biosystems 3500Dx系列基因分析仪对扩增产物进行Sanger测序。
S6、测序结果进行生物信息学分析:将测序结果和在NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中获取的野生型DMD基因序列在软件Chromas中进行序列比对,确定检测位点是否发生变异。
S7、基因变异论证:患者检测到DMD c.31+1G>T变异,即与野生型DMD基因的参考序列相比,变异基因DMD c.31+1位碱基G突变为碱基T.Sanger测序图如图5所示。
检索千人基因组(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/variation/tools/1000genomes/):无。
ClinVar(https://www.snpedia.com/index.php/ClinVar):无。
ESP6500(https://esp.gs.washington.edu/d rupal/):无。
ExAC(http://exac.hms.harvard.edu/):无。
HGMD(http://www.hgmd.c.ac.uk/ac/index.php):无。
本地人群数据库中的扩心病病患者和对照人群均未携带该变异。
采用多个生物信息预测软件(包括SIFT,Polyphen,MutationTaster,CADD)交叉预测,有分值的软件中有一半支持该位点可能有害。(MutationTaster为“1,D”,CADD为“4.945557,25.0”)查询数据库发现该位点在脊椎动物中保守性较好。
根据现有证据:该变异为罕见变异,该变异为扩心病的可疑致病突变。
实施例2:患者家系成员样本验证实验
我们应用全外显子组测序技术,从一个确证先天性扩心病患者及其家系成员中筛选出了这个全新的原发性变异位点DMD(c.31+1G>T,rs398123923)(图1)。该位点位于DMD基因。该家族中共有4例扩心病患者,均为男性,确诊时间从3岁-15岁,均进行了心脏移植手术。
具体鉴定方法如下:
1.全外显子测序和筛选流程:
我们对患者和11位家系成员的基因组DNA进行了全外显子测序,并对测序结果通过以下流程进行致病基因突变筛选(图2):保留在各人群对比数据库中最小等位基因频率小于0.01的突变,保留外显子区域和剪切位点突变,保留除同义突变之外的突变,通过突变有害性软件进行分析并保留被至少2个软件评为有害的突变,用phenolyzer软件对突变进行疾病表型分析并保留优先级前十基因的突变,最后根据家系成员的表型与突变携带情况进行分析,最终确定DMD(c.31+1G>T,rs398123923)为可疑的致病突变位点。
2.Sanger测序和生信分析:
我们针对该突变位点对所有家系成员进行Sanger测序,最终确定该突变位点为该家系可能的致病突变位点DMD(c.31+1G>T,rs398123923),DMD基因位于X染色体,编码肌营养不良蛋白(Dstrophin),该蛋白是一个重要的肌肉蛋白,其功能和肌肉疾病,尤其是杜氏肌肉萎缩症相关。肌营养不良蛋白的缺陷会导致心脏肌肉细胞的结构和功能异常,最终可能导致心脏扩大和功能受损,从而影响心脏细胞的正常功能和机械力传导。该突变位点位于DMD基因肌肉特异性转录本亚型的第一外显子和第一内含子的接头处。其基因型在不同物种中具有高度的保守性。该位点位于第一内含子的供体序列上,RNA Splicer AI模型预测结果提示该位点引起DMD基因肌肉亚型转录本的剪切位点后移,导致移码突变,使得M亚型Dstrophin蛋白的表达完全缺失。
通过以上实验,我们验证鉴定出DMD(c.31+1G>T,rs398123923)突变是先天性扩心病发病风险相关基因突变,存在该突变的被检者可能具有先天性扩心病的发病风险。
本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下,本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中,并且以所附的权利要求为保护范围。
Claims (10)
1.检测DMD基因突变位点的物质在制备筛查或辅助筛查先天性扩心病的产品中的应用。
2.检测DMD基因突变位点的物质在制备诊断或辅助诊断先天性扩心病的产品中的应用。
3.检测DMD基因突变位点的物质在制备预测先天性扩心病患病风险的产品中的应用。
4.根据权利要求1-3任一所述的应用,所述突变为c.31+1G>T,rs398123923。
5.根据权利要求4所述的应用,其特征在于,如果Sanger测序结果显示rs398123923位点检测到等位基因G则为野生型,如果检测到等位基因T则为突变型。
6.根据权利要求1-3任一所述的应用,其特征在于,所述产品包括系统,所述系统包括试剂和/或仪器,所述试剂包括芯片、试剂或试剂盒。
7.根据权利要求1-3任一所述的应用,其特征在于,所述物质含有检测DMD基因或基因片段的引物。
8.根据权利要求7所述的应用,其特征在于,所述引物如下:
前引物:5’-TAATTAGTGAGCTTGTCACAAACTA-3’;
后引物:5’-TGGAGCAATAAAGTTTGAAGAACTT-3’。
9.一种检测先天性扩心病的产品,其特征在于,包括如下任一种:
(B1)检测编码DMD突变位点的基因或基因片段的引物;
(B2)含有(B1)引物的检测试剂;
(B3)含有(B1)引物或(B2)检测试剂的试剂盒。
10.根据权利要求9所述的产品,其特征在于,所述引物如下:
前引物:5’-TAATTAGTGAGCTTGTCACAAACTA-3’;
后引物:5’-TGGAGCAATAAAGTTTGAAGAACTT-3’。
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Legal Events
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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