CN104292320A - 一种黄瓜受低硝态氮胁迫标记基因及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种黄瓜受低硝态氮胁迫标记基因及其应用，属于植物生物技术领域。利用该标记基因，即锌指同源异型域转录因子 CsZHD5 ，能够在低硝态氮胁迫下不同黄瓜品种中稳定上调表达的特性，以该基因CDS序列为模板设计引物。对不同基因型的黄瓜叶片提取总RNA，并反转录得到cDNA，以此为模板进行qRT-PCR检测，并使用iQ?5软件进行分析，通过分析该基因的表达模式和表达量即可了解黄瓜植株是否遭受低硝态氮肥胁迫，进而为指导农民科学施肥及改善黄瓜栽培条件提供准确的数据参考。本发明用于鉴定黄瓜植株是否受到低硝态氮的胁迫。
Description
技术领域
本发明涉及一种黄瓜受低硝态氮胁迫标记基因锌指同源异型域转录因子CsZHD5及其应用，属于植物生物技术领域。
背景技术
黄瓜是一种重要的世界性蔬菜，在其生产栽培过程中硝态氮肥的施用量是关系到黄瓜产量和品质的重要因素之一，而在实际生产过程中农民往往过量施用硝态氮肥，不仅造成了氮肥的浪费也在一定程度上引起了环境污染、黄瓜果实亚硝酸盐含量超标、农民生产成本增加等一系列问题，这也是我国目前倡导的绿色及无公害蔬菜生产面临的主要问题。要解决这些问题，选育出耐低氮的蔬菜新品种是根本途径，但也是一个相对漫长的过程，而改变传统落后的施肥方式与观念，科学合理施肥则是解决上述问题的直接、快速的方法。那么，要想准确、适时地投入氮肥就需要及时了解黄瓜栽培环境的氮肥条件是否有利于其生长，以方便改善栽培条件，可以有效提高黄瓜氮肥利用率，而不会造成浪费。在此过程中，如何能够快速、准确、科学地对黄瓜栽培的氮肥条件进行鉴定就是一个极其关键的环节。对于此类鉴定方法，目前仅限于对土壤氮素含量进行检测，却忽略了作物本身对氮素种类的喜好以及需求量等问题，这样就具有一定的局限性和不可靠性。因此，一种高效、科学、准确的鉴定作物氮素栽培环境的方法的出现必将为解决上述问题提供关键性作用。最近，东北农业大学黄瓜课题组在对低硝态氮胁迫条件下黄瓜植株的表达谱结果进行分析时，发现一些基因在不同黄瓜品种中能够持续、稳定的上调表达，这为开发一种鉴定黄瓜植株是否受到低氮胁迫的分子方法提供了思路，即一些基因受到低氮胁迫诱导后在不同黄瓜材料中拥有相似的表达模式和表达量，我们认为此类基因可作为黄瓜植株受低硝态氮胁迫诱导的标记基因，即一旦我们以正常氮素条件下的黄瓜植株为对照，检测发现该标记基因在某种栽培条件下的某黄瓜品种中为上调表达，且表达量也与我们鉴定的相似或更高（例如3倍），则表明该黄瓜品种的生长条件受到了低硝态氮胁迫，暗示农民应该增施硝态氮肥，以保证黄瓜的正常发育和生长。利用上述方法，可以在黄瓜生长发育的关键时期（如开花期、结果初期、盛果期等）及时了解黄瓜植株的氮肥施用情况，根据检测结果改善黄瓜的生长条件以确保黄瓜的丰产和质量安全。本发明涉及的黄瓜受低硝态氮胁迫标记基因及其应用对于实现黄瓜安全生产是切实可行的，且鉴定方法快捷、成本低、便于推广和普及，可为黄瓜无公害栽培提供准确的生产信息，也可为其他作物栽培提供技术参考。这样，如果黄瓜耐低氮机制与合理施用氮肥双管齐下，就等于实现了理论与实践相结合的哲学理念，相信对于黄瓜生产质量的改善必将事半功倍。目前，对于黄瓜受低硝态氮肥标记基因的鉴定及其应用在国内外尚未见报道。
发明内容
本发明的目的是针对上述存在的问题提供一种在低硝态氮胁迫条件下生长的黄瓜植株中稳定上调表达的标记基因锌指同源异型域转录因子CsZHD5的序列引物，并利用该引物进行黄瓜植株是否受到低硝态氮胁迫的鉴定方法，采用实时定量基因扩增荧光检测技术（qRT-PCR），对该标记基因在待检测黄瓜植株中的表达量进行检测和分析，进而了解待检测黄瓜植株是否处在正常硝态氮肥的环境中生长，以科学指导农民的田间施肥。
上述目的通过以下技术方案实现：
1. 提供一种在低硝态氮胁迫条件下生长的黄瓜植株中稳定上调表达的标记基因锌指同源异型域转录因子CsZHD5 ，其核苷酸序列SEQ ID No.1（534 bp）。
2. 针对上述基因的核苷酸序列，进行qRT-PCR引物的设计，SEQ ID No.2和SEQ ID No.3。
3. 提取待测黄瓜叶片和对照黄瓜叶片的总RNA，并反转录合成cDNA第一链，以此为模板，以CsEF1 α为内参基因（SEQ ID No.4和SEQ ID No.5），进行qRT-PCR鉴定。若标记基因在待测黄瓜叶片中的表达模式为上调表达，且表达量高于3倍及以上，则表明该待测黄瓜叶片受到了低硝态氮肥的胁迫。
有益效果：
1. 本发明通过对黄瓜受低硝态氮胁迫条件下标记基因的表达量进行分析，可快速、准确地对黄瓜的硝态氮肥生长环境进行判断，为改善黄瓜栽培和生长环境提供科学合理的依据，最终提高黄瓜的产量和品质，与我国倡导发展的无公害绿色农业的宗旨相契合。
2. 本发明的黄瓜受低硝态氮胁迫条件下标记基因，普遍存在与黄瓜基因组中，并且可稳定表达，因此可广泛应用于所有黄瓜的栽培品种，具有重要的推广价值。
3. 本发明所需样本少，不会影响黄瓜的生长发育，操作简便、快捷，高效、科学。
4. 本发明技术易于掌握，不受环境条件影响，重复性高。
附图说明
图1黄瓜受低硝态氮胁迫标记基因锌指同源异型域转录因子CsZHD5在黄瓜品种D0328中的表达模式分析。LN,低硝态氮处理（3 mM）；HN，正常硝态氮处理（14 mM）。
图2黄瓜受低硝态氮胁迫标记基因锌指同源异型域转录因子CsZHD5在黄瓜品种D0422中的表达模式分析。LN,低硝态氮处理（3 mM）；HN，正常硝态氮处理（14 mM）。
具体实施方式：
以下实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试验耗材及药品，如无特殊说明，均为生物试剂公司购买得到；所有引物合成均由生工生物工程（上海）有限公司完成。以下实施例中所有用的黄瓜材料均为公知公用。
实施例1：
一种黄瓜受低硝态氮胁迫的标记基因，黄瓜锌指同源异型域转录因子CsZHD5 ，其核苷酸序列SEQ ID No.1（534 bp）。
实施例2：
针对上述基因的核苷酸序列，利用Primer Premier
6.0软件（加拿大的Premier公司开发的专业用于PCR或测序引物以及杂交探针的设计评估的软件）进行qRT-PCR引物的设计，SEQ ID No.2和SEQ ID No.3。
实施例3：
利用Trizol法提取待测黄瓜叶片和对照黄瓜叶片总RNA，并反转录合成cDNA第一链，以此为模板，以CsEF1 α为内参基因（SEQ ID No.4和SEQ ID No.5），进行qRT-PCR鉴定（以北京全式金荧光定量试剂盒Q141为例）：
qRT-PCR反应体系如下：
上游引物（10 µM）
0.5 µL
下游引物（10 µM）
0.5 µL
2×TransStart Tip®Green
qPCR Super Mix 10 µL
ddH2O
7 µL
cDNA模板（50 ng/µL）
2 µL
反应条件：96℃ 2 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 45 s，40 次循环。选用CsEF1 α作为相对定量的参照基因，进行qRT-PCR检测，并使用iQ™5软件进行分析。
实施例4：
一种黄瓜受低硝态氮胁迫标记基因及其在黄瓜栽培生产中的应用
以当前我国生产上主栽的黄瓜品种为材料，分别进行正常硝态氮肥（14 mM硝态氮肥）和低硝态氮肥（3 mM）处理；提取叶片的总RNA后，以其反转录获得的cDNA为模板，用实施例2中的引物进行qRT-PCR检测，并使用iQ™5软件进行分析，结果表明，每个黄瓜品种在低硝态氮处理下该黄瓜低硝态氮胁迫标记基因的表达受到上调，而且品种间的表达量稳定一致。证明黄瓜锌指同源异型域转录因子CsZHD5是一种可以广泛应用于鉴定黄瓜植株栽培环境是否受到低硝态氮胁迫的标记基因。
相关核苷酸序列及引物详情
SEQ ID No.1
ATGGACGGAGAAAACTCAAACTATCATTACAGAGAATGCCTTCGGAACCATGCAGCCAGTCTCGGCAGTTACGCCACCGACGGCTGCGGTGAATTCACTCTCGACGACTCTTCTTCTCCAGCCAACCTCCTCCACTGCGCGGCCTGTGGCTGCCACCGTAACTTCCACCGCAAAGTCACCTACATCGCCGGAGGTGGCCGCTCCTCCGCCGCTACCGCCACCGACGACGACCTCATGGATTACGACCGCCACGCTGTCGTCGAGTACGCCGCTGCCGACACCGAGAGGAGCGGCGGCGGAAGTAAAAAACGGTTCCGTACGAAGTTCACGGCGGATCAGAAAGAGAAGATGTTGGCATTTGCGGAGAAATTAGGTTGGAAATTGCAGAGGAAAGATCTGGACGATGAGATCGAGAGGTTTTGCCGGAGCGTGGGAGTCACTCGCCAAGTTTTTAAGGTTTGGATGCATAATCATAAGAATTCTTTTTCTTCTAATTCTGCATCCACTGGAAATGCCTCTTCTCTAACACAGTAA
SEQ ID No.2
CsZHD5-S:
ACAGAGAATGCCTTCGGAAC
SEQ ID No.3
CsZHD5-A:
AGGTTGGCTGGAGAAGAAGA
SEQ ID No.4
CsEF1 α -S：CGCTCTTCTTGCTTTCACCCTT
SEQ ID No.5
CsEF1 α-A：TACCTTGCCTTGGAGTATTTGG。
序列表
<110> 东北农业大学
<120> 一种黄瓜受低硝态氮胁迫标记基因及其应用
<160> 5
<210> 1
<211> 533
<212> DNA
<213> 黄瓜（Cucumis sativus L.）
<220>
<221> CDS
<222>（1），，（534）
<400> 1
atggacggag aaaactcaaa ctatcattac agagaatgcc ttcggaacca tgcagccagt
ctcggcagtt acgccaccga cggctgcggt gaattcactc tcgacgactc ttcttctcca
gccaacctcc tccactgcgc ggcctgtggc tgccaccgta acttccaccg caaagtcacc
tacatcgccg gaggtggccg ctcctccgcc gctaccgcca ccgacgacga cctcatggat
tacgaccgcc acgctgtcgt cgagtacgcc gctgccgaca ccgagaggag cggcggcgga
agtaaaaaac ggttccgtac gaagttcacg gcggatcaga aagagaagat gttggcattt
gcggagaaat taggttggaa attgcagagg aaagatctgg acgatgagat cgagaggttt
tgccggagcg tgggagtcac tcgccaagtt tttaaggttt ggatgcataa tcataagaat
tctttttctt ctaattctgc atccactgga aatgcctctt ctctaacaca gtaa 534
<210> 2
<211>
<212> DNA
<213> 黄瓜（Cucumis sativus L.）
<220>
<221> CDS
<222> （1）...（20）
<400> 2
acagagaatg ccttcggaac 20
<210> 3
<211>
<212> DNA
<213> 黄瓜（Cucumis sativus L.）
<220>
<221> CDS
<222> （1）...（20）
<400> 3
aggttggctg gagaagaaga 20
<210> 4
<211>
<212> DNA
<213> 黄瓜（Cucumis sativus L.）
<220>
<221> CDS
<222> （1）...（22）
<400> 4
cgctcttctt gctttcaccc tt 22
<210> 5
<211>
<212> DNA
<213> 黄瓜（Cucumis sativus L.）
<220>
<221> CDS
<222>（1）...（22）
<400> 5
taccttgcct tggagtattt gg 22
Claims (4)
1.一种用于鉴定黄瓜植株是否受到低硝态氮胁迫的标记基因锌指同源异型域转录因子CsZHD5 ，其核苷酸序列SEQ ID No.1（534 bp）；其特征是：该基因能够在低硝态氮胁迫条件下的不同黄瓜品种中稳定上调表达。
2.以黄瓜低硝态氮胁迫标记基因锌指同源异型域转录因子CsZHD5的CDS序列为模板，进行qRT-PCR引物的设计，SEQ ID No.2和SEQ ID No.3。
3.提取待测黄瓜叶片总RNA，并反转录合成cDNA第一链，以此为模板，以CsEF1 α（SEQ ID No.4和SEQ ID No.5）为内参基因，以权利要求2所述序列为引物，进行qRT-PCR鉴定（以北京全式金荧光定量试剂盒Q141为例）：
qRT-PCR反应体系如下：
上游引物（10 µM）
0.5 µL
下游引物（10 µM）
0.5 µL
2× TransStart Tip® Green qPCR Super Mix 10 µL
ddH2O
7 µL
cDNA模板（50 ng/µL） 2 µL
反应条件：96℃ 2 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 45 s，40次循环，进行qRT-PCR检测，并使用iQ™5软件进行分析。
4.一种黄瓜受低硝态氮胁迫标记基因及其在黄瓜栽培生产中的应用
以正常硝态氮肥（14 mM）栽培条件下生长的黄瓜品种为对照，以不同基因型的黄瓜品种或在不同环境条件下生长的同一黄瓜品种的叶片为待检测材料，提取总RNA，并反转录得到cDNA，以此为模板，以黄瓜低硝态氮胁迫标记基因特异序列片段为引物，以CsEF1 α 为内参基因，进行qRT-PCR检测，并使用iQ™5软件进行分析，如果黄瓜低硝态氮胁迫标记基因锌指同源异型域转录因子CsZHD5的表达模式在待检测黄瓜品种中为上调表达，且表达倍数大于3，则表明该黄瓜品种的生长环境受到了低硝态氮肥的胁迫，暗示农民应该增施硝态氮肥，以维持黄瓜植株的正常生长和发育；证明黄瓜锌指同源异型域转录因子CsZHD5基因是一个可以广泛应用于鉴定黄瓜低硝态氮肥栽培环境的标记基因。
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Citations (4)
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2014
- 2014-10-10 CN CN201410528179.8A patent/CN104292320A/zh active Pending
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|---|
| NCBI: "Accession No. XM_004137472", 《GENBANK》 * |
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