CN104289281A - 一种大型海藻龙须菜细胞壁的超细破碎方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及细胞破碎技术，具体的说是一种大型海藻龙须菜细胞壁的超细破碎方法。将龙须菜与PBS缓冲液按照2-4:1(W/V)的重量体积比进行混合，混合后3～5次的冰冻-破碎处理，即可实现海藻的完全破壁；采用本发明方法破壁后获得的海藻泥中藻体颗粒直径一般可达到0.1～0.5mm，藻泥稀释十倍，浸提48小时候后，藻红蛋白纯度达到0.35，溶出率达到43.91%（mg/g）。本方法具有设备简单，操作简便，破壁率高，利于生物活性物质溶出等优点。

Description

一种大型海藻龙须菜细胞壁的超细破碎方法
技术领域
本发明涉及细胞破碎技术，具体的说是一种大型海藻龙须菜细胞壁的超细破碎方法。
背景技术
大型海藻龙须菜含有丰富的藻红蛋白和溴过氧化物酶，作为提取藻红蛋白和溴过氧化物酶的主要原材料，在我国也有广泛的种植。自被改良的新品种“龙须菜-981”在广东汕头南澳规模化养殖以来,龙须菜已经成为继海带和紫菜之后第三大海藻栽培业平均亩产达到3.5吨,全国种植面积达20万亩，这为大规模分离纯化藻红蛋白和溴过氧化物酶提供了可能。
龙须菜藻体直立，线形，圆柱状，多丛生，高30～50cm，最长可达1m或以上。龙须菜中的藻红蛋白和溴过氧化物酶是胞内物质，要想充分获取这些生物活性物质需要将龙须菜细胞壁进行破碎，以提高其中的藻红蛋白和溴过氧化物酶的溶出率。
目前龙须菜细胞壁的破碎方法主要是超声破碎，直接研磨法，液氮研磨法，组织捣碎法。由于龙须菜体积较大，藻体光滑，琼胶含量较多，所以采用直接研磨或液氮研磨法来破碎藻体较费时费力，但因液氮研磨对蛋白的提取率较高，适用于实验室中少量藻体材料的处理。组织捣碎法因操作比较简便，也较为常用，但不适用于大规模的破壁。超声破碎的破碎量有限，破碎成本高，而且也可能导致活性物质失活。
实际操作中，经常采用不同的破壁技术组合，以最大限度地破碎藻体细胞壁，使藻红蛋白和溴过氧化物酶释放出来。随着研究的深入，一些破壁技术也获得较好提取效果，但大多局限于实验室少量样品的制备，故找到一种快速可工业化操作的破壁技术具有十分重要的意义。
发明内容
本发明目的在于提供一种大型海藻龙须菜细胞壁的超细破碎方法。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种大型海藻龙须菜细胞壁的超细破碎方法，将龙须菜与PBS缓冲液按照2-4:1(W/V)的重量体积比进行混合，混合后3～5次的冰冻-破碎处理，即可实现海藻的完全破壁；
其中冰冻-破碎处理为混合后于-80～-20℃低温下冰冻3～5小时，冰冻后用超细破碎装置进行破壁。
所述经破壁后冰冻龙须菜在4～25℃条件下融化后，再于-80～-20℃低温下冰冻。
所述龙须菜用水清洗干净，沥干，待用。
所述超细破壁装置进行破壁，调节该装置的刨冰刀与刨冰台所形成的二面角度数，调节后二面角度数为50°～60°。
所述刨冰刀的刀刃与刨冰台的垂直高度小于0.5mm。
本发明所具有的优点：
采用本发明的方法对大型海藻龙须菜细胞壁的破碎，其处理成本低，破壁效率高；操作简便，需求劳动力较少自动化程度高；并且处理设备易得，占用产地小。同时由于破壁处理一直是在低温下进行所以其可以较高程度的提高海藻胞内生物活性物质的活性。
采用本发明方法破壁后获得的海藻泥中藻体颗粒直径一般可达到0.1～0.5mm，藻泥稀释十倍，浸提48小时候后，藻红蛋白纯度达到0.35，溶出率达到43.91%（mg/g）。
附图说明
图1为本发明实施例提供的不同方法破壁后所获得的藻体颗粒大小比较图。
具体实施方式
实施例1
(1)来自广东汕头南澳岛的新鲜暗红褐色粗壮龙须菜-981（981龙须菜）或者低温储存的龙须菜-981，用水清洗干净，沥干。
(2)将上述龙须菜与PBS缓冲液按照重量体积(W（g）/V(ml))比，龙须菜：PBS缓冲液=1:2的比例混合，混合后放入圆柱形冰槽中在-20℃条件下，冰冻放置5小时。
(3)调节超细破碎装置使刨冰刀与刨冰台所形成的二面角度数为50°-60°，刨冰刀的刀刃与刨冰台的垂直高度小于0.5mm。
(4)将上述冻好的海藻冰块置于上述调节好的超细破碎装置中进行破碎。
(5)收集上述步骤（4）破壁后的海藻冰,破碎后海藻冰在4℃条件下融化后再在-20℃下再次冰冻然后在重复以上的破碎，重复5次即可完成海藻的破壁。
经上述方式破壁的龙须菜按物料比1:10（m/v）与25mM/L PBS缓冲液混合，4℃下浸提48小时纯度达到0.35，溶出率为43.91%（mg/g）（见表1），破碎后海藻泥中海藻颗粒直径在0.1～0.5mm之间（见图1-A超细破碎法获得的藻体颗粒）。
实施例2
(1)来自广东汕头南澳岛的新鲜暗红褐色粗壮龙须菜-981或者低温储存的龙须菜-981，用水清洗干净，沥干。
(2)将上述龙须菜与PBS缓冲液按照重量体积(W（g）/V(ml))比，龙须菜：PBS缓冲液=1:2的比例混合，混合后放入圆柱形冰槽中在-80℃条件下，放置3小时。
(3)调节超细破碎装置使刨冰刀与刨冰台所形成的二面角度数为50°-60°，刨冰刀的刀刃与刨冰台的垂直高度小于0.5mm。
(4)将上述冻好的海藻冰块置于上述调节好的超细破碎装置中进行破碎。
(5)收集上述步骤（4）破壁后的海藻冰,破碎后海藻冰在25℃条件下融化后在-80℃下再次冰冻然后在重复以上的破碎，重复3次即可完成海藻的破壁。
经上述方式破壁的龙须菜按物料比1:10（m/v）与25mM/L PBS缓冲液混合，4℃下浸提48小时纯度达到0.35，溶出率为43.91%（mg/g）（见表1），破碎后海藻泥中海藻颗粒直径在0.1～0.5mm之间（见图1-A）。
对比例1
(1)龙须菜用水清洗干净，沥干。
(2)将藻体放入研钵中，加入液氮快速研钵，充分研磨5次。
经上述方式破壁的龙须菜按物料比1:10（m/v）与25mM/L PBS缓冲液混合，4℃下浸提48小时纯度达到0.25，溶出率为64.59%（mg/g）（见表1），破碎后海藻泥中海藻颗粒直径在0.1～0.5mm之间（见图1-B液氮研磨法法获得藻体颗粒）。
对比例2
(1)龙须菜用水清洗干净，沥干。
(2)按料液比1:1(W/V)加入PBS缓冲液，对藻体进行研钵，研磨30min。
经上述方式破壁的龙须菜按物料比1:10（m/v）与25mM/L PBS缓冲液混合，4℃下浸提48小时纯度达到0.29，溶出率为26.76%（mg/g）（见表1），破碎后海藻泥中海藻颗粒直径在0.3～1.0mm之间（见图1-C直接研磨法获得藻体颗粒）。
表1不同方法破壁后所获得的纯度和溶出率比较
注：1、纯度=A566/A280
2、溶出率（mg/g）=溶出的藻红蛋白总量（mg）/海藻鲜重（g）

Claims (5)

1.一种大型海藻龙须菜细胞壁的超细破碎方法，其特征在于：将龙须菜与PBS缓冲液按照2-4:1(W/V)的重量体积比进行混合，混合后3～5次的冰冻-破碎处理，即可实现海藻的完全破壁；
其中冰冻-破碎处理为混合后于-80～-20℃低温下冰冻3～5小时，冰冻后用超细破碎装置进行破壁。
2.按权利要求1所述的大型海藻龙须菜细胞壁的超细破碎方法，其特征在于：所述经破壁后冰冻龙须菜在4～25℃条件下融化后，再于-80～-20℃低温下冰冻。
3.按权利要求1所述的大型海藻龙须菜细胞壁的超细破碎方法，其特征在于：所述龙须菜用水清洗干净，沥干，待用。
4.按权利要求1所述的大型海藻龙须菜细胞壁的超细破碎方法，其特征在于：所述超细破壁装置进行破壁，调节该装置的刨冰刀与刨冰台所形成的二面角度数，调节后二面角度数为50°～60°。
5.按权利要求1所述的大型海藻龙须菜细胞壁的超细破碎方法，其特征在于：所述刨冰刀的刀刃与刨冰台的垂直高度小于0.5mm。
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