CN101381707A - 一种卤素过氧化物酶分离纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种卤素过氧化物酶分离纯化方法，以中国海域养殖龙须菜为原料，经粗提、硫酸铵分级沉淀，离子交换层析，去除丰富的结构多糖及藻红蛋白，得到分子量约60KD电泳纯的卤素过氧化物酶。卤素过氧化物酶是至今唯一被广泛接受、与有机卤化物生物合成相关的酶，可使很多有机物卤化形成具有生理活性的卤素有机物，还具有催化硫氧化、环氧化、吲哚氧化及其它反应的作用，因此卤素过氧化物酶在药物合成和高附加值化合物合成方面越来越引起重视。这是首次从中国海域养殖龙须菜中分离纯化得到卤素过氧化物酶。
Description
技术领域
本发明涉及卤素过氧化物酶的分离纯化，即建立以中国海域养殖红藻龙须菜(Gracilaria lemaneiformis)为原料，卤素过氧化物酶的提取纯化工艺。
背景技术
卤素过氧化物酶普遍存在于海藻中，尤其以红藻居多，国内外对珊瑚藻(Corallina officinalis)的卤素过氧化物酶的研究较多。珊瑚藻生长季节性强，采集量少，成为卤素过氧化物酶开发利用的瓶颈。龙须菜，江蓠属的一个特有种，因适应性快、生长率高等优点，已成为中国第三养殖大型海藻。江蓠属红藻含有丰富的多糖(藻体干重的30～70％)及藻胆蛋白(可溶性蛋白的60％)，影响了酶的活性检测，增加了酶分离纯化的难度，这是红藻生理功能蛋白研究较少的主要原因。建立简便有效的卤素过氧化物酶的分离纯化方法，是开发利用该酶的关键步骤。
发明内容
本发明的目的是提供一种成本低、操作简便的卤素过氧化物酶分离纯化方法。
为实现上述目的，本发明技术方案如下：
一种卤素过氧化物酶的分离提取方法，其以江蓠属养殖龙须菜为原料，分离纯化得到电泳纯的卤素过氧化物酶；卤素过氧化物酶，英文名为：halomoperoxidase，简写HPO；其配基为矾，表观分子量为60000道尔顿，最适pH为6.0，在pH为5～9范围内活性稳定，温度在4～40℃的范围内活性稳定。
具体操作过程如下，
1)清洗并除去龙须菜藻体中的泥沙及其它杂物，控净水分，液氮研磨成粉末；
2)加入藻体重量1/5～3/2的Tris-HCl缓冲液(0.01～0.1mol/L，pH5～9)，0～10℃，浸泡24～72h，纱布过滤。
3)0～10℃，3000g～8000g离心10～50min，上清液即酶粗提液。
4)硫酸铵分级沉淀：粗提液加固体硫酸铵至最终质量浓度10～30％，0～10℃，6000～15000g离心10～50min。弃沉淀，上清再次加固体硫酸铵至最终质量浓度50～90％，0～10℃，6000～15000g离心10～50min。收集沉淀，离心取沉淀物沉淀，用0.01～0.1mol/L、pH5～9Tris-Cl缓冲液进行透析10～48小时，得到卤素过氧化物酶的粗酶液；透析膜截留分子量为14000。
所述粗酶液经一次柱层析即得电泳纯的卤素过氧化物酶：粗酶液上阴离子交换柱层析分离，用含NaCl浓度从0.05～2.0M变化的0.01～0.1mol/L、pH5～9Tris-HCl缓冲液线性梯度洗脱，粗酶液与洗脱液的体积比为1：20～40；洗脱组份按1-10分钟的间隔收集，测定每管收集液的酶活及280nm处的吸光值，合并有酶活的组分，即为卤素过氧化物酶。
所述阴离子交换树脂为DE52或DEAE Sepharose。
本发明具有如下优点：
1.从中国海域养殖龙须菜中分离得到了卤素过氧化物酶。采用本发明提取分离工艺，首次从龙须菜中分离纯化得到电泳纯的卤素过氧化物酶。
卤素过氧化物酶是至今唯一被广泛接受、与有机卤化物生物合成相关的酶，可使很多有机物卤化形成具有生理活性的卤素有机物，还具有催化硫氧化、环氧化、吲哚氧化及其它反应的作用，因此卤素过氧化物酶在药物合成和高附加值化合物合成方面越来越引起重视。
2.操作简便。本发明以中国海域养殖龙须菜为原料，经粗提、硫酸铵分级沉淀，离子交换层析，去除丰富的结构多糖及藻红蛋白，得到分子量约60KD电泳纯的卤素过氧化物酶。硫酸铵分级沉淀后，仅经过一次柱层析，即可得到电泳纯的卤素过氧化物酶。
3.成本低。使用少量成本低的化学试剂；纯化使用的层析填料可再生使用；
4.环境友好。对环境无污染，是一种绿色的提取工艺。
5.作为一种具有卤化功能的过氧化物酶，具有良好的应用前景。可用于卤化、氧化、环氧化、硫氧化等反应；在药物合成和高附加值化合物合成方面越来越引起重视。
总之，本发明是一种无环境污染、高效可行的卤素过氧化物酶的分离纯化方法。分离的卤素过氧化物酶，具备成为工业催化剂的潜力，研究开发其工业应用价值具有重要的科学意义和实际应用价值。在开发利用中国海域养殖龙须菜资源及生物催化产业中，具有广泛应用前景。
附图说明
图1为离子交换层析洗脱谱图。
图2为卤素过氧化物酶活性染色电泳图。
图3为卤素过氧化物酶PAGE电泳图。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明的方法与结果进行说明：
实施例1
取湿重200克龙须菜藻体，液氮研磨成粉末；加入200mlTris-HCl缓冲液(0.02mol/L，pH6.5)，0～5℃，浸泡30h，纱布过滤。4℃，4000g离心15min，取上清液。粗提液加固体(NH4)2SO4至最终质量浓度的15％，4℃，7000g离心20min。弃沉淀，上清再次用(NH4)2SO4沉淀(质量浓度的65％)，4℃，10000g离心15min。收集沉淀，用0.02mol/L、pH6.5 Tris-Cl缓冲液进行透析15小时，得到卤素过氧化物酶的粗酶液；透析膜截留分子量为14000。透析后的酶液样品上DEAE-sepharose柱分离，用含NaCl浓度从0.05～1.0M变化的0.02mol/L、pH6.5 Tris-HCl缓冲液线性梯度洗脱500ml，洗脱组份按5分钟的间隔收集，测定每管收集液的酶活及280nm处的吸光值，合并有酶活的组分，得到的产物经电泳检测，为卤素过氧化物酶。其结果如图1-3所示；
酶活检测方法为：以底物为单氯双甲酮(MCD)、KBr、H2O2的反应体系中，pH6.0，室温下于290nm处测定吸光值的变化，每分钟消耗1μmolMCD所需的酶量定义为一个卤素过氧化物酶活力单位。(参见文献1：Itoh N，Izumi Y，Yamada H，1986，261:5194。)
活性电泳检测方法见文献2：Almeida M，Filipe S，Humanes M，Maia M F，Melo R，Severino N，da Silva J A L，Frausto da Silva J J R，Wever R，2001，57:633。
龙须菜中卤素过氧化物酶的纯化
实施例2
取湿重400克龙须菜藻体，液氮研磨成粉末；加入300mlTris-HCl缓冲液(0.08mol/L，pH8.5)，6-8℃，浸泡65h，纱布过滤。8℃，7000g离心40min，取上清液。粗提液加固体(NH4)2SO4至最终质量浓度的25％，8℃，14000g离心40min。弃沉淀，上清再次用NH4)2SO4沉淀(质量浓度的85％)，8℃，15000g离心30min。收集沉淀，用0.08mol/L，pH8.5 Tris-Cl缓冲液进行透析48小时，得到卤素过氧化物酶的粗酶液；透析膜截留分子量为14000。透析后的酶液样品上DEAE-cellulose柱分离，用含NaCl浓度从0.1～2.0M变化的0.08mol/L、pH8.5Tris-HCl缓冲液线性梯度洗脱500ml，洗脱组份按3分钟的间隔收集，测定每管收集液的酶活及280nm处的吸光值，合并有酶活的组分，得到的产物经电泳检测，为卤素过氧化物酶。其结果如图2、3所示；
龙须菜中卤素过氧化物酶的纯化
Claims (4)
1.一种卤素过氧化物酶分离纯化方法，其特征在于：以中国海域养殖江蓠属龙须菜为原料，分离纯化得到电泳纯的卤素过氧化物酶。
2.按照权利要求1所述卤素过氧化物酶分离纯化方法，其特征在于：具体操作过程如下，
1)清洗并除去龙须菜中的泥沙及其它杂物，控净水分，液氮研磨成粉末；
2)粗提液的制备：加入藻体重量1/5～3/2的0.01～0.1mol/L、pH5～9的Tris-HCl缓冲液，0～10℃，浸泡24～72h，纱布过滤；
3)0～10℃，3000g～8000g离心10～50min，上清液即酶粗提液；
4)硫酸铵分级沉淀：粗提液加固体硫酸铵至最终质量浓度10～30％，0～10℃，6000～15000g离心10～50min；弃沉淀，上清再次加固体硫酸铵至最终质量浓度50～90％，0～10℃，6000～15000g离心10～50min；收集沉淀，离心取沉淀物沉淀，用0.01～0.1mol/L、pH5～9Tris-Cl缓冲液进行透析10～48小时，得到卤素过氧化物酶的粗酶液；透析膜截留分子量为14000。
3.按照权利要求2所述卤素过氧化物酶分离纯化方法，其特征在于：所述硫酸铵分级沉淀后的粗酶液经一次柱层析，即得电泳纯的卤素过氧化物酶：粗酶液上阴离子交换柱层析分离，用含NaCl浓度从0.05～2.0M变化的0.01～0.1mol/L、pH5～9Tris-HCl缓冲液线性梯度洗脱，粗酶液与洗脱液的体积比为1：20～40；洗脱组份按1-10分钟的间隔收集，测定每管收集液的酶活及280nm处的吸光值，合并有酶活的组分，即为卤素过氧化物酶。
4.按照权利要求3所述卤素过氧化物酶分离纯化方法，其特征在于：所述阴离子交换树脂为DE-52或DEAE-Sepharose。
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|---|---|---|---|---|
| CN104289281A (zh) * | 2013-07-19 | 2015-01-21 | 中国科学院烟台海岸带研究所 | 一种大型海藻龙须菜细胞壁的超细破碎方法 |
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