CN104285535A

CN104285535A - 一种快速筛选寄生杂草敏感性除草剂的方法

Info

Publication number: CN104285535A
Application number: CN201410446915.5A
Authority: CN
Inventors: 杨翀; 周伟军; 宋文坚; 朱金文; 胡露飏; 王尖; 许玲
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2014-05-19
Filing date: 2014-09-04
Publication date: 2015-01-21
Anticipated expiration: 2034-09-04
Also published as: CN104285535B

Abstract

本发明公开了一种快速筛选寄生杂草敏感性除草剂的方法，包括：取寄生杂草的种子，经表面消毒后漂洗、晾干；将种子接种至含有待筛选除草剂的吸湿基质上，于密闭、黑暗条件下进行预培养；将种子转移至含有种子萌发刺激物的吸湿基质上，于密闭、黑暗条件下进行发芽试验；计算种子发芽率，筛选出所述寄生杂草敏感性除草剂。将除草剂直接使用于寄生杂草种子的预培养阶段，模拟了除草剂的田间施用和作用过程；用种子萌发刺激物GR24代替寄主根系分泌物，既消除了因萌发刺激物种类和含量差异而导致的假阳性结果，也使种子能在实验室条件下萌发。仅需2周便可快速地明确除草剂对种子萌发的控制效果；数据确实可靠，为除草剂的田间使用提供参考。

Description

一种快速筛选寄生杂草敏感性除草剂的方法

技术领域

本发明属于除草剂快速筛选技术领域，具体涉及一种快速筛选寄生杂草敏感性除草剂的方法。

背景技术

寄生植物是指由于根系或叶片退化或缺乏足够的叶绿素而必须从寄主中掠夺某些营养物质和水分等以满足自身生长发育需求的一类植物。

寄生植物根据对寄主的依赖程度，主要可分为两类：一类是没有叶片或叶片退化成鳞片状，不能进行正常的光合作用，自身所需的养料完全来自于寄主，称为全寄生植物，例如菟丝子(Cusuta chinensis)和列当(Orobanche spp.)等；另一类含有叶绿素，并且能进行正常的光合作用，但根多退化，导管直接与寄主植物相连，从寄主植物内吸收水分和无机盐，称为半寄生植物，例如独脚金(Striga asiatica)、桑寄生(Scurrula parasitica)和槲寄生(Viscum coloratum)等。同时根据其寄生部位的不同，又可分为根寄生植物和茎寄生植物，根寄生植物主要寄生在寄主的根部，而茎寄生植物则寄生在茎杆上。

寄生植物的种类相当繁多，全世界约有20多个科，3000～5000个种，广泛分布于各种生态环境当中，其中危害农业生产最严重的主要有4种，包括列当、菟丝子、独脚金和槲寄生，通常被称为寄生杂草。这些寄生杂草能够大量掠夺寄主的养分和水分，严重阻碍了农作物的生长发育，甚至引起植株枯萎死亡，常常对农业生产造成严重的危害，据报道，寄生杂草可以造成主粮和经济作物的产量损失30％～80％。所以，对寄生杂草进行有效地防治刻不容缓。

由于寄生杂草一旦寄生于农作物上，便开始攫取水分和养分，会对作物造成严重的损害，所以目前田间防治主要集中在播种前这段时期，采取一定措施抑制寄生杂草种子的萌发以防止其寄生。通常采用的方法是除草剂土壤封闭处理，即是将除草剂喷洒与土壤表层或喷洒后通过混土操作将除草剂拌入土壤中建立起一个除草剂封闭层，主要是通过位差选择(即错开药物层和作物种子或根系分布的位置)或时差选择(即错开除草剂药效起作用时间与作物萌发出苗的时间)来达到灭草保苗的目的。

这种除草方法的不足之处在于其缺乏系统深入的研究，农业生产中常出现除草剂乱用、滥用的现象，对农作物乃至环境造成重大的伤害。同时，除草剂的田间筛选常常存在着周期长(至少需要作物的整个生长周期)、投入大(需要大范围种植大量作物)、风险高(有潜在的产量损失的风险)等问题，而且田间筛选也经常存在着不确定因素，例如，不同地里寄生杂草种子密度和种类的差异，不同作物的抗性差异等等，都会造成结果的假阳性。

由此可见，开发能够快速、准确地针对寄生杂草筛选出敏感性除草剂的方法就变得十分重要。

发明内容

本发明提供了一种快速筛选寄生杂草敏感性除草剂的方法，可以快速、安全、简便、可靠地明确某一除草剂对寄生杂草种子萌发的抑制效果。

一种快速筛选寄生杂草敏感性除草剂的方法，包括：

(1)取寄生杂草的种子，经表面消毒后漂洗、晾干；

(2)将晾干后的种子接种至含有待筛选除草剂的吸湿基质上，于密闭、黑暗条件下进行预培养；

(3)将预培养后的种子转移至含有种子萌发刺激物的吸湿基质上，于密闭、黑暗条件下进行发芽试验；

(4)计算种子发芽率，从待筛选除草剂中筛选出所述寄生杂草敏感性除草剂。

本发明中，所述寄生杂草敏感性除草剂是指导致种子发芽率低于5％的除草剂。

本发明以寄生杂草的种子为材料，于实验室环境下进行无土培养，以模拟田间除草过程。其中，将除草剂直接使用于寄生杂草种子的预培养阶段，模拟田间除草剂的使用时期(寄生杂草种子萌发前使用)和作用过程(除草剂作用于种子表面被吸收)；然后再用种子萌发刺激物代替寄主根系分泌物刺激寄生杂草种子萌发，模拟寄生杂草种子在田间的萌发过程；最后通过计算种子发芽率，即可快速得知某待筛选除草剂是否能抑制相应的寄生杂草种子萌发、抑制萌发的效果如何。

整个试验在一定程度上模拟了寄生杂草种子在田间的萌发过程以及除草剂的使用时期和作用过程，仅需2周便可快速地明确除草剂对寄生杂草种子萌发的控制效果；同时因为是在实验室条件下，排除了不可控因素的影响，可以确保对环境的安全以及数据的可靠性，为除草剂的田间使用提供一定参考。

鉴于本发明的种子萌发刺激物是寄主根系分泌物的替代品，因此本发明的方法更适用于根寄生杂草的敏感性除草剂筛选，所述根寄生杂草包括列当、独脚金、丁座草、野菰、肉苁蓉等。

具体地，所述方法包括：

(1)取寄生杂草的种子，经表面消毒后漂洗、晾干；

所述表面消毒是将种子依次浸泡在酒精和消毒液中进行消毒处理。由于寄生杂草的种子一般体积较小、重量较轻，因此进行表面消毒时可先用茶叶袋纸包装寄生杂草种子，再将包装浸泡在酒精或消毒液中进行消毒处理，浸泡过程中经常搅动。一方面防止种子漂浮于液面上，保证消毒彻底；另一方面也便于表面消毒后寄生杂草种子的收集。

作为优选，所述酒精的浓度为50～80％，消毒时间为1～5min；所述消毒液由1～5％的次氯酸钠溶液和0.1～0.3％的Tween-20溶液等体积混合而成，消毒时间为5～12min。作为进一步优选，所述酒精的浓度为70％，消毒时间为2min；所述消毒液由2％的次氯酸钠溶液和0.2％的Tween-20溶液等体积混合而成，消毒时间为10min。相比于其他表面消毒条件，本发明的表面消毒条件能在不对种子造成伤害的基础上实现较为彻底的消毒。

当利用消毒液进行表面消毒时，当消毒液颜色由黑色变为褐色或者棕色时表明消毒完成(消毒液由黑色变为褐色或者棕色，预示了种子表面附着的物质被清除)。完成表面消毒后将寄生杂草种子用无菌蒸馏水漂洗6～10次，然后用无菌干燥滤纸吸干水分，完成后放在超净工作台上晾干3天左右，用灭菌过的离心管分装好，0～20℃干燥保存或4℃低温保存备用，或晾干后直接使用。

(2)将晾干后的种子接种至吸附有待筛选除草剂的吸湿基质上，于密闭、黑暗条件下进行预培养；

本发明中，所述吸湿基质为滤纸，可选用玻纤滤纸或其他普通的定量滤纸或定性滤纸，优选为玻纤滤纸。与其他滤纸相比，玻纤滤纸具有较好的各同向性，孔径分布均匀，减少不确定因素对数据准确性的影响。

由于寄生杂草的种子一般体积较小、重量较轻，预培养完成后还需转移，因此不便于将寄生杂草种子直接接种于玻纤滤纸上。本发明中，预培养在培养皿中进行，培养皿中先放入两层玻纤滤纸，然后在玻纤滤纸上放置若干个玻纤滤纸小圆片。预培养前，先用不同浓度的待筛选除草剂(预培养液)润湿玻纤滤纸和玻纤滤纸小圆片，然后用接种针蘸取寄生杂草种子于玻纤滤纸小圆片上。如此预培养完成后直接转移玻纤滤纸小圆片即可，简化操作步骤。

待筛选除草剂的试验浓度应以能用于实际生产应用为宜，玻纤滤纸上预培养液的润湿量以其能够充分润湿玻纤滤纸和玻纤滤纸小圆片，但又不会出现明显的流动的液体为宜。

寄生杂草种子接种完成后，用封口膜封闭培养皿，培养皿外部用锡箔纸包住以保持完全黑暗，进行预培养。作为优选，所述预培养的条件为：15～25℃培养3～14天，更优选为在20℃下培养7天。预培养温度过低或者过高都会抑制种子的发芽，培养时间过短或者过长则会降低发芽率。

预培养之所以在密闭、黑暗条件下进行，是因为密闭条件可防止种子染菌、发霉，也避免水分丧失；黑暗条件模拟寄生杂草种子在田间的生存状态，使得通过本发明筛选出的除草剂能更好地应用实际农业生产中。

(3)将预培养后的种子转移至吸附有种子萌发刺激物的吸湿基质上，于密闭、黑暗条件下进行发芽试验；

发芽试验也在培养皿中进行，试验开始前，用一定浓度和体积的种子萌发刺激物润湿玻纤滤纸等吸湿基质。转移时，先将承载有寄生杂草种子的玻纤滤纸小圆片转移至干燥滤纸上吸干预培养液，然后再放置于吸附有种子萌发刺激物的吸湿基质上。

发芽试验也在密闭、黑暗条件下进行，作为优选，发芽试验的条件为15～25℃培养3～14天，更优选为在20℃下培养7天。温度过低或者过高都会抑制种子的发芽。发芽时间太短，有些种子会因为胚根长度不够或不明显而被计算为未发芽，影响实验结果；发芽时间太长，种子会由于长时间未能寄生到寄主上而死亡，一般发芽后10天内未能成功寄生到寄主根系上便会死亡，则进行种子发芽率统计时，难以获得准确的统计数据。

所述种子萌发刺激物可选用独脚金内酯或GR24、GR7、GR3，更优选为浓度为10^-6～10^-12M的GR24，GR24的最优浓度为10^-6M。独脚金内酯是植物中普遍存在的植物激素，但独脚金内酯在植物中含量极低，难以提取作为大规模应用。GR24、GR7、GR3均是人工合成的独脚金内酯类似物，是一类新型的植物生长调节物质。其中GR24的活性最高，应用最多，便于获取。利用GR24模拟寄主根系分泌物刺激寄生杂草种子萌发，使得本发明的方法能用于针对各种寄生杂草进行除草剂筛选。

(4)计算种子发芽率，从待筛选除草剂中筛选出导致种子发芽率低于5％的寄生杂草敏感性除草剂。

观察寄生杂草种子发芽情况时，若寄生杂草种子长出的胚根长度等于或长于种子宽度，则认为该种子已发芽。

在能实际应用的浓度范围内，引起种子发芽率低于5％的除草剂浓度越低越好。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明将除草剂直接使用于寄生杂草种子的预培养阶段，一定程度上模拟了除草剂的田间施用时期和作用过程；寄生杂草种子只有在受到特殊的萌发刺激物刺激时才能开始萌发，用人工合成的种子萌发刺激物GR24代替寄主根系分泌物，既消除了因种子萌发刺激物种类和含量差异而导致的假阳性结果，同时也使寄生杂草种子能够在缺乏寄主根系分泌物诱导的条件下萌发成为可能。整个试验过程排除了不可控因素的影响，所得的实验数据确实可靠，为除草剂的田间使用提供参考。

附图说明

图1为寄生杂草种子在实验室环境下无土培养时的状态；

图2为寄生杂草种子发芽时的状态图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明的方法作进一步详细说明。

实施例148％仲丁灵EC对向日葵列当(Orobanche cumana Wallr)的防治效果测试

⑴试剂配制

①消毒液配制，以100ml计：20ml的5％次氯酸钠原液加30ml无菌蒸馏水稀释成2％的次氯酸钠溶液，0.1g的Tween-20加49.9ml无菌蒸馏

②10^-6M的GR24溶液配制，取3mg固体GR24溶于丙酮并定容至10ml形成10^-3M的GR24母液，取10μl母液加无菌蒸馏水定容至10ml配成10^-6M的GR24溶液，用0.22μm滤膜过滤灭菌；

③除草剂溶液配制，取1.2μl 48％仲丁灵EC溶于1.5ml无菌蒸馏水中配成600mg/m²的除草剂溶液，分别稀释10倍、100倍，形成600mg/m²、60mg/m²、6mg/m²的浓度梯度，用0.22μm滤膜过滤灭菌。

⑵48％仲丁灵EC对向日葵列当的防治效果测试

1)种子消毒：将向日葵列当种子用2层茶袋纸包好密封，然后持续浸泡在70％的酒精2min和含有0.2％吐温-20的次氯酸钠消毒液中10min进行表面消毒，浸泡过程中经常搅动，当消毒液颜色从黑色变为褐色或棕色时消毒完成；消毒后的种子用无菌蒸馏水漂洗6～10次，然后用无菌干燥滤纸吸干水分，完成后放在超净工作台上晾干3天左右，用灭菌过的离心管分装好，0～20℃干燥保存或4℃低温保存；

2)预培养：在直径为5cm的培养皿中放入2层玻纤滤纸，再在玻纤滤纸上放15个左右直径为5mm的玻纤滤纸小圆片，然后分别用1.5ml不同浓度的仲丁灵溶液润湿玻纤滤纸和玻纤滤纸小圆片(设空白对照组，用1.5ml无菌蒸馏水润湿玻纤滤纸和玻纤滤纸小圆片)，用接种针蘸取列当种子于玻纤滤纸小圆片上，每个玻纤滤纸小圆片上接种约20粒种子，然后用封口膜(美国parafilm公司)封口，以防水分丧失，外部用锡箔纸包住以保持完全黑暗，最后将向日葵列当种子在20℃黑暗条件下预培养7天；

3)发芽试验：在直径为5cm的培养皿中放入2层玻纤滤纸，加入1.5ml10^-6M的人工合成萌发刺激物GR24溶液润湿玻纤滤纸；然后用干燥的玻纤滤纸吸干预培养后列当种子玻纤滤纸小圆片中的预培养液(即不同浓度的除草剂溶液)，放到含有GR24溶液的玻纤滤纸上；用封口膜将培养皿密封并包裹锡箔纸以保持完全黑暗，最后将培养皿置于20℃黑暗条件下进行发芽试验，7天后观察发芽情况；

4)发芽情况观察：将培养皿置于双筒体式显微镜下观察，种子长出的胚根长度等于或长于种子宽度被认为是已发芽的种子。

观察结果如表1所示。

表1不同浓度仲丁灵溶液预培养下的种子发芽率

除草剂浓度(mg/m²)	发芽率(％)
		0(空白对照)	75.85±3.453198a
6	42.55±2.293716b
		60	34.04±1.381577b
600	17.71±1.648296c

由表1可见，空白对照的种子发芽率高达75.85％；浓度为6mg/m²和60mg/m²时，种子发芽率显著降低，但两者之间无差异；当浓度为最高的600mg/m²时，已超出田间一般使用浓度(225～375mg/m²)一倍左右，但萌发率仍然高达17.71％，表明48％仲丁灵EC对向日葵列当的防治并不理想。

实施例296％金都尔EC对小列当(Orobanche minor)的防治效果测试

⑴试剂配制：

①消毒液配制，以100ml计：20ml的5％次氯酸钠原液加30ml无菌蒸馏水稀释成2％的次氯酸钠溶液，0.1g的Tween-20加49.9ml无菌蒸馏水配成0.2％的溶液，将两种溶液混合配成消毒液；

③除草剂溶液配制，取0.73μl96％金都尔EC溶于1.5ml无菌蒸馏水中配成375mg/m²的除草剂溶液，分别稀释10倍、100倍，形成375mg/m²、37.5mg/m²、3.75mg/m²的浓度梯度，用0.22μm滤膜过滤灭菌。

⑵96％金都尔EC对小列当的防治效果测试

1)种子消毒：将小列当种子用2层茶袋纸包好密封，然后持续浸泡在70％的酒精2min和含有0.2％吐温-20的次氯酸钠消毒液中10min进行表面消毒，在浸泡过程中经常搅动，当消毒液颜色从黑色变为褐色或棕色时消毒完成，消毒后的种子用无菌蒸馏水漂洗6～10次，然后用无菌干燥滤纸吸干水分，完成后放在超净工作台上晾干3天左右，用灭菌过的离心管分装好，0～20℃干燥保存或4℃低温保存；

2)预培养：在直径为5cm的培养皿中放入2层玻璃纤维滤纸，再在滤纸上放15个左右直径为5mm的玻璃纤维小圆片，然后分别用1.5ml不同浓度的金都尔溶液润湿滤纸和小圆片(设空白对照组，用1.5ml无菌蒸馏水润湿玻纤滤纸和玻纤滤纸小圆片)，用接种针蘸取列当种子于玻璃纤维小圆片上，每个小圆片上约20粒种子，然后用封口膜(美国parafilm公司)封口，以防水分丧失，外部用锡箔纸包住以保持完全黑暗，最后将向日葵列当种子在20℃黑暗条件下预培养7天；

3)发芽试验：在直径为5cm的培养皿中放入2层玻璃纤维滤纸，加入1.5ml 10^-6M的人工合成萌发刺激物GR24溶液润湿滤纸，然后用干燥的滤纸吸干预培养后列当种子小圆片中的预培养液，放到含有GR24溶液的培养皿中，用封口膜将培养皿密封并包裹锡箔纸以保持完全黑暗，最后将培养皿置于20℃黑暗条件下进行发芽试验，7天后观察发芽情况；

观察结果如表2所示。

表2不同浓度金都尔溶液预培养下的种子发芽率

除草剂浓度(mg/m²)	发芽率(％)
		0(空白对照)	75.23±1.428181a
6	38.23±1.435587b
		60	23.44±1.38128c
600	1.74±0.575286d

由表2可见，空白对照的种子发芽率高达75.23％；随着除草剂浓度升高，发芽率显著降低，当达到最高浓度375mg/m²时，发芽率仅为1.74％，表明96％金都尔EC对小列当种子的萌发具有较好的抑制作用。

Claims

1.一种快速筛选寄生杂草敏感性除草剂的方法，包括：

(1)取寄生杂草的种子，经表面消毒后漂洗、晾干；

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述表面消毒是将种子依次浸泡在酒精和消毒液中进行消毒处理。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述酒精的浓度为50～80％，消毒时间为1～5min。

4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述消毒液由1～5％的次氯酸钠溶液和0.1～0.3％的Tween-20溶液等体积混合而成，消毒时间为5～12min。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述吸湿基质为滤纸。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述滤纸为玻纤滤纸。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述预培养的条件为：15～25℃培养3～14天。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述种子萌发刺激物为独脚金内酯或GR24、GR7、GR3。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述种子萌发刺激物是浓度为10^-6～10^-12M的GR24。

10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发芽试验的条件为：15～25℃培养3～14天。