CN104284579A - 植物人工种子及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本文公开了用于制备苗的人工种子的组合物和方法，所述苗能够发育成长大的植物以在田间繁殖。在一个实施例中，所述人工种子在可降解容器中发育。本公开的方法也允许快速繁殖所需植物，诸如甘蔗，以满足对该植物的一直增长的全球需求。

Description

植物人工种子及其制备方法
相关申请的交叉引用
根据35 U.S.C.§119(e)要求提交于2011年12月21日的美国临时申请61/578,410的权益，其公开内容全文以引用方式并入本文。
技术领域
本发明涉及植物人工种子的制备。具体地，涉及甘蔗人工种子的制备。
背景技术
一些植物如甘蔗、香蕉、菠萝、柑橘属植物、针叶树和苹果不能经由种子繁殖，这是由于：a)在种子繁殖期间丧失了遗传同一性；b)植物在产生种子前需长期生长；以及c)这些植物的天然种子在大田生长条件下生长和成活率很差。当前这些作物通过营养方法繁殖或经由幼苗繁殖。因此已经进行尝试以开发对它们繁殖的各种经济型替代方案。
已经将人工种子长期研究作为繁育某些植物的替代手段(Kitto，S.，Hort.Science，20：98-100，1985)。人工种子是一种人造物，它包括促进植物生长必需的组分，植物可从其中生长并由它自身的植物组织获得，但是其中植物组织通常不与植物的天然种子相同。与之相反，天然种子由植物在自然的生物学过程中产生，无人工干预。
传统的人工种子是藻酸盐包封的实验室培养组织，其能够体外生长，但是它们在大田环境下成活率非常低，这是由于包封的材料以及生物学挑战。包封是将可再生植物组织加到容器中以提供人工种子的方法。可再生植物组织是能够再生成具有与亲本植物相同特征和遗传同一性的成熟植物的组织。苗是一种类型的可再生植物组织。苗可具有分化良好的芽和根，或它们可为不成熟的苗，仅具有当种植在土壤或其他生长培养基中时能够生根的芽。一些挑战包括暴露的藻酸盐包封组织的脱水、土壤微生物的侵袭、包封材料的换气不良、以及实验室培养组织的不成熟和虚弱(Redenbaugh，K.，Hort.Science，22：803-809，1987和Redenbaugh，K.，Cell Cult and Somat Cell Genet Plants，8：35-74，1991)。
人工种子已被用于利用针叶树胚芽繁殖针叶树(WeyerhaeuserCorporation，WO1998033375)。这种方法使用一种复杂的多隔室单个装配设计。
由于在通过种子进行的有性繁殖期间丧失遗传同一性，甘蔗商业上进行营养繁殖。这种植物的营养繁殖涉及在垄沟中水平地种植茎杆切段(多节茎杆部分，称为整杆或整茎)。每个茎杆在每个节处具有芽或分生组织。分生组织是存在于其中植物能够生长的区域中的未分化细胞。节段是指包含侧生芽，能够繁殖甘蔗植物的一部分杆。在种植后，这些芽产生芽和根，其变成新的甘蔗植物。在杆部分内的糖和营养物质维持新生植物的初始生长。
甘蔗的营养繁殖是非常费力的过程，并且有很多问题。主要问题包括需要用于种植的大量茎杆材料(在商业甘蔗生产中称为“种茎”)，它们否则可被磨碎用于制糖，以及生产种茎涉及的大部分田地和劳动力的投入成本。主要成本只涉及运输种田所需的多吨甘蔗(10-15吨/ha)。另外，种茎可能含有疾病，其通过种植有病的甘蔗传播给下一代。因此，需要维护无病原体的种苗，其涉及大规模的茎杆消毒方法，给常规的繁育增加了更多成本。对于引入甘蔗新品种而言，营养繁殖方法是无效的，这是由于长生长周期以及由此带来的每个1年期生长周期的相对低的倍增因数(例如每lkg种植的甘蔗产生5至15kg种茎)。
PleneTM(Syngenta Co.)是一种商业产品，其由甘蔗杆的单个节段组成，修剪了多余的节内组织以模拟最小化的整杆，并且已被用作营养繁殖体。繁殖体是用于繁殖的植物材料。
已经公开了用于将来自田地种植的甘蔗秆的甘蔗分生组织培养成芽群的另一种方法(BSES，WO2011/085446 A1)。这种方法具有高倍增因数，其可用于加速品种释放。然而，来自这种方法的繁殖体需要在转移到田地前先在苗圃中炼苗，这限制了它们用于大规模甘蔗生产的实用性。
因此，需要开发用于改善掺入人工种子的植物组织活力的新型和经济型的方法以允许直接将苗种植到土壤中。
发明内容
本发明提供人工种子以改善可再生植物组织的生长和活力并允许难以繁殖的植物如甘蔗的规模化的种植方法。
在一个方面，本发明涉及人工种子，其包括一种或多种可再生植物组织、包含可降解部分的容器、未阻塞的空间、和营养物质源，并且还包括选自下列的一个或多个特征：穿过其可再生植物组织生长的可穿透或可降解的区域、容器的单层水溶性部分、在约1℃和50℃之间流动或蠕变的容器的区域、在可再生植物组织生长期间发生物理位移的可分离闭合件、在容器的侧面或底部的一个或多个开口、通向在顶点处的宽度小于2cm的开口的锥形或渐缩区域，并且其中锥形或渐缩区域的角度从相对侧测量时小于135度、和穿过其可再生组织生长的多个柔性翼。
在本发明的一个实施例中，容器、容器的区域、或闭合件还包含下列中的一种或多种、或由下列中的一种或多种组成：聚酯、聚酰胺、聚烯烃、纤维素、纤维素衍生物、多糖、聚醚、聚氨酯、聚碳酸酯、聚(甲基丙烯酸烷基酯)、聚(丙烯酸烷基酯)、聚(丙烯酸)、聚(甲基)丙烯酸、聚磷腈、聚酰亚胺、聚酐、聚胺、聚二烯、聚丙烯酰胺、聚(硅氧烷)、聚(乙烯醇)、聚(乙烯酯)、聚(乙烯醚)、天然聚合物、嵌段共聚物、交联聚合物、蛋白质、蜡、油、增塑剂、抗氧化剂、成核剂、抗冲改性剂、加工助剂、增韧剂、着色剂、填料、稳定剂、阻燃剂、天然橡胶、聚砜、或聚硫化物；或它们的共混物；或它们的交联形式。
在本发明的另一个实施例中，容器还包含选自下列的组分：a)无定形聚(D，L-乳酸)、聚(乳酸)、聚(L-乳酸)、聚(D-乳酸)、聚(内消旋-乳酸)、聚(外消旋-乳酸)、或聚(D，L-乳酸)、聚(羟基链烷酸酯)、聚(羟基丁酸酯)、聚(羟基丁酸酯-共-戊酸酯)、聚(己内酯)、聚(琥珀酸亚丁酯)、聚(琥珀酸亚乙酯)、聚(碳酸亚乙酯)、聚(碳酸亚丙酯)、淀粉、明胶、热塑性淀粉、聚(对苯二甲酸亚丁酯己二酸酯)、聚(对苯二甲酸亚丙酯琥珀酸酯)、聚(对苯二甲酸亚丙酯己二酸酯)、聚(乙烯醇)、聚(乙二醇)、纤维素、脱乙酰壳多糖、乙酸纤维素、或丁酸乙酸纤维素，b)具有大于5摩尔％的脂族单体含量的聚酯，c)交联形式的无定形聚(D，L-乳酸)、聚(乳酸)、聚(L-乳酸)、聚(D-乳酸)、聚(内消旋-乳酸)、聚(外消旋-乳酸)、或聚(D，L-乳酸)、聚(羟基链烷酸酯)、聚(羟基丁酸酯)、聚(羟基丁酸酯-共-戊酸酯)、聚(己内酯)、聚(琥珀酸亚丁酯)、聚(琥珀酸亚乙酯)、聚(碳酸亚乙酯)、聚(碳酸亚丙酯)、淀粉、明胶、热塑性淀粉、聚(对苯二甲酸亚丁酯己二酸酯)、聚(对苯二甲酸亚丙酯琥珀酸酯)、聚(对苯二甲酸亚丙酯己二酸酯)、聚(乙烯醇)、聚(乙二醇)、纤维素、脱乙酰壳多糖、乙酸纤维素、丁酸乙酸纤维素、或具有大于5摩尔％的脂族单体含量的聚酯，d)增塑剂，其中增塑剂以小于总组合物30重量％存在，e)柠檬酸乙酰基三丁酯、柠檬酸三丁酯、癸二酸二正辛酯、癸二酸二-2-乙基己酯、琥珀酸二-2-乙基己酯、己二酸二异辛酯、己二酸二-2-乙基己酯、戊二酸二异辛酯、戊二酸二-2-乙基己酯、聚(乙二醇)、聚(乙二醇)单月桂酸酯、山梨醇、甘油、聚(丙二醇)、或水，f)两种或更多种己内酯、乳酸、D-丙交酯、L-丙交酯、内消旋-丙交酯、D，L-丙交酯、癸二酸、琥珀酸、己二酸、乙醇酸、草酸、乙二醇、1，2-丙二醇、1，3-丙二醇、1，3-丁二醇、1，4-丁二醇、1，5-戊二醇、2，2，4，4-四甲基-1，3-环丁二醇、1，6-己二醇、对苯二甲酸、间苯二甲酸、二甲基硅氧烷、琥珀酸酐、二异氰酸酯、交联剂、或邻苯二甲酸酐的共聚物，g)抗氧化剂、成核剂、抗冲改性剂、加工助剂、增韧剂、着色剂、填料、稳定剂、或阻燃剂，h)纸、水溶性纸、再循环纸、铜版纸、牛皮纸、蜡纸、或涂布纸，i)两种或更多种组分a)至h)的组合，和j)包含两种或更多种组分a)至i)的共混物。
在另一个实施例中，容器的区域或闭合件还包含选自下列的组分：a)乳酸与己内酯的无规、嵌段或梯度共聚物，b)乳酸与二甲基硅氧烷的无规、嵌段或梯度共聚物，c)醇酸树脂，d)聚(乙烯醇)、淀粉、纤维素、聚(乙二醇)、琼脂、黄原胶、藻酸盐、羟丙基纤维素、甲基纤维素、水溶性蛋白质、水溶性碳水化合物、水溶性合成聚合物、或羧甲基纤维素，e)两种或更多种下列物质的共混物：聚(乙烯醇)、淀粉、纤维素、甘油、聚(乙二醇)、柠檬酸、尿素、水、乙酸钠、硝酸钾、硝酸铵、肥料、琼脂、黄原胶、藻酸盐、羟丙基纤维素、甲基纤维素、水溶性蛋白质、水溶性碳水化合物、水溶性合成聚合物、交联剂、或羧甲基纤维素，f)包含嵌段共聚物和油的凝胶，g)羧甲基纤维素钠，h)蜡-浸渍的水溶性纸，i)无定形聚(D，L-乳酸)、聚(乳酸)、聚(L-乳酸)、聚(D-乳酸)、聚(内消旋-乳酸)、聚(外消旋-乳酸)、或聚(D，L-乳酸)、聚(羟基链烷酸酯)、聚(羟基丁酸酯)、聚(羟基丁酸酯-共-戊酸酯)、聚(己内酯)、聚(琥珀酸亚丁酯)、聚(琥珀酸亚乙酯)、聚(碳酸亚乙酯)、聚(碳酸亚丙酯)、淀粉、热塑性淀粉、明胶、聚(对苯二甲酸亚丁酯己二酸酯)、聚(对苯二甲酸亚丙酯琥珀酸酯)、聚(对苯二甲酸亚丙酯己二酸酯)、聚(乙烯醇)、聚(乙二醇)、纤维素、脱乙酰壳多糖、乙酸纤维素、或丁酸乙酸纤维素；或它们的交联形式，j)具有大于5摩尔％的脂族单体含量的聚酯，k)交联形式的无定形聚(D，L-乳酸)、聚(乳酸)、聚(L-乳酸)、聚(D-乳酸)、聚(内消旋-乳酸)、聚(外消旋-乳酸)、或聚(D，L-乳酸)、聚(羟基链烷酸酯)、聚(羟基丁酸酯)、聚(羟基丁酸酯-共-戊酸酯)、聚(己内酯)、聚(琥珀酸亚丁酯)、聚(琥珀酸亚乙酯)、聚(碳酸亚乙酯)、聚(碳酸亚丙酯)、淀粉、明胶、热塑性淀粉、聚(对苯二甲酸亚丁酯己二酸酯)、聚(对苯二甲酸亚丙酯琥珀酸酯)、聚(对苯二甲酸亚丙酯己二酸酯)、聚(乙烯醇)、聚(乙二醇)、纤维素、脱乙酰壳多糖、乙酸纤维素、丁酸乙酸纤维素、或具有大于5摩尔％的脂族单体含量的聚酯，l)增塑剂，其中增塑剂以小于总组合物30重量％存在，m)柠檬酸乙酰基三丁酯、柠檬酸三丁酯、癸二酸二正辛酯、癸二酸二-2-乙基己酯、琥珀酸二-2-乙基己酯、己二酸二异辛酯、己二酸二-2-乙基己酯、戊二酸二异辛酯、戊二酸二-2-乙基己酯、聚(乙二醇)、聚(乙二醇)单月桂酸酯、山梨醇、甘油、聚(丙二醇)、或水，n)两种或更多种下列物质的共聚物：己内酯、乳酸、D-丙交酯、L-丙交酯、内消旋-丙交酯、D，L-丙交酯、癸二酸、琥珀酸、己二酸、乙醇酸、草酸、乙二醇、1，2-丙二醇、1，3-丙二醇、1，3-丁二醇、1，4-丁二醇、1，5-戊二醇、2，2，4，4-四甲基-1，3-环丁二醇、1，6-己二醇、对苯二甲酸、间苯二甲酸、二甲基硅氧烷、琥珀酸酐、二异氰酸酯、交联剂、或邻苯二甲酸酐，o)抗氧化剂、成核剂、抗冲改性剂、加工助剂、增韧剂、着色剂、填料、稳定剂、或阻燃剂，p)蜡、或q)纸、水溶性纸、再循环纸、铜版纸、牛皮纸、蜡纸、或涂布纸；或r)两种或更多种组分a)至q)的组合，和s)包含两种或更多种组分a)至r)的共混物。
在另一个实施例中，容器是能够扩张的。可扩张方法的非限制性例子包括选自下列的方法：a)叠缩两个或更多个管状构件，b)解折叠，c)膨胀，d)展开；以及e)拉伸。
在本发明的另一个实施例中，营养物质源还包含选自下列的组分：a)土壤，b)椰棕，c)蛭石，d)人工生长培养基，e)琼脂，f)超吸收聚合物，g)植物生长调节剂，h)植物激素，i)微量营养素，j)宏量营养素，k)水，l)肥料，m)泥煤，n)两种或更多种组分a)至m)的组合，和o)包含两种或更多种组分a)至n)的共混物。
在另一个实施例中，可再生植物组织是选自下列的可再生组织：a)甘蔗、禾本科植物、甘蔗属物种、甘蔗属杂交物种、芒属植物、柳枝稷、能源甘蔗、不结实草本植物、竹子、木薯、玉米、稻、香蕉、马铃薯、甘薯、薯蓣、菠萝、树、柳树、杨树、桑树、榕属物种、油棕、枣椰、禾本科、马鞭草、香草、茶、啤酒花属植物、蔗茅属物种、甘蔗属间杂种、蔗茅属和高粱属物种、非洲紫罗兰、苹果、枣、无花果、番石榴、芒果、槭树、李子、石榴、番木瓜果、鳄梨、黑莓、栽培的草莓、葡萄、美人蕉、大麻、柑橘属植物、柠檬、橙、柚子、橘子、或酸橙，b)a)的遗传修饰植物，c)a)的微繁形式，和d)a)的遗传修饰的微繁形式。
在另一个实施例中，容器还包含选自下列的部件：a)带有锥形顶部的圆柱形管，b)带有多孔底部部分和无孔顶部部分的两部分管，c)柔性袋，d)半柔性袋，e)能够展开的轧管结构，f)锚固装置，g)带有铰接边缘的多部分管，h)用粘合剂保持在一起的多部分管，i)管状形状，j)与土壤接触的容器部分，其比土壤上方的部分更快地降解，k)包括多个隔室的空间，l)保持水分的封闭底部末端，m)通过粘合接头而附接的顶盖，n)通过插入容器而附接的顶盖，和o)弱区域。
在另一个实施例中，容器或闭合件还包含选自下列的材料：a)透明的、半透明的或部分半透明的材料，b)不透明的材料，c)多孔材料，d)无孔材料，e)可渗透的材料，f)不可渗透的材料；和g)材料a)至f)中的任何一种，其中该材料是能够生物降解的、能够以水解方式降解的、或能够堆肥的。
在另一个实施例中，使用选自下列的部件来固定开口中的一个或多个：a)夹具，b)折叠部，c)多孔材料，d)网片，e)筛网，f)棉，g)纱布；和h)钉。
在另一个实施例中，人工种子还包含选自下列的试剂：a)杀真菌剂，b)杀线虫剂，c)杀昆虫剂，d)抗微生物化合物，e)抗生素，f)杀生物剂，g)除草剂，h)植物生长调节剂或刺激剂，i)微生物，j)杀螺剂，k)杀蛆剂，l)杀螨剂，m)驱鸟剂，n)驱昆虫剂，o)植物激素；和p)驱啮齿动物剂。
在另一个实施例中，用于制备人工种子的方法包括下列步骤：a)制备所述容器；b)制备一种或多种可再生的植物组织；以及c)将步骤(b)的组织置于步骤(a)中制备的容器内。
在另一个实施例中，储存人工种子的方法包括获取人工种子并在种植所述种子之前以一种或多种下列条件储存所述人工种子：a)环境条件，b)亚环境温度，c)亚环境氧水平，或d)在亚环境照明条件下，并且其中可再生植物组织保持活力。
在另一个实施例中，种植人工种子的方法包括获取人工种子并进行下列步骤：a)在种植期间在所述人工种子中引入一个或多个缺口，其中缺口有利于可再生植物组织的生长，b)使人工种子扩张，以及c)a)和b)的组合。
附图说明
图1：图1示出用于制备人工种子的容器的基本设计。这幅图中数字是：(1)闭合件；(2)空间；(3)苗；(4)纸圆柱体；(5)琼脂培养基；(6)任选的棉。
图2：图2示出纸容器的开孔结构。
图3：图3是示出甘蔗人工种子在种植后作为时间函数的萌发分数的图。实线示出包含杀真菌剂的人工种子的苗生长。虚线示出不含杀真菌剂的人工种子的苗生长。在Y轴上示出人工种子萌发的苗分数。时间(天数)在X轴上示出。
图4：图4是包含苗的培养皿的照片，苗在MS液体培养基中培养10天，随后将它们转移到培养皿中的MS琼脂培养基中再培养10天。将苗按一定尺寸分成较小的1.0-1.5cm的苗(组1)和较大的修剪成1.6-2.0cm的组(组2)(左边的两个培养皿-1.6-2.0cm(组2)；右边的培养皿为1-1.5cm长(组1))
图5：图5示出完全装配的人工种子的照片。左侧图是内部带有土壤的一个较小的(4×0.8cm)和一个较大的(6×1.1cm)完全装配的人工种子的侧视图。右侧图示出其中带有苗的装配人工种子，其通过顶部闭合件进行观察。
图6：图6示出完全装配的人工种子在土壤中3周后的照片，成功的人工种子示出苗透过闭合件。在左侧图上观察到小的和大的人工种子。右上方的图示出大的人工种子的闭合顶视图，该种子的苗透过或试图透过闭合件；右下方的图示出较小的人工种子。
图7：图7是示出小(4cm直径)和大(6cm直径)的人工种子的百分比的图，该种子具有发芽透过闭合件的苗。产生植物的百分比在Y轴上示出并且处理方式在X轴上示出。直接种植的苗(对照)的成活百分比在右侧图中示出。
图8：图8是17天苗龄的苗(1.2-3.2cm长)的照片，其用于测试不同的移植基质。
图9：图9是在Y轴上示出人工种子成活/出苗(％)并在X轴上示出天数的图，(T1)示出成活百分比并且(T2-T5)示出17天苗龄的苗的出芽率。T1示出直接种植的结果；T2示出使用带有土壤的容器的结果；T3示出使用带有土壤+水结晶的容器的结果；T4示出使用带有珍珠岩+泥煤苔藓+水结晶的容器的结果；并且T5示出使用带有水结晶的容器从第7天到第63天的结果。
图10：图10是示出芽高度和人工种子在温室中生长63天后萌发的苗数目(Y轴)、以及在X轴上示出多种处理的图。T1＝直接种植；T2＝带有土壤的容器；T3＝带有土壤+水结晶的容器；T4＝带有珍珠岩+泥煤苔藓+水结晶的容器；和T5＝带有水结晶的容器。
图11：图11示出芽和根经修剪过的苗的照片，它们用于包封(左侧图)，以及用于种植的人工种子(右侧图)。
图12：图12示出用于手动种植人工种子的空穴的照片，该种植通过金属棒装置在垄沟中央进行(左侧图)。在喷水前置于空穴中的种子构建体的顶视图(右侧图)。
图13：图13是示出KQ228植物从纸和塑料容器(X轴)中出苗和生长(Y轴)以及直接种植在土壤中的植物的成活和生长(无任何容器覆盖)的图。
图14：图14示出由塑料人工种子(上侧图)在生长5周后产生的植物的照片。根系在人工种子植物(左下方图)和直接种植植物(右下方图)中发育良好。
图15：图15示出纸质人工种子的示意图，其在侧面带有附加的窗口用于改善水平种植的成活率。这幅图中数字是：(7)开孔；(8)窗口和(9)平末端。
图16：图16示出蜡纸管的底端如何进行卷曲
图17：图17示出锥形盖的蜡纸管人工种子，其中锥形盖由在末端带有切孔的离心管形成，并且纸管的底部卷曲。
图18：图18示出锥形盖的蜡纸管人工种子，其中以一角度切割锥形盖，并且将柔性透明膜粘结到邻近处，其自由端覆盖锥形盖中的孔。这形成翼片，它减少种子的水分损失，同时允许植物将这个翼片推到一边。纸管底部是卷曲的。
图19：图19示出锥形盖的蜡纸管人工种子，它以不同深度(8或12.5cm)种植，在底部带有超吸收小珠。
图20：图20示出由两个带有孔和的开放底端的叠堆锥形塑料管构成的人工种子结构，所述孔在锥形尖端处。
图21：图21示出由单个锥形管构成的人工种子结构，该锥形管由一个50mL聚丙烯离心管制成，在顶端带有一个孔并且有一个覆盖该孔的柔性透明翼片，并具有开放的底端。
图22：图22示出由两个锥形管构成的人工种子结构，该锥形管由15mL和50mL的聚丙烯离心管制成，它们取向相反并围绕具有甘蔗苗的土壤塞同心放置。环形空腔包含水溶胀的超吸收聚合物。内管具有在底部切出的狭槽，其允许水分从环形空腔进入具有植物的空腔。50mL管的宽末端覆盖有未拉伸的M并且内管的底端是开放的。
图23：图23示出由两个锥形管构成的人工种子结构，该锥形管由15mL和50mL的聚丙烯离心管制成，它们取向相同，同心放置，并且环形空腔保持空置，底端保持开放。
图24：图24示出由一个管构成的人工种子，该管带有能够扩张的帐篷形状的膜围绕着它。膜在移除在种植前将其保持在原位的纸带后发生扩张。
图25：图25示出锥形管人工种子，它具有狭槽状的柔性膜，该膜在圆柱形管的末端成型为锥形末端。柔性膜锥形末端的“翼片”可被生长的苗推开(未示出)。
图26：图26示出用卷绕塑料片材构造的锥形管人工种子，该片材在一个侧面带有锯齿状图案，产生可被生长的苗(未示出)推开的“翼片”和可被生长的苗扩张的“卷轴”形状。
图27：图27示出锥形袋人工种子，其由聚(乳酸)与甘蔗苗和在内部的润湿360构成，沿着底边热密封。在种植前沿如虚线所示的两条垂直线切开底端和顶部。
图28：图28示出具有用于锚固目的的桩的锥形管人工种子。
图29：图29示出具有用于锚固目的的可延展翼片的锥形管人工种子。
图30：图30示出管状人工种子，其带有从侧面开口插入的苗。
图31：图31示出袋型人工种子，其在底部每半边具有孔并具有开口顶部。
图32：图32示出袋型人工种子，其带有全部沿着每条边的孔和闭合顶部。
图33：图33示出由通过水溶性材料沿着每个边连接的两个半块构成的锥形管人工种子。当水溶性材料溶解时，两个半块分开并且可被生长的苗推开。
图34：图34示出由两个半块构成的锥形管人工种子，其带有用柔性胶胶粘的一个边，形成铰接边缘。这个种子可被生长的苗枢转分开。
图35：图35示出卷轴形的人工种子，其中一个带用于保持它处于压缩状态，并且随后被移除以使种子扩张至它的实际尺寸。这减少了种子在储存期间的尺寸。
图36：图36示出可折叠的人工种子，其由围绕甘蔗苗的柔性透明管和潮湿的360组成。橡皮筋将它保持在折叠状态并且在种植时被移除。这一目的是为了减少人工种子在种植前占据的空间。
图37：图37示出叠缩人工种子，其由两部分透明塑料管制成。较小的部分同心贴合在较大部分内部，用M带形成紧密的贴合性。两部分在种植前处于塌缩状态并且通过在种植时将它们叠缩分开而扩张。这一目的是为了减少人工种子在种植前占据的空间。人工种子的两端都是开放的。
图38：图38示出手风琴形状的扩张人工种子，其由有棱纹的管制成，带有较柔性的顶端，它是塌缩的并且在种植前用带固定在原位。在种植时移除带以扩张种子结构。这一目的是为了减少人工种子在种植前占据的空间。人工种子的底端是开放的。
图39：图39示出管状人工种子，其具有薄膜末端，薄膜用两个交叉的切口形成狭槽。
图40：图40示出锥形管人工种子，其具有包含超吸收聚合物的分开的隔室，在这种隔室和包含苗的隔室之间具有塑料筛网，以及具有附接到底端的塑料筛网。
图41：图41示出锥形管人工种子，其带有漏斗形的盖和开放底端。
图42：图42示出锥形管人工种子，其带有封端的底端和在管的相对两端的两个狭槽，从而形成将水分保持在种子中的杯。
图43：图43示出叠缩的锥形管人工种子，其由无孔柔性套管底部部分构成，该柔性套管在底部同心拟合到在顶部带有锥形孔的刚性管中。底部套管由聚(ε-己内酯)制成，允许它在土壤中降解。
图44：图44示出卵形的合成种子结构。
图45：图45示出可扩张管概念，其具有柔性顶部部分和刚性底部部分。
图46：图46示出可折叠的柔性管形状的人工种子，其带有沿每条边的热密封隔室。顶端是开放的并且底端或是左侧开放的或是热密封的。
图47：图47是在光学目标顶部的膜的图片。从左至右：聚(乳酸)(PLA4032D NatureWorks，Minnetonka，MN)，在PLA4032D中22重量％的聚(1，3-丙二醇琥珀酸酯)，在PLA4032D中50重量％的聚(1，3-丙二醇琥珀酸酯)。
具体实施方式
应当理解，本发明不限于所述的特定方法、方案、细胞系、属、和试剂，它们可有所不同。也应当了解，本文使用的方法目的仅是为了描述具体实施例，不旨在限制本发明的范围。
如本文所用，除非上下文清楚地另外指明，单数形式的“一个”、“和”、以及“所述”包括复数涵义。因此，例如，“一个细胞”的涵义包括多株该类细胞，并且“所述蛋白质”的涵义包括一种或多种蛋白质的涵义及其本领域的技术人员已知的等同物，等等。除非另外清楚地指明，否则本文所用的所有科技术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的一样。
本发明的一个实施例涉及植物人工种子的发育(图1)，其中将可再生植物组织(3)置于容器(4)中，并且将该容器种植在土壤中，并允许可再生植物组织生长。本发明的人工种子包括容器和可再生植物组织。
在另一个实施例中，本发明提供人工种子，其包括一种或多种可再生植物组织、包含可降解部分的容器、未阻塞的空间、和营养物质源，并且还包括选自下列的特征：穿过其可再生植物组织生长的可穿透或可降解区域、容器的单层水溶性部分、在约1℃和50℃之间流动的容器的区域、在可再生植物组织生长期间发生物理位移的可分离闭合件、在容器的侧面或底部的一个或多个开口、通向在顶点处的宽度小于2cm的开口的锥形或渐缩区域，并且其中锥形或渐缩区域的角度从相对侧测量时小于135度、和穿过其可再生组织生长的多个柔性翼。可降解区域可为可生物降解的、可光降解的、可氧化降解的、可水解降解的、或可堆肥的。如本文所用，“区域”是指容器或任何相关联闭合件的任何部件。
可再生植物组织是能够再生成具有与亲本植物相同特征和遗传同一性的成熟植物的组织。如本文所述用于包封人工种子的可再生植物组织包括但不限于顶端或侧生分生组织、愈伤组织、体细胞胚、自然胚、苗、叶轮生体、茎和叶扦插、天然种子、和芽。任何年龄的植物可为这些组织的来源。如本文所用，“顶端分生组织”是指在生长的茎顶端的分生组织。它是随着茎的伸长和高度增加产生新叶以及侧生分生组织的组织。
各种分生组织如茎尖分生组织、侧枝分生组织、根尖分生组织、维管形成层和新生叶被用于实施本发明。在一个实施例中，可使用茎尖分生组织。在另一个实施例中，使用侧枝分生组织。在另一个实施例中使用叶组织。如本文所用，“分生组织”涵盖所有植物可利用的分生组织。
如本文所用，“容器”是指可容纳可再生植物组织的任何中空结构。容器可具有多种形状和形式，只要该形状允许容器容纳植物组织即可。例如，容器可以为球形、圆管形、锥形、立方形、卵形或任何其他横截面形状。在本发明的一个实施例中，可再生植物组织可具有介于0.0001％和90％容器体积的体积。
所关注的一类可再生植物组织是微繁植物组织。微繁组织通常在高度水合环境中生长，并且因此通常缺少特征如全气孔功能和保护形态如表皮层。这些特征对调节组织内的水分是重要的，并且造成这些组织在微繁环境之外成活的问题。具体地，田地环境可能对微繁组织的成活是尤其苛刻的和挑战性的。微繁甘蔗苗缺少脱水耐受性并通常表现出在田地环境中的低成活率。这一问题的传统解决方案是调理温室中的甘蔗苗，然而这需要成本并耗费时间，并且导致植物过大而无法经济地在生产田地中种植。为了维持这些组织在田地环境中的成活率，提供免于脱水的保护是至关重要的。这种保护可涉及保护组织不受风侵害，并且形成围绕组织的潮湿局部环境。这可通过制造围绕组织的物理屏障或容器而达到目的。
微繁组织的另一个特征是通常缺少稳固的木质化结构如木质茎。这些对于为成熟植物提供刚度，防止植物受到风损是重要的。部分由于缺少此类结构，并且有时与天然种子相比这些组织活力降低，对于微繁组织来说离开容器是一个挑战，容器为该组织提供最大防护，使之免于水分损失和脱水。微繁甘蔗苗具有虚弱的、草样的芽，其不能透过常用的包封材料。因此，重要的是开发使这些组织能够离开包装材料并繁殖的机制。
理想的是，容器减少组织在田地环境中经受的水损失速率，水损失通过呼吸作用散失到大气环境中或通过扩散和毛细管作用散失到周围的土壤中。容器也必须具有足够的透气性以允许组织获得它的光合作用和呼吸作用所需的气体。另外，容器允许一些光通过用于植物的光合作用是有益的。假定容器为组织提供充分的保护，使其能够成活并生长，该组织将生长至一定大小，使它需要离开并脱出该容器。这允许根在土壤中增殖以获得附加的营养物质和水源，并且允许叶和芽增殖以提高光合作用。
在一个实施例中，本发明提供新型包封容器用于微繁组织的递送和成功生长，所述新型包封容器下文称为人工种子。一般来讲，人工种子将具有顶端和底端，并且微繁组织的定位使得芽朝着顶端生长，并且根朝着底端生长。在本发明的非限制假说中，据信对于防止水分丧失来说，人工种子的顶部区域比底部区域更重要，这是由于这一事实：土壤提供了蒸发缓冲，并且取决于人工种子种植的深度还可提供水源。
本发明的人工种子可包括一种或多种下列机制(包括所有七种)以平衡人工种子的水分保留特征，同时允许微繁组织的最终离开和增殖：
1)在本发明的一个实施例中，设想人工种子的弱区域或其盖，它们阻止水分损失，同时允许发育植物的芽和根穿透它们。整个容器由此种弱材料构成是不可行的，因为这将造成处理、储存和种植方面的问题；
2)在本发明的另一个实施例中，人工种子包括可降解区域或其盖，它们阻止水分损失并以与植物自身内部的保护结构的生长和发育相当的速率降解，使得该容器在一定发育有利的阶段释放植物。降解机制包括但不限于下列其中之一：生物降解、水解降解、光降解或氧化降解。在一个具体实施例中，人工种子包括两种可降解材料或由两种可降解材料组成，它们具有不同的降解速率，其中表面下部分的降解速率比悬空部分的降解速率更快。在一个非限制性例子中，一旦表面下部分已经降解，悬空部分随着芽生长而离开原位；
3)在本发明的另一个实施例中，人工种子包括翼片样结构，其中多个柔性翼片会聚以基本上包封结构的一端或两端，优选结构的顶端。通过材料选择和几何特征(厚度、相对于发芽的角度)设计翼片的机械特征，使虚弱的植物挠曲并从而离开人工种子；
4)在本发明的另一个实施例中，人工种子包括顶盖、盖或紧固件结构，它们被生长的植物移位。在一个具体实施例中，顶盖、盖或紧固件结构被叠缩动作移位或经由弱粘合接头的破裂移位；
5)在本发明的另一个实施例中，人工种子在顶部包括渐缩区域，导致相对于人工种子直径或横截面较小的开口。这些渐缩区域引导微繁组织的芽朝向开口，它们通过开口离开；
6)在本发明的另一个实施例中，人工种子包括水溶性顶部区域或闭合件，其中闭合件被灌溉或降雨溶解，从而允许微繁组织的芽生长至人工种子结构之外；
7)在本发明的另一个实施例中，人工种子包括一个区域或闭合件，其中该闭合件或区域在1-50℃之间流动或蠕变。这一温度范围与其中本发明涉及的田地环境中经受的典型环境温度相当。
在另一个实施例中，容器包括弱接缝或带狭槽的边缘，允许它开口并释放生长组织。弱接缝可在容器中通过本领域已知的任何方法形成，包括但不限于穿孔、打薄容器的壁区域、预应力、折皱、或断裂的容器的区域。在一个实施例中，容器是挤出的圆柱形管，其中弱接缝通过沿着接缝挤出材料较薄的区域，沿着一个或多个边形成。在另一个实施例中，容器是带有一个沿着一条边的狭槽切口的圆柱形管。随后容器的材料具有足够的柔性以允许苗推动容器开口。在一个实施例中，容器可由两个或更多个片或部件构成，它们可被生长组织分开或通过溶解或降解连接它们的粘合剂分开。在一个实施例中，容器由挤出的圆柱形管构成，其沿着圆柱体的长度方向带有可溶解或可降解材料的带。这可通过挤出双部件或多部件来完成，或通过使用粘合剂或热密包封配多个片来完成。在另一个实施例中，容器由管的两个纵向半块组成，它们通过粘合剂连接。在另一个实施例中，两个半块沿着一条边通过包括但不限于热密封或粘接剂的方式连接，使得形成铰接结构。在一个实施例中，粘合剂由水溶性聚合物组成，包括但不限于聚(乙烯醇)或聚(乙烯吡咯烷酮)。两个半块可使用粘合剂或可降解材料连接。粘合剂在约1-50℃的温度范围内可为水溶性的或可流动的。可降解材料可为以水解方式可降解的、氧化可降解的、能够生物降解的、可堆肥的、或可光降解的。在另一个实施例中，容器由两个相连的管构成。连接部分可具有不同的孔隙率和/或可降解能力。该部分可通过包括但不限于插入、胶带或粘合剂的方式连接。在一个实施例中，顶部部分由塑料构成，并且底部部分由纸构成。
容器可具有锥形或渐缩的特征。从锥形部分一侧向相对侧测得的锥形特征的角度可不同，优选地小于179度，更优选地小于135度，并且最优选地小于100度。本文将锥形管定义为具有连接到其上的一个或多个锥形特征的圆柱形管。锥形特征可由与圆柱形管相同的材料或不同的材料制成。锥形或渐缩的特征可具有一个或多个孔，植物能够通过孔生长。另外，孔提供快速的换气。孔尺寸可为0.1至30mm，优选地1至20mm，并且更优选地3至15mm。
容器可为能够扩张的或可塌缩的，使得在种植前(对于在储存期间)种子占据比种植后更小的体积。容器可具有能够扩张的部分或部件。如本文所用，“能够扩张的”是指增加尺寸的能力。这例如通过同心管状或圆柱形容器获得，它们可发生叠缩以形成较长的管。
如本文所用，“叠缩”是指两个接触对象以相对方向运动，无断开的触点。另外，容器可为部分或全部可折叠的，使得折叠容器在种植前比在种植后占据未折叠容器更少的空间。容器可具有折叠或有棱纹的部分，允许当保持与扩张形式相同的总体形状时发生塌缩。容器可通过手风琴样结构的解折叠发生扩张。容器可具有硬化部件。如本文所用，“硬化部件”是指提高对象刚度的部件。硬化部件包括但不限于折皱、折叠、膨胀隔室、和容器的厚或有棱纹的区域。容器可由卷绕的片材或管形成，使得结构在种植时或种植后能够通过组织的生长展开或解开。如本文所用，“展开”是指展开卷绕的对象，并且不丧失对象的总体形状。容器可具有可塌缩的膜，其能够扩张以形成围绕人工种子的保护性帐篷。在一个实施例中，人工种子的容器也可为可拉伸的。如本文所用，“拉伸”是指通过在一个或多个方向上变形的拉伸动作。在一个实施例中，容器可为可塌缩的和可膨胀的。塌缩可通过施加外部压力或通过真空密封实现。在破坏密封时，容器可自动再膨胀。作为另外一种选择，可施加气体压力以引起膨胀。在许多情况下，可使用约束装置以保持容器在种植前处于压实或塌缩形式。这种约束装置包括但不限于带或胶带、胶或其他紧固件。
在一个实施例中，人工种子具有封闭底端，其包含水分。这种封闭端阻止水分排入周围的土壤。随后定位在容器的侧面上的孔以允许根生长，同时保持人工种子底端的封闭性质。
容器可包括一个袋或小袋。袋可被完全密封或可具有多个开口。袋可由能够生物降解的、可光降解的、可氧化降解的、或可水解降解的材料制成。袋可为柔性的或半柔性的。将半柔性的定义为能够通过外力变形，但是在除去外力后恢复到类似于它初始形状的形状。袋可具有硬化部件。袋可具有包括但不限于管状、圆柱形、矩形、正方形或圆形的形状。
容器可为透明的、半透明的、部分半透明的或不透明的。透明材料包括但不限于聚碳酸酯和玻璃。半透明材料包括但不限于高密度聚乙烯和聚丙烯。部分半透明材料包括但不限于毛玻璃和涂膜塑料。不透明材料包括但不限于填充塑料、木材和纸。
容器的尺寸可能有差别。然而，在一个实施例中，容器具有圆柱形形状，其具有在0.01-0.25cm范围内的壁厚和0.5-5cm的直径与1-30cm的长度。
可使用多种材料制备容器，并且在本发明的一个实施例中用于制备容器的材料包括下列物质或由下列物质构成：纤维素材料，例如纤维素、乙基纤维素、硝化纤维、乙酸纤维素、丙酸纤维素、乙酸丁酸纤维素；具有或不具有蜡和油的合成和天然聚合物和塑料例如明胶、脱乙酰壳多糖、玉米素、聚烯烃、聚丙烯、聚乙烯、聚烯烃、可光降解的聚合物、可氧化降解的聚合物、聚苯乙烯、丙烯酸共聚物、多(烷基(甲基)丙烯酸酯)、聚酯、聚醚、聚(乙酸乙烯酯)共聚物、聚(丙烯酰胺)、聚(乙烯吡咯烷酮)、聚(乙烯吡啶)、天然橡胶、聚环氧乙烷、聚酰胺、多糖和聚碳酸酯、多孔和非织造材料、以及它们的交联形式、它们的组合、它们的共聚物和它们的增塑形式；能够生物降解的塑料包括聚(羟基链烷酸酯)、聚(乳酸)、聚(L-丙交酯)、聚(D-丙交酯)、聚(D，L-丙交酯)、聚(L-丙交酯)与聚(D-丙交酯)的立构复合结构、聚(1，2-丙二醇琥珀酸酯)、和它们的共聚物以及它们的交联形式。
多孔材料包括但不限于陶瓷、非织造材料和纺织品。容器也可为无孔的。无孔材料包括但不限于塑料、玻璃和金属。容器可由可渗透材料制成。渗透性包括但不限于透水性、透气性和透氧性。可渗透材料包括聚(乙烯醇)、聚(二甲基硅氧烷)和天然橡胶。容器可由不可渗透的材料制成。不可渗透性包括但不限于水分不可渗透的或阻隔材料、气体不可渗透的或阻隔材料和氧气不可渗透的或阻隔材料。不可渗透的材料包括但不限于玻璃、金属和聚乙烯对苯二甲酸。蜡和/或油可用于涂覆容器壁。蜡包括但不限于石蜡、鲸蜡、蜂蜡和巴西棕榈蜡。
优选的是本文所述的人工种子在田地环境中基本上降解或完全降解，使得种植的容器经多年重复种植后不在田地里积聚。为了实现这一目的，可使用能够生物降解的材料构造容器和闭合件。传统的能够生物降解的材料包括聚(乳酸)、聚(1，3-丙二醇琥珀酸酯)、聚(丙烯琥珀酸酯)、聚(羟基丁酸酯)、聚(己内酯)和纤维素衍生物，它们是候选的能够生物降解的材料。在聚(乳酸)的一个优选的实施例中，掺入具有较高D-乳酸含量(通常＞6摩尔％D-乳酸)的无定形等级以提供比包含更多结晶的聚(乳酸)(＜6摩尔％D-乳酸)更高的降解速率。
提高可降解能力同时降低脆性的另一种方法涉及共混聚(乳酸)或无定形聚(乳酸)与可较快速降解的聚合物如聚(己内酯)、聚(羟基丁酸酯)或热塑性淀粉(Rychter等人，Biomacromolecules 2006，7，3125)。共混物可通过本领域已知的任何方法形成，包括溶液共混、熔融共混、挤出、配混、反应性挤出物等等。如本文所用，“共混物”是指两种或更多种组分的混合物。共混物可为可混溶的、不混溶的、部分可混溶的并且可由每种组分的独立域组成。在本发明的一个实施例中，用于制备容器的材料可包含下列物质或由下列物质组成：聚(乳酸)、聚(羟基丁酸酯)、聚(羟基丁酸酯-共-戊酸酯)、淀粉、纤维素、和脱乙酰壳多糖的共混物，任选地与增塑剂共混，包括但不限于山梨醇、甘油、柠檬酸酯、邻苯二甲酸酯和水。将增塑剂定义为降低材料的玻璃化转变温度的物质。
在本发明的另一个实施例中，容器包含或由聚(乳酸)与聚(1，3-丙二醇琥珀酸酯)的共混物组成。此类共混物是目测半透明的至半透明的，这有利于光达到组织。结晶聚(乳酸)与聚(1，3-丙二醇琥珀酸酯)的共混物是部分可混溶的，这通过存在两个玻璃化转变温度(其作为组成的函数而改变)得到证明。另外，光学透明度甚至在聚(1，3-丙二醇琥珀酸酯)的高浓度下(甚至50重量％)保持良好。另外，本文公开聚(1，3-丙二醇琥珀酸酯)表现出快速的土壤降解能力，这对于人工种子的用途是理想的。
提高可降解能力同时降低脆性的另一种方法涉及用增塑剂增塑聚(乳酸)，增塑剂包括但不限于柠檬酸酯衍生物、柠檬酸酯、乙酰柠檬酸丁酯、柠檬酸三乙酯、柠檬酸三丁酯、二羟甲基丙二酸二乙酯、邻苯二甲酸酯、甘油、聚(乙二醇)、聚(乙二醇)单月桂酸、低聚(乳酸)。
在另一个实施例中，容器是可降解的，其降解速率与组织生长速率相当。在这个实施例中，容器包含或由聚(ε-己内酯)或聚(羟基链烷酸酯)组成。在一个实施例中，整个容器由聚(ε-己内酯)或聚(羟基链烷酸酯)制成，使得接触土壤的部分的降解速率足以允许根离开并在周围土壤中增殖，并且随后顶部被生长的芽施加的力推开或推离。
在另一个实施例中，容器和/或它的闭合件包含或由可溶解材料构成。在一个此种实施例中，容器和/或它的闭合件包含或由下列物质组成：聚(乙烯醇)与淀粉、纤维素纤维和甘油的共混物，其任选地与合适的剂交联，包括但不限于六甲氧甲基三聚氰胺或戊二醛。这提供了在潮湿土壤条件下可快速降解的材料，允许内部的组织快速生长。淀粉可来自下列来源：包括但不限于马铃薯、玉米、稻、小麦和木薯，并且可为改性的或未改性的。附加的添加剂可包括但不限于聚(乙二醇)、柠檬酸、尿素、水、包括但不限于乙酸钠、硝酸钾和硝酸铵的盐、肥料、琼脂、黄原胶、藻酸盐、和包括但不限于羟丙基纤维素、甲基纤维素和羧甲基纤维素的纤维素衍生物。
容器也可包含增塑剂、抗氧化剂、成核剂、增韧剂、着色剂、填料、抗冲改性剂、加工助剂、稳定剂、和阻燃剂。抗氧化剂包括但不限于对苯二酚、1010、和维生素E。成核剂包括但不限于碳酸钙、环糊精和苯基膦酸锌。增韧剂包括但不限于苯乙烯嵌段共聚物、Strong、和油。着色剂包括但不限于颜料和染料。填料包括但不限于淀粉、云母和二氧化硅。抗冲改性剂包括但不限于ParaloidTM BPM-520、280、和丁二烯橡胶。加工助剂包括但不限于芥酸酰胺和硬脂基芥酸酰胺。稳定剂包括但不限于UV稳定剂、受阻胺光稳定剂、抗臭氧剂和有机含硫酸化合物。阻燃剂包括但不限于三水合氧化铝(ATH)、氢氧化镁(MDH)、膦酸酯、磷酸三苯酯、磷酸酯、焦磷酸铵和聚磷酸三聚氰胺。
当容器由纤维素材料构成时，它可任选地含有粘土、矾、蜡、粘合剂、胶、表面活性剂和阻隔如塑料或金属层。纤维素材料可为多孔的并且可具有多个层，该层包括多种纸或由纸构成，包括但不限于牛皮纸、铜版纸、再循环纸、可再循环的新闻纸、彩色美术纸、木屑压合板、纸杯纸板、复印纸、蜡纸、和涂布纸。
在目前公开的发明中，人工种子可使用纸或塑料容器制备。用于构造容器的纸或塑料具有适于此种用途的下列性能：它不被其中包含的含水营养物质源立即过度软化。纸容器可为天然多孔的，并且在土壤中经过至少5年可降解。塑料容器可为多孔的或无孔的，并且在土壤中可为或可不为可降解的。塑料材料是热塑性或热固性材料。
在一个实施例中，蜡纸可用于制备纸容器。在这种情况下，蜡纸容器的尺寸可为约1.19cm的直径和4-6cm的长度。
圆柱形容器可具有在顶部和底部的平坦端部。在一个实施例中，容器底端是开孔的(参见图2)。如本文所用，“开孔”是指经由使用从边缘延伸的插片材料和凹入边缘的凹痕形成的不规则边缘。开孔尺寸可为0.65cm至约2cm的长度，带有2-6个插片。在另一个实施例中，开孔可为0.8cm至约1.2cm的长度，带有3-4个插片。
人工种子也可包括一种或多种营养物质源(图1，(5))、固体物质如棉花块(图1，(6))、杀虫剂、杀真菌剂、杀线虫剂、抗微生物化合物、抗生素、杀生物剂、除草剂、植物生长调节剂或刺激剂、微生物、杀软体动物剂、杀蛆剂、杀螨剂、驱鸟剂、驱昆虫剂、植物激素、驱啮齿动物剂、肥料、水凝胶、超吸收剂、填料、土壤、土壤改良剂和水。杀生物剂包括但不限于次氯酸盐、二氯异氰尿酸钠、购自Plant Cell Technology的Plant Preservative MixtureTM和三氯异氰尿酸钠。杀软体动物剂包括但不限于、蜗牛敌或灭虫威。杀螨剂包括但不限于伊维菌素或扑灭司林。将驱鸟剂定义为驱逐鸟类的物质。驱鸟剂包括但不限于氨茴酸甲酯、灭虫威、氯蜱硫磷和丙环唑。将驱啮齿动物剂定义为驱逐啮齿动物的物质。驱啮齿动物剂包括但不限于二硫四甲秋兰姆和灭虫威。驱昆虫剂包括但不限于N，N-二乙基-间-甲苯甲酰胺、精油和香茅油。杀蛆剂包括但不限于阿巴美丁和溴虫腈。植物激素包括但不限于脱落酸、生长素、细胞分裂素、乙烯和赤霉素。植物生长调节剂包括但不限于多效唑、乙烯利、和嘧啶醇。如本文所用，“超吸收剂”是指吸收水或水溶液，产生水合凝胶，使得凝胶重量为干燥超吸收剂重量30倍或更大的吸收剂。超吸收剂包括但不限于超吸收聚合物、交联聚(丙烯酸钠)、交联聚(丙烯酸)、交联聚(丙烯酸)盐、丙烯酸改性淀粉、丙烯酸与聚(乙二醇)丙烯酸酯的交联共聚物、聚(乙二醇)甲基丙烯酸酯、聚(乙二醇)二丙烯酸酯、丙烯酰胺、乙酸乙烯酯、丙烯酸盐、双丙烯酰胺、N-乙烯吡咯烷酮、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、苯乙烯单体、二烯单体和交联剂。超吸收剂可以干燥或溶胀状态存在于人工种子中。它可用水或水溶液溶胀，包括但不限于营养物质溶液、肥料溶液和抗微生物溶液。超吸收剂也可与土壤或营养培养基的其他组分混合。在一个实施例中，超吸收剂可存在于种子的单独隔室中。隔室可与包含可再生植物组织的隔室相连或不相连。隔室可通过筛网或网片与包含组织的隔室分开。微生物包括但不限于有益微生物、固氮细菌、根瘤菌属、真菌、固氮菌属、根菌、释放纤维素酶的微生物、和促进人工种子容器降解的微生物。
适于在其中可再生植物组织将被插入生长的容器中使用的土壤应能够提供透气、水、营养、和用于生长可再生植物组织的固定点。可在容器中使用各种土壤，包括合成土壤如和蛭石。它也可包括天然土壤如沙土、粉砂壤土、泥煤、和这些土壤的混合物。合适的土壤可存在，使得容器最多充满99％。
本发明所公开的人工种子包括在容器内的空间(2)。人工种子也可含有闭合件(图1，(1))。将闭合件定义为盖、顶盖或覆盖开口的物体。在一个实施例中，闭合件可与容器分离。可再生植物组织可能够在其生长期间推开或脱出分离的闭合件。分离闭合件包括但不限于顶盖、插入件、平膜、圆顶形顶盖和锥形顶盖。分离闭合件可使用粘合剂或可降解材料附接到容器上。粘合剂在约1-50℃的温度范围内可为水溶性的或可流动的。可降解材料可为以水解方式可降解的、氧化可降解的、能够生物降解的、可堆肥的、或可光降解的。顶盖或盖也可通过简单的物理方法进行附接，包括但不限于插入或卷曲。
如本文所用，“营养物质源”是指能够有助于维持并提供植物从可再生组织开始的生长的营养物质。合适的营养物质包括但不限于下列一种或多种：水、土壤、椰棕、蛭石、人工生长培养基、琼脂、植物生长调节剂、植物激素、超吸收聚合物、宏量营养素、微量营养素、肥料、无机盐(包括但不限于硝酸盐、铵、磷酸盐、钾和钙盐)维生素、糖和其他碳水化合物、蛋白质、脂质、Murashige and Skoog(MS)营养配方、Hoagland营养配方、Gamborg B-5培养基、营养配方和天然与合成土壤、泥煤和酒糟、以及它们的组合。宏量营养素包括但不限于硝酸盐、磷酸盐和钾。微量营养素包括但不限于氯化钴、硼酸、硫酸亚铁和硫酸锰。营养物质源也可含有细胞外多糖如在Mager、D.M.和Thomas，A.D.Journal of AridEnvironments，2011，75，2，91-7中描述的那些。
营养物质源也可包含激素和植物生长调节剂，包括但不限于赤霉酸、吲哚乙酸、萘乙酸(NAA)、乙烯利、6-苄氨基嘌呤(6-ABP)、2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)、多效唑、嘧啶醇和脱落酸。
营养物质可存在于水溶液或含水凝胶溶液中，例如在植物繁殖领域中熟知的那些，包括但不限于天然和合成凝胶，包括：琼脂、琼脂糖、结冷胶、瓜尔胶、阿拉伯树胶、GelriteTM、PhytagelTM、超吸收聚合物、角叉菜胶、直链淀粉、羧甲基-纤维素、葡聚糖、刺槐豆胶、藻酸盐、黄原胶、明胶、果胶、淀粉、玉米素、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸、聚(乙二醇)和它们的交联形式。
在一个实施例中，营养物质可存在于硅酸盐凝胶中。此种硅酸盐凝胶可通过用酸中和硅酸钠或硅酸钾溶液形成。在一个实施例中，后续洗涤或浸泡步骤可用于除去过量的盐。任选地，随后可通过浸泡或其它方法将营养物质注入凝胶。作为另外一种选择，硅酸盐凝胶可由硅酸或其他前体形成，包括但不限于烷氧基硅烷、甲硅烷基卤化物、或硅氮烷。
当容器包含营养物质源时，在容器内的可再生植物组织被部分嵌入或接触营养物质源并可部分暴露于容器内的空间。如本文所用，术语“部分暴露于空间”是指接触或已经部分嵌入容器中存在的营养物质源的可再生植物组织(即，浸入0至90％的组织)，其剩余部分暴露于容器内的空间。可再生植物组织可部分或全部被营养物质源包围。可再生植物组织也可置于营养物质源顶部。如本文所用，“空间”是指容器内的空隙，该容器是空的，无任何固体或液体材料，并且充满大气气体如空气。如本文所定义的空间不包括在多孔或颗粒物质中的共同空隙。
除了容器壁的限制外，空间再无限制可再生植物组织生长的阻隔对人工种子的功能是有利的。如本文所用，“无阻隔的空间”是指在可再生植物组织的任何部分和容器的任何区域之间是连续的并且无中断的空间。如本文所用，“渐缩的”是指沿着某一尺寸变窄或逐渐变得更窄。
出于本公开发明的目的，可再生植物组织可使用相关领域熟知的多种方法进行制备，例如在国际公布WO2011/085446中所述的分生组织的组织培养方法，其公开内容以引用方式并入本文。其他可能的方法包括利用植物扦插、来自天然种子的胚或通过体细胞胚胎形成获得的体细胞胚。在一个实施例中，可切出分生组织以形成外植体并进行培养以增加组织量。如本文所用，术语“外植体”是指已经从植物中切出，将用于植物组织培养的组织。
本发明的可再生植物组织也可为经基因修饰的。这种基因修饰包括但不限于抗除草剂性、病害抗性、耐旱性、和抗昆虫性。经基因修饰的(也称为转基因)的植物可具有单个转基因性状或一个或多个转基因多核苷酸与一个或多个附加的多核苷酸的堆叠，导致多个多肽序列的产生或抑制。具有多核苷酸序列堆叠的转基因植物可通过传统的育种方法或基因工程方法中的任一者或两者获得。这些方法包括但不限于育种每个包含所关注的多核苷酸的单个品系、用后续基因转化包含基因的转基因植物并把基因共转化到单个植物细胞中。
如本文所用，术语“堆叠的”包括具有存在于相同植物的多个性状(即，将两个性状整合到核基因组中，将一个性状整合到核基因组中并将一个性状整合到质粒基因组中，或将两个性状整合到质粒基因组中)。在一个非限制性例子中，“堆叠的性状”包括分子堆叠，其中序列物理上彼此邻近。如本文所用，性状是指来源于特定序列或序列组的表型。基因的共转化可使用包含多个基因的单转化载体进行，或在多个载体上分别携带基因。如果序列通过遗传转化植物堆叠，则受关注的多核苷酸序列可在任何时间以任何顺序进行组合。可以用共转化规程将特性与受关注的多核苷酸同时导入，所述多核苷酸由转化盒的任何组合提供。例如，加入将导入两个序列，可将两个序列包含在分离的转化盒中(反式)或包含在相同转化盒中(顺式)。可通过相同启动子或不同启动子促进序列表达。在某些实例中，可能期望导入将抑制受关注的多核苷酸表达的转化盒。这可以与其它抑制盒或超表达盒的任何组合组合使用以在植物中生成所需特性组合。进一步认识到可使用位点特异性重组体系在所需基因组位点堆叠多核苷酸序列。参见例如国际公布WO 1999/25821、WO 1999/25854、WO1999/25840、WO 1999/25855和WO 1999/25853，每个公开以引用方式并入本文。
在一些实施例中，单独的或与一个或多个附加的抗昆虫性状堆叠的编码多肽的多核苷酸可与一个或多个附加的输入性状(例如抗除草剂性、真菌抗性、病毒抗性、胁迫耐受性、病害抗性、雄性不育、茎强度等等)或输出性状(例如提高产量、改性淀粉、改善的油特征、平衡氨基酸、高赖氨酸或甲硫氨酸、提高的消化性、改善的纤维质量、耐旱性等等)堆叠。因此，多核苷酸实施例可用于提供完整的农学一揽子解决方案，其具有改善的作物质量与灵活地并且高费效比地控制任意多种农学害虫的能力。
用于制备转基因植物的转基因包括但不限于下列：
1.赋予昆虫或病害抗性的转基因：
(A)植物病害抗性基因。植物防御常常被植物中的病害抗性基因(R)产物和病原体中的相应无毒(Avr)基因之间的特定相互作用激活。用克隆抗性基因转化植物品种以工程化对特定病原体菌株有抗性的植物。参见例如Jones等人，(1994)，Science266：789(克隆对黄枝孢霉(Cladosporium fulvum)有抗性的番茄Cf-9基因)；Martin等人，(1993)，Science 262：1432(对丁香假单胞菌番茄致病变种(Pseudomonas syringae pv.tomato)有抗性的番茄Pto基因编码蛋白质激酶)；Mindrinos等人，(1994)，Cell 78：1089(对丁香假单胞菌(Pseudomonassyringae)有抗性的拟南芥(Arabidopsis)RSP2基因)，McDowell和Woffenden，(2003)，Trends Biotechnol.21(4)：178-83和Toyoda等人，(2002)，Transgenic Res.11(6)：567-82。对病害有抗性的植物是与野生型植物相比对病原体抗性更强的植物。
(B)编码苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)蛋白质、其衍生物或在其上建模的合成多肽的基因。参见例如Geiser等人，(1986)，Gene 48：109，他们公开了BtΔ-内毒素基因的克隆和核苷酸序列。此外，编码Δ-内毒素基因的DNA分子可购自American Type Culture Collection(Rockville，Md.)，例如，以ATCC登录号40098、67136、31995和31998购得。经遗传工程的苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)转基因的其他非限制性例子在下列专利和专利申请中给出，并且为此目的以引用方式并入本文：美国专利5,188,960；5,689,052；5,880,275；5,986,177；6,023,013、6,060,594、6,063,597、6,077,824、6,620,988、6,642,030、6,713,259、6,893,826、7,105,332；7,179,965、7,208,474；7,227,056、7,288,643、7,323,556、7,329,736、7,449,552、7,468,278、7,510,878、7,521,235、7,544,862、7,605,304、7,696,412、7,629,504、7,705,216、7,772,465、7,790,846、7,858,849和WO 1991/14778；WO1999/31248；WO 2001/12731；WO 1999/24581和WO1997/40162，它们每个的公开以引用方式并入本文。
(C)编码昆虫特异性激素或信息素如蜕皮激素和保幼激素、它们的变体、基于它们的拟肽或它们的拮抗剂或激动剂的多核苷酸。参见例如Hammock等人，(1990)，Nature 344：458公开的克隆保幼激素酯酶在杆状病毒中的表达，保幼激素酯酶是一种保幼激素灭活剂。
(D)编码昆虫特异性肽的多核苷酸，该肽在表达时破坏感染的害虫的生理机能。例如，参见Regan，(1994)，J.Biol.Chem.269：9(表达克隆产生编码昆虫利尿激素受体的DNA)；Pratt等人，(1989)，Biochem.Biophys.Res.Comm.163：1243(在太平洋折翅蠊(Diploptera puntata)中鉴定出咽侧体抑制素)；Chattopadhyay等人，(2004)，Critical Reviews in Microbiology30(1)：33-54；Zjawiony，(2004)，J Nat Prod 67(2)：300-310；Carlini和Grossi-de-Sa，(2002)，Toxicon 40(11)：1515-1539；Ussuf等人，(2001)，Curr Sci.80(7)：847-853以及Vasconcelos和Oliveira，(2004)，Toxicon 44(4)：385-403。还可参见授予Tomalski等人的美国专利5,266,317，他们公开了编码昆虫特异性毒素的基因。
(E)编码负责超积累单萜、倍半萜烯、甾体化合物、异羟肟酸、苯基丙酸类衍生物或另一种具有杀昆虫活性的非蛋白质分子的酶的多核苷酸。
(F)编码涉及修饰(包括翻译后修饰)生物活性分子的酶的多核苷酸；例如糖酵解酶、蛋白分解酶、脂解酶、核酸酶、环化酶、转氨酶、酯酶、水解酶、磷酸酶、激酶、磷酸化酶、聚合酶、弹性蛋白酶、壳多糖酶和葡聚糖酶，无论它们是天然的或合成的。参见在Scott等人名下的PCT专利申请WO 1993/02197，其公开了胼胝质酶(callase)基因的核苷酸序列。含有编码壳多糖酶序列的DNA分子可从例如ATCC中以登录号39637和67152获得。还可参见Kramer等人，(1993)，Insect Biochem.Molec.Biol.23：691，他们提出编码烟草属植物钩虫壳多糖酶的cDNA的核苷酸序列，和Kawalleck等人，(1993)，Plant Molec.Biol.21：673，他们提供欧芹ubi4-2聚泛素基因的核苷酸序列，以及美国专利6,563,020；7,145,060和7,087,810。
(G)编码刺激信号转导的分子的多核苷酸。例如，参见Botella等人，(1994)，Plant Molec.Biol.24：757公开的绿豆钙调素cDNA克隆的核苷酸序列，以及Griess等人，(1994)，Plant Physiol.104：1467，他们提供玉米钙调素cDNA克隆的核苷酸序列。
(H)编码疏水矩肽的多核苷酸。参见PCT专利申请WO 1995/16776和美国专利5,580,852公开的抑制真菌植物病原体的鲎抗菌肽(Tachyplesin)的肽衍生物)，以及PCT专利申请WO1995/18855和美国专利5,607,914(提出赋予疾病抗性的合成抗微生物肽)。
(I)编码膜通透酶、通道形成剂或通道阻断剂的多核苷酸。例如参见Jaynes等人，(1993)，Plant Sci.89：43公开的杀菌肽-β溶胞肽类似物的异源表达以使转基因烟草属植物对青枯假单胞菌(Pseudomonas solanacearum)有抗性。
(J)编码病毒侵入蛋白质或自其衍生的复合毒素的基因。例如，病毒外壳蛋白质在经转化植物细胞中的积累赋予对由衍生出该外壳蛋白质基因的病毒及相关病毒招致的病毒感染和/或疾病形成的抗性。参见Beachy等人，(1990)，Ann.Rev.Phytopathol.28：451。已经对经转化的植物赋予了针对苜蓿花叶病毒、黄瓜花叶病毒、烟草线条病毒、马铃薯X病毒、马铃薯Y病毒、烟草蚀刻病毒、烟草脆裂病毒和烟草花叶病毒的外壳蛋白质介导的抗性。
(K)编码昆虫特异性抗体或自其衍生的免疫毒素的基因。从而靶向昆虫肠中的重要代谢功能的抗体会使受影响的酶失活，杀死昆虫。Cf.Taylor等人，摘要号497，SEVENTH INT′L SYMPOSIUM ONMOLECULAR PLANT-MICROBE INTERACTIONS(Edinburgh，Scotland，1994)(经由生成单链抗体片段进行的转基因烟草中的酶促失活)。
(L)编码病毒特异性抗体的基因。参见例如Tavladoraki等人，(1993)，Nature 366：469，他们显示了表达重组抗体基因的转基因植物受到保护免于病毒攻击。
(M)编码在自然界由病原体或寄生物生成的发育阻滞蛋白质的多核苷酸。从而真菌内α-1，4-D-多聚半乳糖醛酸酶通过溶解植物细胞壁同-α-1，4-D-半乳糖醛酸酶来促进真菌定殖和植物营养物释放。参见Lamb等人，(1992)，Bio/Technology 10：1436。编码豆内多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白质的基因的克隆和表征描述于Toubart等人，(1992)，Plant J.2：367。
(N)编码在自然界由植物生成的发育阻滞蛋白质的多核苷酸。例如，Logemann等人，(1992)，Bio/Technology 10：305已经显示了表达大麦核糖体失活基因的转基因植物对真菌病害具有提高的抗性。
(O)涉及系统获得抗性(Systemic Acquired Resistance，SAR)响应和/或发病机制相关基因的基因。Briggs，(1995)，Current Biology5(2)，Pieterse和Van Loon，(2004)，Curr.Opin.Plant Bio.7(4)：456-64和Somssich，(2003)，Cell 113(7)：815-6。
(P)抗真菌基因(Cornelissen和Melchers，(1993)，Pl.Physiol.101：709-712和Pariis等人，(1991)，Planta 183：258-264和Bushnell等人，(1998)，Can.J.of Plant Path.20(2)：137-149。还可参见美国专利申请序列号09/950,933；11/619,645；11/657,710；11/748,994；11/774,121和美国专利6,891,085和7,306,946。在作为植物防御真菌病原体的响应第一步中用于感知甲壳质片段的LysM受体样激酶(US 2012/0110696)。
(Q)解毒基因如烟曲霉毒素、白僵菌素、串珠镰刀菌素和玉米赤霉烯酮以及它们的结构相关衍生物。例如参见美国专利5,716,820；5,792,931；5,798,255；5,846,812；6,083,736；6,538,177；6,388,171和6,812,380。
(R)编码胱抑素(Cystatin)和半胱氨酸蛋白酶抑制剂的多核苷酸。参见美国专利7,205,453。
(S)防御素基因。参见WO 2003/000863和美国专利6,911,577；6,855,865；6,777,592和7,238,781。
(T)赋予线虫抗性的基因。参见例如PCT专利申请WO 1996/30517；PCT专利申请WO 1993/19181、WO 2003/033651和Urwin等人，(1998)，Planta 204：472-479，Williamson，(1999)，CurrOpin Plant Bio.2(4)：327-31；美国专利6,284,948和7,301,069以及miR164基因(WO 2012/058266)。
(U)赋予对疫霉根腐病(Phytophthora Root Rot)如Rps 1、Rps 1-a、Rps 1-b、Rps 1-c、Rps 1-d、Rps 1-e、Rps 1-k、Rps 2、Rps 3-a、Rps 3-b、Rps 3-c、Rps 4、Rps 5、Rps 6、Rps 7和其他Rps基因抗性的基因。参见例如Shoemaker等人，Phytophthora Root RotResistance Gene Mapping in Soybean，Plant Genome IVConference，San Diego，Calif.(1995)。
(V)赋予对褐茎腐病(Brown Stem Rot)抗性的基因，例如在美国专利5,689,035中描述并且为此目的以引用方式并入的基因。
(W)赋予对刺盘孢(Colletotrichum)抗性的基因，例如在美国专利申请公布US 2009/0035765中描述并且为此目的以引用方式并入的基因。这包括可用作单基因座转化的Rcg基因座。
2.赋予对除草剂抗性的转基因：
(A)编码对抑制生长点或分生组织的除草剂(如咪唑啉酮或磺酰脲)的抗性的多核苷酸。在这类中的示例性基因编码突变型ALS和AHAS酶，例如分别由Lee等人，(1988)，EMBO J.7：1241和Miki等人，(1990)，Theor.Appl.Genet.80：449所描述的基因。还可参见美国专利5,605,011；5,013,659；5,141,870；5,767,361；5,731,180；5,304,732；4,761,373；5,331,107；5,928,937和5,378,824；美国专利申请序列号11/683,737和国际公布WO1996/33270。
(B)编码对草甘膦(分别由突变型5-烯醇丙酮酰-3-磷酸莽草酸合酶(EPSP)和aroA基因赋予的抗性)和其它膦酰基化合物诸如草胺磷(草胺膦乙酰转移酶(PAT)和吸水链霉菌(Streptomyceshygroscopicus)草胺膦乙酰转移酶(PAT)(bar)基因)、和吡啶氧或苯氧丙酸类和环己酮(ACC酶抑制剂编码基因)的抗性蛋白质的多核苷酸。参见例如授予Shah等人的美国专利4,940,835，其公开了形成能够赋予草甘膦抗性的EPSPS的核苷酸序列。授予Barry等人的美国专利5,627,061也描述了编码EPSPS酶的基因。还可参见美国专利6,566,587；6,338,961；6,248,876B1；6,040,497；5,804,425；5,633,435；5,145,783；4,971,908；5,312,910；5,188,642；5,094,945、4,940,835；5,866,775；6,225,114 B1；6,130,366；5,310,667；4,535,060；4,769,061；5,633,448；5,510,471；Re.36,449；RE 37,287 E和5,491,288以及国际公布EP 1173580；WO 2001/66704；EP 1173581和EP1173582，它们为此目的以引用的方式并入本文。草甘膦抗性还被赋予表达编码草甘膦氧化还原酶的基因的植物，这在美国专利5,776,760和5,463,175中有更充分的描述，它们为此目的以引用的方式并入本文。此外可通过超表达编码草甘膦N-乙酰转移酶的基因来赋予植物草甘膦抗性。参见例如美国专利7,462,481；7,405,074和美国专利申请公布US 2008/0234130。编码突变的aroA基因的DNA分子可通过ATCC登录号39256获得，并且授予Comai的美国专利4,769,061公开了突变基因的核苷酸序列。授予Kumada等人的EP申请0 333 033和授予Goodman等人的美国专利4,975,374公开了谷氨酰胺合成酶基因的核苷酸序列，其赋予对例如L-草胺膦的除草剂的抗性。草胺膦乙酰转移酶(PAT)基因的核苷酸序列在授予Leemans等人的EP专利申请0 242 246和0 242 236中提供；De Greef等人，(1989)，Bio/Technology7：61描述了表达编码用于草胺膦乙酰转移酶(PAT)活性的嵌合bar基因的转基因植物的制备。还可参见美国专利5,969,213；5,489,520；5,550,318；5,874,265；5,919,675；5,561,236；5,648,477；5,646,024；6,177,616 B1和5,879,903，它们为此目的以引用的方式并入本文。赋予对苯氧基丙酸和环己酮如稀禾定和吡氟氯草灵抗性的示例性基因是Acc1-S1、Acc1-S2和Acc1-S3基因，它们由Marshall等人，(1992)，Theor.Appl.Genet.83：435描述。
(C)编码对抑制光合作用的除草剂如三嗪(psbA和gs+基因)和苯甲腈(腈水解酶基因)有抗性的蛋白质的多核苷酸。Przibilla等人，(1991)Plant Cell 3：169描述了用编码突变型psbA基因的质粒转化南极冰藻(Chlamydomonas)。授予Stalker的美国专利4,810,648公开了腈水解酶基因的核苷酸序列，并且包含这些基因的DNA分子可通过ATCC登录号53435、67441和67442获得。编码谷胱甘肽S-转移酶的DNA的克隆和表达由Hayes等人，(1992)，Biochem.J.285：173描述。
(D)编码乙酰羟酸合成酶抗性蛋白质的多核苷酸，已经发现乙酰羟酸合成酶用于制备表达抗多种除草剂的这类酶的植物，已将其引入多种植物中(参见例如Hattori等人，(1995)，Mol Gen Genet.246：419)。赋予除草剂抗性的其他基因包括：编码大鼠细胞色素P4507A1和酵母NADPH-细胞色素P450氧化还原酶的嵌合蛋白质的基因(Shiota等人，(1994)，Plant Physiol 106：17)、谷胱甘肽还原酶和过氧化物歧化酶的基因(Aono等人，(1995)，Plant Cell Physiol 36：1687)和多种磷酸转移酶的基因(Datta等人，(1992)，Plant Mol Biol 20：619)。
(E)编码靶向原卟啉原氧化酶(protox)的除草剂抗性的多核苷酸，该氧化酶是生产叶绿素所必需的。原卟啉原氧化酶(protox)用作多种除草剂化合物的靶标。这些除草剂也抑制所有存在的不同种类植物的生长，导致它们完全被摧毁。含有改变的protox活性的对这些除草剂有抗性的植物的发育描述于美国专利6,288,306B1；6,282,837 B1和5,767,373以及国际公布WO 2001/12825中。
(F)aad-1基因(源自Sphingobium herbicidovorans)编码芳氧基链烷酸酯双氧化酶(AAD-1)蛋白质。该性状赋予针对2，4-二氯苯氧基乙酸和芳氧基苯氧基丙酸酯(一般称作“fop”除草剂，如喹禾灵(quizalofop))除草剂的耐受性。aad-1基因自身首先在WO2005/107437(也参见US 2009-0093366)中公开在植物中的除草剂耐受性。来源于食酸代尔夫特菌(Delftia acidovorans)的aad-12基因编码芳氧基链烷酸酯双氧化酶(AAD-12)蛋白质，该蛋白质通过用芳氧基链烷酸酯部分灭活多种除草剂赋予对2，4-二氯苯氧基乙酸和芳氧基苯氧基丙酸酯和吡啶氧基乙酸酯除草剂的抗性，包括苯氧基生长素(例如2，4-D，MCPA)以及吡啶氧基生长素(例如氯氟吡氧乙酸、绿草定)。
(G)编码赋予麦草畏抗性的抗除草剂的麦草畏单氧酶的多核苷酸公开于美国专利申请公布2003/0135879中；
(H)编码赋予溴苯腈抗性的溴苯腈腈水解酶(Bxn)的多核苷酸分子公开于美国专利4,810,648中；
(I)编码八氢番茄红素(crtl)的多核苷酸分子描述于Misawa等人，(1993)，PlantJ.4：833-840和Misawa等人，(1994)，PlantJ.6：481-489中，提供哒草伏抗性。
3.赋予或有助于改变的谷物特性的转基因
(A)改变的脂肪酸，例如通过
(1)下调硬脂酰-ACP来增加植物的硬脂酸含量。参见Knultzon等人，(1992)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：2624和WO1999/64579(玉米中改变脂质特性的基因)。
(2)通过FAD-2基因修饰来提高油酸和/或通过FAD-3基因修饰来降低亚麻酸(参见美国专利6,063,947；6,323,392；6,372,965和WO1993/11245)。
(3)改变共轭亚麻酸或亚油酸含量，例如在WO 2001/12800中。
(4)改变LEC1、AGP、Dek1、Superal1、mi1 ps、多种Ipa基因如Ipa1、Ipa3、hpt或hggt。例如参见WO 2002/42424、WO1998/22604、WO 2003/011015、WO 2002/057439、WO2003/011015、美国专利6,423,886、6,197,561、6,825,397和美国专利申请公布US 2003/0079247、US 2003/0204870以及Rivera-Madrid等人，(1995)，Proc.Natl.Acad.Sci.92：5620-5624。
(5)编码用于制备长链多不饱和脂肪酸的Δ8去饱和酶(美国专利8,058,571)、用于降低饱和脂肪的Δ9去饱和酶(美国专利8,063,269)、用于改善ω-3脂肪酸特征的报春花属(Primula)Δ6-去饱和酶的基因。
(6)与脂质和糖代谢调节相关联的分离核酸和蛋白质，具体地，脂质代谢蛋白质(LMP)，其用于制备转基因植物和调节包括脂质、脂肪酸、淀粉或种子贮存蛋白质在内的种子贮存化合物的方法，并且用于调节植物的种子尺寸、种子数目、种子重量、根长度和叶尺寸的方法(EP 2404499)。
(7)改变高水平表达的糖诱导2型(HSI2)蛋白质在植物中的表达以增加或减少HSI2在植物中的表达。增加的HSI2表达提高油含量，而减少的HSI2表达降低脱落酸敏感性和/或提高耐旱性(美国专利申请公布2012/0066794)。
(B)改变的磷含量，例如通过
(1)肌醇六磷酸酶编码基因的引入将促进肌醇六磷酸的分解，增加更多的游离磷酸盐到转化的植物中。例如，参见Van Hartingsveldt等人，(1993)，Gene 127：87，其公开了黑曲霉(Aspergillusniger)肌醇六磷酸酶基因的核苷酸序列。
(2)调节降低肌醇六磷酸含量的基因。在玉米中，例如，这可以通过克隆和然后再引入DNA来完成，该DNA与一个或多个等位基因相关，例如在以低水平肌醇六磷酸为特征的玉米突变体中鉴别出来的LPA等位基因，如在WO 2005/113778中，和/或通过改变肌醇激酶活性，如在WO 2002/059324、美国专利申请公布2003/0009011、WO 2003/027243、美国专利申请公布2003/0079247、WO 1999/05298、美国专利6,197,561、美国专利6,291,224、美国专利6,391,348、WO 2002/059324、美国专利申请公布2003/0079247、WO 1998/45448、WO 1999/55882、WO2001/04147中。
(C)改变受影响的碳水化合物，例如，通过改变影响淀粉分枝模式的酶的基因或使硫氧还蛋白如NTR和/或TRX(参见美国专利6,531,648，其为此目的以引用方式并入)和/或γ-玉米醇溶蛋白基因启动子(Gamma-zein)敲除体或突变体如cs27或TUSC27或en27(参见美国专利6,858,778和美国专利申请公布2005/0160488、美国专利申请公布2005/0204418，它们为此目的以引用方式并入)改变的基因。参见Shiroza等人，(1988)，J.Bacteriol.170：810(突变链球菌(Streptococcus mutans)果糖基转移酶基因的核苷酸序列)，Steinmetz等人，(1985)，Mol.Gen.Genet.200：220(枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)蔗糖6-果糖基转移酶基因的核苷酸序列)，Pen等人，(1992)，Bio/Technology 10：292(表达地衣芽抱杆菌(Bacilluslicheniformis)α-淀粉酶的转基因植物的生产)，Elliot等人，(1993)，Plant Molec.Biol.21：515(番茄转化酶基因的核苷酸序列)，等人，(1993)，J.Biol.Chem.268：22480(大麦α-淀粉酶基因的定点诱变)和Fisher等人，(1993)，PlantPhysiol.102：1045(玉米胚乳淀粉分支酶II)，WO 1999/10498(通过修饰UDP-D-木糖4-差向异构酶、FragiIe 1和2、Ref1、HCHL、C4H来改善消化性和/或淀粉提取)，美国专利6,232,529(通过改良淀粉水平制备高油种子的方法(AGP))。本文提及的脂肪酸修饰基因也可以通过淀粉和油途径的相互关系而用于影响淀粉的含量和/或组成。
(D)改变的抗氧化剂含量或组成，例如改变生育酚或生育三烯酚。例如，参见美国专利6,787,683、美国专利申请公布2004/0034886和WO 2000/68393，它们涉及操纵抗氧化剂的水平，并且WO2003/082899通过改变尿黑酸香叶基香叶基转移酶(hggt)达到这一目的。
(E)改变的必需种子氨基酸。例如，参见美国专利6,127,600(提高种子中必需氨基酸积聚的方法)、美国专利6,080,913(提高种子中必需氨基酸积聚的二元方法)、美国专利5,990,389(高赖氨酸)、WO 1999/40209(种子中氨基酸组成的改变)、WO1999/29882(改变蛋白质的氨基酸含量的方法)、美国专利5,850,016(改变种子中氨基酸组成的方法)、WO 1998/20133(具有水平提高的必需氨基酸的蛋白质)、美国专利5,885,802(高甲硫氨酸)、美国专利5,885,801(高苏氨酸)、美国专利6,664,445(植物氨基酸生物合成酶)、美国专利6,459,019(提高的赖氨酸和苏氨酸)、美国专利6,441,274(植物色氨酸合成酶β亚基)、美国专利6,346,403(甲硫氨酸代谢酶)、美国专利5,939,599(高硫)、美国专利5,912,414(提高的甲硫氨酸)、WO 1998/56935(植物氨基酸生物合成酶)、WO 1998/45458(含更高百分比的必需氨基酸的工程种子蛋白质)、WO 1998/42831(提高的赖氨酸)、美国专利5,633,436(提高的硫氨基酸含量)、美国专利5,559,223(具有特定结构的合成贮存蛋白质，包含可设计必需氨基酸的水平来改善植物的营养值)、WO1996/01905(提高的苏氨酸)、WO 1995/15392(提高的赖氨酸)、美国专利申请公布2003/0163838、美国专利申请公布2003/0150014、美国专利申请公布2004/0068767、美国专利6,803,498、WO 2001/79516。
4.产生用于位点特异性DNA整合的位点的基因。
这包括引入可用于FLP/FRT系统中的FRT位点和/或可用于Cre/Loxp系统中的Lox位点。例如，参见Lyznik等人，(2003)，Plant Cell Rep21：925-932和WO 1999/25821，它们以引用方式并入本文。可使用的其他系统包括噬菌体Mu的Gin重组酶(Maeser等人，(1991)Vicki Chandler，The Maize Handbook ch.118(Springer-Verlag 1994)、大肠杆菌的Pin重组酶(Enomoto等人，1983)和pSRi质粒的R/RS系统(Araki等人，1992)。
5.影响抗非生物性应激的基因
包括但不限于开花、抽穗与种子发育、氮利用率的提高、改变的氮反应性、抗旱性或耐旱性、抗寒性或耐寒性，以及抗盐性或耐盐性、和在应激下增加的产量。
(A)例如，参见：WO 2000/73475，其中水的使用效率可通过苹果酸盐的改变而改变；美国专利5,892,009、5,965,705、5,929,305、5,891,859、6,417,428、6,664,446、6,706,866、6,717,034、6,801,104、WO 2000/060089、WO 2001/026459、WO2001/035725、WO 2001/034726、WO 2001/035727、WO2001/036444、WO 2001/036597、WO 2001/036598、WO2002/015675、WO 2002/017430、WO 2002/077185、WO2002/079403、WO 2003/013227、WO 2003/013228、WO2003/014327、WO 2004/031349、WO 2004/076638、WO199809521。
(B)WO 199938977描述了包括CBF基因与转录因子在内的基因，其有效减轻严寒、高盐度与干旱对植物的负面作用，以及赋予植物表型其他正面作用。
(C)美国专利申请公布2004/0148654和WO 2001/36596，其中植物中的脱落酸被改变从而产生改善的植物表型，例如产量增加和/或对非生物性应激的耐性增强。
(D)WO 2000/006341、WO 2004/090143、美国专利7,531,723和6,992,237，其中细胞分裂素的表达被改良从而导致植物应激耐性如耐旱性增强，和/或产量增加。也参见WO 2002/02776、WO2003/052063、JP 2002/281975、美国专利6,084,153、WO2001/64898、美国专利6,177,275和美国专利6,107,547(促进氮的利用和改变的氮反应性)。
(E)对于乙烯的改变，参见美国专利申请公布2004/0128719、美国专利申请公布2003/0166197和WO 2000/32761。
(F)关于植物的非生物性应激的转录因子或转录调节子，参见例如美国专利申请公布2004/0098764或美国专利申请公布2004/0078852。
(G)增加液泡焦磷酸酶如AVP1(美国专利8,058,515)表达以提高产量的基因；编码HSFA4或HSFA5(A4或A5类的热休克因子)多肽的基因，该多肽是一种低聚肽转运蛋白质(OPT4-样)多肽；plastochron2-样(PLA2-样)多肽或Wuschel相关的同源盒1-样(WOX1-样)多肽(美国专利申请公布US 2011/0283420)。
(H)下调编码聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)蛋白质的多核苷酸以调节细胞程序死亡(美国专利8,058,510)，从而提高活力。
(I)编码赋予耐旱性的DTP21多肽的多核苷酸(美国专利申请公布US 2011/0277181)。
(J)编码ACC合成酶3(ACS3)蛋白质的核苷酸序列，该蛋白质用于调节发育、调节对应激的响应、以及调节胁迫耐受性(美国专利申请公布US 2010/0287669)。
(K)编码赋予耐旱性表型(DTP)以提高耐旱性的蛋白质的多核苷酸(WO 2012/058528)。
影响植物生长与农学特性例如产量、开花、植物生长和/或植物结构的其他基因与转录因子，均可被引入或基因掺入植物，参见例如WO1997/49811(LHY)、WO 1998/56918(ESD4)、WO 1997/10339和美国专利6,573,430(TFL)、美国专利6,713,663(FT)、WO 1996/14414(CON)、WO 1996/38560、WO 2001/21822(VRN1)、WO 2000/44918(VRN2)、WO 1999/49064(GI)、WO 2000/46358(FR1)、WO1997/29123、美国专利6,794,560、美国专利6,307,126(GAI)、WO1999/09174(D8和Rht)和WO 2004/076638和WO 2004/031349(转录因子)。
6.赋予提高产量的基因
(A)用1-氨基环丙烷-1-羧酸脱氨酶-样多肽(ACCDP)编码核酸转化的转基因作物植物，其中在作物植物中的核酸序列表达导致与野生型植物相比，植物的根生长增加、和/或产量提高、和/或对环境胁迫的耐受性提高(美国专利8,097,769)。
(B)使用种子优选启动子的玉米锌指蛋白质基因(Zm-ZFP1)的超表达已经显示促进植物生长、增加每株植物的玉米籽数和总玉米籽重量(美国专利申请公布2012/0079623)。
(C)玉米侧生器官基部(lateral organ boundaries，LOB)结构域蛋白质(Zm-LOBDP1)的组成型超表达已经显示增加每株植物的玉米籽数和总玉米籽重量(美国专利申请公布2012/0079622)。
(D)通过调节编码VIM1(甲基化1变体)-样多肽或VTC2-样(GDP-L-半乳糖磷酸化酶)多肽或DUF1685多肽或ARF6-样(生长素响应因子)多肽的核酸在植物中的表达增强产量相关的性状(WO2012/038893)。
(E)调节编码Ste20-样多肽或其同源物的核酸在植物中的表达提供具有相对于对照植物产量增加的植物(EP 2431472)。
7.基因沉默
在一些实施例中，堆叠的性状可为沉默所关注的一种或多种多核苷酸的形式，导致一种或多种靶向害虫多肽的抑制。在一些实施例中，提高使用抑制DNA构建体完成沉默。
在一些实施例中，编码多肽或片段或它们的变体的一种或多种多核苷酸可与编码具有杀昆虫活性或如上文所示的农学性状一种或多种多肽的一种或多种多核苷酸堆叠，并且任选地还可包括一种或多种多核苷酸，其提供如下文所讨论的一种或多种靶向多核苷酸的基因沉默。
“抑制DNA构建体”是在转化或稳定整合进植物基因组时，导致该植物中的靶基因“沉默”的重组DNA构建体。对该植物来说，该靶基因可以是内源性的或是转基因的。如本文针对靶基因所使用的，“沉默”通常指在由靶基因表达的mRNA或蛋白质/酶的水平上的抑制，和/或在酶活性或蛋白质功能性的水平上的抑制。术语“抑制”包括降低、减少、下调、减弱、抑制、消除和阻止。“沉默”或“基因沉默”不测定机理并且包括(并且不限于)反义、共抑制、病毒抑制、发夹抑制、茎环抑制、基于RNAi的方法以及基于小RNA的方法。
抑制DNA构建体可以包含源自所关注的靶基因的区域并且可以包含所关注的靶基因的有义链(或反义链)的核酸序列的全部或部分。根据利用的方法，该区域可与所关注基因的有义链(或反义链)的全部或部分100％相同或小于100％相同(例如至少50％或介于51％和100％之间的任何整数相同)。
抑制DNA构建体是本领域所熟知的，一旦选定所关注的靶基因就很容易构建，并且包括但不限于共抑制构建体、反义构建体、病毒-抑制构建体、发夹抑制构建体、茎-环抑制构建体、产生双链RNA的构建体，以及更通常的是，RNAi(RNA干扰)构建体和小RNA构建体，例如siRNA(短干扰RNA)构建体和miRNA(微RNA)构建体。
“反义抑制”指产生能够抑制靶蛋白质表达的反义RNA转录物。
“反义RNA”指与靶初级转录物或mRNA的全部或部分互补，并阻断分离的靶核酸片段表达的RNA转录物(美国专利5,107,065)。反义RNA可与特定基因转录物的任何部分，即5′非编码序列、3′非编码序列、内含子或编码序列互补。
“共抑制”指产生能够抑制靶蛋白质表达的有义RNA转录物。“有义”RNA指包含mRNA并且能在细胞内或体外翻译成蛋白质的RNA转录物。此前，已通过着眼于以有义方向过表达与内源mRNA具有同源性的核酸序列(其导致与过表达的序列具有同源性的所有RNA减少)设计出了植物中的共抑制构建体(参见Vaucheret等人，(1998)Plant J.16：651-659和Gura，(2000)，Nature 404：804-808)。
另一种变型描述了将植物病毒序列用于引导对近端mRNA编码序列的抑制(PCT公开WO 1998/36083)。
最近的工作已经描述了“发夹”结构的用途，该结构以互补方向整合mRNA编码序列的全部或部分，导致已表达的RNA形成潜在的“茎-环”结构(PCT公开WO 1999/53050)。在这种情况下，茎由对应相对于启动子以有义或反义方向插入的相关基因的多核苷酸形成，并且环由一些相关基因的多核苷酸形成，在构建体中该多核苷酸不具有互补序列。这增加了获得的转基因植物中的共抑制或沉默频率。关于发夹抑制的综述，参见Wesley等人，(2003)，Methods in Molecular Biology，Plant FunctionalGenomics：Methods和Protocols 236：273-286。
其中茎由至少30个来自待抑制基因的核苷酸形成而环由任何的核苷酸序列形成的构建体也已经有效地用于抑制(PCT公开WO 1999/61632)。
使用聚-T和聚-A序列产生茎-环结构中的茎已经有所描述(PCT公开WO 2002/00894)。
然而另一种改变形式涉及使用合成的重复序列来促进茎环结构中的茎的形成。用这种重组DNA片段产生的转基因生物体已经显示由形成茎环结构的核苷酸片段编码的蛋白质的水平降低，如PCT公开WO 2002/00904所述。
RNA干扰是指动物中由短干扰RNA(siRNA)介导的序列特异性转录后基因沉默的过程(Fire等人，(1998)，Nature 391：806)。在植物中的对应过程通常称为转录后基因沉默(PTGS)或RNA沉默，并且在真菌中也称为阻抑作用(quelling)。据信转录后基因沉默过程是用于防止外来基因表达的进化保守性细胞防御机制，并且通常由不同植物区系和门所共有(Fire等人，(1999)Trends Genet.15：358)。这种防止外来基因表达的保护作用可能是通过特异性破坏病毒基因组RNA的同源单链RNA的细胞反应，响应源自病毒感染或源自转座因子随机整合到宿主基因组内的双链RNA(dsRNA)的生成而进化而来。dsRNA在细胞中的存在通过还没有完全表征的机制引发了RNAi反应。
细胞中长dsRNA的存在刺激了称为dicer的核糖核酸酶III的活性。Dicer涉及使dsRNA加工成称为短干扰RNA(siRNA)的短dsRNA片段(Berstein等人，(2001)，Nature 409：363)。源自dicer活性的短干扰性RNA的长度通常是约21至约23个核苷酸，并且包含约19个碱基对双链体(Elbashir等人，(2001)Genes Dev.15：188)。Dicer还涉及从保守结构的前体RNA上切下21个和22个核苷酸的小时序RNA(stRNA)，该小时序RNA参与翻译控制(Hutvagner等人，(2001)，Science 293：834)。RNAi响应还涉及内切核酸酶复合物，通常称为RNA诱导沉默复合物(RISC)，其介导具有与siRNA双链体的反义链互补的序列的单链RNA的裂解。靶RNA的裂解在与siRNA双链体的反义链互补的区域中间发生(Elbashir等人，(2001)，Genes Dev.15：188)。此外，RNA干扰还涉及小RNA(如miRNA)介导的基因沉默，可推定是通过调节染色质结构并由此防止靶基因序列转录的细胞机制(参见例如Allshire，(2002)Science297：1818-1819；Volpe等人，(2002)，Science 297：1833-1837；Jenuwein，(2002)，Science 297：2215-2218和Hall等人，(2002)，Science297：2232-2237)。这样，本发明的miRNA分子可用于通过与RNA转录物相互作用或作为另一种选择通过与特定基因序列相互作用来介导基因沉默，其中这样的相互作用导致在转录或转录后水平上的基因沉默。
还提供了允许由沉默元件产生的RNAi增加的方法和组合物。在此类实施例中，所述方法和组合物采用第一多核苷酸，其包含可操作地连接至在植物细胞中有活性的启动子的靶向害虫序列的沉默元件；以及，第二多核苷酸包含抑制子增强子元件，该元件包含可操作地连接至在植物细胞中有活性的启动子的靶向害虫序列或活性变体或其片段。沉默元件与抑制子增强子元件的组合表达导致由沉默元件产生的抑制RNA的扩增比仅单独表达沉默元件获得的扩增增加。除了特定RNAi种类本身的扩增增加之外，该方法和组合物还允许产生不同的RNAi种类，它们能够增强中断靶基因表达的效果。同样地，当抑制子增强子元件在植物细胞中与沉默元件组合表达时，该方法和组合物可允许在整个植物中系统产生RNAi。仅单独使用沉默元件构建体将观察到较大量RNAi的产生；并且，RNAi向植物韧皮部的递送改善，从而通过RNAi方法提供对以韧皮部为食的昆虫较好的控制。因此，多种方法和组合物提供用于递送抑制RNA到靶向生物体的改善方法。参见例如美国专利申请公布2009/0188008。
如本文所用，“抑制子增强子元件”包含具有待抑制的靶序列或活性片段或其变体的多核苷酸。认识到抑制子增强子元件不需要与靶序列相同，而是抑制子增强子元件可包含靶序列的变体，只要抑制子增强子元件具有与靶序列足够的序列同一性即可，从而允许由沉默元件产生的RNA水平高于仅表达沉默元件达到的RNA水平。相似地，抑制子增强子元件可包含靶序列片段，其中该片段具有足够的长度以允许由沉默元件产生的RNAi水平高于仅表达沉默元件达到的水平。
已经认识到可使用来自相同靶序列或不同靶序列或相同靶序列的不同区域的多个抑制子增强子元件。例如，使用的抑制子增强子元件可包含来源于靶序列不同区域的靶序列片段(即，来自3′UTR、编码序列、内含子、和/或5′UTR)。此外，如本文其他部分所述，抑制子增强子元件可包含在表达盒内，并且在具体实施例中，抑制子增强子元件在与沉默元件相同或不同的DNA载体或构建体上。抑制子增强子元件可操作地连接至启动子。已经认识到抑制子增强子元件可组成型表达，或它可以阶段特异性方式，使用如本文其他部分所述的多种诱导型或组织优选的或发育调节启动子进行表达。
在具体实施例中，使用沉默元件和抑制子增强子元件系统产生RNAi在整个植物中发生。在其他实施例中，本发明的植物或植物部分具有的RNAi到植物韧皮部的递送比单独表达沉默元件构建体的植物将观察到的递送相比得到改善，并且因此提供通过RNAi方法对以韧皮部为食的昆虫更好的控制。在具体实施例中，本发明的植物、植物部分和植物细胞还可表征为允许产生多个RNAi种类，它们能够增强中断靶基因表达的效果。
在具体实施例中，沉默元件和抑制子增强子元件的组合表达获得的高植物细胞、植物、植物部分、植物组织或韧皮部中的抑制RNA的浓度比当单独表达沉默元件时获得的浓度更高。
如本文所用，“提高的抑制RNA水平”包括植物中产生的RNAi水平的任何统计意义上显著的提高，该植物在与合适的对照植物进行比较时具有组合表达。例如，在植物、植物部分或植物细胞中的RNAi水平的提高可包括在与合适的对照植物进行比较时，比其植物、植物部分、植物细胞或韧皮部中的RNAi水平提高了至少约1％，约1％-5％，约5％-10％，约10％-20％，约20％-30％，约30％-40％，约40％-50％，约50％-60％，约60-70％，约70％-80％，约80％-90％，约90％-100％或更大。在其它实施例中，在植物、植物部分、植物细胞或韧皮部中的RNAi水平的提高可包括在与合适的对照植物进行比较时，比其植物、植物部分、植物细胞或韧皮部中的RNAi水平提高了至少约1倍，约1倍-5倍，约5倍-10倍，约10倍-20倍，约20倍-30倍，约30倍-40倍，约40倍-50倍，约50倍-60倍，约60倍-70倍，约70倍-80倍，约80倍-90倍，约90倍-100倍或更大。沉默元件与抑制子增强子元件组合表达以控制蝽虫(Stinkbugs)和盲蝽(Lygus)的例子可见于美国专利申请公布2011/0301223和美国专利申请公布2009/0192117。
一些实施例涉及通过干扰核糖核酸(RNA)分子下调在昆虫害虫物种中靶基因的表达。PCT公开WO 2007/074405描述了抑制在包括科罗拉多马铃薯甲虫(Colorado potato beetle)在内的无脊椎害虫中的靶基因表达的方法。PCT公开WO 2005/110068描述了抑制在具体地包括西部玉米根虫(Western corn rootworm)在内的无脊椎害虫中的靶基因表达的方法，该方法用作控制昆虫侵染的手段。此外，PCT公开WO 2009/091864描述了用于抑制来自昆虫害虫物种(包括来自盲蝽属(Lygus genus)的害虫)的靶基因的组合物和方法。PCT公开WO 2012/055982描述了抑制或下调靶基因表达的核糖核酸(RNA或双链RNA)，该靶基因编码下列：昆虫核糖体蛋白质如核糖体蛋白质L19、核糖体蛋白质L40或核糖体蛋白质S27A；昆虫蛋白酶亚基如Rpn6蛋白质、Pros 25、Rpn2蛋白质、蛋白酶β1亚基蛋白质或Prosβ2蛋白质；昆虫COPI囊泡的β-外被体、COPI囊泡的γ-外被体、β′-外被体蛋白质或COPI囊泡的ζ-外被体；昆虫四跨膜蛋白(Tetraspanine)2A蛋白质，它是推定的跨膜结构域蛋白质；属于肌动蛋白家族的昆虫蛋白质如肌动蛋白5C；昆虫泛素-5E蛋白质；昆虫Sec23蛋白质，它是一种GTP酶激活因子，涉及细胞内蛋白质转运；昆虫皱缩蛋白质，它是非常规的肌球蛋白，涉及肌动活动；昆虫歪脖蛋白质，其涉及细胞核选择性mRNA剪接的调节；昆虫空泡型H+-ATP酶G亚基蛋白质和昆虫Tbp-1如Tat-结合蛋白质。
“干旱”指植物可利用的水不足，尤其是当时间延长时，能够引起植物损伤或阻止其正常发育(例如限制植物生长或种子产量)。“耐旱性”指植物在干旱条件下存活较长时间并且基本上不表现出生理或物理退化的特性。植物的“耐旱性增加”相对于参比植物或对照植物进行测量，它是植物在干旱条件下存活较长时间，并且相对于在相似干旱条件下生长的参比或对照植物基本上不表现出相同程度的生理或物理退化的特性。通常当转基因植物在其基因组中包含重组DNA构建体或抑制DNA构建体时，它相对于参比或对照植物表现出增加的耐旱性，所述参比或对照植物在其基因组中不包含重组DNA构建体或抑制DNA构建体。
本领域的普通技术人员熟悉模拟干旱条件并评价植物耐旱性的规程，所述植物已经遭受了模拟的或天然存在的干旱条件。例如，技术人员可通过向植物提供比正常需求较少的水或在一定时期内不提供水来模拟干旱条件，并且技术人员可通过寻找在生理和/或物理条件上的差异来评价耐旱性，包括但不限于活力、生长、大小、或根长、或具体地讲叶片颜色或叶片面积大小。用于评价耐旱性的其他技术包括测量叶绿素荧光、光合作用速率和换气速率。
干旱胁迫实验可涉及慢性胁迫(即缓慢干燥)和/或可涉及两种急性胁迫(即突然除去水)，它们由一天或两次恢复分开。
可再生植物组织可获取自任何植物种类，包括作物诸如，但不限于：禾本科植物、甘蔗属物种、甘蔗属杂交物种、甘蔗、芒属植物、柳枝稷、能源甘蔗、不结实草本植物、竹子、木薯、稻、香蕉、马铃薯、甘薯、薯蓣、菠萝、树、柳树、杨树、桑树、榕属物种、油棕、枣椰、禾本科、马鞭草、香草、茶、啤酒花属植物、蔗茅属物种、甘蔗属间杂种、蔗茅属和高粱属物种、非洲紫罗兰、苹果、枣、无花果、针叶树、番石榴、芒果、槭树、李子、石榴、番木瓜果、鳄梨、黑莓、栽培的草莓、葡萄、美人蕉、大麻、柑橘属植物、柠檬、橙、柚子、橘子、酸橙、玉米、小麦、高粱和棉花。
在一个实施例中，在人工种子中使用的可再生植物组织可来自甘蔗。可再生植物组织可使用多种方法进行制备，包括将分生组织从甘蔗杆顶部切出，然后在固体或液体培养基上进行组织培养，或暂时浸入营养液，以及它们的组合。在一个实施例中，可再生甘蔗组织可使用在固体培养基上的组织培养物，随后暂时浸入液体营养培养基进行制备。
可允许分生组织使用增殖培养基生长并繁殖。增殖培养基可包括但不限于在多种液体营养培养基中培养、在固体培养基上培养、暂时浸入液体营养培养基、以及它们的任何变型。在一个实施例中，在本发明方法中使用的增殖培养基包含MS营养物质并且可另外包含不限于下列的成分：30g/L蔗糖，一种或多种细胞分裂素，包括6-BAP、生长素、或细胞分裂素和生长素的组合，具有或不具有植物激素赤霉素的抑制剂。然而，也可使用其他营养物质制剂如本领域熟知的Gamborg B-5培养基、其他碳源如葡萄糖和甘露糖醇、其他细胞分裂素如激动素和玉米素。
可允许分生组织增殖约3周至约52周。用于增殖的温度可为约15℃至约45℃。用于可再生植物组织生长的温度控制可使用相关领域熟知的恒温培养箱完成。
在分生组织生长后，形成增殖的芽，其含有独立的分生组织结构，能够分化成芽，并且随后在后期分化成形态良好的苗。如本文所用，“增殖的芽组织”是指能够繁殖并自身再生成相似的分生组织结构的分生组织。随时间推移，这种组织的基部(其为初始的植物组织)可能由于多酚产生而变黑，并且可通过相关领域熟知的机械修剪方法移除。
在上述步骤期间，分生组织可经受光照而生长。适用于本发明的光密度可为1微(μ)爱因斯坦每平方米每秒(μE/m2/s)至约1500(μE/m2/s)。可通过适于这一目的的多种装置发光，例如荧光灯泡、白炽光灯泡、日光、植物生长灯泡和发光二极管(LED)。分生组织生长所需的光照量可为1小时光周期至24小时光周期。在一个实施例中，可使用利用30μE/m2/s的16小时光周期。
在分生组织形成增殖的芽组织后，可随后将其切成小块(碎块)以形成组织碎块。这些组织碎块大小可为0.5-10mm。作为另外一种选择，它们的大小可为1-5mm。随后可再培养这些组织碎块0-5周以形成苗，其适用于包封在人工种子中。形成苗的培养方法可包括但不限于在多种液体营养培养基中培养、在固体培养基上培养、暂时浸入液体营养培养基、以及它们的任何变型。在这些方法中形成的苗具有芽，具有或不具有根。
如本发明所述类型的人工种子包括容器组件。容器组件可使用上文公开的任何种类的材料进行制备。在本发明方法中，可使用已经被进一步培养以产生苗的可再生植物组织。苗可部分嵌入在人工种子容器底部的包含营养物质的琼脂塞中，使得部分组织(例如大约80％)任选地暴露于营养物质源上方的空间。作为另外一种选择，苗可设置为使得约1％至99.9％的苗暴露于空间。苗可为定向的或不定向的，并且可进行修剪以适形于容器内部。作为另外一种选择，苗可置于容器中的土壤层中，使得在它上方存在空间。
在本发明方法中，期望在容器内形成空间。空间的目的是为了允许苗的快速换气，有助于维持组织并允许它生长。容器可具有孔隙，其能够允许一定的换气速率，使得在空间和外部环境之间能够保持平衡。因此，随着苗消耗或释放氧气或二氧化碳，由于呼吸作用或光合作用，这些气体迅速与外部大气环境进行平衡。此外，苗暴露于空间促进组织发育，组织发育较好地适于苗一旦从种子中萌发时可能暴露于的比较恶劣的条件(例如降低的湿度、风、较高的光照)。在人工种子中，苗暴露于较不恶劣的条件，这是由于容器的保护。在本发明中，空间对于可见光也是透明的，这允许苗进行光合作用。空间也可提供一些对苗的绝热。空间可由多个隔室组成。这些隔室可为连接的或毗邻的，并且可彼此连通。在容器人工种子内的空间为容器总体积的至少1％。
为了防止真菌污染人工种子，容器在装配前可用杀真菌剂溶液进行处理。多种杀真菌剂可用于此目的。例子包括但不限于：XL、4FS、Ridomil两性霉素B、放线菌酮、制霉菌素、灰黄霉素、五氯硝基苯、噻苯哒唑、苯菌灵、2-(硫代氰酰基甲硫基)-1，3-苯并噻唑、多菌灵、麦穗宁、托布津、甲基硫菌灵、乙菌利、异菌脲、腐霉利、乙烯菌核利、抑霉唑、咪唑、稻瘟酯、咪鲜安、氟菌唑、嗪氨灵、啶斑肟、氯苯嘧啶醇、氟苯嘧啶醇、戊环唑、双苯三唑醇、糠菌唑、环唑醇、恶醚唑、烯唑醇、氟环唑、腈苯唑、氟喹唑、氟硅唑、粉唑醇、己唑醇、酰胺唑、种菌唑、叶菌唑、腈菌唑、戊菌唑、丙环唑、丙硫菌唑、硅氟唑、戊唑醇、氟醚唑、三唑酮、三唑醇、灭菌唑、苯霜灵、呋霜灵、甲霜灵、高效甲霜灵(精甲霜灵)、恶霜灵、呋酰胺、杀螟丹、十二环吗啉、丁苯吗啉、十三吗啉、苯锈啶、粉病灵、螺环菌胺、敌瘟磷、异稻瘟净、(IBP)、定菌磷、稻瘟灵、麦锈灵、氟酰胺、灭锈胺、甲呋酰苯胺、萎锈灵、氧化萎锈灵、噻呋灭、福拉比、吡噻菌胺、啶酰菌胺、乙嘧酚磺酸酯、甲菌定、乙嘧酚、嘧菌环胺、嘧菌胺、嘧霉胺、乙霉威、嘧菌酯、甲氧基丙烯酸酯类、烯肟菌酯、啶氧菌酯、唑菌胺酯、克收欣、肟菌酯、醚菌胺、苯氧菌胺、肟醚菌胺、唑菌酮、氟嘧菌酯、咪唑菌酮、吡菌苯威、拌种咯、咯菌腈、快诺芬、联苯基、地茂散、氯硝胺、五氯硝基苯(PCNB)、四氯硝基苯(TCNB)、甲基立枯磷、土菌灵、氯唑灵、四氯苯酞、咯喹酮、三环唑、环丙酰菌胺、双氯氰菌胺、氰菌胺、环酰菌胺、稗草畏、奈替芬、特比萘芬、多抗霉素、戊菌隆、赛座灭、吲唑磺菌胺、草酰胺、杀稻瘟菌素-S、春雷霉素、链霉素、硫酸链霉素、井冈霉素、霜脲氰、碘代丙炔基丁基甲氨酸酯、霜霉威、硫菌威、乐杀螨、敌螨普、嘧菌腙、氟啶胺、三苯基乙酸锡、三苯基氯化锡、三苯基氢氧化锡、喹酸、恶霉灵、辛噻酮、三乙膦酸铝、亚磷酸及其盐、叶枯酞、唑菌嗪、磺菌胺、哒菌清、硅噻菌胺、二氟林、烯酰吗啉、氟吗啉、苯噻菌胺、丙森锌、霜霉灭、双炔酰菌胺、氧四环素、磺菌威、氟吡菌胺、阿拉酸式苯-S-甲基、烯丙异噻唑、噻酰菌胺、异噻菌胺、噻唑菌胺、环氟菌胺、丙氧喹啉、苯菌酮、铜(不同的，盐)、硫、福美铁、代森锰锌、代森锰、代森联、丙森锌、二硫四甲秋兰姆、代森锌、福美锌、克菌丹、敌菌丹、灭菌丹、百菌清、抑菌灵、甲苯氟磺胺、多果定、克热净、双胍辛胺、敌菌灵、二噻农、矿物油、有机油、碳酸氢钾、十三吗啉苯氨嘧啶、抗生素、放线菌酮、灰黄霉素、烯唑醇、嘧硫磷、稻痕酯、5-氯-7-(4-甲基-哌啶-1-基)-6-(2，4，6-三氟-苯基)-[1，2，4]三唑并[1，5-a]嘧啶、2-丁氧基-6-碘代-3-丙基-苯并吡喃-4-酮、3-(3-溴代-6-氟代-2-甲基-吲哚-1-磺酰基)-[1，2，4]三唑-1-磺酸二甲胺、代森钠、威百亩、福代锌、棉隆、3-[5-(4-氯-苯基)-2，3-二甲基-异唑-3-基]-吡啶、波尔多液、乙酸铜、氢氧化铜、氧氯化铜、碱式硫酸铜、硝基苯基衍生物、敌螨通、硝基邻苯二甲酰异丙基苯基吡咯、硫、有机金属硫化合物、苯酞、甲基立枯磷、N-(2-{4-[3-(4-氯-苯基)-2-丙炔氧基]-3-甲氧基-苯基}-乙基)-2-间-乙烷磺酰基氨基-3-甲基-丁酰胺、N-(2-{4-[3-(4-氯-苯基)-2-丙炔氧基]-3-甲氧基-苯基}-乙基)-2-乙烷磺酰基氨基-3-甲基-丁酰胺；3，4-二氯-异噻唑-5-羧酸(2-氰基-苯基)-酰胺、苯噻菌胺、3-(4-氯-苯基)-3-(2-异丙氧基羰基氨基-3-甲基-丁酰氨基)-丙酸甲酯、{2-氯-5-[1-(6-甲基-吡啶-2-基甲氧基亚氨基)-乙基]-苄基}-氨基甲酸甲酯、{2-氯-5-[碘-(3-甲基-苄氧亚氨基)-乙基]-苄基}-氨基甲酸甲酯、下式的六氯代苯酰胺，其中X是CHF2或CH3；并且R1、R2彼此独立地来自卤素、甲基或卤代甲基；烯肟菌酯、次磺酸衍生物、肉桂酰胺和类似物如氟酰菌胺酰胺杀真菌剂如环氟菌胺或(Z)-N-[a-(环丙基甲氧基亚氨基)-2，3-二氟-6-(二氟甲氧基)苄基]-2-苯基乙酰胺、噻苯咪唑、和氟菌唑。
另外容器可包括一种或多种抗微生物剂，包括但不限于：可使用漂白剂、Plant Preservative MixtureTM、季铵或吡啶盐、氰乙基化山梨醇的铜盐(如US6978724所述)、银盐和银纳米颗粒。另外容器可包括一种或多种抗生素，包括但不限于：头孢噻肟、羧苄青霉素、氯霉素、四环素、红霉素、卡那霉素、硫酸新霉素、硫酸链霉素、硫酸庆大霉素、氨苄青霉素、青霉素、替卡西林、多粘菌素B和氯己定、洗必太、乙酸洗必太、洗必太葡糖酸酯、盐酸洗必太、硫酸洗必太、六亚甲基双胍、低聚六甲基双胍、乙酸银、苯甲酸银、碳酸银、氯化银、碘酸银、碘化银、乳酸银、月桂酸银、硝酸银、氧化银、棕榈酸银、银蛋白质、磺胺嘧啶银、多粘菌素、四环素、妥布霉素、庆大霉素、利福平、杆菌肽、新霉素、氯霉素、咪康唑、托萘酯、喹酸、诺氟沙星、萘啶酸、培氟沙星、依诺沙星、环丙沙星、氨苄青霉素、阿莫西林、piracil、万古霉素、聚六亚甲基双胍、聚六亚甲基双胍盐酸盐、聚六亚甲基双胍氢溴酸盐、聚六亚甲基双胍硼酸盐、聚六亚甲基双胍乙酸盐、聚六亚甲基双胍葡糖酸盐、聚六亚甲基双胍磺酸盐、聚六亚甲基双胍马来酸盐、聚六亚甲基双胍抗坏血酸盐、聚六亚甲基双胍硬脂酸盐、聚六亚甲基双胍酒石酸盐、聚六亚甲基双胍柠檬酸盐、以及它们的组合。
为了防止虫害，人工种子也可包含一种或多种杀虫剂。合适杀虫化合物的例子包括但不限于阿巴美丁、氰亚胺、啶虫脒、硝基亚甲基类杀虫剂、烯啶虫胺、可尼丁、乐果、呋虫胺、氟虫腈、虱螨脲、氟虫双酰胺、蚊蝇醚、噻虫啉、氟西汀、吡虫啉、噻虫嗪、β氟氯氰菊酯、苯氧威、高效三氟氯氰菊酯、丁醚脲、吡蚜酮、敌匹硫磷、乙拌磷；丙溴磷、呋线威、环丙氨嗪、氯氰菊酯、氟胺氰菊酯、七氟菊酯、氯虫苯甲酰胺、氟啶虫酰胺、氰氟虫腙、螺虫乙酯、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)产物、嘧菌酯、活化酯、双苯三唑醇、萎锈灵、Cu2O、霜脲氰、环唑醇、嘧菌环胺、抑菌灵、恶醚唑、烯唑醇、氟环唑、拌种咯、咯菌腈、氟嘧菌酯、氟康唑、氟硅唑、粉唑醇、呋霜灵、克热净、己唑醇、恶霉灵、抑霉唑、酰胺唑、种菌唑、克收欣、代森锰锌、甲霜灵、R-甲霜灵、精甲霜灵、叶菌唑、腈菌唑、恶霜灵、稻瘟酯、多效唑、戊菌唑、戊菌隆、啶氧菌酯、咪鲜安、丙环唑、咯喹酮、SSF-109、螺环菌胺、戊唑醇、噻苯哒唑、二硫四甲秋兰姆、tolifluamide、唑菌嗪、三唑酮、三唑醇、肟菌酯、氟菌唑、灭菌唑、烯效唑。
人工种子可包含其他作物保护化学物质，包括但不限于杀线虫剂、杀白蚁剂、杀软体动物剂、杀蛆剂和杀螨剂。
在人工种子制备和随后加入苗的过程中，并且在一些情况下，营养物质，容器中的开口可被固定。容器可具有不止一个开口。作为另外一种选择，容器可具有顶部开口和底部开口。根椐设计和种植方法，任选地可固定一个或两个开口。容器的顶部开口和底部开口可使用与闭合件相同的材料。作为另外一种选择，不同材料可用于固定开口的闭合件。本公开发明中用作闭合件的合适材料包括但不限于：各种类型的纸、蜡、预拉伸的能够生物降解的聚合物，包括聚(丙交酯)、聚(L-丙交酯)、聚(D-丙交酯)、聚(D，L-丙交酯)、聚(L-丙交酯)与聚(D-丙交酯)和聚(羟基链烷酸酯)的立构复合结构、天然和合成聚合物，包括但不限于聚(乙二醇)、聚(丙烯酸)及其盐、聚(乙烯醇)、聚(苯乙烯)、多(烷基(甲基)丙烯酸酯)、聚(乙酸乙烯酯)、聚(乙烯吡咯烷酮)、聚(乙烯吡啶)、聚丙烯酰胺、聚碳酸酯、环氧树脂、醇酸树脂、聚烯烃、可光降解的聚合物、聚酯、聚酰胺、淀粉、明胶、天然橡胶、多糖，包括但不限于藻酸盐、角叉菜胶、纤维素、羧甲基纤维素及其盐、黄原胶、瓜尔胶、玉米素、脱乙酰壳多糖、刺槐豆胶、阿拉伯树胶、果胶、琼脂、琼脂糖、它们的交联形式、它们的增塑形式、它们的共聚物、以及它们的组合。在一个实施例中，闭合件具有蜡涂层。蜡包括但不限于石蜡、鲸蜡、蜂蜡和巴西棕榈蜡。
在本发明的一个实施例中，闭合件由能够生物降解的塑料材料制成，例如聚(乳酸)、聚(羟基丁酸酯)、聚(羟基丁酸酯-共-戊酸酯)、或它们的共混物，任选地具有淀粉、纤维素、脱乙酰壳多糖和增塑剂，包括但不限于山梨醇、甘油、柠檬酸酯、邻苯二甲酸酯和水。这些共混物可通过溶液共混或熔融共混形成。
在另一个实施例中，闭合件包含或由下列物质组成：可快速溶解的聚(乙烯醇)与淀粉、纤维素纤维和甘油的共混物，其任选地与合适的剂交联，包括但不限于六甲氧甲基三聚氰胺或戊二醛。这提供了在潮湿土壤条件下可快速降解的材料，允许内部的组织快速生长。淀粉可来自下列来源：包括但不限于马铃薯、玉米、稻、小麦和木薯，并且可为改性的或未改性的。附加的添加剂可包括但不限于聚(乙二醇)、柠檬酸、尿素、水、包括但不限于乙酸钠、硝酸钾和硝酸铵的盐、肥料、琼脂、黄原胶、藻酸盐、和包括但不限于羟丙基纤维素、甲基纤维素和羧甲基纤维素的纤维素衍生物。
在本公开发明中，容器可具有能够被固定的顶部开口和底部开口。在本公开发明的一个实施例中，预拉伸的F可用于固定容器的顶部开口和底部开口。在另一个实施例中，底部开口的闭合件可为预拉伸的M并且顶部开口的闭合件可为水溶性的塑料膜，其可能由聚(乙烯醇)、聚(乙烯吡咯烷酮)、聚((甲基)丙烯酸)及其盐或聚(乙二醇)构成。在另一个实施例中，顶部开口的闭合件可为预拉伸的M并且底部开口的闭合件可为蜡浸渍的水溶性纸。如本文所用，蜡浸渍的水溶性纸是指水溶性纸，其中已经把蜡引入材料的孔和/或表面。
在另一个实施例中，开口的闭合件包括或由醇酸树脂膜构成。此类醇酸树脂是本领域熟知的，并且可通过不饱和的植物油与多元醇的反应并用金属催化剂固化形成。合适的醇酸树脂包括但不限于11-035和1074(Reichhold Corp，Durham，NC)。
在另一个实施例中，开口的闭合件包括或由嵌段共聚物构成。这些聚合物包括化学上不同组成的共价连接重复单元的两个或更多个片段。这些嵌段共聚物可为能够生物降解的。在一个实施例中，使用聚酯嵌段共聚物。此类聚合物可为弹性体，允许苗容易地穿透它们。嵌段共聚物含有嵌段，包括但不限于：聚(乳酸)、聚(丙交酯)、聚(L-乳酸)、聚(D-乳酸)、聚(D，L-乳酸)、聚(己内酯)、聚(己内酯-共-乳酸)、聚(二甲基硅氧烷)、聚(乙烯醇)、聚(乙酸乙烯酯)、聚(乙二醇)、聚(丙二醇)、聚(碳酸酯)、聚醚、聚酯。在一个实施例中，嵌段共聚物可由聚(L-乳酸-b-己内酯-共-D，L-乳酸-b-L-乳酸)组成。在另一个实施例中，嵌段共聚物由聚(D，L-乳酸-b-二甲基硅氧烷-b-D，L-乳酸)组成。
在本发明中使用的闭合件可包含油。适用于本发明的油具有下列特性：它应在约30℃至38℃之间熔融，并且在室温下(约20℃至约25℃)为固体。可使用各种类型的油和甘油三酯(脂肪)。非限制性例子包括黄油、可可油、棕榈油、硬脂和猪油。在一个实施例中，可使用植物起酥油如在另一个实施例中，闭合件可由油-凝胶构成。将油-凝胶定义为通过与一种或多种添加剂组合，在适用于本专利申请的有限温度范围内不流动的油。在一个实施例中，油-凝胶通过在高温下将化合物溶解在油中，并且随后冷却该溶液形成凝胶来形成。合适的油包括但不限于植物油、蓖麻油、大豆油、肉豆蔻酸异丙酯、油菜籽油、和矿物油。合适的化合物包括但不限于嵌段聚合物和缔合型的低分子量物质。嵌段聚合物包括但不限于苯乙烯系嵌段共聚物如以商品名(Kraton Polymers，Houston，TX)售卖的那些，环氧乙烷和环氧丙烷的嵌段共聚物如以商品名(BASF，Ludwigshafen，Germany)售卖的那些。苯乙烯系嵌段共聚物包括但不限于聚(苯乙烯-b-异戊二烯-b-苯乙烯)、聚(苯乙烯-b-丁二烯-b-苯乙烯)和它们的氢化形式。适用于本专利申请的油-凝胶将具有足够弱的机械性能以允许生长的可再生植物组织透过。
在另一个实施例中，可使用多孔材料固定开口，包括但不限于筛网、网片、纱布、棉花、粘土、粗棉布、和岩石棉。
作为另外一种选择，顶部和底部开口可通过将容器的相对侧折叠、卷曲、紧缩、网装固定、或紧固在一起进行固定。在一个实施例中，底部开口可通过使用常见的镀锌钢钉将它的侧面网装固定在一起进行固定。
在另一个实施例中，开口可通过翼片-样结构进行固定，其中一个或多个柔性翼片突出到开口上方。翼片的柔性足以允许苗在生长时将它们推开。在一个实施例中，翼片形成狭槽状盖或“花朵”或“花”-形盖。
在另一个实施例中，容器可在容器的侧面具有一个或多个开口。这些侧面开口可为除顶部和底部开口之外的开口。作为另外一种选择，容器可仅具有一个侧面开口，无顶部或底部开口。这些开口也可使用上述方法和材料进行固定。
在另一个实施例中，容器可具有锚固装置。此类装置包括但不限于翼片、倒钩、桩和肋。锚固装置可为可折叠的或塌缩的以在种植前减少空间。在此种情况下，可使用约束装置以保持锚固装置在折叠或塌缩状态。此类约束装置可包括但不限于胶带、带、和粘合剂。
按照装配容器的方法，加入苗或可再生植物组织、营养培养基(如果需要)，并且固定顶部开口和底部开口，从而形成人工种子，其可种植在土壤中。为此目的可使用任何种类的土壤，例如田地土壤、沙土、粉砂土、粘土、富含有机物的土壤、贫乏有机物的土壤、高pH土壤、低pH土壤、壤土、合成土壤、蛭石、盆栽土、苗圃土壤、表层土、蘑菇土壤和它们的灭菌形式。在一个实施例中，360(和田地土壤-例如来自全世界农田或其他天然来源的土壤)可用于在容器中种植苗或可再生植物组织。人工种子随后将以某些频率其后萌发或发芽。如本文所用，“萌发”和“发芽”是指可再生组织由于可再生组织的生长从人工种子容器基部突出。
本文所述的人工种子适于在种植前储存。储存条件可包括但不限于环境温度、冷藏温度、亚环境温度、亚环境氧水平、亚环境照明、在光下或暗下、在外部包封中、在空气或惰性气氛中。将亚环境温度定义为低于环境温度的温度。将亚环境照明定义为照明水平低于环境照明。将亚环境氧水平定义为氧水平低于天然大气环境中存在的氧水平。储存时间可为一年或几个月，但是也可为大约几周或几天。
在一个实施例中，在种植时可在人工种子中制造孔、切口、缺口或狭缝，这是为了有利于可再生植物组织的生长。这可使芽或根能够长出并离开容器。
本发明制备植物的人工种子，它能够发育成完全长成的作物以在田间繁殖。例如，本公开发明能够提供繁殖难以扩大规模的植物如甘蔗的经济型方法，该方法可允许它们快速繁殖以迎合甘蔗生产的增长的全球需求。另外，本发明能够提供比经由机械或手动装置的传统甘蔗杆和整杆种植方法更简单、更安全、并且更经济的种植方法。只是减少种植材料的重量和体积(从甘蔗杆和整杆减少至人工种子)能够节省将种植材料运输到田间进行种植所需的能量和时间。
本发明的上述各种示出实施例不旨在为详尽的或限制发明于公开的具体形式。虽然本文为了进行示意性的说明描述了本发明的具体实施例和例子，各种等同的修正形式可能在本发明的范围之内，相关领域的技术人员将认识到这一点。本发明中提供的教导内容可用于除上述例子之外的其他目的。本发明可以不同于在前述描述和例子中具体所述的那些方式的方式实施。按照上述教导内容，本发明的多个修正形式和变型是可能的，并且因此在所附权利要求范围内。
按照上述具体实施方式可对本发明进行这些和其他修改。一般来讲，在下文权利要求中，使用的术语应不被理解为将本发明限制于说明书和权利要求中所公开的具体实施例。
涉及存活植物人工种子的某些教导内容公开在提交于2011年12月21日的美国临时专利申请61/578,410中，其公开内容全文以引用方式并入本文。
在背景技术、具体实施方式、和例子中的每个引用文献的全部公开(包括专利、专利申请、期刊文献、摘要、手册、书籍、或其他公开)全文以引用方式并入本文。
提出下列实例以提供本领域技术人员任何制备并使用本主题发明的完整公开和描述，并且不旨在限制认为是本发明的范围。已经努力确保针对使用数字(例如量、温度、浓度等)的精确性，但是应允许一些实验误差和偏差。除非另外指明，份数是重量份，分子量是平均分子量；温度是摄氏度；并且压力是大气压或接近大气压。
实例
材料
蜡纸容器(1.19cm OD，Aardvark，“Colossal”尺寸)购自PrecisionProducts Group，Inc，245 Falley Dr，Westfield，MA。
蛭石(部件编号65-3120，Whittemore，等级D3，细)购自在Morgantown，Pa的Griffin Greenhouse and Nursery Supplies。
Conviron型号BDW-120和Conviron CGR-962购自Conviron，Manitoba Canada。
多孔过滤带得自Carolina Biological Supply Company，Burlington，NC.
Decagon EC-5探针得自Decagon Devices，Inc.，Pullman，WA。
-360土壤得自Sun Gro Horticulture，Vancouver，Canada。
OsmocoteTM得自Scotts Company，Marysville，OH。
杀真菌剂(Maxim 4FS)得自Syngenta，Wilmington，DE。
得自Yates(Padstow，NSW，Australia)
Water Crystals得自(Kilcoy，QLD，Australia)
由聚丙烯制成的1.1cm和0.8cm直径的塑料吸管，购自Brisbane，Australia的当地商店。
冷水溶解的塑料袋，购自Extra Packaging Corp，Boca Raton，FL。
热水溶解的塑料袋，购自Extra Packaging Corp.736 Glouchester St.Boca Raton，Florida)。
用单体制备的聚(1，3-丙二醇琥珀酸酯)(177-330um厚的熔压膜)，使用如Chrissafis，K.等人，Polymer Degradation and Stabilization 2006，91，60-68所述的方法。
F和M，购自Pechiney Plastic Packaging，Chicago，IL。
水溶性纸(ASW-60)，购自Aquasol Corporation，NorthTonawanda，NY。
包含12％戊酸酯共聚单体的聚(3-羟基丁酸酯-共-3-羟基戊酸乙酯)，购自Sigma Aldrich，St.Louis，MO。
聚(乳酸)(IngeoTM 4032D)，购自NatureWorks，LLC(Minnetonka，MN)。
Macozeb，购自
CriscoTM油，购自J.M.Smucker Co.Orrville，Ohio。
1-萘乙酸(NAA，＞95％纯度)购自Sigma Aldrich。
珍珠岩和泥煤苔藓购自Centenary Landscaping supplies(Darra，QLD)
聚(ε-己内酯)购自Sigma Aldrich(St.Louis，MO)。
11-035醇酸树脂购自Reichhold Inc(Durham，NC)。
ε-己内酯、3，6-二甲基-1，4-二氧戊环-2，5-二酮、和2-乙基己酸锡(II)购自Sigma Aldrich(St.Louis，MO)。
A1535聚(苯乙烯-b-乙烯-共-丁烯-共-苯乙烯-b-苯乙烯)嵌段共聚物购自Kraton Polymers(Houston，TX)。
0.625英寸外径和0.5英寸内径的乙酸丁酸纤维素(CAB)刚性管购自McMaster-Carr。
0.75英寸外径，0.5英寸内径，和20μm孔尺寸的多孔聚乙烯(PPE)刚性管购自Interstate Specialty Products，并且被切成6英寸长度。
氨基丙基封端的PDMS具有900-1100cSt的粘度，购自Gelest(Morrisville，PA)。
大豆油购自MP Biomedicals，(Solon，OH)。
BD Difco琼脂购自VWR。
PhytatrayTM II购自Sigma Aldrich，St.Louis MO。
Murashige & Skoog(MS)Basal Medium w/Vitamins购自PhytoTechnology Laboratories(Shawnee Mission，KS)。
Plant Preservative MixtureTM(PPM)购自Plant Cell Technology，Washington，DC。
萘酸钴(II)(在溶剂油中55重量％)购自Electron MicroscopySciences，Hatfield PA。
15mL和50mL离心管购自VWR，Radnor PA。
高压灭菌胶带购自VWR，Radnor PA。
10uL一次性套环购自Becton Dickinson and Co.，Sparks，MD。
四氢呋喃(THF)、卤代甲基和氯仿溶剂购自EMD Chemicals，它是Merck KGaA，Darmstadt，Germany的分公司。
聚(丙烯酸)，部分钠盐-接枝-聚环氧乙烷购自Sigma Aldrich，StLouis，MO。
防水笔记本复印纸购自J.L.Darling Corp，Tacoma，WA。
Special Mix Coco，Gold Label SpecialSubstrates购自Gold LabelAmericas，Olivehurst，CA。
-盆栽土购自Vida Verde，Mogi Mirim，SP，Brazil。
甘油和尿素购自Synth，Diadema，SP，Brazil。
玉米淀粉(未改性的，73％支链淀粉和27％直链淀粉)，购自SigmaAldrich。
消泡剂Hypermaster 602购自Montenegro Química，Piracaia，SP，Brazil。
柠檬酸可购自Sigma Aldrich(St.Louis，MO)。
具有97％的平均甲基化程度的六甲氧甲基三聚氰胺(HMMM)(303 LF树脂)交联剂购自Cytec，Barcelona，Spain。
聚(乙烯醇)(52-22)购自E.I.DuPont de Nemours andCompany，Wilmington，DE。
长纤维素纤维购自MD Papéis，Formitex，Caieiras，SP，Brazil。
生长培养基
增殖琼脂培养基包含Murashige and Skoog(MS)基本培养基，其具有维生素(Phytotechnology Laboratories，Shawnee Mission，KS)加上30g/L蔗糖(1级蔗糖，Sigma，St.Louis，MO)，8g/L DifcoTM琼脂，和6-苄基氨基嘌呤0.9毫克/升(mg/L)(Phytotechnology Laboratories，ShawneeMission，KS)，pH5.7)。
再生培养基，其包含MS基本培养基，具有维生素(PhytotechnologyLaboratories，Shawnee Mission，KS)加上30g/L蔗糖和0.2％PlantPreservative MixtureTM(PPM，Plant Cell Technology，Washington，DC)，pH5.7)
Hoagland生长培养基如下进行制备：
首先制备各种原液：2M KNO3(202克/升，g/L)；2M Ca(NO3)2×2H2O(236g/L)；铁(Sprint 300铁螯合物，38.5g/L)；2M MgSO4×7 H2O(493g/L)；1M NH4NO3(80g/L)。具有磷酸盐的微量营养素使用如下物质制备：H3BO3(2.86g/L)；MnCl2×4H2O(1.81g/L)；ZnSO4×7H2O(0.22g/L)；CuSO4(0.051 g/L)；H3MoO4×H2O(0.09g/L)；1MKH2PO4(用3M KOH(136g/L)调节至pH6.0。为了制备Hoagland生长培养基，原液与约0.5L水如下混合：2M KNO3(2.5毫升，mL)；2MCa(NO3)2(2.5mL)；铁(1.5mL)；2M MgSO4(1.0mL)；1M NH4NO3(1.0mL)；微量营养素溶液(1.0mL)。最后，用将混合物稀释至1L的总体积。
实例1：制备甘蔗可再生植物组织，随后片段化并制备苗
下列实例设计用于制备可用于包封在纸和塑料容器中的苗，用于制备甘蔗人工种子。
第1周：开始培养
1.在切除分生组织(下文称为外植体)的当天或切除前一天切下来自2至12个月的植物品种CP01-1372或KQ228的甘蔗杆进行培养。准确修剪叶片，保留叶鞘完整。如果需要，在室温下将杆保存在塑料袋中过夜。
2.修剪甘蔗杆以更接近分生组织，并且随后移除两至三个外部叶鞘。用70％乙醇喷洒在杆上以浸透外表面。喷洒乙醇用于保持每个叶鞘表面上无菌。随后将甘蔗杆转移到无菌操作台中。
3.随后移除叶鞘以确定分生组织的位置，在这个点下方2-3厘米(cm)处和该点上方2-3cm处切断甘蔗杆，并且置于培养皿的无菌表面上。
4.最后，在纵向上将分生组织分成两半，并且将两个修剪后的半片直接置于增殖培养基上。将切割表面嵌入培养基并用多孔过滤带密封培养皿以允许气体交换并保持无菌。
5.外植体在26℃，30微爱因斯坦/m2/s光密度下从PhilipsF32T8/ADV841/XEN 25瓦特荧光管中生长。
第2-3周：培养物生长和外植体生长和增殖的初始阶段
1.外植体在切口表面褐化，这是由于多酚流到培养基中。
2.在无菌条件下，仔细修剪外植体的切口末端以避免切掉从中发芽的可再生组织。按需移除外植体的变黑外部组织，此过程中最小化组织切除。
3.修剪来自任何侧生芽的芽，侧生芽萌发自节段上侧。
4.按需修剪叶和芽。
5.将生长的外植体转移到新鲜培养基中，每周一次。
第4-5周：增殖芽发育
1.一旦外植体开始增殖，将它们分成较小片的增殖芽。
2.移除增殖芽的变黑的组织并且给每个芽片一个新的切口表面以良好接触新鲜增殖琼脂培养基。
3.用无菌剪刀或手术刀将芽长出的叶和枝修剪成＜1cm。
4.移除尽可能多的初始杆组织，仅保留有增殖芽。
5.将芽转移到新鲜培养基中。
第5-6周：片段化和苗再生
1.增殖芽组织通常在生长7周后易于片段化并再生出苗。然而，增殖芽在开始生长后偶尔使用6周的幼芽或使用9周的老芽。
2.通过用剪刀修剪增殖芽群以将芽剪断至2-3毫米完成片段化。
3.‘修剪后的’增殖芽随后使用无菌手术刀，利用2mm的网格图案作为引导件将芽群切成2-3mm的片进行片段化。
4.大约2mm的立方片段直接置于苗再生培养基(具有30g/L蔗糖，无植物生长调节剂的MS)中。
5.片段在无菌250毫升(mL)聚碳酸酯烧瓶内的50-100mL液体再生培养基中培养，该烧瓶带有空气过滤器，每个烧瓶中有15-20个片段，烧瓶在75转/分钟(rpm)的旋转摇动器上培养以形成苗。
6.培养物在26℃下，用来自Philips F32T8/ADV841/XEN 25瓦特冷白荧光管的60微爱因斯坦/m2/s光照，在容器中孵育2-3周以提供用于人工种子的苗。
实例2：在蜡纸容器中包封甘蔗苗以提供人工种子
人工种子如图1所示进行构建。将圆柱形蜡纸容器(4)(Aardvark大吸管，1.19cm外径)切成6cm长度。在蜡纸容器的一个开口插入一小片棉花(6)并且高压消毒容器。在无菌操作台中，将蜡纸容器不含棉花的另一个开口浸入培养皿中两次，该培养皿包含大约1cm的0.8重量百分比(wt％)的DifcoTM琼脂层，其包含MS营养物质，0.2重量％的PlantPreservative MixtureTM(PPM)和30g/L蔗糖，从而获得大约2cm的琼脂塞(5)，将其面朝下，使用薄蜡纸容器，置于蜡纸容器的棉花层上。甘蔗苗在片段化后已经从苗再生培养基中的增殖芽组织片段中再生(3)14天(如实例1所述)，将该苗置于琼脂顶部，并且随后用手动预拉伸的M固定蜡纸容器的两个开口(1)以提供人工种子。
将人工种子种植在10cm塑料罐中的经高压消毒的蛭石中，该罐下方具有塑料托盘用于收集水，并且竖直取向，使得人工种子的顶部开口在蛭石表面上方约0.5cm处。在22℃(白天)和20℃(黑夜)，220uE/m2/s的16小时光周期条件下将人工种子置于走入式生长室(Conviron BDW-120型)中。蛭石每日用过滤后的蒸馏水浇灌并且罐覆盖有透明塑料圆顶。
在生长室中6天后，一株甘蔗苗开始长出(叶伸展)穿过M顶部闭合件。在13天后，3个人工种子有苗长出穿过顶部闭合件，并且一株苗长出根穿过底部闭合件。从罐上除去透明塑料圆顶，该罐包含萌发的人工种子并且它们用半强度Hoagland营养培养基进行浇灌。在17天后，第四个人工种子有苗长出穿过顶部。当实验在第38天停止时，6个无萌发的苗的人工种子中有4个在容器中包含成活植物。在另一个未萌发人工种子中观察到真菌生长，但是组织仍为绿色并且存活。已经萌发的4株苗继续生长并且看起来健康。
实例3：比较人工种子中的平开口与开孔开口对苗生长的效应
这个实例设计用于研究人工种子底部开口处的开孔对改善根穿透的效应。将蜡纸容器切成4cm长度，具有平顶部和底部开口，并且与具有开孔开口的5cm纸容器进行比较。开孔是将三个1cm长及3-4mm宽的插片切出容器的一个开口的结果图2)。开孔仅用于蜡纸容器的底部开口。也对人工种子中存在和不存在琼脂对该实例中组织生长的效应进行比较。在无菌操作台中构建人工种子(具有或不具有开孔以及具有或不具有琼脂)。在这个实验中，琼脂具有与实例2所述相同的组成，不同的是使用20g/L蔗糖，而非30g/L蔗糖。手动预拉伸的M用于在已经从分生组织片段再生(在片段化后在再生培养基中再生15天)的甘蔗苗(品种CP01-1372)被加到蜡纸容器中后包封容器的顶部和底部开口。在这个实验中不使用棉花。
在31℃白天，22℃黑夜，14小时光周期，220uE/m2)条件下将人工种子种植在生长室(Conviron CGR-962)的-360土壤中，其位于10cm塑料罐中，在底部具有托盘，并且在顶部具有透明塑料闭合件。初始在第0天时，每个10cm罐的土壤浇水100mL，并且随后每周浇同样量的水。如制造商所推荐，将OsmocoteTM肥料颗粒施用于土壤。表1概述了该实验的结果。
表1
开孔开口和存在或不存在琼脂对甘蔗人工种子萌发的效应
容器初始# 第23天的萌发％ 第23天萌发10cm或更高％
平开口-琼脂 10 90 50
开孔开口-琼脂 10 100 50
平开口-无琼脂 6 67 33
开孔开口-无琼脂 4 50 50
如表1所示，在容器开口处的开孔对人工种子中的植物组织的萌发或生长无显著效应。无琼脂的话，似乎对植物组织的萌发具有轻微的有害效应。
实例4：在蛭石表面或略深处种植人工种子的效应
制备具有平开口的圆柱形蜡纸容器(5cm长，1.19cm直径)，高压消毒，并且如实例2所述插在琼脂上。将已经从分生组织片段再生(在片段化后在再生培养基中再生14天)的甘蔗苗(品种KQ228)置于容器中，该容器具有通过预拉伸的M固定的顶部开口。从而制备的人工种子被种植在蛭石中，略微突出于表面(＜0.5cm)，或略微埋在表面下方(＜0.5cm)。人工种子在走入式生长室的10cm塑料罐中孵育，条件为白天31℃，夜间22℃，以及14小时光周期，220uE/m2)。这个实验的结果在表2中示出。
表2
人工种子埋在蛭石中对萌发和植物生长的效应。在每个时间点指示存 在的突起穿过 M闭合件的芽或根。ND＝未测定。
总体上，在已经埋在蛭石下的人工种子和那些已经设置在蛭石表面上的人工种子之间未观察到苗萌发和生长的显著差异。
实例5：杀真菌剂对人工种子中的苗活力的效应
进行这个实验以研究杀真菌剂对防止真菌侵袭以及人工种子中的苗活力的效应。利用开孔圆柱形蜡纸容器(5cm总长，如实例3所述)。通过将80mg Maxim 4FS分散在30mL去离子(DI)水中，然后加入70mL 70％乙醇制备杀真菌剂Maxim 4FS的溶液。所得溶液为透明的。最后，在无菌操作台内将十二个容器浸入这一溶液中大约1分钟(min)，然后在无菌纸巾上干燥30分钟。将17个容器的对照组浸入70％乙醇并在无菌操作台中干燥。使用标准琼脂培养基，如实例2所述装配容器，并且将从增殖芽组织片段开始培养14天的苗(品种CP01-1372)插入生长培养基。由此制备的两个人工种子开口用预拉伸的M固定。
将人工种子种植在生长室内的带有透明塑料圆顶和托盘的10cm塑料罐内的360中，种植条件为白天31℃，夜间22℃，以及13小时光周期(220uE/m2)。浇灌从底部进行，大约100mL/罐/周。在9天后观察到土壤表面上的藻类生长，指示土壤的高含水量。整个实验周期内土壤水分(用Decagon EC-5探针测量)在～0.3-0.7立方米/立方米(m3/m3)体积水含量的范围内。通过目测定期监测苗萌发探出人工种子顶部开口的数目。如图3可见，与不包含杀真菌剂的那些人工种子相比(在图3中用黑色方块表示)，杀真菌剂的存在对改善人工种子的萌发(在图3中用带白色方块的曲线表示)具有显著效应。此外，植物活力似乎在无杀真菌剂的组中较低。在完成该实验时，从土壤中移除人工种子并检查它们的内容物。与用杀真菌剂处理过的样品相比，在尚未用杀真菌剂处理过的人工种子的内表面上观察到显著更大量的真菌生长。
实例6：用于人工种子的不同顶部闭合件材料的适用性
进行这个实验以筛选将用作使用蜡纸容器的人工种子顶部闭合件的一系列可供选择的材料。使用在底部开口具有开孔的圆柱形蜡纸容器(4cm总长)，其如实例5所述进行装配，不同的是用作顶部开口闭合件的材料。在这个实验中的底部开口闭合件由预拉伸的M构成。在如实例5所述装配前也将容器浸泡在杀真菌剂Maxim 4FS溶液中。在这一测试中使用的顶部闭合件材料包括基于聚(乙烯醇)的冷水溶解的塑料袋(Extrapackaging)、基于聚(乙烯醇)的热水溶解的塑料(Extra packaging)、聚(1，3-丙二醇琥珀酸酯)(177-330微米厚度的熔压膜)、预拉伸的F和预拉伸的M。使用家用硅质填隙剂将冷水溶解的袋膜附接到纸容器的顶部开口，而使用热熔胶枪附接聚(1，3-丙二醇琥珀酸酯)。利用标准琼脂培养基如实例2所述装配容器，并且使用15天苗龄的液体培养基来源的苗(品种CP01-1372)。将人工种子种植在生长室(Conviron BDW-120型)内的带有托盘但是无透明塑料圆顶的10cm塑料罐内的360中，种植条件为白天31℃，夜间22℃，以及13小时光周期(220uE/m2)。浇灌从底部进行，大约100mL/罐/周。整个实验周期内土壤水分(用Decagon EC-5探针测量)在～0.3-0.6m3/m3体积水含量的范围内。通过目测在整个实验周期内监测苗从人工种子顶部的萌发，并且结果在表3中示出。
表3
用于固定人工种子顶部开口的不同材料对植物萌发的效应
从上表可见，冷水溶解的塑料顶部闭合件具有最佳的萌发性能，并且相当于M和F。较强的或对水分较不敏感的闭合件(热水溶解的塑料袋和聚(1，3-丙二醇琥珀酸酯))产生较低的苗萌发百分比。
实例7：筛选人工种子的底部闭合件材料
进行这个实验以筛选用于制备人工种子的蜡纸容器的底部开口闭合件的多种材料。在这种情况下，制备平末端的4cm长蜡纸圆柱形容器。也在如实例5所述进行装配前将容器浸泡在Maxim 4FS溶液中。在所有测试中使用M作为顶部闭合件。底部闭合件材料包括如实例6所述的相同材料，并且加入水溶性纸(ASW-60)，其由已经用蜡浸渍过的羧甲基纤维素钠构成。将水溶性纸片浸泡在12重量百分比(wt％)的石蜡(mp 53-57℃)环己烷溶液中进行蜡浸渍，并且使溶剂在20-25℃通风柜中蒸发18小时。蜡浸渍旨在减缓水溶性纸的溶解速率。另外，研究聚(3-羟基丁酸酯-共-3-羟基戊酸乙酯，包括2％戊酸酯共聚单体)作为其中一种底部开口闭合件材料。通过将聚合物的挤压粒料熔融成125-177微米(μm)厚的膜制备这一闭合件。利用热熔胶枪将这些新材料附接到容器底部。在水分敏感的闭合件材料(例如冷水和热水溶解的袋及蜡浸渍的水溶性纸)顶部施加几滴熔化的CriscoTM油(T大约60℃)以防止水分在加入再生组织前从琼脂塞进入蜡纸容器内，溶解或软化底部开口闭合件。在加入琼脂塞之前使CriscoTM油冷却并硬化。利用标准琼脂培养基如实例2所述装配人工种子，并且使用生长20天的液体培养可再生甘蔗组织(品种KQ228)。将人工种子手动置于在生长室(Conviron BDW-120型)内的带有托盘但是无透明塑料圆顶的10cm塑料罐内的360中形成的凹陷中，种植条件为白天31℃，夜间22℃，以及13小时光周期(220uE/m2)。浇灌从底部进行，大约100mL/罐/周。整个实验周期内土壤水分用Decagon EC-5探针测量，并且它在～0.3-0.6m3/m3体积水含量的范围内。通过目测在整个实验周期内监测苗从人工种子的萌发，并且结果在表4中示出。
表4
检查用于人工种子底部开口闭合件的多种材料
概述于表4的结果指示蜡浸渍的水溶性纸ASW 60和聚(1，3-丙二醇琥珀酸酯)作为底部开口闭合件材料在测试条件下优于M。冷水溶解的塑料袋和聚(3-羟基丁酸酯-共-3-羟基戊酸酯)闭合件性能相当于M。
实例8：筛选用于人工种子容器装配的材料
进行这个实验以筛选用于人工种子圆柱形容器装配的各种材料。当使用蜡纸作为材料时，制备带有平开口的4cm长蜡纸容器。在装配前将这些纸容器浸泡在Maxim 4FS溶液中。其他测试材料是聚(3-羟基丁酸酯-共-3-羟基戊酸乙酯)。具有这种材料的容器通过将聚合物的挤压粒料熔融成125-177μm厚的膜进行制备。另一种测试材料是聚(乳酸)(IngeoTM 4032D，NatureWorks，Minnetonka，MN)，将其熔融压制成膜，厚度为245-490μm。将这两种塑料膜材料手动包装成单层壁容器，它们具有与蜡纸相似的长度和直径，并且使用热熔胶枪进行附接。对于这个实验中的所有容器，使用预拉伸的M用于顶部开口和底部开口闭合件。塑料膜材料不用杀真菌剂处理。
利用标准琼脂培养基如实例2所述装配人工种子，并且使用生长20天的可再生甘蔗组织(品种KQ228)。将人工种子种植在生长室(ConvironBDW-120型)内的带有托盘(无透明塑料圆顶)的10cm塑料罐内的360中，种植条件为白天31℃，夜间22℃，以及13小时光周期(220uE/m2)。浇灌从人工种子底部进行，大约100mL/罐/周。整个实验周期内土壤水分用Decagon EC-5探针测量，并且它在～0.3-0.6m3/m3体积水含量的范围内。通过目测在整个实验周期内监测组织从人工种子的萌发，如表5所示。
表5
比较用于装配人工种子的多种材料对甘蔗苗萌发的效应
表5中概述的结果指示从蜡纸容器人工种子中萌发的组织与那些由聚(乳酸)或聚(3-羟基丁酸酯-共-3-羟基戊酸酯)制成的容器相比具有更高的百分比。在完成实验后，从土壤中移除容器进行检测(第55天)。聚(乳酸)人工种子未显示降解迹象，而在聚(3-羟基丁酸酯-共-3-羟基戊酸酯)中观察到轻微的降解迹象。另一方面，来自用蜡纸制备的人工种子的容器显示高水平的降解。
实例9：消除人工种子容器中的空间的效应
该实验的目的是为了研究用上述琼脂培养基完全填充圆柱形蜡纸容器，从而消除人工种子内的空间的效应。这与其中在苗上方保留空间的标准设计进行比较。将蜡纸容器(Aardvark“Colossal”蜡纸吸管)切成具有平开口的4cm长度。在这个实验中，琼脂具有与实例2相同的组成，不同的是使用0.6％的Difco琼脂，而不是8g/L琼脂。对于完成填充的蜡纸吸管，将～3cm的琼脂层加到吸管中，然后推入苗，并且最后加入较多的琼脂至蜡纸吸管顶部。制备对照容器，其具有～2cm的琼脂塞。在将14天苗龄的甘蔗苗(CP01-1372)引入完整人工种子后，使用手动预拉伸的M固定容器的两个开口。
将人工种子种植在生长室(Conviron CGR-962，白天31℃，夜间22℃，14小时光周期(220μE/m2)内具有0.5重量％OsmocoteTM 17的 -360土壤中，该土壤位于底部带有托盘并且在顶部带有透明塑料盖的10cm塑料罐中(在第10天移除)。初始每个10cm罐的土壤浇水100mL，并且随后每周浇同样量的水。结果列于下表6中。
表6
填充容器对萌发和生长的效应。
表6概述的结果指示用琼脂填充容器对人工种子的甘蔗苗的萌发比率、生长速率和最终尺寸均有有害效应。
实例10：再生苗的苗龄决定人工种子中的苗的萌发频率
制备甘蔗苗和人工种子
在这个实验中，在如实例1所述的相同实验条件下制备甘蔗品种KQ228的3mm分生组织片段，实验条件不同之处如下所述。它们在苗再生培养基(液体培养基)中生长10、15和20天以产生不同苗龄的苗，用于包封在人工种子中。因为10天苗龄的苗非常小并且未良好发育，将所有培养物转移到用琼脂(6g/L)硬化的MS培养基中并再生长10天。将培养物保持在生长室中，该生长室设定为26℃，16小时光周期(30微爱因斯坦/m2/s，来自Philips 25瓦特荧光管)。将来自三种苗龄中的每一种的1-1.5cm长度的苗分离，并称为组1，而将较大的苗修剪成1.6-2.0cm长度，并称为组2(图4)。用两种不同尺寸(4.0cm长度×0.8cm直径和6.0cm长度×1.1cm直径；两端开口)的圆柱形塑料容器构建人工种子，该容器由可商购获得的塑料圆柱体(聚丙烯吸管，购自Brisbane，Australia的当地商店)制成。较小的容器接收1-1.5cm长的苗(组1)，而较大的容器具有1.5-2cm长的苗(组2)。测试苗龄和容器尺寸的组合，总计测试六个不同的组合[2个圆柱形容器尺寸(4和6cm长)×3个苗龄(在液体再生培养基中10、15、20天并且随后在琼脂培养基上10天)]。通过网装固定保持塑料容器的底部开口部分封闭。这种装配有利于不受妨碍的根生长。根据这一实例涉及构建人工种子的其他部件和步骤在下文中详述。
塑料容器用栽培土(市售作为植物苗圃的顶层土)填充3/4体积，其具有一个2mm长的水结晶(Water Crystals)，它是一种高度吸湿的合成化合物，能够保持大量的水和营养物质，将其置于土柱中央。随后把如上制备的甘蔗苗插入塑料容器，插入方式使至少一半长度的苗埋入土壤，留下剩余部分的苗暴露于空间。接下来，将包含1g/L培养基Mancozeb(一种市售通用杀真菌剂)的液体MS营养物质加到土壤中至完全水饱和。通过用完全拉伸的(Bando Chemical Industries，Japan)(一种柔性防水的热塑性密封膜)固定顶部开口完成人工种子的构建(图5)。
在温室中种植人工种子
如上所述制备的人工种子种植在塑料幼苗托盘(35×29cm；64孔，4cm深)中，托盘包含栽培土(可商购获得的顶层土)，填充至顶部。如此种植每个人工种子，使得至少1cm的小人工种子(4cm长)和2cm的较大人工种子(6cm长)保持在土壤上方(图6)。每种类型的容器构造种植至少20个人工种子。作为对照处理，将来自各种苗龄的组1的20株苗(在液体再生培养基中10、15、20天并且随后在琼脂培养基上10天)直接种植在土壤中。所有托盘覆盖有平坦透明塑料片12天。托盘每周交替用自来水和(4g/9L)(一种可商购获得的通用营养物质制剂)灌溉至完全田地容量两次。
在种植后记录三周人工种子萌发植物(定义为具有芽的那些，它们萌发穿过)的百分比(图7)。数据表明人工种子中的苗龄对它的成活和萌发能力起到显著作用。在这个测试中，在3周后，初始已经在液体培养基中生长20天的苗的萌发百分比(图7，浅灰色柱)明显较高(至少70％生长)，无论它们已经被包封在人工种子中(图7，中等灰色和深灰色的柱)或将它们直接种植在土壤中均如此。获取自10天液体培养物的苗的成活百分比在25-40％人工种子范围内，并且当直接种植在土壤中时略高。人工种子的高死亡率是由于真菌污染的高发生率。
实例11：不同种植基质在苗成活和人工种子萌发中的比较
制备甘蔗苗和人工种子
进行这个实验以确定是否无土培养基(如珍珠岩、泥煤苔藓和水结晶)改善人工种子中苗的成活率和生长。使用甘蔗品种KQ228。类似于实例1所述制备组织片段。增殖芽片段(3mm)随后在加入2μM NAA的苗再生培养基中生长17天以使它们生根。在这一阶段末期，形成的苗的尺寸为1.2-3.2cm。这些苗用于包封在人工种子中。对于它们中的大多数，根发育是不可见的(图8)。
在这个实验中使用塑料圆柱形容器(6cm长，1.1cm直径，聚丙烯吸管)，并且它们根据实例10所述的方法制备，不同的是在这个实验中使用5种不同的组成(T)，如下文列出的那些。处理的组成是：在T1中，将苗直接种植在土壤中，不使用种子容器；在T2中，人工种子包含栽培土(类似于实例10使用的那种栽培土)；在T3中，人工种子包含栽培土和水结晶(1g干结晶/L土；)；在T4中，人工种子包含等体积混合的泥煤苔藓和珍珠岩，加上水结晶(1g干结晶/L土)；在T5中，人工种子仅包含水结晶。Ridomil(1g/L土壤)杀真菌剂和(Yates)营养物质以液体形式供应(0.44g/L溶液)，已经将它们加到所有处理中。
实验细节
每种处理制备至少30个人工种子并且还使用相似数目的苗进行直接种植(对照)。约75％体积的每个容器填充有无土培养基，并且用容液灌溉容器至完全田地容量。在不进行环境控制的温室内的塑料托盘(500mm×380mm×80mm)中进行实验，该托盘穿了20个孔(直径1cm)。所有托盘衬有2层纸巾，并且随后填充栽培土，并用水浇灌至完全田地容量。种植人工种子，使它们的顶部开口保持在土壤上方至少1cm。所有处理在第0天时用水浇灌，并且随后每周浇灌一次。所有处理在第0天时施肥，并且随后用2.0L/托盘(4g/9L)每两周施肥一次。在第7、14、21、28、31、40和63天记录在对照(T1)中成活的苗数和在处理中的出芽率(T2-T5)。
图9中概述的结果指示其中将苗直接种植在土壤中(无容器)的对照T1观察到最高的成活率(80％)。T4容器具有等体积混合的泥煤苔藓和珍珠岩加上水结晶，它具有带容器的测试中最高的苗萌发百分比(63％)，接下来是仅包含栽培土的T2(37％)和包含栽培土和水结晶的T3(33％)。仅包含水结晶的T5示出最低的萌发率(7％)。
图10中概述的结果指示芽高度和芽数目在T1-T4中相似，但是T5处理显著更低。
这个测试的结果表明水结晶与其他基质如泥煤苔藓和珍珠岩的组合使用是用于形成无发育良好的根的苗的优良选择。
实例12：人工种子的田间性能
制备人工种子构建体
这个实验设计用于展示来源于甘蔗人工种子的苗的萌发和成功形成。在这个实验中使用甘蔗品种KQ228。人工种子的制备类似于实例10所述，不同的是使用塑料和蜡纸(Aardvark大吸管，1.19cm直径)圆柱形容器进行比较。塑料容器长6cm，直径1.1cm，具有网装固定以部分封闭的底部开口。此外，使用的栽培土混合物补充有杀真菌剂Ridomil(1g/L土)和Water Crystals(1g干结晶/L土)，并且用半强度液体(Yates)饱和。水结晶用半强度(2g/9L)预水合，并且随后在制备构建体前与土壤混合。甘蔗苗在液体培养基中培养2-3周，并且随后再培养附加的4-6周(苗在琼脂上生长，琼脂具有30g/L蔗糖和MS营养物质；图11)，并且在插入容器前修剪成3-4cm的高度。修剪苗的芽和根。将苗置于容器中的土壤内约1.5cm深处。
田间种植
在实验田中进行田间实验，该实验田位于BSES Burdekin ResearchStation，Ayr，Australia。类似于用于常规甘蔗整杆种植的商业操作(即，1.5米行间距)进行整地，这是相关领域熟知的。整出约100米长的垄沟，垄沟之间有1.5米的间隙，并且在种植前2-3天灌溉至完全田地容量。将人工种子种植在垄沟内的孔中，孔深5-6cm并且直径为1.2cm，并且在种植后立即浇水以在土壤和人工种子直接形成良好的连接。种植后的垄沟前10天中每三天进行灌溉，并且随后继续每周一次灌溉。纸和塑料容器每种种植大约100个人工种子(图12)。作为对照，将相似苗龄及类似制备的苗直接种植在田间并接受类似的田地处理。
在种植后五周，记录人工种子萌发的植物数目。图13示出使用塑料容器的人工种子中几乎55％的苗生长并萌发穿过闭合件并且成活。这些结果表明与使用纸容器构建的人工种子或直接种植相比，当使用塑料容器构建人工种子时，出苗率要高得多。图14示出生长5周后由塑料容器制成的人工种子产生的植物照片(上侧图)和直接种植在土壤中的苗的照片(右下方图)。在人工种子内的植物中根系发育良好(左下方图)
得自这一大田实验的结果指示利用在纸容器或塑料容器中的人工种子允许在类似于商业种植操作的条件下在田间形成苗。
实例13：侧面开口对在水平种植的人工种子中的苗成活和萌发的效应
该实例的目的是为了比较在容器的侧面具有附加开口(图15，8)的人工种子与仅在人工种子顶端和底端具有开口的容器，当它们以水平方向种植在土壤中时人工种子内的苗的生长和成活。
蜡纸容器(5cm长)通过高压消毒进行灭菌。容器在一个开口处开孔(图15，7)，或在两端是平的(图15，9)。在容器壁上打出圆形开口(5mm直径)，其接近开孔容器情况下的平末端，或接近平末端容器情况下的两端。用包含营养物质的琼脂塞如实例2所述装配容器，并且将已经从分生组织片段再生(在片段化后在再生培养基中再生15天)的甘蔗苗(品种KQ228)置于容器中。所有开口用预拉伸的M固定。由此制备的人工种子置于360中，其侧面开口暴露或浅浅地埋在土下。制备对照组，其无侧面开口并且水平种植，但是左侧部分暴露于表面，由此人工种子的侧面透过土壤可见，但是人工种子的开口不延伸到土壤表面上方。人工种子在生长室的10cm塑料罐(Conviron CGR-962，白天31℃，夜间22℃，14小时光周期，220uE/m2)中生长，开始时用塑料圆顶覆盖所述罐。在16天后移除塑料盖。实验结果在下表7中给出。
表7
当水平种植时窗口对人工种子内的苗成活和萌发的效应
表7中的结果指示当水平种植人工种子时，侧面开口的存在改善苗的成活率。
实例14：种植倒置人工种子的效应
该实验的目的是为了研究以倒转竖直方向种植人工种子(苗的芽指向下)的效应。制备蜡纸容器(5cm长)，其具有开孔，但是无侧面开口。用包含营养物质的琼脂塞如实例2所述装配容器，并且将已经从分生组织片段再生(在片段化后在再生培养基中再生14天)的甘蔗苗(品种CP01-1372)置于容器中。所有开口用预拉伸的M固定。由此制备的人工种子以倒置或正常方向(右侧向上)竖直种植在360中。人工种子在生长室的10cm塑料罐(Conviron CGR-962，白天31℃，夜间22℃，14小时光周期，220uE/m2)中生长，开始时用塑料圆顶覆盖所述罐。在大约14天后移除塑料盖。结果列于下表8中。
表8
以倒置构型种植人工种子的效应
表8中概述的结果指示以倒置构型种植的人工种子与以右侧向上方向种植的对照人工种子相比导致更低的萌发率。
实例15：合成用于人工种子的聚酯嵌段共聚物
合成一系列聚酯嵌段共聚物以形成能够生物降解的材料，其适用作合成种子盖，具有适于萌发的植物芽穿过的机械性能。首先，称重3.00g 3，6-二甲基-1，4-二氧戊环-2，5-二酮置于在手套箱内的50mL圆底烧瓶中，其包含在氮气环境中的磁力搅拌棒。接下来，称重0.020g 2-乙基己酸锡(II)放入烧瓶。将3.00gε-己内酯连同0.025g 1，4-苯二甲醇加到烧瓶中。将冷凝器附接到烧瓶上，并且将其从手套箱中移出并立即用氮气吹扫。然后在氮气环境下用油浴将烧瓶加热到140℃并磁力搅拌24小时。在24小时后，取出少量聚合物进行分析，并且加入附加的3.00g 3，6-二甲基-1，4-二氧戊环-2，5-二酮。继续加热和搅拌3小时。将最终产物冷却至室温，溶解在氯仿中并滴入过量己烷/甲醇(90/10v/v)以沉淀聚合物。在60℃真空炉中干燥最终产物3天。
使用这种方法合成一系列聚合物，其变型如表9所述，包括使用机械搅动和手性单体，从而获得各种性能。利用多角度激光光散射检测器，用尺寸排阻色谱法在四氢呋喃(THF)溶剂中表征聚合物分子量。在第一步骤结束时从取样中测定中嵌段分子量，并且这从最终产物的分子量中减去以测定第一和最终嵌段分子量(假定它们由于引发剂的双官能度而均匀分布)。
表9.聚酯嵌段共聚物的组成和合成工艺参数。
实例16：人工种子中附加的膜盖组合物比较
从较长的部分中切出蜡纸容器(5cm长，1.19cm直径)。手动卷曲底端(图16)。随后将360加到管中，在管底部形成大约1cm厚的层。随后将已被修剪为大约3cm长度的甘蔗苗置于土壤塞顶部，并将附加的土壤加到管中，使得管大约填满75％，并加入1mL水。用下述多种方法之一固定管的顶部。在一种情况下，使用预拉伸的M覆盖人工种子顶部。在另一种情况下，通过用10密耳的刮粉刀从25重量％的THF溶液将PLA-8(实例15)浇铸到聚(四氟乙烯)(PTFE)片上形成38um厚的膜。膜随后在室温下干燥5小时，然后在大约60℃的真空炉中干燥18小时。最后通过在热板上，在聚(四氟乙烯)(PTFE)涂覆的箔上加热膜直至它软化(～80℃)将膜附接到管末端，然后手动压到管顶部。在另一种情况下，通过使用磁力搅拌棒混合2.20g11-035(Reichhold Inc，Durham，NC)与0.545g棕榈油(Sigma Aldrich，St.Louis，MO)，以及0.020g萘酸钴(II)(在溶剂油中55重量％，Electron MicroscopySciences，Hatfield PA)，随后利用245um的刮粉刀将该混合物涂布在聚(四氟乙烯)(PTFE)片上并在室温下固化24小时形成醇酸树脂膜。膜的最终厚度为75um，并且使用遮蔽胶带将它附着到纸管的顶端。在另一种情况下，将半透明的3/8”直径圆柱形塑料顶盖(Alliance Express，Erie，PA)插入管顶部。在另一种情况下，通过将盖切离1.7mL微离心管(SafeSealMicrocentrifuge Tubes，Sorenson BioScience Inc，Salt Lake City，UT)，并且随后将末端切离楔形末端形成锥形盖，在管的楔形末端产生～3-5mm的孔，并且随后将这个管的宽末端插入纸管的顶端(图17)。在另一种情况下，相似地制备微离心管，不同的是在底端的切割与管轴成～45度角，并且将100um厚的膜切成～1cm×～2cm的矩形，其弯曲成一角度使得它能够胶粘到塑料管的侧面并覆盖倾斜的孔(图18)。这形成覆盖孔的翼片，它能被苗的生长的芽推开。在另一种情况下，将盖切离1.7mL微离心管，但是不在底端形成孔，并且这使用熔融PLA-7(实例15)，通过首先将微离心管浸入在热板上保持在140℃的熔融PLA-7中被附着到纸管的顶部，并且随后将它压到纸部分的顶部。在另一种情况下，利用熔融PLA-7将100um厚的膜的～1.5cm正方形片附着到纸管末端。在最终实施例中，膜的矩形片(～1.5×2.5cm)在最长尺寸中部弯曲成90度角，并且随后用热熔胶粘结到纸管侧面，使得弯曲部分覆盖管的开口端，形成翼片。将由此制备的人工种子种植在360中，使得纸部分的顶部高于土壤表面大约0.3-0.5cm，人工种子在10cm塑料罐中并在(ConvironBDW-120型)中生长，生长条件为白天31℃，夜间22℃，以及13小时光周期，220uE/m2)。
表10.不同类型的盖对人工种子萌发的效应。
如表10可见，PLA 8膜和醇酸树脂膜优于预拉伸的M。在多种情况下，苗的芽能够延伸穿过带翼片设计的锥形管，以及具有90度翼片的纸管。另外，苗能够推开多个3/8”圆柱形塑料盖。
实例17：测量聚酯嵌段共聚物的机械性能
选择盖材料的机械性能以穿孔模式进行测量，用于评估苗的芽的穿透容易程度。这在TA-XT2i Texture Analyser(Texture Technologies，Scarsdale，NY)上进行。金属圆柱形探针直径为2mm并且长度为38mm，在末端渐缩，具有1mm的圆形末端，将其安装在质构分析仪的负荷传感器臂上。将膜安装在1.19cm直径纸管的开口端上。探针设置为向下移动，使得它与膜表面成90度角冲击纸管中心的膜。以恒定变形和恒定负荷(蠕变)两种模式进行研究。
表11.盖膜材料的机械性能。用逗号分开的值表示平行测试。
在表11中，PLA-8和醇酸树脂膜样品当以恒定变形速率测试时具有相当的断裂力和在恒定负荷下较快的失效时间，表明它们将比预拉伸的M更容易穿透。
实例18：比较人工种子中的锥形盖与膜盖
通过从较长的管中切出部分制备蜡纸容器(5cm长，1.19cm直径)。底端被手动卷曲(图16)，或将一个小(～1cm厚)的岩石棉塞插入底部。随后将360加到管中，形成大约1cm厚的层。随后将修剪过的甘蔗苗置于土壤塞顶部，并且把附加的土壤加到管中，使得管填满大约75％。随后将1mL水加到每个管的土壤中。管顶部用预拉伸的M固定，它是一种150-225um厚的PLA-7(实例15)膜，或用锥形管固定，它如实例16所述通过将盖和底部末端切离1.7mL微离心管(SafeSealMicrocentrifuge Tubes，Sorenson BioScience Inc，Salt Lake City，UT)，在管的窄末端产生～3-5mm的孔，并且将这个管的宽末端插入纸管的顶端而形成(图17)。将由此制备的人工种子种植在360中，使得纸部分的顶部高于土壤表面大约0.3-0.5cm，人工种子在10cm塑料罐中并在(Conviron BDW-120型)中生长，生长条件为白天31℃，夜间22℃，以及13小时光周期，220uE/m2)。
表12.不同类型的盖对萌发的效应。
在表12中，实验结果表明与膜型盖相比(包括预拉伸的和PLA-7)，苗的较高部分成功地萌发穿过锥形盖。此外，据观察预拉伸的盖具有比锥形盖更多的受困的苗(其中芽明显地冲击盖的内表面)。
实例19：锥形盖人工种子的田间测试
通过从较长的部分中切出制备蜡纸容器(6cm长，2cm直径)。纸管部分在两端是平的。从15mL聚丙烯离心管(VWR International，LLC，Radnor，PA)中移除盖，并且与管轴成90度角切割锥形末端，形成～5-8mm直径的孔。切出2cm直径纸管的短(～2cm长)部分，并且随后沿着它们的长度方向切割以充当楔或垫片，用于保持塑料管紧密地位于纸管内。来自组织培养的甘蔗苗被修剪成～8cm长度。甘蔗苗的根末端在 360中滚动以形成土壤覆盖的根球。随后将苗插入6cm长的纸管部分，使得根球比底部大约高1cm，并且芽末端伸出顶端。随后，围绕植物从顶部和底部加入360，使得底部填充至开口，并且在顶部留下约1cm不填充。用笔轻轻地把它压实，并且加入更多的土壤直至管被填满至距离顶部大约1cm。随后将纸插件压入纸管顶部，围绕苗的芽。随后将15mL离心管插入纸管，其宽末端向下，在苗的芽上方，使得它有约2cm插入纸管。随后通过塑料部分中的孔将4mL水加到每个管的土壤中。将人工种子种植在DuPont Stine Haskell Research Center in Newark，DE的田地环境中。土壤已经被犁过并整理平坦，并且已经用尿素施过肥。在多种不同条件下将人工种子以竖直方向种植成有30cm间距的行。在一种条件下，将它们种植在土壤中8cm深。在另一种条件下，将它们种植为8cm深，带有预溶胀在水中的大约30mL超吸收剂小珠(Magic Water Beads，magicwaterbeads.com)，围绕每个管的基部放置(图19)。在另一种条件下，将它们种植为12.5cm深，带有预溶胀在水中的大约30mL超吸收剂小珠(Magic water beads，magicwaterbeads.com)，围绕每个管的基部放置(图19)。在另一种条件下，将它们种植为12.5cm深，带有预溶胀在Murashige and Skoog(MS)营养培养基中的大约30mL超吸收剂小珠(Magic water beads，magicwaterbeads.com)，围绕每个管的基部放置。在另一种条件下，挖出20cm深和20cm直径的孔，并且田地土壤用 360替换，并且将人工种子种植为8cm深，带有预溶胀在水中的大约30mL超吸收剂小珠(Magic water beads，magicwaterbeads.com)，围绕每个管的基部放置。作为比较，也将裸露的苗直接种植在田间，使得根大约为1cm深。在种植后立即灌溉田地，并且随后每周灌溉一般3次。
表13.用15mL锥形盖人工种子进行大田实验的结果
在表13中，15mL人工种子提供比赤裸的苗提高的成活率。使用较浅的种植导致成活率提高。另外，据观察塑料锥形管在实验期间的某些时间用于收集露水。另外，据观察当植物长得足够大时，芽冲击在锥形管中形成的孔，使多个植物(到第90天时68％)长出邻近塑料管体的蘖。这看起来在生长穿过由已经在土壤中降解的纸部分构成的种子区域时发生。
实例20：锥形盖的大小和尺寸对人工种子田间成活率的效应
带有15mL锥形盖的蜡纸容器如实例19所述制备。此外，将甘蔗苗种植在2”罐内的360中，其已经用水饱和过，并且甘蔗苗被修剪成大约6-8cm的长度。从15mL锥形离心管(VWR International，LLC，Radnor，PA)中移除盖并且切割底部楔形末端使得形成～5-8mm的孔。从50mL锥形离心管(VWR International，LLC，Radnor，PA)中移除盖并且切割底部楔形末端使得形成～1.5cm的孔。将15mL和50mL锥形管定位在种植的甘蔗苗的芽上方，并且随后强行转动并向下压，使得苗以及围绕它的土壤被取到锥形管中。这形成土壤塞，它在管基部大约高3-6cm。对于一种处理，将第二个50mL管堆叠在包含苗的第一个50mL管顶部(图20)。这形成在苗上方的第二“室”。随后将管提起到罐外，在塑料袋中储存过夜并运送到田间，在早晨种植。将人工种子种植在DuPont StineHaskell Research Center in Newark，DE的田地环境中。土壤已经被犁过并整理平坦，并且已经用尿素施过肥。将人工种子以竖直方向种植成行，行间距30cm，在土壤中深8cm。作为比较，也将裸露的苗直接种植在田间，使得根深度为大约1cm。在种植后立即灌溉田地，并且随后每周灌溉一般3次。
表14.用多种锥形盖人工种子设计进行大田实验的结果。
在表14中，注意到50mL管具有比15mL管更高的成活率，并且堆叠的50mL管具有比单个50mL管更高的成活率，在萌发以及植物高度方面均如此。此外，50mL和堆叠的50mL锥形管提供比裸露的苗对照提高的成活率。
实例21：锥形管末端和保护性翼片对人工种子田间成活率的效应
15mL和50mL锥形管人工种子如实例20所述制备。此外，将甘蔗苗种植在2”罐内的360中，其已经用水饱和过，并且甘蔗苗被修剪成大约6-8cm的长度。从50mL锥形离心管(VWR International，LLC，Radnor，PA)中移除盖，并且切除整个锥形末端，在两端产生圆柱形管开口。在另一种处理中，从50mL锥形离心管(VWR International，LLC，Radnor，PA)中移除盖，并且切除锥形末端的尖端，形成～5-8mm的孔。100um厚的矩形膜(～2cm×～1cm)弯曲成一个角度，使得当热胶粘至锥形管的侧面末端时，自由端松散地覆盖～5-8mm的孔(图21)。在另一种处理中，从15mL离心管(VWR International，LLC，Radnor，PA)中移除盖，并且切除锥形末端的尖端，留下5-8mm的孔。沿着管轴从具有较大开口的末端朝着楔形末端切出四个4.5cm的狭槽。从50mL锥形离心管(VWR International，LLC，Radnor，PA)中移除盖，并且切除末端以形成足够大的孔，使15mL锥形管倒转插入该孔中。倒置该结构，使得50mL管的宽末端指向上。超吸收剂粉末聚(丙烯酸)是部分钠盐-接枝-聚环氧乙烷(Sigma Aldrich，St Louis，MO)，它以1∶223的比率(粉末重量∶水重量)在去离子水中溶胀。随后将这种凝胶插入两管之间的环形空腔中。随后在50mL管的宽末端上拉伸M，该管在中间具有孔，其中伸出15mL管(图22)。在15mL管中的开口保持开放。将所有类型的锥形管定位在种植的甘蔗苗的芽上方，并且随后强行转动并向下压，使得植物以及围绕它的土壤被取到锥形管中。这形成土壤塞，它在结构基部大约高3-6cm。随后将管提起到管外部并运输到田间进行种植。在2012年8月24日将人工种子种植在DuPont Stine Haskell Research Center in Newark，DE的田地环境中。土壤已经被犁过并整理平坦，并且已经用尿素施过肥。将人工种子以竖直方向种植成行，行间距30cm，在土壤中深8cm。作为比较，也将裸露的苗直接种植在田间，使得根深度为大约1cm。在种植后立即灌溉田地，并且随后每周灌溉一般3次。
表15.用多种锥形盖人工种子设计进行大田实验的结果。
在表15中，实验结果表明在顶部具有孔的50mL锥形管(无纸)在成活率方面表现最好。这一结果比无锥形末端的相同尺寸圆柱形管更好。
实例22：不同锥形管设计和储存对人工种子田间成活率的效应
15mL和50mL锥形管人工种子如实例20所述制备。此外，将甘蔗苗种植在2”罐内的360中，其已经用水饱和过，并且甘蔗苗被修剪成大约6-8cm的长度。从15mL锥形离心管(VWR International，LLC，Radnor，PA)中移除盖并且切割末端，在末端形成5-8mm的孔。从50mL锥形离心管(VWR International，LLC，Radnor，PA)中移除盖，并且切除末端以形成足够大的孔，使15mL锥形管适形于该孔。随后将15mL锥形管插入50mL锥形管，其取向使得两个锥形末端指向上方并且15mL管紧密贴合在50mL管内侧(图23)。在另一种处理中，从15mL锥形离心管(VWR International，LLC，Radnor，PA)中移除盖，并且切除锥形末端的尖端，形成～5-8mm的孔。切割聚乙烯样品袋的拐角以形成三角形帐篷，其高度从大开口端至拐角大约等于15mL锥形管的长度。通过切掉这个三角形的拐角形成大约lcm的小孔，从而允许15mL锥形管的末端插入。这形成围绕15mL锥形管的塑料膜帐篷。高压灭菌胶带自身折叠以形成足够大的带，用于保持帐篷部分围绕所述管。这条带在种植前移除，并且帐篷扩张到它的最大覆盖百分比(图24)。种植这种结构，使得帐篷的边缘被土壤覆盖。在另一种处理中，从50mL锥形离心管(VWR International，LLC，Radnor，PA)中移除盖，并且切除锥形末端的尖端，形成～2cm的孔。切割聚乙烯样品袋的拐角以形成三角形帐篷，其高度从大开口端至拐角大约等于50mL锥形管的初始锥形部分的高度。热胶粘样品袋拐角至锥形管中的开口，从而形成覆盖在孔上的帐篷样覆盖。然后使用剪刀在这个帐篷样覆盖件中切出两条大约1cm的狭槽，它们彼此成90度角，切割方向沿着管轴取向。这形成开口，通过它苗的芽能够生长(图25)。在另一种处理中，聚(乳酸)粒料(PLA2002D，NatureWorks，Minnetonka，MN)在190℃下热压成膜，其厚度为200-380um。将这些膜切成大约12cm×10cm的矩形片。沿着10cm边之一切出锯齿图案，其具有大约2cm深度和3cm宽度的三角形特征。接下来，将膜卷成重叠管形状，并且插入50mL锥形离心管(VWR International，LLC，Radnor，PA)，锯齿图案指向锥体。随后将锥形管置于120℃烘箱中，由聚(乙缩醛)制成的锥形榫钉(22mm直径，15cm长度)插入管中间，烘烤2-5分钟将膜软化以适形于管的形状。随后将其移除并在实验室工作台顶部上冷却至室温，形成从锯齿图案指向彼此的三角形特征的锥形形状(图26)。从50mL离心管中移除卷起来的聚(乳酸)膜和榫钉。将上述管定位在种植的甘蔗苗的芽上方，并且随后强行转动并向下压，使得植物以及围绕它的土壤被取到锥形管中。这形成土壤塞，它在结构基部大约高4-6cm。随后将管提起到管外部并运输到田间进行种植。在2012年9月13日将人工种子种植在DuPont Stine Haskell ResearchCenter in Newark，DE的田地环境中。作为比较，也将裸露的苗直接种植在田间，使得根深度为大约1cm。在种植后立即灌溉田地并且随后不进行灌溉。土壤已经被犁过并整理平坦，并且已经用尿素施过肥。将人工种子以竖直方向种植成行，行间距30cm，在土壤中深8cm。在另一种处理中，12.5重量％的聚(乳酸)粒料(PLA2002D，NatureWorks，Minnetonka，MN)溶解在氯仿中。将这种溶液倾注到50mL离心管(VWRInternational，LLC，Radnor，PA)中。将过量的溶液倾出管外并使内壁上的残余在通风柜内部的环境条件下干燥24小时。随后将管置于真空炉中并在50℃下干燥3天，其中有稳定的空气流过该室。将聚(乳酸)浇铸取出50mL离心管。将这些溶液浇铸的管定位在种植的甘蔗苗的芽上方，并且随后强行转动并向下压，使得植物以及围绕它的土壤被取到锥形管中。这形成土壤塞，它在结构基部大约高4-6cm。随后将管提起到罐外并使用QuickSeal脉冲密封机(National Instrument Co，Baltimore，MD)沿着底部边缘热封。将这些种子分成两组并储存在环境温度或15℃下9天，随后种植在田间。通过切除已经热封的底部边缘，并且切割锥形部分末端使之有沿轴方向约1cm长的两条垂直切口来完成种植(图27)。随后将管种植在土壤中大约5cm深处。
表16.用多种锥形盖人工种子设计进行大田实验的结果。
如表16所示，性能最好的人工种子是套叠在50mL锥形管内部的15mL管。帐篷结构显示与非帐篷结构类似的成活率。所有种子结构提供比裸露的苗改善的成活率。
实例23：锥形管人工种子的变型
进行这一研究是为了探究锥形管人工种子的多个实用的具体实施，并且用于解决潜在问题如在搬运和储存期间土壤和水分的保持。无纸部分的15mL锥形管人工种子如实例20所述制备。除了这种设计之外，包括下列修改形式作为处理。在一种情况下，热胶粘冷水溶解的聚(乙烯醇)膜(Extra Packaging，Boca Raton，FL)以覆盖在15mL锥形管人工种子顶部的开口。这旨在改善种子中的水分保持。在种植后，这些种子从顶部浇水，模拟降雨，从而溶解膜。在一种处理中，通过切除环形末端的10uL一次性环(Becton Dickinson and Co.，Sparks，MD)形成薄塑料杆，制备大约11cm长的塑料杆。随后将这些热胶粘到15mL锥形管人工种子的侧面，使得它们延伸到低于管底部大约5cm，尖端指向下方。这旨在将管固定在土壤中(图28)。在另一种情况下，使用高压灭菌胶带(VWRInternational，LLC，Radnor，PA)覆盖15mL锥形管人工种子的顶部和底部。将这种种子在室温下储存1周，随后种植，并且在种植时移除胶带。在另一种处理中，将一小圈塑料窗筛网(Lowe’s Home Improvement，Newark DE)热胶粘到15mL锥形管人工种子底部。这旨在有利于在储存和搬运期间保持土壤。在另一种处理中，15mL锥形管人工种子使用包含椰棕(Special Mix Coco，Gold Label SpecialSubstrates，Gold LabelAmericas，Olivehurst，CA)而非360的盆栽土形成。在另一种处理中，将100um厚的膜的三角形片热胶粘到15mL锥形管人工种子基部以用作可折叠的锚定件(图29)。在另一种处理中，纸管由Rite inthe防水复印纸(J.L.Darling Corp，Tacoma，WA)制成，其与牛皮纸或铜版纸相比具有改善的防水性。管通过围绕15mL离心管包裹这种纸并沿着边缘热胶粘来形成。将管切成5cm片段并用预拉伸的M覆盖。纸管人工种子种植在360中，使得纸部分的顶部比土壤表面高大约0.3cm，该种子位于10cm塑料罐中并在(Conviron BDW-120型)中生长，生长条件为白天31℃，夜间22℃，80％相对湿度和13小时光周期，220uE/m2)。将15mL的锥形塑料管人工种子种植在10cm塑料罐内的360中，种植深度为4-5cm。
表17.比较在生长室中的不同管种子结构的结果。
从表17中可确定，锥形管合成种子的多种实用修改形式，包括使用筛网底部、桩和锚定件，不对成活率具有显著的有害效应。当人工种子在实验末期(第40天)被挖出时也观察到根穿过窗筛网。
实例24：锥形管人工种子的锥角度对萌发的效应
该研究的目的是为了确定锥形管人工种子设计的最佳锥角度。无纸部分的50mL锥形管人工种子如实例20所述制备。除了这种设计之外，包括下列修改形式作为处理。在一种处理中，将锥形末端完全切除50mL锥形离心管(VWR International，LLC，Radnor，PA)的末端，形成圆柱形管。将100um厚的膜切成与50mL管相同直径的圆。使用打孔器在圆心处制造5mm的孔。随后将圆热胶粘到管的顶部。在另一种处理中，将锥形末端完全切除50mL锥形离心管(VWR International，LLC，Radnor，PA)的末端，形成圆柱形管。将100um厚的膜切成直径略大于50mL管的圆。在中心打孔，并且从中心孔径向向外至外侧边缘切出单个狭缝。所得闭合的弧强行重叠以形成比标准50mL锥形管(65度)角度更宽(大约135度)的锥。如实例20所述用苗和内部土壤装配具有不同锥角度的管。将它们种植在10cm塑料罐中，深4-5cm，并且在(Conviron BDW-120型)中生长，生长条件为白天31℃，夜间25℃，以及13小时光周期，220uE/m2)。
表18.比较在生长室中的不同管种子结构的结果。
表18表明具有较小锥角度的管产生较好的萌发结果。在具有平顶部或浅锥的情况下，大多数植物受困，但是依然活着。
实例25：制备用于人工种子闭合件的聚酯-聚硅氧烷嵌段聚合物膜
进行下述合成工序以提供可供选择的材料，其具有增强的生物降解能力，用作人工种子闭合件。该材料是嵌段聚合物，它由聚(丙交酯)(PLA)-一种在室温下刚性的玻璃状聚合物-和聚(二甲基硅氧烷)(PDMS)-在室温下为液体，构成。选择材料中PLA和PDMS的相对含量以产生类似于手动预拉伸的M的总体机械响应。
900-1100cSt粘度的氨基丙基封端的PDMS购自Gelest(DMS-A31)，并且用作用于聚合丙交酯的双官能大引发剂。在无氧和无水条件下，将40gPDMS加到1L圆底烧瓶中。将60g丙交酯(Sigma-Aldrich)，40μL 2-乙基己酸锡(II)(Sigma-Aldrich)，和461mL甲苯(EMD Chemicals)加到烧瓶中。在搅拌下将反应混合物在100℃下加热24小时。所得聚(丙交酯-b-二甲基硅氧烷-b-丙交酯)(LDL)三嵌段聚合物溶液使用旋转蒸发器进行干燥。将固体LDL聚合物再溶解在435g二氯甲烷(EMD Chemicals)中，在10倍体积的过量甲醇(EMD Chemicals)中沉淀，过滤并用甲醇洗涤，并且随后在45℃下真空干燥。获得大约87g LDL。
LDL的总数均分子量Mn和组成fPLA(PLA的重量分数)通过核共振光谱学进行测定，并且多分散指数PDI通过尺寸排阻色谱法进行测定，它们在表A中提供。通过首先在氯仿(EMD Chemicals)中溶解20重量％的聚合物制备LDL膜。使用具有5cm宽度和254um厚度间隙的刮粉刀将这种溶液浇铸在基质上。在环境条件下干燥5天后，获得大约75um厚的膜。在单轴牵伸张力下测量LDL的弹性模量E、拉伸强度σf、和断裂应变εf，如表19所示。为了比较，也提供了预拉伸的M的对应值。在这种情况下，在测量之前，具有相同初始长度和宽度的M样品沿其长度方向经受200％的单轴牵伸应变，然后沿其宽度方向经受200％的单轴牵伸应变。
表19
LDL和 M的分子和机械性能
实例26：容器长度和闭合件类型对人工种子活力的效应
将蜡纸容器切成4cm和7cm的长度。用如实例25所述制备的38um厚的LDL膜，或254um厚的大豆油凝胶膜固定每个容器的一个开口端。后者通过在155℃下溶解9重量％的A1535聚(苯乙烯-b-乙烯-共-丁烯-共-苯乙烯-b-苯乙烯)三嵌段聚合物在大豆油(MP Biomedicals，Solon，OH)中，并使用具有5cm宽度和254um厚度间隙的刮粉刀将热溶液浇铸在预热至155℃的玻璃基板上进行制备。在冷却至室温时，三嵌段聚合物在油中的物理胶凝作用产生固态的、但是高度可变形的膜。使用薄层氰基丙烯酸酯粘合剂(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)将LDL膜附连到蜡纸容器上。大豆油凝胶膜通过加热膜附接，仍旧附着玻璃基板上，接近它的溶胶-凝胶过渡态(大约80℃)，将蜡纸容器末端压到软化膜中，并且冷却至室温以再硬化膜。
随后将4和7cm的蜡纸容器(用LDL或大豆油凝胶膜固定它们的底端)加载大约三分之一的干燥360生长培养基。随后将一株再生甘蔗苗加到每个容器中。根据类似于实例1所述的方法由品种CPO-1372制备再生苗。再生苗长度从几厘米至超过10cm。在将苗加到4cm容器后，修剪苗的芽以贴合在4cm长度内。对于7cm容器，仍旧修剪苗的芽以贴合在4cm容器内，即，修剪所有苗至相同长度，无论容器的尺寸如何。随后用附加的360填充至4cm容器顶部，并且经由移液管将1mL去离子水加到容器中。在加入水后，在4cm管中的土壤含量压实至充满容器大约三分之二。随后用4cm厚的360层填充7cm容器，并且经由移液管将1mL去离子水加到容器中。用LDL或大豆油凝胶膜如前文所述固定容器顶端。使用相同材料用于每个容器的顶部和底部闭合件，即，仅通过LDL膜或仅通过大豆油凝胶膜封闭每个容器。
人工种子种植在10cm塑料罐中，该罐具有沿着底部表面切出的狭缝并填充有360。还将罐置于塑料托盘中以收集水。所有人工种子以竖直方向种植；种植4cm容器，其顶部闭合件与土壤水平平齐，并且种植7cm容器，其顶部闭合件比土壤水平高3cm。将罐保持在环境舱中，其具有16小时光周期，3000lum/ft2的亮度和31/20℃的白天/夜间循环。一般以几天一次的频率给罐浇水。
容器长度和闭合件类型的每个组合种植的人工种子数目在表20中提供，并且提供4周观察期间萌发并成活的人工种子百分比和它们的平均高度。人工种子表现出高萌发率和成活率，最低为60％。为了比较，在相同环境舱中直接从再生向360移植的裸露的苗在4周后分别表现出46％的成活率。因此，将再生苗包封在蜡纸容器中提供显著的活力提高。它进一步证明LDL闭合件提供增强的活力-最少90％-与大豆油凝胶闭合件进行比较。虽然后者更易于变形，并且因此更易于被包封的苗的芽穿透，当接触顶部闭合件时观察到苗的芽变色。这表明大豆油凝胶对苗某些程度的植物毒性，这可能解释相应人工种子的成功率较低。相比之下，接触LDL闭合件的苗的芽未观察到变色。
表20
来自不同容器长度、闭合件类型、和苗类型的人工种子甘蔗植物的活 力
实例27：来自圆柱形容器的人工种子在田间测试中的活力
这个实验比较来自三种不同人工种子的甘蔗苗在田间环境中的生长，它们主要区别在于构成种子容器主体的材料。将蜡纸容器切成21.6cm的长度。乙酸丁酸纤维素(CAB)刚性管具有1.59cm的外径和1.25cm的内径，其购自McMaster-Carr(Santa Fe Springs，CA)并被切成21.6cm的长度。1.90cm外径，1.25cm内径，和20μm孔尺寸的多孔聚乙烯(PPE)刚性管购自Interstate Specialty Products(Sutton，MA)，并且被切成15.24cm长度。如实例26所述用38.1um厚的LDL膜固定每个蜡纸容器、CAB容器、和PPE容器的一个开口端。容器随后填充有1g干燥360生长培养基。将通过类似于实例1中描述方法制备的品种CPO-1372的一株再生甘蔗苗加到每个容器中。在加入容器之前或之后不对苗进行修剪。在加入苗后，所有容器填充有附加的1g干燥-360和2mL去离子水，随后使用氰基丙烯酸酯粘合剂，用LDL膜固定容器顶端(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)。
将人工种子种植在位于Newark，DE的DuPont Stine Haskell ResearchCenter的田地中。整地以提供平坦的种植表面。人工种子种植成行，行间距1.5米，并且在行内的相邻种子之间距离15cm。人工种子以竖直方向种植，使得包封的苗的芽面朝上并且容器大约4cm位于土壤平面下方。在种植后立即灌溉田地，并且随后每周灌溉一般3次。每个种植的容器类型的人工种子数目，以及在4周观察期间萌发并成活的种子百分比在表21中列出。CAB和PPE容器与蜡纸容器相比导致显著更高的成活比率。
表21
来自不同容器类型人工种子的甘蔗植物在田间的活力
实例29：在能够快速生物降解的容器中包封甘蔗苗以提供人工种子
脂族聚酯聚(ε-己内酯)(PCL)用于快速构建能够生物降解的容器。PCL购自Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)并且溶解在氯仿中，浓度为10重量％。使用具有5cm宽度和254um厚度间隙的不锈钢刮粉刀将这种溶液浇铸在玻璃基板上。干燥所得PCL膜，最终厚度为0.001-0.002英寸。在从玻璃基板上移除后，两片膜(每个宽度为5cm并且长度为10.2cm)重叠放置并沿着两条较长边和一条较短边热封以形成开放小袋。该小袋装有1g干燥360。随后将再生甘蔗苗加到小袋中，然后加入附加的1.2g干燥360和2.1g去离子水。根据类似于实例1所述的方法由品种CPO-1372制备苗。如果需要的话，修剪苗的芽以贴合小袋内部并密封剩余的开口边缘，形成围绕苗的密封气密PCL容器。
将如此制备的人工种子种植在10cm塑料罐中，该罐具有沿着底部表面切出的狭缝并填充有360。还将罐置于塑料托盘中以收集水。将所有人工种子以竖直方向种植，深度大约2-3英寸，使得包封的苗的芽面朝上。将罐保持在环境舱中，其具有13小时光周期，1900lum/ft2的亮度和31/22℃的白天/夜间循环。将相对湿度控制在恒定值80％。罐以每周1-2次的频率浇水。为了比较，来自用于制备人工种子的相同批的苗被裸露地种植在相同制备并保持的罐中。
由于PCL的快速生物降解能力和其中它用于上述人工种子的相对薄的构成，由所述人工种子产生的甘蔗植物表现出不同于前文所述管状人工种子的形成过程。人工种子的定期取样指示PCL容器埋入部分的可见降解和破碎-生物降解作用的直接结果-大约在种植后一周至两周发生。这一现象使得植物的根在围绕初始PCL容器的土壤中形成。经过相同时间并且实际上经过该实验的六周，未观察到PCL上表面部分降解的可见迹象。然而，植物的芽在PCL容器内明显变大。在种植后几周至超过一个月内，生长植物的芽能够从土壤表面推开PCL容器的未降解部分并且甘蔗植物的生长随后以规律方式继续。最后，PCL容器的未降解部分脱落或保持附着到生长植物芽的尖端上。
种植的30个人工种子中，在实验六周时22(73％)个萌发并成活。20个裸露种植的苗中，经过相同时间有12(60％)个成活。成活的裸露植物的根质量和高度显著超过那些来自人工种子的成活植物。这是包封的甘蔗苗的根和芽从它们的PCL容器中延迟释放的结果。在种植后一周未观察到PCL容器被生长植物从土壤中抬起。最后，所有成活的样品萌发，但是萌发在几个人工种子中延迟超过一个月。总体上，结果展示了由被薄的、密封的、和能够快速生物降解的容器包封的甘蔗苗构成的人工种子的活力。
包括能够快速生物降解的容器的人工种子在田间的活力
制备包括由PCL膜容器包封的甘蔗苗的人工种子并种植在田间，田地在位于Newark，DE的DuPont Stine-Haskell Research Center的两个分开的地方。在所有情况下，人工种子种植在平坦的田地中。将人工种子以竖直方向种植，深度大约5-7.5英寸，使得包封的苗的芽面朝上。在第一次实验期间，在种植后立即灌溉田地，并且之后每周灌溉一次至两次。在第二次实验期间，在种植后立即灌溉田地，但是之后不进行灌溉。
表22示出每个实验种植的人工种子数目，以及在实验期间的萌发百分比(第一次实验和第二次实验分别为七周和四周)和成活百分比。甘蔗植物在周围土壤中由这些种子形成的过程类似于在生长室实验中观察到的过程。经过种植后头一周至两周，PCL容器的埋入部分快速生物降解，从而将苗的根释放到周围土壤中。在相同时间内，芽生长发生在PCL容器未降解的上表面部分的限制内。经过较长时间，连续的芽生长将PCL容器的剩余部分抬起远离土壤表面，并且随后生长以规律方式继续。将如前文所提及的成活率定义为健康存活植物的视觉证据。来自第一次种植的大量样品成活，但是未萌发。萌发首先在大约两周后再种植的群体间被观察到，并且萌发样品的百分比随后以相对于时间的线性方式增加。相比之下，在第二次实验的四周后，未观察到萌发。这是低温的结果，低温显著降低了植物生长速率；在两次实验期间测得的平均表面土壤温度分别是第一次24℃和第二次20℃。表22指出用这些人工种子获得中到高的成活率。由于第二次实验遇到亚最佳生长温度，数据展示了能够快速生物降解的容器的人工种子的活力。
表22
来自PCL膜容器的甘蔗植物在田间的萌发率和成活率
在种植后记录7周
在种植后记录4周
实例30：人工种子的硅酸盐营养培养基
这个研究的目的是为了检查硅酸盐凝胶作为甘蔗苗生长的营养培养基的使用情况。将45g硅酸钾水溶液(29.1重量％固体，1，PQCorporation，Malvern，PA)加到在烧杯中的255g去离子水以及300g的Murashige and Skoog(MS)培养基中，该培养基具有3重量％蔗糖和0.2重量％植物防腐剂混合物(PPM)。使用硝酸将混合物调节至pH7。随后使用1L，0.22um孔尺寸的过滤器组件(Corning Inc.，Corning NY)将该溶液过滤除菌。在放置2小时后，溶液形成凝胶。随后将凝胶浸入过量去离子水中并进行浸泡以除去残余的盐(硝酸钾)。将凝胶浸泡4天并且在第4天更换去离子水。在第5天，用具有3重量％蔗糖和0.2重量％PPM的过量MS培养基更换该培养基。在浸泡于MS/蔗糖培养基24小时后，排出过量的液体并在测试前将凝胶高压消毒。另一种凝胶利用2135制备。将45g硅酸钾水溶液(35.5重量％固体，2135，PQ Corporation，Malvern，PA)加到在烧杯中的255g去离子水以及300g的Murashige andSkoog培养基中，该培养基具有3重量％蔗糖。使用硝酸将混合物调节至pH 7。随后使用1L，0.22um孔尺寸的过滤器组件(Corning Inc.，CorningNY)将该溶液过滤除菌。在2小时后，这形成凝胶。随后将凝胶浸入过量去离子水中并进行浸泡以除去残余的盐(硝酸钾)。将凝胶浸泡4天并且在第4天更换去离子水。在第5天，用具有3重量％蔗糖和0.2重量％PPM的过量MS培养基更换该培养基。在浸泡于培养基中24小时后，排出过量的液体并在测试前将凝胶高压消毒。这些凝胶的电导率为大约5mS，而培养基自身的电导率为大约3mS。作为对照，利用琼脂，通过在大约80℃加热在具有3重量％蔗糖和0.2重量％PPM的MS培养基中0.7重量％的琼脂直至其溶解，然后注入PhtyatraysTM(PhytatrayTM II，SigmaAldrich，St.Louis MO)并冷却来制备凝胶。在无菌操作台中的无菌条件下，来自分生组织组织培养的甘蔗苗已经在片段化后在液体培养基中生长4周，将其分成12组，用纸巾吸干并称重。将这些置于在PhytatraysTM中的3×4阵列模式的多种凝胶材料顶部。用无菌的气体可渗透的胶带(过滤带，Carolina Biological Supply Company，Burlington，NC)封闭PhytatraysTM并且在26℃容器中下孵育16天，容器有Philips F32T8/ADV841/XEN 25瓦特冷白荧光管发出的60微爱因斯坦/m2/s光照。在这段时间后，来自每个Phytatray TM 的苗从凝胶中移出，吸干并再次称重(鲜重)。测定16天后的重量对初始重量的比率。
在另一个实验中，硅酸盐凝胶以与上文所述相似的方式制备，不同的是不进行用于移除残余盐的浸泡步骤。由于无浸泡步骤，所得Murashigeand Skoog和蔗糖营养物质的强度为标准MS培养基强度的45-50％。第二个差异是凝胶用乙酸中和，而非用硝酸中和。最后一个差异是甘蔗苗在实验时间内在液体培养基中15天，而非4周。对于这个实验，使用低熔点的琼脂糖(在1/2强度的Murashige and Skoog营养培养基中0.5重量％)作为对照凝胶，而非琼脂。在这个实验中形成三个重复托盘。基于的硅酸盐凝胶(不浸泡)的电导率是基于1凝胶13.5mS，而基于2135的凝胶超出了测量装置的量程(ConducitivityPen)。
表23.甘蔗苗在硅酸盐凝胶营养培养基上的生长。“A”、“B”和 “C”代表相同处理的平行测定。
如表23可见，用于从硅酸盐凝胶中除盐的浸泡步骤与未经浸泡的凝胶相比改善甘蔗苗的生长。进行浸泡步骤，硅酸盐凝胶用作成功的甘蔗苗生长培养基，而无浸泡步骤，不发生生长。此外，在无浸泡的硅酸盐凝胶上培养的苗表现出变色和应力迹象。
在蜡纸管人工种子中使用硅酸盐营养物质凝胶
这个研究的目的是为了检查硅酸盐凝胶作为人工种子中的营养培养基的使用情况。将15g硅酸钾水溶液(29.1重量％固体，1，PQCorporation)加到在烧杯中的85g去离子水以及100g的Murashige andSkoog培养基中，该培养基具有3重量％蔗糖。使用硝酸将混合物调节至pH7。随后使用1L，0.22um的过滤器组件(Corning Inc.，Corning NY)将该溶液过滤除菌。在2小时后，这形成凝胶。随后将凝胶浸入过量去离子水中并进行浸泡以除去残余的盐(硝酸钾)。将凝胶浸泡5天，并且在此期间更换三次去离子水。在第6天，用具有3重量％蔗糖的过量Murashigeand Skoog培养基更换该培养基。在MS/蔗糖培养基中浸泡24小时后，滗出过量的液体。凝胶的最终电导率为3.8mS。凝胶随后被高压消毒，在测试前达到无菌。将蜡纸管(1.19cm直径)切成4cm长度，带有平开口。管底部用预拉伸的M密封。随后将大约2cm厚的硅酸盐凝胶营养培养基塞加到管中。接下来，将甘蔗苗置于营养物质凝胶顶部。接着用预拉伸的M密封管顶部。此外，研究其他处理方法。这包括测试琼脂营养培养基，其已经浸泡在包含0.57ppm乙烯利(2-氯乙基膦酸)和3重量％蔗糖的Murashige and Skoog营养培养基中24小时。这如上所述组装成蜡纸管人工种子，用于其他培养基。在另一种处理中，形成如上所述的蜡纸管人工种子，其包含具有Murashige and Skoog营养物质和3重量％蔗糖的琼脂培养基，不同的是将薄聚乙烯膜(来自杂货店的产品袋)切成大约4×7cm的矩形并围绕纸管顶端末端包裹，并且用橡皮筋保持在适当位置，形成末端开放的柔性管结构，而不是用预拉伸的覆盖该管。在另一种处理中，将冷水溶解的膜(Extra Packaging，Boca Raton，FL)切成大约7.5cm的正方形片。将高压消毒过的蛭石置于每个正方形片的中心，形成一堆，其占据大约3cm直径的圆形区域。接下来，将大约2-4g包含Murashige and Skoog营养物质和3重量％蔗糖的琼脂培养基块置于蛭石顶部上。接着将甘蔗苗置于琼脂块中央并接触琼脂块。加入附加的蛭石以覆盖甘蔗苗和培养基。最后，聚拢冷水溶解的膜边缘以形成袋，并且在顶部用胶带粘在一起，产生半球形的人工种子。
将管形人工种子种植在360中，使得蜡纸部分的顶部高于土壤表面大约0.3-0.5cm，人工种子在10cm塑料罐中并在(Conviron BDW-120型)中生长，生长条件为白天31℃，夜间22℃，80％相对湿度以及13小时光周期，220uE/m2)。将袋形种子埋入在在10cm塑料罐中的 360，使得小袋顶部接触土壤表面，并且在与管形人工种子相同的条件下培养。
表24.具有多种培养基类型和结构的生长人工种子的结果。
从表24，基于营养培养基的硅酸盐凝胶导致人工种子的发芽率比基于琼脂的营养培养基改善。
实例31：从侧面开口插入苗的蜡纸管人工种子
在这个实例中，我们研究从在5cm蜡纸管部分的中心处的侧面开口插入苗。将1.19cm直径的蜡纸管切成5cm部分并高压消毒。蜡纸管的一端用预拉伸的M密封。随后，加入营养物质培养基以填充纸管，该培养基包含4重量％的低熔点琼脂糖与Murashige and Skoog营养物质，3重量％的蔗糖和0.2重量％的植物防腐剂混合物与150ppm4FS(Syngenta，Wilmington，DE)，以及100ppmXL(Syngenta，Wilmington，DE)。蜡纸管的第二开口用预拉伸的M密封。接下来，使用金属镊子的锋利末端在5cm蜡纸管的中心形成大约4mm直径的孔。随后将甘蔗苗插入孔中，使芽指向外部(图30)，甘蔗苗之前已经在液体营养培养基中培养过10天。将最终组件种植在生长室(ConvironBDW-120型)内的带有托盘的10cm塑料罐内的360中，种植条件为白天31℃，夜间22℃，80％相对湿度以及13小时光周期(220uE/m2)。将管水平种植，使得上部管表面与土壤表面平齐并且苗指向上方。这些管的成活率在第27天为12个种植管中有3个。也种植裸露的苗，其表现出在第27天在24个种植管中有12个成活的成活率。
实例32：管长对蜡纸管人工种子的效应
这个实例的目的是为了研究蜡纸管长度对人工种子成活率的效应。将蜡纸管(1.19cm直径)切成4、8和12cm长度。如实例5所述，也在装配前将容器浸泡在Maxim 4FS溶液中。将管的底端开孔，并且覆盖有预拉伸的M。将360置于管内作为营养物质来源，形成大约1cm厚的层。接下来，将甘蔗苗置于土壤层顶部上，该甘蔗苗已经在液体增殖培养基中培养了14天。加入附加的360，使得该管具有大约3-4cm厚的土壤层。将1mL去离子水加到管中，并且用预拉伸的M密封顶部。将管种植在生长室(Conviron BDW-120型)中具有托盘的10cm塑料罐内的360中，种植条件为白天31℃，夜间22℃，80％相对湿度和13小时光周期(220uE/m2)。将管全部种植在大约4cm的深度。
表25.管长对在恒定种植深度(4cm)的蜡纸管人工种子发芽的效应。
管长(cm) 种植数目 在第39天萌发的数目
4 15 4
8 16 2
12 14 0
表25示出4cm蜡纸管产生比8cm或12cm长纸管更高水平的发芽率。。
在另一个相关实验中，研究三个长度相同的蜡纸管人工种子，这时在顶部无盖并且手动卷曲(图16)底部。种植这些种子，使得管的顶部从土壤表面突出大约0.5-1cm(比管长不同的较早研究种植的更深)。对于较长的管，这需要使用直径更深的8”罐。
表26.管长对在不同种植深度的蜡纸管人工种子发芽的效应。
管长(cm) 大约的种植深度(cm) 种植数目 在第35天萌发的数目
4 3.5 15 14
8 7 15 12
12 11 16 3
从表26可看出长12cm管具有比较短的(4cm，8cm)管更低的发芽率。
在DuPont do Brazil，in Paulínia的Brazilian田地进行相似实验。相似地，4和8cm管表现地比12cm长管更好。
实例33：蜡纸管人工种子纸类型和直径的变化
在这个实验中，将一系列不同类型的纸和直径用作蜡纸管人工种子。1.0cm直径再循环纸管、2.0cm直径再循环纸管和1.2cm直径的管由购自Precision Products Group，Intl(Westfield，Massachusetts)的水溶性纸(羧甲基纤维素钠，ASW 60，Aquasol Corp)制成。将这些切成5cm的长度。通过首先用预拉伸的M封闭底部，随后加入约1cm的 360层装配纸管。接下来将甘蔗苗置于土壤顶部上，该甘蔗苗在实验前已经在液体培养基中培养了5周。接下来加入附加的土壤以在管中形成大约4cm厚的层。加入1mL去离子水。最后用预拉伸的M密封管的顶部。将管种植在生长室(Conviron BDW-120型)内的带有托盘的10cm塑料罐内的360中，种植条件为白天31℃，夜间22℃，80％相对湿度以及13小时光周期(220uE/m2)。将管种植在大约4.5cm深处。
表27.管组成和直径对蜡纸管人工种子发芽的效应。
从表27可看出水溶性纸管具有与可再循环的和标准蜡纸管相当水平的发芽率。
在DuPont do Brazil，Paulínia的Brazilian田间环境中进行类似实验，比较水溶性管与利用网装固定底部的非水溶性蜡纸管人工种子，然而水溶性纸管观察到不良的成活率，原因未明。
实例34：包括能够缓慢生物降解的容器的人工种子的田间活力
以与如实例29所述的PCL膜容器相似的方式制备包括由聚交酯(PLA)膜容器包封的甘蔗苗的人工种子。PLA粒料购自NatureWorks(Minnetonka，MN，grade 4032D)并以按重量计10％溶解在氯仿(EMDChemicals)中。使用具有5cm宽度和254um宽间隙的不锈钢刮粉刀将这种溶液浇铸在玻璃基板上。干燥所得PLA膜，产生25.4um的最终厚度。在从玻璃基板上移除后，两片膜(宽度为5cm)重叠放置并沿着两条较长边和一条较短边热封以形成开放小袋。构建小袋，其长度为17.8和10cm35.6cm。每个小袋填充有1g干燥360生长培养基。随后将再生甘蔗苗加到小袋中，然后加入附加的2g干燥360和3g去离子水。根据类似于实例1所述的方法由品种CPO-1372制备苗。不修剪苗的芽是使苗完全贴合小袋内侧所必需的。最后，密封小袋的剩余开放边缘，围绕苗形成密封的气密PLA容器。
将这些人工种子种植在位于Newark，DE的DuPont Stine HaskellResearch Center的田地中。整地以提供平坦的种植表面。与在实例29和30中描述的PCL膜容器相比之下，这个实例的PLA膜容器在土壤中经过相对长的时间生物降解-超过几个月。因此，如上所述构建的PLA膜容器不提供用于匹配植物的生长特性，经一段时间释放苗的根和芽的机构。因此，离开的途径通过在不同位置和时间切割开放容器形成。切开小袋的顶部和底部密封，从而形成5cm宽的狭缝。在所有样品中，在种植前立即移除底部密封。对于一半样品，在种植前立即移除顶部密封，而对于剩余的一半样品，在种植后19天移除顶部密封。将人工种子以竖直方向种植，深度大约5-7.6英寸，使得包封的苗的芽面朝上。在种植后立即灌溉田地，并且随后每周灌溉一般3次。
表28示出为每个容器尺寸和顶部密封移除时间种植的人工种子数目，以及在种植后4周成活植物的百分比。最终成活率的微小差异在小袋长度和移除小袋顶部密封的时间的四个组合之间被观察到。然而，与实例29所述的能够快速生物降解的PCL容器相比(甘蔗苗在种植后头几天内由该容器完全包封)，这个实例的人工种子表现出相对低的活力。这可能是部分由于前一种情况下较有利的生长条件；存在于土壤中的水的平均温度和体积分数经过实例29的时间分别为29℃和21％，而相应的值经过本实验的时间为24℃和32％。然而，PLA的相对慢的生物降解使在种植期间和种植后移除容器密封成为必须，这也可能是成活率降低的原因。在种植时，人工种子的营养培养基通过容器底部的开口直接接触周围土壤。这必定导致在种植后关键的头几天内，在苗根部位置的营养培养基含水量降低。相比之下，使用如实例29所述的能够快速生物降解的容器防止营养培养基和周围田地土壤在这个初始阶段的接触，并且它的可见降解使苗的根随后可在周围土壤中逐渐形成。
表28
来自PLA膜容器的甘蔗植物在田间的成活率
实例35：带孔的袋型人工种子
这个实例的目的是为了测试具有多个孔的袋型人工种子。袋由6.5×10cm的聚乙烯样品袋(100um厚)(Minigrip，Kennesaw，GA)制成。在一种处理中，使用打孔器在样品袋的半边底部制造大约12，6mm的孔。接下来将含水-360生长培养基和甘蔗苗加到样品袋中。生长培养基大约填满样品袋的一半。将苗的芽修剪至大约8cm，并且将袋顶部保持开放，使芽伸出(图31)。在第二种处理中，沿着样品袋的整个长度制造大约20，6mm的孔。将甘蔗苗修剪至至约4cm并加入-360生长培养基至填满样品袋。用内置密封固定样品袋顶部(图32)。将袋以竖直方向种植生长室(Conviron BDW-120型)中具有托盘的10cm塑料罐内的360生长培养基(它们的顶部突出大约3cm)中，种植条件为白天31℃，夜间22℃，80％相对湿度和13小时光周期(220uE/m2)。
表29.袋实验的结果。
设计 顶部开放/密封 初始种植的数目 在第28天萌发的数目
袋-沿着底部半边的孔 开放的 8 6
袋-遍及的孔 密封的 8 0
裸露的苗 N/a 8 7
在表29中，具有孔的袋和开口顶部提供最好的成活率，相当于裸露的苗。在第43天，从土壤中移除人工种子，显示具有开口顶部的种子的根已经长出袋中的孔。具有密封顶部的袋无保持有苗的迹象。
实例36：铰接和可扩张种子的设计
这个实验的目的是为了研究铰接或可扩张种子设计的用途。切除50mL离心管(VWR International，LLC，Radnor，PA)的末端，在末端形成5-8mm的孔。随后在长度方向将管切成两个半块。随后通过冷水溶解的塑料膜(从购自Extra Packaging Corp，Boca Raton，FL的冷水溶解的袋切出)的热胶粘条(大约2cm宽×大约9cm长)再连接管的两个半块。对于这一设计，水将软化两个半块，允许苗生长并推开管的两个半块(图33)。在另一种处理中，通过热胶粘一边到一起而保持另一边开放再连接两个半块，从而形成柔性铰链(图34)。将这些锥形管定位在在2”罐中的 360内预种植的甘蔗苗的芽上方，并且随后强行转动并向下压，使得植物以及围绕它的土壤被取到管中。在另一种处理中，将100um厚的膜切成大约11cm×12cm的矩形片。将矩形膜卷成大约11cm长的卷轴并插入50mL离心管，并且在100℃对流烘箱中加热18小时，从而使它们的直径为50mL离心管的直径(28mm)。然后从烘箱中移除卷轴并冷却至室温。将2cm直径的蜡纸管切出大约2cm长的部分。将卷轴较紧密地包封并插入纸带(图35)。随后将具有润湿蛭石的甘蔗苗插入卷轴以形成4-6cm厚的塞。将卷轴样种子以竖直方向种植生长室(Conviron BDW-120型)中具有托盘的10cm塑料罐内的360(大约4cm深)中，种植条件为白天31℃，夜间22℃，80％相对湿度和13小时光周期(220uE/m2)。在种植后立即切开纸带，使卷轴伸展恢复至接近它们的初始直径(28mm)。将具有卷轴型种子的铰接管设计种植在相同平地中4-5cm深处。
表30.铰接和可扩张种子设计实验的结果。
设计 初始种植的数目 在第28天萌发的数目
具有冷水溶解的膜边缘的50mL管 15 14
具有热胶粘铰链的50mL管 15 14
可扩张“卷轴”-型 11 10
裸露的苗 36 34
从表30中可看出所有结构的萌芽良好，并且相当于裸露的苗。到第23天，有证据表明一些铰接种子展开以适应生长的苗。
实例37：可扩张人工种子结构和其他变型
这个实验的目的是为了测试多种可扩张人工种子结构。这包括可折叠的、叠缩的和手风琴样结构。这些种子结构的目的是为了实现在储存条件下的较小尺寸和在种植后在田间的较大尺寸。这将有益于增大种植物的储存密度，并且如实例20所见，种子的尺寸增大导致较高的成活率。将1.25cm内径的管(1.59cm外径，MSC Industrial Supply Co.，Melville，NY)切成16.5cm的长度。接下来，将甘蔗苗和润湿360插入管底端，形成大约4cm长的土壤塞。折叠管的6cm顶部并用橡皮筋固定(图36)。在种植时移除橡皮筋，导致管解折叠。在另一种处理中，使用透明塑料管制备叠缩种子结构。将两个不同直径的透明定制40PVC管(3.35cm外径/2.62cm内径和4.22cm外径/3.45cm内径(MSCIndustrial Supply Co.，Melville，NY))切成7.6cm的长度。用大约2cm宽的M带包封较窄的一段并同心插入较宽的一段以形成紧密的贴合性。将组件定位在甘蔗苗的芽上方，该甘蔗苗已经被种植在10cm罐内的润湿360中，并且随后强行转动并向下压，使得苗以及围绕它的土壤被取到管中。随后提出该管，形成大约3cm厚的土壤塞。管的两端保持开放。透明塑料管的外部部分相对于内部部分在种植时向上滑动，保留有大约2cm的重叠，这是为了形成较高的(～13cm)种子结构(图37)。在另一种处理中，用塑料手动虹吸滚筒泵(MSC Industrial supply co，Melville，NY)，利用有棱纹的出口管制备手风琴样可扩张种子。有棱纹的出口管包括一段较易于压缩的、窄间距的(每隔3mm)的具有较薄塑料的棱纹，它连接一段壁较厚的、较难以压缩的、间距较宽的(每隔6mm)的棱纹，并且直径为大约1.5cm。切割有棱纹的出口管，使得5cm长的一段较高刚性的管连接4cm长的一段较高柔性的管。将组件定位在甘蔗苗的芽上方，该甘蔗苗已经被种植在2”罐内的润湿360中，并且随后强行转动并向下压，使得苗以及围绕它的土壤被取到管中。随后提出该管，形成大约2cm厚的土壤塞。较高柔性的顶部部分随后手动压缩至大约2cm的长度，并且使用胶粘带粘结在原位。在种植时移除胶带，从而允许管从7cm的压缩长度伸展至9cm的长度(图38)。将所有种子以竖直方向种植生长室(Conviron BDW-120型)中具有托盘的10cm塑料罐内的360(大约3cm深)中，种植条件为白天31℃，夜间22℃，80％相对湿度和13小时光周期(220uE/m2)。种植裸露的苗作为对照。
表31.可扩张人工种子实验的结果。
设计 初始种植的数目 在第21天萌发的数目
可折叠的人工种子 10 10
叠缩的人工种子 5 5
手风琴样可扩张种子 10 9
裸露的苗对照 21 18
从表31中看出可扩张人工种子具有高成活率。
实例38：具有超吸收剂的人工种子和其它变型
这个实验的目的是为了研究超吸收剂在人工种子多种构型中的用途，以及其它变型，包括漏斗形盖和带狭槽的膜盖。在一种处理中，将锥形末端完全从15mL离心管(VWR International，LLC，Radnor，PA)中切除。将管定位在甘蔗苗的芽上方，该甘蔗苗已经被种植在2”罐内的润湿 360中，并且随后强行转动并向下压，使得苗以及围绕它的土壤被取到管中。随后将未拉伸的M热胶粘至管的两端。使用剃刀刀片切出一个“X”，它具有在顶部和底部延伸至管边缘的切口。这在管的两端形成一个带狭槽的盖开口(图39)。在另一种处理中，如实例20使用15mL离心管制备人工种子，不同的是底部覆盖有热胶粘的热水溶解的塑料膜，其已经从袋中被切成～2cm的正方形(Extra Packaging Corp.，Boca Raton，Florida)。在另一种处理中，将楔形末端从50mL离心管(VWRInternational，LLC，Radnor，PA)中切除，形成5-8mm的孔，并且将管在30mL刻度处切割(距离宽螺纹开口4.5cm)。随后将具有锥形部分的管定位在甘蔗苗的芽上方，甘蔗苗已经被种植在2”罐内的润湿360中，并且随后强行转动并向下压，使得苗以及围绕它的土壤被取到管中，形成3cm的土壤层。随后将塑料窗筛网(Lowe’s Home Improvement，Newark，DE)热胶粘至土壤塞下方的底部。随后将第二段管回粘到底部上，并将已经在去离子水中预溶胀的超吸收聚合物(Magic water beads，magicwaterbeads.com)加到管的较低部分。最后，将第二层塑料窗筛网热胶粘至结构底部(图40)。在另一种处理中，使用50mL离心管制备如实例20的人工种子，不同的是在去离子水中预溶胀的超吸收剂小珠(Magicwater beads)与土壤(润湿360)以近似1∶1的体积∶体积比混合。另外，使用大约5.5cm厚的带小珠的一段较厚土壤。在相关处理中，遵循相同的方法，不同的是一半Magic水珠在去离子水中预溶胀，并且一半在(The Scotts Company，LLC)肥料溶液中预溶胀。在另一种处理中，使用50mL离心管(VWR International，LLC，Radnor，PA)制备如实例20的人工种子，不同的是将两个15mL离心管热胶粘至50mL管的相对侧，并且通过热胶粘使底部覆盖有塑料窗筛网(Lowe’s HomeImprovement，Newark，DE)，所述两个离心管具有切除的锥形端部和顶盖，它们包含在去离子水中预溶胀的(一个管)和在(TheScotts Company，LLC)肥料溶液中预溶胀的(另一个管)超吸收剂小珠(Magic water beads)。将15mL管定位成与50mL管平行并朝下运动，使得它们延伸至低于50mL管的开放底部2cm。在另一种处理中，使用50mL离心管制造如实例20的人工种子，不同的是通过切除锥形的楔形末端制造的漏斗形段，另一个50mL管热胶粘至50mL管的顶部，宽末端指向上(图41)。在另一种处理中，使用50mL离心管制造如实例20的人工种子，不同的是将底部塑料盖放回管的末端，并且在管的相对侧切出两个狭槽，它们距离封端3.5cm，垂直于管轴并且长大约23mm，宽5mm(图42)。这种设计导致闭杯在种子底部填充有润湿360，并且狭槽用作通过其根可长出的点。将所有种子以竖直方向种植生长室(Conviron BDW-120型)中具有托盘的10cm塑料罐内的360(大约3cm深)中，种植条件为白天31℃，夜间22℃，60％相对湿度和13小时光周期(220uE/m2)。种植裸露的苗作为对照。将一些人工种子和裸露的苗种植在干燥360中，而将其他种植在润湿360中，如表32所示。在这个实验中，在种植后不给土壤浇水。
表32.测试包含不同超吸收剂的种子和其他设计的结果。
在表32中，明显地是在润湿初始土壤条件下，所有种子结构表现良好，如同裸露的苗一样。对于种植在干燥土壤中的种子，在成活率方面存在较大差异，种子结构具有比裸露的苗更高的成活率。在种植后24天，挖出带有封闭端的侧面有狭槽的种子并且据观察植物的根成功地通过已经萌发的种子的侧面狭槽开口露出。
实例39：带有多个苗的人工种子
这个实例的目的是为了研究在相同人工种子结构中使用多个苗。将2cm直径的蜡纸管切成6cm长的部分。将甘蔗苗修剪至4cm长度。管的底端覆盖有预拉伸的M。将大约2cm厚的一层360加到底部。将1个或2个修剪过的苗置于顶部，并且加入更多的360直至管充满大约75％。加入大约3mL水。顶部随后覆盖有预拉伸的M。将人工种子以竖直方向种植在Matapeake/沙土(Maryland土壤与沙土的混合物，形成高沙土含量土壤)中，使得它们的顶部高于在生长室(Conviron BDW-120型)内的带托盘的10cm塑料罐中的土壤表面大约0.5cm，生长室条件为白天31℃，夜间22℃，40％相对湿度和13小时光周期(220uE/m2)。结果汇总于表33中。从包含2株苗的纸管人工种子中的萌发相当于在这些条件下包含1株苗的人工种子的萌发。
表33.每个种子多个植物的实验结果。
实例40：土壤层厚度和底部盖在干旱胁迫条件下的效应
这个实验的目的是为了研究改变锥形管人工种子中的土壤塞厚度并使用底部盖在干旱胁迫条件下的效应。在一种处理中，制备如实例20的15mL锥形离心管人工种子，其带有4cm厚的土壤塞。这些在10cm罐内的干燥50∶50 Matapeakee/沙土(当地的Maryland土壤与沙土的混合物，形成高沙土含量土壤)中被种植约4cm深。在另一种处理中，从管底端加入附加的润湿360，直至土壤层顶部厚度为9cm。管的底部保持开放或覆盖有预拉伸的M。这些在10cm罐内的干燥50∶50Matapeakee/沙土(当地的Maryland土壤与沙土的混合物，形成高沙土含量土壤)中被种植约9cm深。在另一种处理中，聚(ε-己内酯)套管(75um厚度)通过将8重量％的聚(ε-己内酯)(Sigma Aldrich，St.Louis，MO)氯仿(EMD Chemicals，它是Merck KGaA，Darmstadt，Germany的分公司)溶液倾注到50mL离心管中、倾出过量溶液并使膜在实验室通风柜中，在环境温度下干燥2天而形成。套管自动收缩远离离心管壁，并且被手动拉出。允许它们在通风柜中的环境温度下干燥附加的1周。随后用润湿360将套管填充至距离顶部2cm，然后将甘蔗植物种植在顶部。加入附加的润湿360直至土壤距离套管顶部约0.5cm。切除50mL锥形聚丙烯离心管(VWR International，LLC，Radnor，PA)的末端，形成5-8mm的孔。随后将这个管置于套管上方并向下滑动以形成两个同心管(图43)。在种植前，离心管向上叠缩，与内部套管保留有约2cm的重叠。将组件种植在干燥Matapeakee/沙土混合物中，使得套管部分顶部几乎与土壤表面平齐。将人工种子罐置于生长室(Conviron BDW-120型)中，生长室条件为白天31℃，夜间22℃，40％相对湿度以及13小时光周期(220uE/m2)。在这个实验中人工种子不浇水。
表34.研究土壤层厚度和底部盖在干旱胁迫条件下的效应的实验结果。
在表34中，明显的是较厚的土壤层在干旱胁迫条件下导致较高的成活率。另一个观察结果是在底部具有M盖的人工种子在10天周期结束时表现出比用开放底部处理更好的活力。另外，具有聚(ε-己内酯)套管的叠缩设计表现出比带有4cm土壤层的15mL管更好的成活率。在31天后，挖出具有聚(ε-己内酯)套管的叠缩设计，并且据观察根已经长出套管底部，进入周围的土壤。
实例41：在巴西的人工种子在田间测试中锥形盖(15mL锥形塑料 管)对蜡纸管顶部的效应
将圆柱形蜡纸容器(大吸管，Precision Products Group，FtWayne，IN，1.19cm外径)切成5cm和8cm的长度。品种V11(SP813250)的甘蔗苗已经在苗再生培养基中从芽组织片段再生28天，其用于这个实验。修剪苗的芽以贴合管的长度。通过用预拉伸的M包封底部密封纸管底部。将大约1cm的薄层高压消毒盆栽土(HT)置于管底部。将苗置于土壤层上，并且随后加入附加的盆栽土以填充该管，直至苗被大部覆盖。将体积大约1mL的水加到结构中，并且随后用预拉伸的M或锥形盖(无孔15mL聚丙烯离心管密封管顶部。
将人工种子以竖直方向种植在位于Paulínia(SP)，Brazil的DuPontdo Brasil位置的高设苗床上，使得管顶部高出土壤表面小于0.5cm。将未经修剪的裸露的苗种植在田地以及附近的温室内(使用与结构内相同的高压消毒盆栽土)的8cm罐(240mL体积))中。在实验前已经使用旋转锄和整畦器对田地土壤进行了整备。在种植后，每天进行灌溉并且每隔两天监测成活率。
表35
用蜡纸管人工种子进行大田实验的结果。
如表35所示，较短的(5cm)管具有比8cm管更高的成活率水平。对于5cm管，具有锥形塑料盖的处理提供比具有预拉伸的M盖的处理更高的成活率。在这个实验中观察到苗使盖破裂。
实例42：在蜡纸管内的超吸收聚合物的效应
将圆柱形蜡纸容器(大吸管，Precision Products Group，FtWayne，IN，1.19cm外径)切成4cm的长度。品种V11(SP813250)的甘蔗苗已经在苗再生培养基中从芽组织片段再生28天，其用于这个实验。在包封前将苗的芽修剪成大约3cm的长度。纸管底部用延伸到管末端之外的半个钉沿着管轴网装固定，或通过用预拉伸的M包封整个底部密封。大约1cm管填充有超吸收聚合物溶液与Murashige andSkoog营养培养基或与高压消毒盆栽土的混合物。管顶部用预拉伸的M密封。
将人工种子以竖直方向种植在生长室内的8cm罐(240mL体积)中，罐内填充有1∶1重量比的Paulínia田地土壤与沙土的混合物。将未修剪的裸露的苗种植在罐中，罐内填充有相同混合物(田地对照)，并且在覆盖有塑料塞的罐内也填充有高压消毒盆栽土(温室对照)。罐留在生长室中。在种植后，仅对填充有盆栽土的罐每天进行灌溉，并且每隔两天监测成活率。对于所有处理，在5、14和33天后进行检验。
表36
用蜡纸管人工种子进行的生长室实验结果。
如表36所示，用包封进行处理的最终活力(在33天后检验)是相同的(0％)，但是用管内的超吸收聚合物进行的处理保持苗较长期的存活。在这个实验中，在大多数情况下苗破碎盖，但是在大田环境中一些盖自动破裂。
实例43：在巴西田间测试中的人工种子的结构渗透性的效应
将圆柱形蜡纸容器(大吸管，Precision Products Group，FtWayne，IN，1.19cm外径)、15mL和50mL聚丙烯离心管管切成4cm长度。对于离心管，4cm部分仅包括管的圆柱形(非锥形)部分。品种V11(SP813250)的甘蔗苗已经在苗再生培养基中从芽组织片段再生37天，其用于这个实验。在包封前将苗的芽修剪成大约3cm的长度。管底部用预拉伸的M包封整个底部密封，或保持开放。在一种处理中，切除50mL离心管的末端，形成1.5cm的孔，并且用作底部结构。将大约1cm的薄层高压消毒盆栽土(HT)置于管底部。将苗置于土壤层上，并且随后加入附加的盆栽土以填充该管，直至苗被大部覆盖。将体积大约1mL的水加入结构。管顶部用预拉伸的M、倒置的15mL或50mL离心管密封。管顶部的孔尺寸从无孔(不可渗透的向1.0cm的孔)变化。
将人工种子以竖直方向种植在位于Paulínia(SP)，Brazil的DuPontdo Brasil位置的高设苗床上，使得管顶部高出土壤表面小于0.5cm。将未经修剪的裸露的苗种植在田地以及附近的温室内(使用与结构内相同的高压消毒盆栽土)的8cm罐(240mL体积))中。在实验前已经使用旋转锄和整畦器对田地土壤进行了整备。在种植后，不进行灌溉。每隔两天监测成活率。
表37
用蜡纸管人工种子进行大田实验的结果。
如表37所示，在这个实验中，所有包封处理具有低的成活率(从0％至14％)。用两个在彼此顶部的50mL离心管进行的处理具有最高的成活率。对于基于15mL离心管的人工种子，较大的孔尺寸提供提高的成活率。田间裸露的苗具有0％的活力，指示人工种子提供改善的成活率。在这个实验中，观察到91％的M盖在大田环境中经几天后(在苗可能使它们破裂之前)自动破裂。在这个实验中的最高温度在前6天为约32-35℃。
实例44：来自能够生物降解的管和杯的合成种子
能够生物降解的管和杯用聚(乳酸)(4032D级PLA，NatureWorks，Minnetonka，MN)、淀粉(Sigma Aldrich)、α-纤维素(Sigma Aldrich，St.Louis，MO)、脱乙酰壳多糖(Sigma Aldrich，St.Louis，MO)、聚(羟基-丁酸酯)(PHB，Sigma Aldrich，St.Louis，MO)、和/或聚(羟基-丁酸酯)-共-聚(羟基-戊酸酯)(PHB-PHV，Sigma Aldrich，St.Louis，MO)制备。对于一些共混物，加入D-山梨醇(Sigma Aldrich，St.Louis，MO)和甘油(Sigma Aldrich，St.Louis，MO)作为增塑剂。管和杯通过将溶解在氯仿中的20％聚合物/共混聚合物溶液倾注到15mL离心管或100mL塑料烧杯中形成，确保聚合物溶液涂覆容器的整个内表面。在蒸发氯仿时，从容器表面剥离管或杯，并且移除管/杯并在环境温度下干燥过夜。表38描述用于制造管和杯的特定聚合物共混物。
表38.用于形成能够生物降解的合成种子管和杯结构的聚合物组合物。
(重量比)组合物
聚(L-乳酸)
1∶1∶0.5聚(L-乳酸)/淀粉/山梨醇
1∶1∶0.5聚(L-乳酸)/纤维素/山梨醇
1∶1∶0.5聚(L-乳酸)/脱乙酰壳多糖/山梨醇
1∶1 PHB/PHB-PHV
1∶1∶2∶0.05 PHB/PHB-PHV/淀粉/山梨醇
1∶1∶2∶0.05 PHB/PHB-PHV/纤维素/山梨醇
1∶1∶2∶0.05 PHB/PHB-PHV/脱乙酰壳多糖/山梨醇
2∶1 PLA/淀粉/山梨醇
1∶1∶0.1聚(L-乳酸)/淀粉/甘油
1∶1∶0.1聚(L-乳酸)/纤维素/甘油
1∶1∶0.1聚(L-乳酸)/脱乙酰壳多糖/甘油
10/1/1 PLA/PHB/PHB-PHV
3∶2∶1∶1 PLA/淀粉/PHB/PHB-PHV
将甘蔗苗(以与实例1相似的方式制备)种植到盆栽土(360)中。种子通过将管放置到植物上并向下压到土壤中进行装配。将二十个能够生物降解的合成种子种植在花箱(12cm深×60cm长×20cm宽)中，其包含50∶50的matapeake/沙土(当地的Maryland土壤与沙土的混合物，形成高沙土含量土壤)。植物中生长室Conviron BDW-120型)中生长4周，生长室条件为白天31℃，夜间22℃，60％相对湿度，以及13小时光周期(220uE/m2)，并且每周浇水3次，每次1L。所有结构的甘蔗植物在8周后具有95％的成活率。由较高柔性的材料(即，PLA/脱乙酰壳多糖和PLA/PHB/PHB-PHV)制成的管中的植物能够比包封在较高刚性的管(即，PLA)中的植物更容易地突破管。
实例45：能够生物降解的卵形合成种子
能够生物降解的卵形外壳由无定形聚(D，L-乳酸)(6361D级，NatureWorks，Minnetonka，MN)和聚(ε-己内酯)(Sigma Aldrich，St.Louis，MO)制成。通过将在氯仿中的25重量％聚合物溶液倾注到塑料Easter蛋(卵形，7.5×3.75cm)中形成所述蛋。在蒸发氯仿时，从Easter蛋的内表面剥离蛋壳。从Easter蛋中移除卵形外壳，并且在蛋的顶部和底部部分制造1cm的孔。蛋壳的下半部填充有润湿盆栽土(360)，并且将甘蔗苗(参见实例1)种植在其中。将蛋的上半部置于顶部(图44)并用Elmer万能胶或预拉伸的M固定。将合成种子蛋种植在具有50∶50的matapeake/沙土(当地的Maryland土壤与沙土的混合物，形成高沙土含量土壤)的花箱(12cm深×60cm长×20cm宽)中，使得2/3的卵形外壳覆盖有土壤。植物中生长室Conviron BDW-120型)中生长，生长室条件为白天31℃，夜间22℃，60％相对湿度，以及13小时光周期(220uE/m2)，并且每周浇水3次，每次1L。在卵形合成种子结构中的甘蔗植物在第21天具有50％的成活率。
实例46：具有可扩张的管顶部的合成种子
由两部分管结构制备具有可扩张的管顶部的合成种子，其中下半部是刚性的，并且上半部是柔性的。刚性的下半部通过切除50mL离心管的锥形末端制得。柔性的上半部通过薄膜浇铸稀释聚合物氯仿溶液到50mL离心管中制得。对于柔性材料，使用淀粉(Sigma Aldrich，St.Louis，MO)和无定形聚(D，L-乳酸)(PLA 6361D Resin，NatureWorks，Minnetonka，MN)的1∶1共混物或PLA、淀粉、聚(羟基丁酸酯)(PHB，SigmaAldrich，St.Louis，MO)的3∶2∶1∶1(重量)共混物和聚(羟基丁酸酯-共-羟基戊酸乙酯)(PHB-PHV，Sigma Aldrich，St.Louis，MO)。一旦蒸发掉氯仿，从管内侧移除管形状的薄膜。在柔性管的顶部切出小狭槽(0.5cm)，并且随后将它压缩以形成环。随后使用Super Glue(3M，St.Paul，MN)将环胶粘至刚性管结构的顶部内侧。将甘蔗苗(实例1)种植到润湿360中。将种子结构置于植物上方并向下压入土壤中以装配合成种子。将附加的润湿360置于管底部，如此土壤填充2/3的刚性部分。将合成种子种植在具有50∶50的matapeake/沙土(当地的Maryland土壤与沙土的混合物，形成高沙土含量土壤)的花箱(12cm深×60cm长×20cm宽)中，使得2/3的刚性管位于土壤下方。植物中生长室Conviron BDW-120型)中生长，生长室条件为白天31℃，夜间22℃，60％相对湿度，以及13小时光周期(220uE/m2)，并且每周浇水3次，每次1L。随着甘蔗的生长，植物推动柔性管向上脱出刚性管，随着植物的生长显著扩张该结构(图45)。能够扩张的管在第21天具有100％的成活率。
实例47：管和袋型人工种子的储存测试
制备两种类型的人工种子用于储存研究，从而测定它们的储存寿命：1)聚(ε-己内酯)袋(如实例29)和2)具有开口顶部和开口底部的50mL聚丙烯锥形管(如实例20)。每种类型制备160个复制品并包封到保藏袋(VWR Red Line Storage Bag，32×48cm，100um厚度)中，20个种子/包装。对于锥形管种子结构，将胶带(VWR通用实验室标记胶带)置于结构顶部和底部上以覆盖开口。每种类型制备附加的15个种子结构以在实验开始时种植。将管和袋的四个包装在暗处室温(20±1℃)储存1至4周。将管和袋的另外4个包装在暗处亚环境温度(10±2℃)储存1至4周。
在储存实验开始时，将15个管、15个袋、和20个裸露的植物种植在具有47.5∶47.5∶5 matapeake∶沙土∶360土壤的12cm深×60cm长×20cm宽的花箱中。植物在生长室Conviron BDW-120型)中生长，生长室条件为白天31℃，夜间22℃，60％相对湿度以及13小时光周期(220uE/m2)。植物每周浇水3次，每次1L。在每周后，从环境温度储存和亚环境温度储存条件下移出管和袋的1个包装。对于管种子，在种植前从开口处移除胶带。每周将种子种植在使用47.5∶47.5∶5的matapeake∶沙土∶360土壤的花箱中，在生长室中生长，并且每周浇水3次，每次1L。植物生长4周。在4周末期，将植物挖出花箱，测量芽长度，并且计算成活率。四周储存研究的结果在下表39中示出。这些结果指示在亚环境温度下储存获得比环境温度下储存更高的植物成活率。当管状合成种子结构在环境温度下储存时，芽长度也随着储存时间的增加而降低。
表39.储存合成种子的结果
实例48：柔性可折叠的管形人工种子
这个实例的目的是为了研究柔性可折叠的管形人工种子。聚(己内酯)膜(50um厚度)使用28mm双螺杆挤出机和膜生产线由聚(ε-己内酯)粒料(CapaTM 6800，Perstorp Company，Perstorp，Sweden)制成。模具温度保持在155℃并且筒体温度在127-160℃范围内。将膜切成大约12cm×12cm的矩形，并且热密封成圆柱形。通过平行于主管轴热压管部分形成三个或四个较小的管状亚隔室。也热密封亚隔室的末端，而将较大的管在顶端保持开放，并且在一种处理中沿着底部热密封(图46)。这提供刚性提高的较大结构。使用柔性材料的优点是厚度以及由此带来的聚合物量减少，并且这还形成在种植前能够折叠占据较小空间的结构，并且在移除束缚时将伸展恢复成它的较大构型。从管底部插入甘蔗苗和润湿360，形成大约5cm厚的土壤塞。将结构以竖直方向种植生长室(ConvironBDW-120型)中具有托盘的10cm塑料罐内(大约5cm深)，种植条件为白天31℃，夜间22℃，40％相对湿度和13小时光周期(220uE/m2)。制造6个种子并且所有6个种子在第25天萌发。
实例49：制备人工种子结构基于聚(乙烯醇)、淀粉和纤维素纤维的复 合膜
下述方法提供可供选择的塑料材料，它们来自可再生资源，具有良好的机械性能和生物降解性能，用于人工种子结构。该材料是复合聚合物，包含聚(乙烯醇)(PVOH)，一种水溶性聚合物；具有大约27％直链淀粉和73％支链淀粉的玉米淀粉，和作为增强材料的纤维素纤维，其具有高吸水能力。PVOH的极性结构使其能够与天然聚合物材料良好的相容，形成均匀的能够生物降解的膜。
在1L烧杯中，在90℃加入大约21g PVOH到200mL蒸馏水中，搅拌直至形成均匀的溶液。加入大约50mL水以补偿任何蒸发损耗，随后加入12g甘油和7.5g尿素。搅拌这一溶液10分钟，在室温下将16.5g玉米淀粉溶解在100mL水中，并且将这种混合物加到受热溶液中。在30分钟后，在70℃下加入3g纤维素纤维和100mL水并再搅拌40分钟，这时加入10滴Hypermaster 602(Montenegro Quimica，Brazil)消泡剂。将溶液倾注到具有不粘涂层的阔口容器中，并且在40℃烘箱中干燥过夜。在刀式粉碎机中碾碎这种材料并压模，产生大约350μm厚的膜。
对于交联样品，在纤维素纤维后加入六甲氧甲基三聚氰胺(HMMM)(一种低亚氨基三聚氰胺-甲醛)和催化剂量的柠檬酸，并且在加入消泡剂前，在70℃下搅拌混合物附加的45分钟。组成的变型在表40中列出。
表40
复合膜的组成
在能够生物降解的袋中包封稻芽
上述使用复合材料2和3的压模复合膜用于构建能够快速生物降解的容器。一片膜测得有7.0cm的宽度和9.5cm的长度，将其折叠以重叠侧面，沿着两条较短边热密封以形成开口小袋。用两种处理破开两片膜：一个小袋填充有预润湿的盆栽土(HT)和一个在发芽纸中萌发两天的稻芽；另一个小袋仅填充有稻芽。
在底部具有狭槽的1.16L塑料罐中并列种植具有和不具有盆栽土的结构，罐中填充有Paulínia田地土壤。将所有袋以竖直方向种植在5cm深处，使得袋完全被土壤覆盖。将罐保持在温室中并每天浇水。为了比较，将裸露的稻芽种植在相同整备并保持的罐中。
在两周后，结构取样指示部分降解，这对于复合材料2比复合材料3更加明显，表明通过交联材料调节降解的可能性。
我们从表41可见，四周后的结构外观比率结果与对照相比更低。取样显示复合材料在这段时间后完全降解并且一些芽仍旧在发育。这个实验表明这些材料不对稻芽具有植物性毒性。
表41
* 复合材料小袋和裸露的芽对照的外观比率
*本文将外观速率定义为植物使结构(当适用时)破碎并出现在土壤水平面上方的能力
实例50：比较包括能够快速生物降解的盖和不可降解的结构的人工种 子
将蜡纸管(大吸管，Precision Products Group，Ft Wayne，IN，1.19cm外径)切成4cm的长度。每个管的一个开口端用254μm厚的大豆油凝胶膜、预拉伸的M、680μm和380μm厚的复合材料2浇铸膜(实例49)、或515μm和325μm厚的复合材料3浇铸膜(实例49)密封。
大豆油凝胶膜如实例26所述进行制备，而复合材料根据类似实例49所述的方法制备。复合膜通过在干燥步骤前在具有不粘涂层的广口盘中竖直地装配纸管来制备，使得溶液保持高于管底部大约1cm(较厚样品)和0.5cm(较薄样品)，在管的一端提供浇铸膜层。在干燥后使用打孔器移除样品。通过用4cm单向预拉伸的M首先封闭底部装配M纸管容器。在所有结构中，加入1cm的高压消毒盆栽土HT层。在这之后，将已经在苗再生培养基中培养5周的甘蔗苗置于土壤顶部，并且修剪叶片以贴合在管中。接下来加入附加的土壤以在管中形成大约3cm厚的层，并且加入1mL水。最后，每个管顶部仅覆盖有预拉伸的M。对于具有复合材料2或3的盖的管，按照类似方法进行，不同的是起始于具有已经浇铸在底部和顶端的复合膜的管用包括与底部相同材料的1cm纸部分密封。将管种植在填充有Paulínia田地土壤的240mL塑料罐中，保存在生长室(Instala Frio)内，生长室条件在前16天内为白天28℃，夜间18℃，70-80％相对湿度，16小时光周期(190μE/m2)。在第17之后，将生长室条件变为白天25℃，70％相对湿度和2小时峰值温度30℃，夜间18℃，相对湿度保持在75％，以及14小时光周期(相同的光照强度)。
所有处理每隔2天用降雨模拟器(E.I.DuPont de Nemours，WilmingtonDE 19880)浇灌，该模拟器提供25mm的降雨(流量大约7.5L/min)。一半样品在模拟降雨期间受到塑料锥形盖的保护，这是为了评估在不直接接触水的情况下材料的降解。
紧接着第一次降雨，暴露于雨水的57％的复合材料2较薄的无保护样品、29％的复合材料2较厚的无保护样品和14％的复合材料3较薄的无保护样品开始破裂，而其他暴露的复合材料样品变为不透明的。受到保护的样品保持完整。在这期间植物可能仅使大豆油凝胶和M样品破裂。
在33天后，10次模拟降雨的破裂结果可能直接与2个不同因素有关：植物使结构破裂或由于来自模拟降雨的水引起的降解导致的材料自身破裂。大多数受保护的复合材料样品不降解并且植物不能使它们破裂。降解原因的结果在表42中概述。
表42
不同顶盖的蜡纸管人工种子在33天和10次降雨模拟后的降解原因
从这些结果可看出大豆/由凝胶样品具有最高的植物引起的破裂比率，其与低厚度、弱材料、和良好的防水性能(其将水保持在结构内部)有关。
所有种子结构的植物成活率在表43中示出。
表43
使用不同顶盖材料的人工种子的成活率。
实例51：聚(1，3-丙二醇琥珀酸酯)与聚(乳酸)的共混物
由于聚(乳酸)的刚度和脆性，可期待与其他聚合物的共混物以改善人工种子应用的机械性能，其中种子可通过种植机处理。另外，聚(乳酸)在土壤中，在环境温度下生物降解缓慢(Shogren，R.L.，Doane，W.M.，Garlotta，D.，Lawton，J.W.，Willett，J.L.Polymer Degradation andStability，2003，79，405-411)。与其他聚合物的共混物可能有助于改善韧性(Afrifah，K.A.，Matuana，L.M.Macromolecular Materials andEngineering，2010，802-811)和生物降解能力(Shogren，R.L.，Doane，W.M.，Garlotta，D.，Lawton，J.W.，Willett，J.L.Polymer Degradation andStability，2003，79，405-411)。然而，聚合物共混物像在引用参考文献中讨论的那些是不透明的，这是由于在两种或更多种聚合物相之间的不相容性引起。就人工种子的目的而言，允许光透过种子材料以加速某些组织类型的生长可能是有利的。从而，寻求PLA与能够生物降解的聚酯的共混物。具体地，研究聚(乳酸)(PLA 4032D，NatureWorks，Minnetonka，MN)与聚(1，3-丙二醇琥珀酸酯)(通过尺寸排阻色谱法，Mn＝8100g/mol，Mw＝23000g/mol)的共混物。称重1.3g PLA 4032D和0.2g聚(1，3-丙二醇琥珀酸酯)置于20mL玻璃小瓶中。加入8.0g氯仿并且溶液搅拌1天。使用具有40密耳厚间隙的刮粉刀将溶液浇铸到聚(四氟乙烯)片上。这产生具有13.3重量％聚(1，3-丙二醇琥珀酸酯)的膜，其厚度为75-150um。按照类似方法制备共混物，其具有22重量％和50重量％的聚(1，3-丙二醇琥珀酸酯)。所有共混物是光学半透明的至透明的(图47)。
使用差示扫描量热法(DSC)表征共混物。这在氮气中进行，加热速率为10℃/分钟，使用TA Instruments(New Castle，DE)Model Q100DSC。分析结果在表44中示出。结果指示在聚合物共混物中存在两个玻璃化转变。这表明存在两个聚合物相，并且共混物很大程度上是不混溶的。然而，注意到玻璃化转变温度随着组成改变，指示一些相间相互作用、可能的增塑作用或部分相容性。另外观察到共混物显著的结晶双峰，它在纯PLA4032D中不存在，以及较大的熔融放热。这指示聚(1，3-丙烯琥珀酸酯)通过增塑效应或通过成核作用对于加速结晶的影响。
表44.聚(1，3-丙二醇琥珀酸酯)和半结晶聚(乳酸)的共混物的热转换
对共混物的拉伸测量使用TA-XT2i Texture Analyser(TextureTechnologies，Scarsdale，NY)进行。结果列于下表45中。聚(1，3-丙二醇琥珀酸酯)的共混物与纯PLA4032D相比表现出更高的伸长率、更低的拉伸强度和更低的脆性。
表45.聚(1，3-丙二醇琥珀酸酯)与聚(乳酸)的共混物的拉伸测量。列出的 数据是3个平行测定。
通过将22重量％的聚(1，3-丙二醇琥珀酸酯)膜卷成直径1.2cm的单层圆柱形管构建人工种子。沿着管侧面热胶粘膜的边缘。将管切成大约6cm长的部分。加入甘蔗苗与润湿360，使得管大约充满75％，并且将种子种植在生长室(Conviron BDW-120型)中10cm罐内的润湿 360中，生长室条件为白天31℃，夜间22℃，40％相对湿度，以及13小时光周期(220uE/m2)。种植9个人工种子并且其中4个在21天后萌发。
聚(1，3-丙二醇琥珀酸酯)的土壤降解
聚(1，3-丙二醇琥珀酸酯)(Mn＝22000，Mw＝41800g/mol，通过尺寸排阻色谱法测得)与其他聚合物比较的土壤降解研究在DuPont StineHaskell Research Center in Newark，DE进行。通过在高于它们的熔点的合适温度下熔压形成多种聚酯膜。膜的厚度在大约200至400um范围内，并且为大约2cm宽×8-12cm长。每个组成测试三个膜样品。使用高压灭菌胶带(VWR，Radnor，PA)将膜粘结到铝托盘底部，使得膜的主要部分暴露，并且将托盘水平埋在田间大约15cm深处。样品保留27天，然后挖出。通过目测定性判断降解结果。在挖出后，用水冲洗膜以除去土壤并再次观察。表46中的结果指示聚(1，3-丙二醇琥珀酸酯)在真实土壤条件下表现出与其他可快速降解的聚合物(聚(3-羟基丁酸酯-共-3-羟基戊酸乙酯))类似的视觉降解，但是随后在冲洗时容易发生机械破裂，而其他聚合物保持原样。这表明聚(1，3-丙二醇琥珀酸酯)在大田环境中更易于破裂的优点。
表46.聚酯在27天后的田间降解结果。
进行附加实验以比较这些聚合物在360中的降解速率。在这个实验中一式三份地制造相似尺寸的膜条，并且以竖直方向埋入在10cm塑料罐内的360中，并置于生长室(Conviron BDW-120型)中，生长室条件为白天31℃，夜间22℃，80％相对湿度，以及13小时光周期(220uE/m2)。定期给罐浇水，并且在1个月后挖出膜。在冲洗后目测判断样品的降解(表47)。据观察在29天后聚(1，3-丙二醇琥珀酸酯)在360中显著降解。
表47.在29天后聚酯在 360中的生长室降解结果。
研究聚(1，3-丙二醇琥珀酸酯)与无定形聚(D，L-乳酸)(PLA 6361D，NatureWorks，Minnetonka，MN)的附加共混物。这些以相同方式如上形成，并且也是均匀地透明至半透明。使用差示扫描量热法研究它们的热特性，并且在表48中示出结果。
表48.聚(1，3-丙二醇琥珀酸酯)和无定形聚(D，L-乳酸)共混物的热转换。
实例52：使用具有经遗传工程的甘蔗植物的合成种子
经遗传工程的甘蔗植物通过标准技术制备(参见例如Manickavasagam等人，(2004)，Plant Cell Rep 23：134-143；Jain等人(2007)Plant CellRep 26：581-590；Joyce等人(2010)Plant Cell Rep 29：173-183)。经遗传工程的植物含有经修饰的或引入的基因，其赋予改变的农学性能(包括但不限于除草剂抗性、害虫抗性、病害抗性、改善的产量和改善的含糖量)。在这个专利申请中描述的任何合成种子设计用于为种植经遗传工程的植物提供便利。
经遗传工程的植物如实例1所述再生或通过其他等同方法再生，将其插入种子容器，该容器如本专利申请所述由多种材料构建(包括但不限于由蜡纸、聚(乳酸)、聚己内酯、聚(3-羟基丁酸酯-共-3-羟基戊酸酯)聚丙烯、和纤维素复合物制成的管或容器。)向在容器内的植物加入材料以支持植物的生长和健康(包括但不限于土壤、MetroMix、琼脂、岩石棉、糖、无机盐、MS营养物质、超吸收聚合物、水、杀真菌剂、杀虫剂、除草剂、植物生长调节剂和植物激素)，在容器中保留有空间。容器末端保持开放或用多种材料密封(包括但不限于聚(乳酸)、醇酸树脂膜、膜、LDL三嵌段共聚物)。
将种子结构置于在生长室、温室、网室或田地的土壤中，提供足够的水、温度、肥料、光照、和害虫防护并允许生长大约4周。这些植物在这些生长条件下的成活表明这些种子的成功。
经遗传工程的种子的抗除草剂性在土壤中生长4周后得到证明。这时，将种子容器和盖材料(如果仍然围绕植物的悬空部分存在的话)从植物中移除。随后用除草剂(包括但不限于草甘膦和磺酰脲类)以适用于区域或环境的典型使用比率处理植物，杀灭或严重伤害非转基因的甘蔗和靶标野草。在处理后四周，来源于包含经遗传工程的除草剂抗性植物的合成种子的植物是健康的并有活力地生长，而非转基因的甘蔗对照死亡或受到严重损伤。
实例53：使用具有经遗传工程的甘蔗植物的合成种子
经遗传工程的甘蔗植物通过标准技术制备(参见例如Manickavasagam等人，(2004)，Plant Cell Rep 23：134-143；Jain等人(2007)Plant CellRep 26：581-590；Joyce等人(2010)Plant Cell Rep 29：173-183)。经遗传工程的植物含有经修饰的或引入的基因，其赋予改变的农学性能(包括但不限于除草剂抗性、害虫抗性、病害抗性、改善的产量和改善的含糖量)。在这个专利申请中描述的任何合成种子设计用于为种植经遗传工程的植物提供便利。
将如实例1所述再生或通过其他等同方法再生的经遗传工程的植物插入种子容器。对照植物是相同品种，但是未经遗传工程化。增殖、再生、并以相同方式处理GM和非GM植物。此外，从整杆长出的GM植物被用作另一个对照。所有植物，无论来源于微繁或整杆，在相同条件下生长。
将裸露的、未包封的植物用作对照。此外，从GM整杆长出的植物也用作对照。
将蜡纸管切成4cm长度。每个管的一个开口端用膜密封，所述膜由明胶和淀粉的共混物制成。通过蒸发明胶、淀粉和甘油的水溶液制备明胶-淀粉-甘油膜层。在这种溶液中，明胶的浓度可为0.5重量％至5重量％。淀粉浓度可为0.1重量％至2重量％。甘油浓度可为2重量％至8重量％。在一个实施例中，用于形成膜的溶液可包含2.5重量％的明胶(175 BloomStrength)；1.0重量％的淀粉和5.0重量％的甘油。在另一个实施例中，成膜溶液可包含1.25重量％的明胶(175 Bloom Strength)和1.25重量％的明胶(300 Bloom Strength)；1.0重量％的淀粉和5.0重量％的甘油。加入一层1.5cm的高压消毒盆栽土(HT)。随后将植物置于在土壤顶层上的纸容器内，修剪叶片以贴合在管中。接下来加入附加的土壤以在管中形成大约2cm厚的层，并且加入足够的水进行饱和。最后，使用在顶部具有5mm孔的15mL的聚丙烯离心管密封每个管的顶部，使用一片M附接到纸管上。
将种子结构和裸露植物竖直种植在470mL塑料罐中，罐内填充有田地土壤(来自Paulínia Experimental Farm)、沙土和盆栽土(HT)的混合物，它们的体积比为1∶1∶1。种植种子结构，它们在罐中的土壤水平面与聚丙烯管的顶部平齐，并且种植裸露的植物使得土壤水平面在根和芽的交界处。将整杆水平种植在填充有相同的土壤混合物的500mL罐中，位于土壤平面下方2-5cm处。在3-4周后将整杆植物转移到1L罐中。所有植物每天灌溉两次，并且保持在温室内。
监测植物的发育和成活率多达8周。在这时移除塑料锥形盖，此时植物在土壤中生长良好。
在这时由种子构建体和裸露植物制备的GM和非GM植物；和由整杆制备的GM植物(它们所有具有等同的活力和生理期)，经选择进行如表49所示的除草剂处理。对于表中所示的每个处理，测试10个植物。
表49
对GM微繁植物、非GM微繁植物、和来自整杆的GM植物进行除草 剂处理。
在2L PET瓶中通过在水中溶解一定量的除草剂以提供正确比率制备除草剂喷雾液体。将植物置于温室工作台上并使用配有110.02摆动喷嘴的棒进行施用。喷雾参数为2.0巴压力，1m·s-1速度，200L·ha-1喷雾体积，每个喷嘴获得0.6L·min-1的喷雾液体流速。将除草剂喷雾施用于植物顶部上方50cm处。对于所有甲嘧磺隆的施用，将0.2％(壬基苯氧基聚乙氧基乙醇)辅助剂加到喷雾液体中。
对作物响应(％植物毒素)和植物高度的评估在施用后第7、14、21、30和45天进行，目测评估叶片损伤、叶片变色、总体植物生长和植物活力。以5％的递增，从无损伤(0％)到死亡(100％)对损伤进行定量。来自种子结构和裸露植物的非GM植物在14天内显示受到所有除草剂处理的损伤。对于来自种子结构和来自微繁以及来自整杆的裸露植物的GM植物，所有除草剂处理未检测到损伤或仅检测到最小的损伤(小于10％)。
实例54：挤出用于合成种子的聚(D，L-乳酸)管
无定形聚(D，L-乳酸)(6361D Resin，Natureworks，LLC.，Minnetonka，MN)使用冷却螺杆挤出机(1 1/2”Davis Standard，Davis-Standard LLC，Fulton，NY)挤出，形成0.664”外径的管，其具有0.012”的壁厚。以13.4英尺/分钟的速度挤出管，使用390°F的熔融温度，螺杆温度为350-390°F，模具温度为390-391°F，并且螺杆转速为14.8RPM。将挤出的管切成6”长度的较短管。
通过加热用热风枪(Master Heat Gun，Master Appliance，Racine，WI)加热管的一端装配种子，并且用夹钳将它卷曲闭合。将两克盆栽土(360)加到管的开口端。将一个甘蔗苗(实例1)向下压入土壤并加入2mL水。通过上述相同方法密封管的顶部。种子在种植前在室温、光照条件下储存5天。
在种植前，使用剪刀剪开种子的顶部和底部。将合成种子种植在花箱(12cm深×60cm长×20cm宽)中，其包含50∶50的matapeake/沙土(当地的Delaware土壤与沙土的混合物，形成高沙土含量土壤)，使得管内的土壤水平面与外部土壤水平面平齐。植物中生长室(Conviron BDW-120型)中生长，生长室条件为白天31℃，夜间22℃，40％相对湿度，以及13小时光周期(220uE/m2)，并且每周浇水3次，每次1L。在PLA管合成种子结构中的甘蔗植物在第14天具有70％的成活率。

Claims (14)

1.一种人工种子，包括一种或多种可再生植物组织、包含可降解部分的容器、未阻塞的空间、和营养物质源，并且还包括选自下列的一个或多个特征：
a)可穿透或可降解的区域，所述可再生植物组织穿过所述可穿透或可降解的区域而生长，
b)所述容器的单层水溶性部分，
c)在约1℃和50℃之间流动或蠕变的所述容器的区域，
d)在可再生植物组织生长期间发生物理位移的可分离闭合件，
e)在所述容器的侧面或底部中的一个或多个开口，
f)通向在所述顶点处的宽度小于2cm的开口的锥形或渐缩区域，并且其中所述锥形或渐缩区域的角度从相对侧测量时小于135度，和
g)多个柔性翼，所述可再生组织穿过所述多个柔性翼而生长。
2.根据权利要求1所述的人工种子，其中所述容器或所述容器的区域或所述闭合件还包含下列中的一种或多种：聚酯、聚酰胺、聚烯烃、纤维素、纤维素衍生物、多糖、聚醚、聚氨酯、聚碳酸酯、聚(甲基丙烯酸烷基酯)、聚(丙烯酸烷基酯)、聚(丙烯酸)、聚(甲基)丙烯酸、聚磷腈、聚酰亚胺、聚酐、聚胺、聚二烯、聚丙烯酰胺、聚(硅氧烷)、聚(乙烯醇)、聚(乙烯酯)、聚(乙烯醚)、天然聚合物、嵌段共聚物、交联聚合物、蛋白质、蜡、油、增塑剂、抗氧化剂、成核剂、抗冲改性剂、加工助剂、增韧剂、着色剂、填料、稳定剂、阻燃剂、天然橡胶、聚砜、或聚硫化物；或它们的共混物；或它们的交联形式。
3.根据权利要求1所述的人工种子，其中所述容器还包含选自下列的组分：
a)无定形聚(D，L-乳酸)、聚(乳酸)、聚(L-乳酸)、聚(D-乳酸)、聚(内消旋-乳酸)、聚(外消旋-乳酸)、或聚(D，L-乳酸)、聚(羟基链烷酸酯)、聚(羟基丁酸酯)、聚(羟基丁酸酯-共-戊酸酯)、聚(己内酯)、聚(琥珀酸亚丁酯)、聚(琥珀酸亚乙酯)、聚(碳酸亚乙酯)、聚(碳酸亚丙酯)、淀粉、明胶、热塑性淀粉、聚(对苯二甲酸亚丁酯己二酸酯)、聚(对苯二甲酸亚丙酯琥珀酸酯)、聚(对苯二甲酸亚丙酯己二酸酯)、聚(乙烯醇)、聚(乙二醇)、纤维素、脱乙酰壳多糖、乙酸纤维素、或丁酸乙酸纤维素，
b)具有大于5摩尔％的脂族单体含量的聚酯，
c)交联形式的无定形聚(D，L-乳酸)、聚(乳酸)、聚(L-乳酸)、聚(D-乳酸)、聚(内消旋-乳酸)、聚(外消旋-乳酸)、或聚(D，L-乳酸)、聚(羟基链烷酸酯)、聚(羟基丁酸酯)、聚(羟基丁酸酯-共-戊酸酯)、聚(己内酯)、聚(琥珀酸亚丁酯)、聚(琥珀酸亚乙酯)、聚(碳酸亚乙酯)、聚(碳酸亚丙酯)、淀粉、明胶、热塑性淀粉、聚(对苯二甲酸亚丁酯己二酸酯)、聚(对苯二甲酸亚丙酯琥珀酸酯)、聚(对苯二甲酸亚丙酯己二酸酯)、聚(乙烯醇)、聚(乙二醇)、纤维素、脱乙酰壳多糖、乙酸纤维素、丁酸乙酸纤维素、或具有大于5摩尔％的脂族单体含量的聚酯，
d)增塑剂，其中所述增塑剂以小于所述总组合物30重量％存在，
e)柠檬酸乙酰基三丁酯、柠檬酸三丁酯、癸二酸二正辛酯、癸二酸二-2-乙基己酯、琥珀酸二-2-乙基己酯、己二酸二异辛酯、己二酸二-2-乙基己酯、戊二酸二异辛酯、戊二酸二-2-乙基己酯、聚(乙二醇)、聚(乙二醇)单月桂酸酯、山梨醇、甘油、聚(丙二醇)、或水，
f)两种或更多种下列物质的共聚物：己内酯、乳酸、D-丙交酯、L-丙交酯、内消旋-丙交酯、D，L-丙交酯、癸二酸、琥珀酸、己二酸、乙醇酸、草酸、乙二醇、1，2-丙二醇、1，3-丙二醇、1，3-丁二醇、1，4-丁二醇、1，5-戊二醇、2，2，4，4-四甲基-1，3-环丁二醇、1，6-己二醇、对苯二甲酸、间苯二甲酸、二甲基硅氧烷、琥珀酸酐、二异氰酸酯、交联剂、或邻苯二甲酸酐，
g)抗氧化剂、成核剂、抗冲改性剂、加工助剂、增韧剂、着色剂、填料、稳定剂、或阻燃剂，
h)纸、水溶性纸、再循环纸、铜版纸、牛皮纸、蜡纸、或涂布纸，
i)两种或更多种上文组分a)至h)的组合，和
j)包含两种或更多种上文组分a)至i)的共混物。
4.根据权利要求1所述的人工种子，其中所述容器的区域或所述闭合件还包含选自下列的组分：
a)乳酸与己内酯的无规、嵌段或梯度共聚物，
b)乳酸与二甲基硅氧烷的无规、嵌段或梯度共聚物，
c)醇酸树脂，
d)聚(乙烯醇)、淀粉、纤维素、聚(乙二醇)、琼脂、黄原胶、藻酸盐、羟丙基纤维素、甲基纤维素、水溶性蛋白质、水溶性碳水化合物、水溶性合成聚合物、或羧甲基纤维素，
e)两种或更多种下列物质的共混物：聚(乙烯醇)、淀粉、纤维素、甘油、聚(乙二醇)、柠檬酸、尿素、水、乙酸钠、硝酸钾、硝酸铵、肥料、琼脂、黄原胶、藻酸盐、羟丙基纤维素、甲基纤维素、水溶性蛋白质、水溶性碳水化合物、水溶性合成聚合物、交联剂、或羧甲基纤维素，
f)包含嵌段共聚物和油的凝胶，
g)羧甲基纤维素钠，
h)蜡浸渍的水溶性纸，
i)无定形聚(D，L-乳酸)、聚(乳酸)、聚(L-乳酸)、聚(D-乳酸)、聚(内消旋-乳酸)、聚(外消旋-乳酸)、或聚(D，L-乳酸)、聚(羟基链烷酸酯)、聚(羟基丁酸酯)、聚(羟基丁酸酯-共-戊酸酯)、聚(己内酯)、聚(琥珀酸亚丁酯)、聚(琥珀酸亚乙酯)、聚(碳酸亚乙酯)、聚(碳酸亚丙酯)、淀粉、热塑性淀粉、明胶、聚(对苯二甲酸亚丁酯己二酸酯)、聚(对苯二甲酸亚丙酯琥珀酸酯)、聚(对苯二甲酸亚丙酯己二酸酯)、聚(乙烯醇)、聚(乙二醇)、纤维素、脱乙酰壳多糖、乙酸纤维素、丁酸乙酸纤维素；或它们的交联形式，
j)具有大于5摩尔％的脂族单体含量的聚酯，
k)交联形式的无定形聚(D，L-乳酸)、聚(乳酸)、聚(L-乳酸)、聚(D-乳酸)、聚(内消旋-乳酸)、聚(外消旋-乳酸)、或聚(D，L-乳酸)、聚(羟基链烷酸酯)、聚(羟基丁酸酯)、聚(羟基丁酸酯-共-戊酸酯)、聚(己内酯)、聚(琥珀酸亚丁酯)、聚(琥珀酸亚乙酯)、聚(碳酸亚乙酯)、聚(碳酸亚丙酯)、淀粉、明胶、热塑性淀粉、聚(对苯二甲酸亚丁酯己二酸酯)、聚(对苯二甲酸亚丙酯琥珀酸酯)、聚(对苯二甲酸亚丙酯己二酸酯)、聚(乙烯醇)、聚(乙二醇)、纤维素、脱乙酰壳多糖、乙酸纤维素、丁酸乙酸纤维素、或具有大于5摩尔％的脂族单体含量的聚酯，
l)增塑剂，其中所述增塑剂以小于所述总组合物30重量％存在，
m)柠檬酸乙酰基三丁酯、柠檬酸三丁酯、癸二酸二正辛酯、癸二酸二-2-乙基己酯、琥珀酸二-2-乙基己酯、己二酸二异辛酯、己二酸二-2-乙基己酯、戊二酸二异辛酯、戊二酸二-2-乙基己酯、聚(乙二醇)、聚(乙二醇)单月桂酸酯、山梨醇、甘油、聚(丙二醇)、或水，
n)两种或更多种下列物质的共聚物：己内酯、乳酸、D-丙交酯、L-丙交酯、内消旋-丙交酯、D，L-丙交酯、癸二酸、琥珀酸、己二酸、乙醇酸、草酸、乙二醇、1，2-丙二醇、1，3-丙二醇、1，3-丁二醇、1，4-丁二醇、1，5-戊二醇、2，2，4，4-四甲基-1，3-环丁二醇、1，6-己二醇、对苯二甲酸、间苯二甲酸、琥珀酸酐、二异氰酸酯、交联剂、或邻苯二甲酸酐，
o)抗氧化剂、成核剂、抗冲改性剂、加工助剂、增韧剂、着色剂、填料、稳定剂、或阻燃剂，
p)蜡、或
q)纸、水溶性纸、再循环纸、铜版纸、牛皮纸、蜡纸、或涂布纸，或
r)两种或更多种上文组分a)至q)的组合，和
s)包含两种或更多种上文组分a)至r)的共混物。
5.根据权利要求1所述的人工种子，其中所述容器是能够扩张的。
6.根据权利要求5所述的人工种子，其中所述人工种子能够通过选自下列的方法而扩张：
a)叠缩两个或更多个管状构件，
b)解折叠，
c)膨胀，
d)展开，以及
e)拉伸。
7.根据权利要求1所述的人工种子，其中所述营养物质源还包含选自下列的组分：
a)土壤，
b)椰棕，
c)蛭石，
d)人工生长培养基，
e)琼脂，
f)超吸收聚合物，
g)植物生长调节剂，
h)植物激素，
i)微量营养素，
j)宏量营养素，
k)水，
l)肥料，
m)泥煤，
n)两种或更多种上文组分a)至m)的组合，和
o)包含两种或更多种上文组分a)至n)的共混物。
8.根据权利要求1所述的人工种子，其中所述可再生植物组织是选自下列的可再生组织：
a)甘蔗、禾本科植物、甘蔗属物种、甘蔗属杂交物种、芒属植物、柳枝稷、能源甘蔗、不结实草本植物、竹子、木薯、玉米、稻、香蕉、马铃薯、甘薯、薯蓣、菠萝、树、柳树、杨树、桑树、榕属物种、油棕、枣椰、禾本科(poaceae)、马鞭草、香草、茶、啤酒花属植物、蔗茅属物种、甘蔗属间杂种、蔗茅属和高粱属物种、非洲紫罗兰、苹果、枣、无花果、番石榴、芒果、槭树、李子、石榴、番木瓜果、鳄梨、黑莓、栽培的草莓、葡萄、美人蕉、大麻、柑橘属植物、柠檬、橙、柚子、橘子、或酸橙，
b)上文a)的遗传修饰植物，
c)上文a)的微繁形式，和
d)上文a)的遗传修饰的微繁形式。
9.根据权利要求1所述的人工种子，其中所述容器还包括选自下列的部件：
a)带有锥形顶部的圆柱形管，
b)带有多孔底部部分和无孔顶部部分的两部分管，
c)柔性袋，
d)半柔性袋，
e)能够展开的轧管结构，
f)锚固装置，
g)带有铰接边缘的多部分管，
h)用粘合剂保持在一起的多部分管，
i)管状形状，
j)与土壤接触的容器部分，所述与土壤接触的容器部分比土壤上方的部分更快地降解，
k)包括多个隔室的空间，
l)保持水分的封闭底部末端，
m)通过粘合接头而附接的顶盖，
n)通过插入所述容器而附接的顶盖，和
o)弱区域。
10.根据权利要求1所述的人工种子，其中所述容器或闭合件还包含选自下列的材料：
a)透明的、半透明的或部分半透明的材料，
b)不透明的材料，
c)多孔材料，
d)无孔材料，
e)可渗透的材料，
f)不可渗透的材料，和
g)上文材料a)至f)中的任何一种，其中所述材料是能够生物降解的、能够以水解方式降解的、或能够堆肥的。
11.根据权利要求1所述的人工种子，其中使用选自下列的部件来固定所述开口中的一个或多个：
a)夹具，
b)折叠部，
c)多孔材料，
d)网片，
e)筛网，
f)棉，
g)纱布，和
h)钉。
12.根据权利要求1所述的人工种子，其中所述人工种子还包含选自下列的试剂：
a)杀真菌剂，
b)杀线虫剂，
c)杀昆虫剂，
d)抗微生物化合物，
e)抗生素，
f)杀生物剂，
g)除草剂，
h)植物生长调节剂或刺激剂，
i)微生物，
j)杀螺剂，
k)杀蛆剂，
l)杀螨剂，
m)驱鸟剂，
n)驱昆虫剂，
o)植物激素，和
p)驱啮齿动物剂。
13.一种储存权利要求1所述的人工种子的方法，包括获取所述人工种子并在种植所述人工种子之前以一种或多种下列条件储存所述人工种子：
a)环境条件，
b)亚环境温度，
c)亚环境氧水平，或
d)在亚环境照明下，并且
其中所述可再生植物组织保持活力。
14.一种种植权利要求1所述的人工种子的方法，包括获取所述人工种子并进行下列步骤：
a)在所述人工种子中引入一个或多个缺口，其中所述缺口有利于所述可再生植物组织的生长，
b)使所述人工种子扩张，以及
c)上文a)和b)的组合。
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