BR102012032801A2

BR102012032801A2 - semente artificial e mÉtodos de armazenar e plantar a semente artificial

Info

Publication number: BR102012032801A2
Application number: BR102012032801-1A
Authority: BR
Inventors: Timothy Caspar; Denise De Oliveira Gaspareto; Lawrence Doka Gaultney; Ross Gilmour; Beverly Hallahan; David L Hallahan; Barry D Johnson; Brad H Jones; Katrina Kratz; Prakash Lakshmanan; Surbhi Mahajan; Brian D Mather; Barry Alan Morris; Jingjing Xu; Marcos Luciano Nunhez
Original assignee: Du Pont
Priority date: 2011-12-21
Filing date: 2012-12-20
Publication date: 2013-09-10
Also published as: CA2859976A1; AU2012358929A1; AU2012358929C1; EP2793551A1; PH12014501407A1; MX2014007449A; US20130174483A1; CO7010786A2; WO2013096531A1; BR112014015240A2; CN104284579A; AU2012358929B2

Abstract

SEMENTE ARTIFICIAL E MÉTODOS DE ARMAZENAR E PLANTAR A SEMENTE ARTIFICIAL.Composição e método para preparar sementes artificiais de plantinhas que podem ser desenvolvidas em plantas cultivadas para a propagação no campo são divulgados. Em uma forma de realização, as sementes artificiais são desenvolvidas em recipientes degradáveis. Os métodos divulgados também possibilitam a propagação rápida de olantas em demanda, tais como cana de açúcar, para atingir a demanda global sempre crescente quanto a esta planta.

Description

"SEMENTE ARTIFICIAL E MÉTODOS DE ARMAZENAR E PLANTAR A SEMENTE ARTIFICIAL"

REFERÊNCIA CRUZADA AOS PEDIDOS RELACIONADOS

Benefício é reivindicado sob 35 U.S.C. § 119(e) até a data de depósito do Pedido Provisório U.S. No. 61/578.410, depositado em 21 de dezembro de 2011, a divulgação do qual é aqui incorporada por referência na sua totalidade.

CAMPO DA INVENÇÃO Esta invenção diz respeito à produção de sementes artificiais de planta. Especificamente, a mesma diz respeito à produção de sementes artificiais de cana de açúcar.

FUNDAMENTOS Algumas plantas tais como cana de açúcar, banana, abacaxi, cítricos, coníferas e maçã não podem ser propagadas por intermédio de sementes devido a: a) a perda de identidade genética durante a reprodução pela semente; b) a longa duração do crescimento para as plantas antes da produção de semente; e c) o crescimento e taxas de sobrevivência deficientes das sementes naturais destas plantas sob as condições de cultivo no campo. Correntemente, estas safras são propagadas pelos meios vegetativos ou por intermédio de mudas. Assim tentativas foram feitas para desenvolver várias alternativas econômicas para a sua propagação.

As sementes artificiais têm sido há muito tempo estudadas como um meio alternativo para propagar algumas plantas (Kitto, S., Hort. Science, 20: 98 - 100, 1985). Uma semente artificial é um objeto que é fabricado pelo ser humano, e que inclui componentes necessários para facilitar o crescimento da planta, e a partir do que uma planta pode crescer e ser estabelecida a partir do seu próprio tecido vegetal, mas em que o tecido vegetal tipicamente não é o mesmo como a semente natural da planta. Ao contrário, uma semente natural é produzida pelas plantas em um processo biológico natural sem a intervenção humana.

As sementes artificiais tradicionais são de tecido cultivado em laboratório encapsulado em alginato que pode ser cultivado in vitro, mas eles sofrem de taxas de sobrevivência muito baixas em ambientes no campo devido tanto ao material encapsulado assim como desafios biológicos. A encapsulação é o processo de adicionar o tecido vegetal regenerável a um recipiente para fornecer uma semente artificial. Um tecido vegetal regenerável é um tecido capaz de regenerar em uma planta madura com as mesmas características e identidade genética como a planta precursora. Uma plantinha é um tipo de tecido vegetal regenerável. As plantinhas podem possuir brotos e raízes bem diferenciados ou eles podem ser plantinhas imaturas com apenas brotos que são capazes de enraizar quando plantados no solo ou outro meio de cultivo. Alguns dos desafios incluem a dessecação do tecido encapsulado em alginato exposto, ataque pelos microorganismos do solo, troca gasosa insuficiente dos encapsulantes, e imaturidade e fraqueza do tecido cultivado em laboratório (Redenbaugh, K., Hort. Science, 22: 803-809, 1987 e Redenbaugh, K., Célula Cult and Somat Cell Genet Plants, 8: 35-74, 1991).

As sementes artificiais foram usadas para a produção de coníferas usando embriões de conífera (Weyerhaeusor Corporation, W01998033375). Este método usa um projeto complexo, de multicompartimento, individualmente montado.

A cana de açúcar é comercialmente propagada vegetativamente devido à perda de identidade genética durante a reprodução sexual pela semente. A reprodução vegetativa desta planta envolve o plantio de cortes do talo (seções de haste de multinó chamadas de billets ou talos inteiros) horizontalmente em sulcos. Cada talo tem um broto ou meristema, em cada nó. Meristemas são células não diferenciadas encontradas em zonas da planta onde o crescimento pode ocorrer. Um segmento de nó refere-se a uma seção de talo de cana contendo um broto lateral, capaz de regenerar uma planta de cana de açúcar. Depois do plantio, estes brotos produzem brotos e raízes, que se tonam em novas plantas de cana de açúcar. O açúcar e nutrientes dentro das seções de talo estimulam o crescimento inicial das novas plantas.

A reprodução vegetativa da cana de açúcar é um processo

muito trabalhoso e é repleto com problemas. Os problemas principais-incluem a exigência de uma grande quantidade de material de talo para o plantio (chamado de "cana semente" nas operações de produção de cana comerciais) que de outro modo seria moído para a produção de açúcar, e o custo de dedicar uma porção significante do campo e o trabalho envolvido para produzir cana semente. Custo significante está envolvido simplesmente no transporte de toneladas múltiplas de cana de açúcar (10 a 15 ton/ha) necessárias para plantar um campo. Adicionalmente, a cana semente pode conter doenças que são propagadas pelo plantio da cana de açúcar doente para a geração seguinte. Consequentemente, estoques de plantio isentos de patógeno necessitam ser mantidos, o que envolve procedimentos de esterilização de talo em larga escala, adicionando mais custo à propagação convencional. Para a introdução de novas variedades de cana de açúcar, o método da propagação vegetativa é ineficaz devido aos ciclos de crescimento longos e consequentemente o fator de multiplicação relativamente baixo (por exemplo, de 5 a 15 kg de cana semente produzidos para cada 1 kg de cana de açúcar plantado) por ciclo de crescimento de 1 ano de duração.

Plene® (Syngenta Co.), é um produto comercial que consiste de segmentos de nó único do talo da cana de açúcar, aparado de tecido de interno em excesso para se parecer com billets miniaturizados, e foi usado como um propágulo vegetativo. Um propágulo é um material vegetal usado para a propagação.

Um outro processo para cultivar meristemas da cana de açúcar em massas de broto a partir dos talos cultivados no campo de cana de açúcar foi divulgado (BSES, W02011/085446 Al). Este método possibilita fatores de multiplicação altos, que podem ser usados para acelerar a liberação de variedade. Entretanto, os propágulos deste processo requerem endurecimento em um viveiro antes de serem transferidos para o campo, o que limita a sua praticabilidade para a produção de cana de açúcar em larga escala.

Assim, permanece uma necessidade para desenvolver métodos novos e econômicos para melhorar a viabilidade dos tecidos vegetais incorporados em sementes artificiais para permitir o plantio direto das plantinhas no solo.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção fornece sementes artificiais para melhorar o crescimento e viabilidade de tecidos vegetais regeneráveis e possibilitar um processo de plantio escalonável de plantas difíceis de propagar tais como a cana de açúcar.

Em um aspecto, a invenção está direcionada a uma semente artificial que compreende um ou mais tecidos vegetais regeneráveis, um recipiente que compreende uma porção degradável, um espaço aéreo não obstruído, e uma fonte de nutriente, e que compreende ainda uma ou mais características selecionadas do grupo que consiste de: uma região penetrável ou degradável através da qual o tecido vegetal regenerável cresce, uma porção de monocamada solúvel em água do recipiente, uma região do recipiente que flui ou desliza entre cerca de 1°C e 50°C, um fechamento separável que é fisicamente deslocado durante o crescimento do tecido vegetal regenerável, uma ou mais aberturas nas laterais ou fundo do recipiente, uma região cônica ou afunilada que leva a uma abertura de menos do que 2 cm de largura no ápice e em que o ângulo da região cônica ou afunilada é menor do que 135 graus medido a partir de lados opostos, e uma pluralidade de abas flexíveis através das quais o tecido regenerável cresce.

Em uma forma de realização da invenção, o recipiente, região do recipiente, ou um fechamento compreendem ainda, ou alternativamente consistem de, um ou mais dos que seguem: poliésteres, poliamidas, poliolefmas, celulose, derivados de celulose, polissacarídeos, poliéteres, poliuretanos, policarbonatos, poli(metacrilatos de alquila), poli(acrilatos de alquila), poli(ácidos acrílicos), poli(ácidos metacrílicos), polifosfazenos, poli- imidas, polianidridos, poliaminas, polidienos, poliacrilamidas, poli(siloxanos), poli(álcool vinílico), poli(ésteres vinílicos), poli(éteres vinílicos), polímeros naturais, copolímeros de bloco, polímeros reticulados, proteínas, ceras, óleos, plastificadores, antioxidantes, agentes de nucleação, modificadores de impacto, auxiliares de processamento, endurecedores, corantes, enchedores, estabilizantes, retardantes de chama, borracha natural, polissulfonas, ou polissulfetos; ou misturas destes; ou versões reticuladas destes.

Em uma outra forma de realização da invenção, o recipiente compreende ainda um componente selecionado do grupo que consiste de: a) poli(ácido D,L-láctico) amorfo, poli(ácido láctico), poli(ácido L-láctico), poli(ácido D-láctico), poli(ácido meso-láctico), poli(ácido rac-láctico), ou poli(ácido D,L-láctico), (poli(hidroxialcanoato), poli(hidroxibutirato), poli(hidroxibutirato-co-valerato), poli(caprolactona), poli(succinato de butileno), poli(succinato de etileno), poli(carbonato de etileno), poli(carbonato de propileno), amido, gelatina, amido termoplástico, poli(tereftalato adipato de butileno), poli(tereftalato succinato de propileno), poli(tereftalato adipato de propileno), poli(álcool vinílico), poli(etileno glicol), celulose, quitosano, acetato de celulose, ou butirato acetato de celulose, b) um poliéster com mais do que 5 por cento em mol de teor de monômero alifático, c) uma versão reticulada de poli(D,L-ácido láctico) amorfo, poli(ácido láctico), poli(L-ácido láctico), poli(D-ácido láctico), poli(meso-ácido láctico), poli(rac-ácido láctico), ou poli(D,L-ácido láctico), (poli(hidroxialcanoato), poli(hidroxibutirato), poli(hidroxibutirato-co- valerato), poli(caprolactona), poli(succinato de butileno), poli(succinato de etileno), poli(carbonato de etileno), poli(carbonato de propileno), amido, gelatina, amido termoplástico, poli(tereftalato adipato de butileno), poli(tereftalato succinato de propileno), poli(tereftalato adipato de propileno), poli(álcool vinílico), poli(etileno glicol), celulose, quitosano, acetato de celulose, butirato acetato de celulose, ou um poliéster com mais do que 5 por cento em mol de teor de monômero alifático, d) um plastificador, em que o plastificador está presente em menos do que 30 % em peso da composição total, e) citrato de acetil tributila, citrato de tributila, sebacato de di-n-octila, sebacato de di-2-etilexila, succinato de di-2-etilexila, adipato de di-isooctila, adipato de di-2-etilexila, glutarato de di-isooctila, glutarato de di-2-etilexila, poli(etileno glicol), monolaurato de poli(etileno glicol), sorbitol, glicerol, poli(propileno glicol), ou água, f) copolímeros de dois ou mais de caprolactona, ácido láctico, D-lactídeo, L-lactídeo, meso-lactídeo, D,L- lactídeo, ácido sebácico, ácido succínico, ácido adípico, ácido glicólico, ácido oxálico, etileno glicol, 1,2-propanodiol, 1,3-propanodiol, 1,3-butanodiol, 1,4- butanodiol, 1,5-pentanodiol, 2,2,4,4-tetrametil-l,3-ciclobutanodiol, 1,6- hexanodiol, ácido tereftálico, ácido isoftálico, dimetil siloxano, anidrido succínico, um di-isocianato, um reticulador, ou anidrido itálico, g) um antioxidante, um agente de nucleação, um modificador de impacto, um auxiliar de processamento, um endurecedor, um corante, um enchedor, um estabilizante, ou um retardante de chama, h) papel, papel solúvel em água, papel reciclado, papel de carta, papel kraft, papel encerado, ou papel revestido, i) uma combinação de dois ou mais dos componentes de a) até h), e j) uma mistura que compreende dois ou mais dos componentes de a) até i).

Em uma outra forma de realização, uma região do recipiente ou fechamento compreende ainda um componente selecionado do grupo que consiste de: a) copolímeros aleatórios, de bloco ou gradiente do ácido láctico com caprolactona, b) copolímeros aleatórios, de bloco ou gradiente do ácido láctico com dimetilsiloxano, c) uma resina alquídica, d) poli(álcool vinílico), amido, celulose, poli(etileno glicol), ágar, goma xantana, alginato, hidroxipropilcelulose, metilcelulose, uma proteína solúvel em água, um carboidrato solúvel em água, um polímero sintético solúvel em água, ou carboximetilcelulose, e) misturas de dois ou mais dos que seguem: poli(álcool vinílico), amido, celulose, glicerol, poli(etileno glicol), ácido cítrico, uréia, água, acetato de sódio, nitrato de potássio, nitrato de amônio, fertilizantes, ágar, goma xantana, alginato, hidroxipropilcelulose, metilcelulose, uma proteína solúvel em água, um carboidrato solúvel em água, um polímero sintético solúvel em água, um reticulador, ou carboximetilcelulose, f) um gel que compreende um copolímero de bloco e um óleo, g) carboximetilcelulose de sódio, h) papel solúvel em água impregnado com cera, i) poli(D,L-ácido láctico) amorfo, poli(ácido láctico), poli(L-ácido láctico), poli(D-ácido láctico), poli(meso-ácido láctico), poli(rac-ácido láctico), ou poli(D,L-ácido láctico), poli(hidroxialcanoato), poli(hidroxibutirato), poli(hidroxibutirato-co- valerato), poli(caprolactona), poli(succinato de butileno), poli(succinato de etileno), poli(carbonato de etileno), poli(carbonato de propileno), amido, amido termoplástico, gelatina, poli(tereftalato adipato de butileno), poli(tereftalato succinato de propileno), poli(tereflalato adipato de propileno), poli(álcool vinílico), poli(etileno glicol), celulose, quitosano, acetato de celulose, butirato acetato de celulose; ou uma versão reticulada destes, j) um poliéster com mais do que 5 por cento em mol de teor de monômero alifático, k) uma versão reticulada de poli(D,L-ácido láctico) amorfo, poli(ácido láctico), poli(L-ácido láctico), poli(D-ácido láctico), poli(meso-ácido láctico), poli(rac-ácido láctico), ou poli(D,L-ácido láctico), poli(hidroxialcanoato), poli(hidroxibutirato), poli(hidroxibutirato-co-valerato), poli(caprolactona), poli(succinato de butileno), poli(succinato de etileno), poli(carbonato de etileno), poli(carbonato de propileno), amido, gelatina, amido termoplástico, poli(tereftalato adipato de butileno), poli(tereftalato succinato de propileno), poli(tereftalato adipato de propileno), poli(álcool vinílico), poli(etileno glicol), celulose, quitosano, acetato de celulose, butirato acetato de celulose, ou um poliéster com mais do que 5 por cento em mol de teor de monômero alifático, 1) um plastificador, em que o plastificador está presente em menos do que 30 % em peso da composição total, m) citrato de acetil tributila, citrato de tributila, sebacato de di-n-octila, sebacato de di-2-etilexila, succinato de di- 2-etilexila, adipato de di-isooctila, adipato de di-2-etilexila, glutarato de di- isooctila, glutarato de di-2-etilexila, poli(etileno glicol), monolaurato de poli(etileno glicol), sorbitol, glicerol, poli(propileno glicol), ou água, n) copolímeros de dois ou mais de caprolactona, ácido láctico, D-lactídeo, L- lactídeo, meso-lactídeo, D,L-lactídeo, ácido sebácico, ácido succínico, ácido adípico, ácido glicólico, ácido oxálico, etileno glicol, 1,2-propanodiol, 1,3- propanodiol, 1,3-butanodiol, 1,4-butanodiol, 1,5-pentanodiol, 2,2,4,4- tetrametil-l,3-ciclobutanodiol, 1,6-hexanodiol, ácido tereftálico, ácido isoftálico, anidrido succínico, um di-isocianato, um reticulador, ou anidrido itálico, o) um antioxidante, um agente de nucleação, um modificador de impacto, um auxiliar de processamento, um endurecedor, um corante, um enchedor, um estabilizante, ou um retardante de chama, p) uma cera, Parafilm® ou Nescofilm®, q) papel, papel solúvel em água, papel reciclado, papel de carta, papel kraft, papel encerado, ou papel revestido; ou r) um combinação de dois ou mais dos componentes de a) até q), e s) uma mistura que compreende dois ou mais dos componentes de a) até r).

Em uma outra forma de realização, o recipiente é expansível. Os exemplos não limitantes de métodos expansíveis incluem métodos selecionados do grupo que consiste de: a) encaixe telescópico de dois ou mais membros tubulares, b) desdobramento, c) inflação, d) descosturamento; e e) estiramento.

Em uma outra forma de realização da invenção, a fonte de nutriente compreende ainda um componente selecionado do grupo que consiste de: a) solo, b) fibra de coco, c) vermiculita, d) um meio de crescimento artificial, e) ágar, f) um polímero superabsorvente, g) um regulador do crescimento de planta, h) uma hormônio de planta, i) micronutrientes, j) macronutrientes, k) água, 1) um fertilizante, m) turfa, n) uma combinação de dois ou mais dos componentes de a) até m), e o) uma mistura que compreende dois ou mais dos componentes de a) até n).

Em uma outra forma de realização, o tecido vegetal regenerável é um tecido regenerável selecionado do grupo que consiste de: a) cana de açúcar, uma planta graminácea, saccharum spp, híbridos de saccharum spp, miscanthus, switchgrass, cana energética, gramas estéreis, bambu, mandioca, milho, arroz, banana, batata, batata doce, inhame, abacaxi, árvores, salgueiro, álamo, amoreira,ficus spp, dendezeiro, tamareira, poaceae, verbena, baunilha, chá, lúpulos, Erianthus spp, híbridos intergenéricos de Saccharum, Erianthus e Sorghum spp, violeta africana, maçã, tâmara, figo, goiaba, manga, bordo, ameixa, romã, mamão, abacate, amora silvestre, morango silvestre, uvas, cana, canabis, cítricos, limão, laranja, toranja, tangerina, ou lima, b) uma planta geneticamente modificada de a), c) uma versão micropropagada de a), e d) uma versão micropropagada, geneticamente modificada de a). Em uma outra forma de realização, o recipiente compreende

ainda um componente selecionado do grupo que consiste de: a) um tubo cilíndrico com um topo cônico, b) um tubo de duas partes com uma seção de fundo porosa e uma seção de topo não porosa, c) um pacote flexível, d) um pacote semiflexível, e) uma estrutura de tubo rolado, capaz de descosturamento, f) um dispositivo de ancoramento, g) um tubo de partes múltiplas com uma borda articulada, h) um tubo de partes múltiplas mantidos juntos com adesivo, i) uma forma tubular, j) uma porção de recipiente em contato com o solo que degrada mais rápido do que a porção acima solo, k) um espaço aéreo que compreende compartimentos múltiplos, 1) uma extremidade de fundo fechada que retém umidade, m) uma tampa ligada por uma junta adesiva, n) uma tampa ligada pela inserção dentro do recipiente, e o) uma região fraca.

Em uma outra forma de realização, o recipiente ou fechamento compreendem ainda um material selecionado do grupo que consiste de: a) um material transparente, translúcido ou semitranslúcido, b) um material opaco, c) um material poroso, d) um material não poroso, e) um material permeável, f) um material impermeável; e g) qualquer um dos materiais de a) até f), em que o material é biodegradável, hidrolíticamente degradável, ou compostável.

Em uma outra forma de realização, uma ou mais das aberturas são presas usando um componente selecionado do grupo que consiste de: a) uma plissagem, b) um dobra, c) um material poroso, d) malha, e) tela, f) algodão, g) gaze; e h) um grampo.

Em uma outra forma de realização, a semente artificial compreende ainda um agente selecionado do grupo que consiste de: a) um fungicida, b) um nematicida, c) um inseticida, d) um composto antimicrobiano, e) um antibiótico, f) um biocida, g) um herbicida, h) regulador ou estimulador do crescimento de planta, i) micróbios, j) um moluscicida, k) um pesticida para eliminação de ácaros, 1) um acaricida, m) um repelente de pássaro, n) um repelente de inseto, o) um hormônio de planta; e p) um repelente de roedor.

Em uma outra forma de realização, um método para preparar a semente artificial que compreende as etapas de: a) preparar o dito recipiente; b) preparar um ou mais tecidos vegetais regeneráveis; e c) colocar o tecido da etapa (b) dentro do recipiente preparado na etapa (a).

Em uma outra forma de realização, um método de armazenar a semente artificial, que compreende obter a semente artificial e armazenar a dita semente artificial antes do plantio em uma ou mais das condições que seguem: a) condições ambientes, b) temperatura subambiente, c) níveis de oxigênio subambientes, ou d) sob iluminação subambiente, e em que o tecido vegetal regenerável permanece viável.

Em uma outra forma de realização, um método de plantio da semente artificial, que compreende obter a semente artificial e realizar uma etapa do grupo que consiste de: a) introduzir uma ou mais brechas na dita semente artificial durante o plantio, em que as brechas facilitam o crescimento dos tecidos vegetais regeneráveis, b) expandir a semente artificial, e c) a combinação de a) e b).

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Figura 1. A Figura 1 representa o projeto básico de um recipiente para o uso na preparação de sementes artificiais. Os números nesta Figura são: (1) fechamentos com Parafilm®; (2) espaço aéreo; (3) plantinha; (4) cilindro de papel; (5) meio de ágar; (6) algodão opcional.

Figura 2. A Figura 2 representa uma estrutura ameada para um recipiente de papel.

Figura 3. A Figura 3 é um gráfico que mostra a fração de brotamento das sementes artificiais de cana de açúcar como uma função do tempo depois do plantio. A linha sólida representa o crescimento de plantinhas em sementes artificiais contendo íungicida. A linha tracejada representa o crescimento de plantinhas em sementes artificiais sem fungicida. A fração de brotamento das plantinhas a partir da semente artificial é mostrada no eixo Υ. O tempo (dias) é mostrado no eixo X.

Figura 4. A Figura 4 é uma fotografia de placas de Petri contendo plantinhas que foram cultivadas no meio MS líquido por 10 dias antes da sua transferência para o meio MS ágar em placas de Petri por mais dias. As plantinhas foram separadas por tamanho em plantinhas menores de 1,0 a 1,5 cm (grupo 1) e o grupo maior aparado de 1,6 a 2,0 cm (grupo 2) (duas placas à esquerda - 1,6 a 2,0 cm (grupo 2); placa da direita 1 a 1,5 cm de comprimento (grupo 1)). Figura 5. A Figura 5 mostra fotografias de sementes artificiais totalmente montadas. O painel esquerdo é a vista lateral de uma semente artificial totalmente montada menor (4 χ 0,8 cm) e uma maior (6 χ 1,1 cm) com solo dentro. O painel direito mostra a vista de topo de sementes artificiais "5 montadas com plantinhas nelas observadas através do fechamento de topo de Nescofilm®.

Figura 6. A Figura 6 mostra fotografias de sementes artificiais totalmente montadas depois de 3 semanas no solo, as sementes artificiais bem sucedidas mostram plantinhas rompendo o fechamento de Nescofilm®. Sementes artificiais tanto pequenas quanto grandes são observadas no painel esquerdo. O painel de topo direito mostra fotografia tirada de perto da vista de topo de semente artificial grande com plantinhas rompendo ou tentando romper o fechamento de Nescofilm®; o painel direito de fundo mostra as sementes artificiais menores. Figura 7. A Figura 7 é um gráfico que representa a

porcentagem de sementes artificiais pequenas (4 cm de diâmetro) e grandes (6 cm de diâmetro) com plantinhas brotadas através dos fechamentos de Nescofilm®. A porcentagem de plantas produzidas é mostrada no eixo Y e os tratamentos no eixo X. A porcentagem de sobrevivência de plantinhas diretamente plantadas (controle) é mostrada no painel direito.

Figura 8. A Figura 8 é uma fotografia de plantinhas de 17 dias de idade (1,2 a 3,2 cm de comprimento), usadas para testar substratos de transplante diferentes.

Figura 9. A Figura 9 é um gráfico que representa a sobrevivência/emergência (%) das sementes artificiais no eixo Yeo número de dias no eixo X (Tl) mostra a porcentagem de sobrevivência e (T2 - T5) mostram a emergência de broto de plantinhas com 17 dias de idade. Tl mostra os resultados com plantio direto; T2 mostra os resultados usando um recipiente com solo; T3 mostra os resultados usando um recipiente com solo + cristais aquosos; T4 mostra os resultados usando um recipiente com perlita + musgo turfoso + cristais aquosos; e T5 mostra os resultados usando um recipiente com cristais aquosos do dia 7 ao dia 63.

Figura 10. A Figura 10 é um gráfico que representa a altura do broto e o número de plantinhas que emergem das sementes artificiais depois de 63 dias de crescimento eni estufa (eixo Y) e vários tratamentos no eixo X. Tl = plantio direto; T2 = recipiente com solo; T3 = recipiente com solo + cristal aquoso; T4 = recipiente com perlita + musgo turfoso + cristais aquosos; e T5 = recipiente com cristais aquosos.

Figura 11. A Figura 11 mostra fotografias de broto e plantinhas aparadas na raiz para encapsulação (painel esquerdo) e as sementes artificiais prontas para o plantio (painel direito).

Figura 12. A Figura 12 mostra fotografias de reservatórios para o plantio manual de sementes artificiais foi feito no meio de sulcos por um dispositivo de vareta de metal (painel esquerdo). A vista de topo das construções de semente colocadas nos reservatórios exatamente antes de pulverizar com água (painel direito).

Figura 13. A Figura 13 é um gráfico que representa a emergência e estabelecimento de plantas KQ228 (eixo Y) a partir de recipientes de papel e plástico (eixo X) e a sobrevivência e estabelecimento de plantas (sem qualquer cobertura de recipiente) plantados diretamente no solo.

Figura 14. A Figura 14 mostra fotografias de plantas produzidas a partir de sementes artificiais plásticas (painel de topo) depois de semanas de crescimento. O sistema de raiz foi bem desenvolvido nas plantas em sementes artificiais (painel esquerdo de fundo) e naquelas plantadas direto (painel direito de fundo).

Figura 15. A Figura 15 mostra diagramas de sementes artificiais em papel com janelas adicionais na lateral para sobrevivência melhorada no plantio horizontal. Os números nesta Figura são: (7) ameia; (8) janelas e (9) extremidades planas.

Figura 16: A Figura 16 mostra como a plissagem das extremidades do fundo dos tubos de papel encerado foi realizada.

Figura 17: A Figura 17 representa uma semente artificial em tubo de papel encerado com tampa cônica, em que a tampa cônica é formada de um tubo de centrífuga com um furo cortado na extremidade, e a base do tubo de papel é plissada.

Figura 18: A Figura 18 representa uma semente artificial em tubo de papel encerado com tampa cônica, em que a tampa cônica é cortada em um ângulo, e uma película transparente flexível é colada adjacente, com a extremidade livre cobrindo o furo na tampa cônica. Isto forma uma aba que reduz a perda de umidade da semente, enquanto possibilita que a planta empurre isto para longe. A base do tubo de papel é plissada.

Figura 19: A Figura 19 representa sementes artificiais em tubo de papel encerado com tampa cônica plantadas em várias profundidades (8 ou 12,5 cm) com pérolas superabsorventes na base.

Figura 20: A Figura 20 representa uma estrutura de semente artificial que consiste de dois tubos plásticos cônicos empilhados com furos, com furos nas pontas cônicas, e uma extremidade de fundo aberta.

Figura 21: A Figura 21 representa uma estrutura de semente artificial que consiste de um único tubo cônico adaptado de um tubo de centrífuga de polipropileno de 50 ml com um furo na extremidade de topo e uma aba transparente flexível que cobre este furo e uma extremidade de fundo aberta.

Figura 22: A Figura 22 representa uma estrutura de semente artificial construída a partir de dois tubos cônicos adaptados a partir de tubos de centrífuga de polipropileno de 15 ml e 50 ml orientados em direções opostas e colocados concentricamente em torno de um torrão de solo com a plantinha de cana de açúcar. A cavidade anelar contém polímero superabsorvente intumescido com água. O tubo interno tem fendas cortadas na base para possibilitar que a umidade entre na cavidade com a planta da cavidade anelar. A parte larga do tubo de 50 ml é coberto com Parafilm® M não estirado e a parte do fundo do tubo interno é aberta.

Figura 23: A Figura 23 representa uma estrutura de semente artificial construída de dois tubos cônicos adaptados a partir de tubos de centrífuga de polipropileno de 15 ml e 50 ml orientados na mesma direção, colocados concentricamente, com a cavidade anelar deixada vazia e as extremidades de fundo deixadas abertas.

Figura 24: A Figura 24 representa uma semente artificial construída a partir de um tubo com uma película na forma de tenda expansível circundando o mesmo. A película é expandida depois de remover uma faixa de papel que a segura no lugar antes do plantio.

Figura 25: A Figura 25 representa uma semente artificial em tubo cônico que possui uma película flexível com fendas formada em uma extremidade cônica, na extremidade de um tubo cilíndrico. As "abas" da extremidade cônica da película flexível podem ser empurradas longe por uma plantinha em crescimento (não mostrado).

Figura 26: A Figura 26 representa uma semente artificial em tubo cônico construída a partir de uma folha plástica enrolada com um padrão de dente de serra de um lado, resultando em "abas" que podem ser empurradas para longe por uma plantinha em crescimento (não mostrado) e uma forma de "rolo" que pode ser expandido por uma plantinha em crescimento.

Figura 27: A Figura 27 representa uma semente artificial em pacote cônico construído de poli(ácido láctico) com uma plantinha de cana de açúcar e Metro-Mix® 360 úmido dentro, selado por calor ao longo da borda do fundo. A extremidade do fundo foi cortado e o topo foi cortado com duas linhas verticais perpendiculares como indicado pelas linhas tracejadas antes do plantio.

Figura 28: A Figura 28 representa uma semente artificial em tubo cônico que possui uma estaca para propósitos de ancoragem.

Figura 29: A Figura 29 representa uma semente artificial em tubo cônico que possui abas extensíveis para propósitos de ancoragem.

Figura 30: A Figura 30 representa uma semente artificial tubular com uma plantinha inserida a partir de uma abertura lateral.

Figura 31: A Figura 31 representa uma semente artificial do tipo pacote com furos na metade de fundo de cada lateral e um topo aberto.

Figura 32: A Figura 32 representa uma semente artificial tipo pacote com furos todos ao longo de cada lateral e um topo fechado.

Figura 33: A Figura 33 representa uma semente artificial em tubo cônico composta de duas metades que são conectadas por um material solúvel em água ao longo de cada borda. Quando o material solúvel em água se dissolve, as duas metades se separam e podem ser empurradas para longe pela plantinha em crescimento.

Figura 34: A Figura 34 representa uma semente artificial em tubo cônico composta de duas metades com uma borda colada com uma cola flexível que forma uma borda articulada. Esta semente pode ser pivotada para longe pela plantinha em crescimento.

Figura 35: A Figura 35 representa uma semente artificial de forma enrolada em que uma faixa é usada para mantê-la em um estado comprimido, e depois removido para possibilitar a semente de expandir até o seu tamanho natural. Isto reduz o tamanho da semente durante a armazenagem.

Figura 36: A Figura 36 representa uma semente artificial dobrável que consiste de um tubo transparente flexível que circunda uma plantinha de cana de açúcar e Metro-Mix® 360 úmido. Uma faixa de borracha mantém a mesma no estado dobrado e é removido no plantio. O propósito disto é reduzir o espaço ocupado pela semente artificial antes do plantio.

Figura 37: A Figura 37 representa uma semente artificial de encaixe telescópico fabricada a partir de duas seções de tubo plástico transparente. As seções menores ajustam-se concentricamente dentro da seção maior com uma faixa de Parafilm® M para criar um ajuste confortável. -As duas seções estão no estado colapsado antes do plantio e são expandidas encaixando-as separadamente no plantio. O propósito disto é reduzir o espaço ocupado pela semente artificial antes do plantio. Ambas as extremidades da semente artificial são abertas.

Figura 38: A Figura 38 representa uma semente artificial que se expande na forma de sanfona fabricada a partir de tubo com nervuras com uma extremidade de topo mais flexível que é colapsada e colada com fita adesiva no lugar antes do plantio. A fita é removida no plantio para expandir a estrutura de semente. O propósito disto é reduzir o espaço ocupado pela semente artificial antes do plantio. A extremidade de fundo da semente artificial é aberta.

Figura 39: A Figura 39 representa uma semente artificial tubular com extremidades de película que são entalhadas com dois cortes cruzados.

Figura 40: A Figura 40 representa uma semente artificial em tubo cônico com um compartimento separado contendo polímero superabsorvente, com telas plásticas entre este compartimento e o compartimento contendo a plantinha, assim como uma tela plástica ligada à extremidade de fundo.

Figura 41: A Figura 41 representa uma semente artificial em tubo cônico com uma tampa em forma de funil e uma extremidade de fundo aberta.

Figura 42: A Figura 42 representa uma semente artificial em tubo cônico com uma extremidade de fundo tampada em extremidades opostas do tubo, formando deste modo um copo para conter a umidade na semente.

Figura 43: A Figura 43 representa uma semente artificial de encaixe telescópico em tubo cônico que consiste de uma porção de fundo de luva flexível sem um furo no fundo que se ajusta concentricamente em um tubo rígido com um furo cônico no topo. A luva de fundo é fabricada de poli(e-caprolactona), possibilitando que a mesma se degrade no solo.

Figura 44: A Figura 44 representa uma estrutura de semente sintética na forma ovoide.

Figura 45: A Figura 45 representa um conceito de tubo expansível que possui uma porção de topo flexível e uma porção de fundo rígida.

Figura 46: A Figura 46 representa um semente artificial na forma de tubo flexível dobrável com compartimentos selados por calor ao longo de cada borda. A extremidade de topo é aberta e as extremidades de fundo são deixadas abertas ou são seladas por calor.

Figura 47: A Figura 47 é uma fotografia de películas no topo de alvos ópticos. Da esquerda para a direita: Poli(ácido láctico) (PLA4032D NatureWorks, Minnetonka, MN), 22 % em peso de poli(succinato de 1,3- propanodiol) em PLA4032D, 50 % em peso de poli (succinato de 1,3- propanodiol) em PLA4032D.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Deve ser entendido que esta invenção não é limitada à metodologia, protocolos, linhagens de célula, gêneros, e reagentes descritos, particulares visto que tais podem variar. Também deve ser entendido que a terminologia aqui usada é apenas para o propósito de descrever formas de realização particulares, e não é intencionada a limitar o escopo da presente invenção. 10

Como aqui usado as formas singulares "um(a)", "e", e "o(a)" incluem referendos plurais a menos que o contexto claramente dite de outro modo. Assim5 por exemplo, referência a "uma célula" inclui uma pluralidade de tais células e referência "à proteína" inclui referência a uma ou mais proteínas e equivalentes destas conhecidas por aqueles habilitados na técnica, e assim por diante. Todos os termos técnicos e científicos aqui usados têm o mesmo significado como habitualmente entendido por uma pessoa de habilidade comum na técnica à qual esta invenção pertence a menos que claramente de outro modo indicado.

Uma forma de realização da invenção diz respeito ao

desenvolvimento de uma semente artificial de planta (Figura 1) onde um

tecido vegetal regenerável (3) é colocado em um recipiente (4) e o recipiente

é plantado no solo e o tecido vegetal regenerável é deixado crescer. Uma

semente artificial da presente invenção compreende um recipiente e um tecido vegetal regenerável.

Em uma outra forma de realização da invenção é fornecida uma semente artificial que compreende um ou mais tecidos vegetais regeneráveis, um recipiente que compreende uma porção degradável, um espaço aéreo não obstruído, e uma fonte de nutriente, e que compreende ainda uma característica selecionada do grupo que consiste de: uma região penetrável ou degradável através das quais o tecido vegetal regenerável cresce, uma porção de monocamada solúvel em água do recipiente, uma região do recipiente que flui entre cerca de I0C e 50°C, um fechamento separável que é fisicamente deslocado durante o crescimento do tecido vegetal regenerável, uma ou mais aberturas nas laterais ou fundo do recipiente, uma região cônica ou afunilada que leva a uma abertura menor do que 2 cm de largura no ápice e em que o ângulo da região cônica ou afunilada é menor do que 135 graus medido a partir de lados opostos, e uma pluralidade de abas flexíveis através das quais o tecido regenerável cresce. A região degradável pode ser biodegradável, fotodegradável, oxidativamente degradável, hidrolíticamente degradável, ou compostável. Como aqui usado, "uma região" significa qualquer componente do recipiente ou qualquer um dos fechamentos associados. '5 Um tecido vegetal regenerável é um tecido capaz de regenerar

em uma planta madura com as mesmas características e identidade genética como a planta precursora. Os tecidos vegetais regeneráveis usados para encapsulação em sementes artificiais como aqui descritos incluem, mas não são limitados a, tecido meristemático apical ou lateral, calo, embriões somáticos, embriões naturais, plantinhas, verticilo de folha, cortes de haste e folha, sementes naturais, e brotos. Uma planta de qualquer idade pode ser uma fonte destes tecidos. Como aqui usado, "meristema apical" significa o

r

meristema na extremidade apical do talo em crescimento. E o tecido que gera folhas novas assim como meristemas laterais conforme o talo se alonga e cresce em altura.

Vários tecidos meristemáticos tais como meristema apical de broto, meristema lateral de broto, meristema apical de raiz, meristema vascular e folhas imaturas jovens são usados na prática da presente invenção. Em uma forma de realização, o tecido do meristema apical de broto pode ser usado. Em uma outra forma de realização, o tecido de meristema lateral de broto é usado. Em uma outra forma de realização tecido de folha é usado. Como aqui usado, "meristema" abrange todos os tipos de meristemas disponíveis de uma planta.

Como aqui usado, "recipiente" significa qualquer estrutura oca que possa conter o tecido vegetal regenerável. O recipiente pode ter uma variedade de formatos e formas, contanto que o formato possibilite o recipiente de conter o tecido vegetal. Por exemplo, o recipiente pode ser esférico, tubular com formato de seção transversal circular, cônico, cúbico, ovoide ou qualquer outro formato transversal. Em uma forma de realização da invenção, o tecido vegetal regenerável pode ter um volume entre 0.0001 % e 90 % do volume do recipiente.

Uma classe de tecidos vegetais regeneráveis de interesse é tecido vegetal micropropagado. O tecido micropropagado é tipicamente "5 cultivado em um ambiente altamente hidratado, e assim tipicamente carece de características tais como função estomatal e morfologia protetiva completas tais como uma camada de cutícula. Estas características são importantes para a regulagem da umidade dentro do tecido e apresenta um problema para a sobrevivência destes tecidos fora do ambiente de micropropagação. Em particular, o ambiente de campo pode ser particularmente severo e desafiador para a sobrevivência de tecidos micropropagados. As plantinhas de cana de açúcar micropropagadas carecem de tolerância à dessecação e tipicamente exibem sobrevivência baixa no ambiente de campo. A solução tradicional para isto é condicionar as plantinhas de cana de açúcar em uma estufa, entretanto isto é caro e demorado e resulta em plantas que são muito grandes para plantar economicamente em campos de produção. De modo a sustentar a sobrevivência destes tecidos em um ambiente de campo, é crítico oferecer proteção da dessecação. Esta proteção pode envolver proteger o tecido do vento, e criar um ambiente local úmido em torno do tecido. Isto pode ser realizado pela criação de uma barreira física ou recipiente em torno do tecido.

Uma outra característica de tecido micropropagado é que o mesmo tipicamente carece de estruturas robustas, lignificadas tais como hastes lenhosas. Estas são importantes para fornecer rigidez a uma planta madura que previne a planta de dano durante ventos. Devido em parte à falta de tais estruturas, e ao vigor algumas vezes diminuído destes tecidos comparado com sementes naturais, é desafiador para o tecido micropropagado escapar de um recipiente que oferece proteção máxima contra a perda de umidade e dessecação. As plantinhas de cana de açúcar micropropagadas possuem brotos fracos, parecidos com capim, que são incapazes de perfurar os materiais de embalagem habitualmente usados. Assim, é importante desenvolver mecanismos que possibilitem o escape e proliferação destes tecidos dos materiais de embalagem.

Idealmente, os recipientes reduzem a taxa de perda de água 3 que o tecido experiência no ambiente de campo, através da transpiração na atmosfera ou condução e ação capilar no solo circundante. O recipiente também deve possibilitar permeabilidade gasosa suficiente, para possibilitar ao tecido obter os gases que ele necessita para a fotossíntese e respiração. Adicionalmente, é benéfico que o recipiente possibilita a passagem de um pouco de luz para a planta para a fotossíntese. Assumindo que o recipiente protege o tecido adequadamente para possibilitar a sobrevivência e o crescimento, o tecido crescerá até um tamanho que requer que o mesmo escape e se projete do recipiente. Isto possibilita que as raízes proliferem no solo para atingir fontes de nutriente e água adicionais, e possibilita que as folhas e brotos proliferem para aumentar a fotossíntese.

Em uma forma de realização, a invenção fornece novos recipientes de embalagem para a liberação e crescimento bem sucedido de tecido micropropagado, os ditos novos recipientes de embalagem aqui aludido a seguir como semente(s) artificial(is). No geral, a semente artificial terá uma extremidade de topo e de fundo, com o tecido micropropagado posicionado tal que os brotos cresçam na direção da extremidade de topo, e as raízes cresçam na direção da extremidade de fundo. Em uma hipótese não limitante da invenção, acredita-se que a região de topo da semente artificial é mais importante proteger da perda de umidade do que a região de fundo, devido ao fato de que o solo oferece um tampão da evaporação e também pode fornecer uma fonte de umidade dependendo da profundidade que a semente artificial é plantada.

A semente artificial da invenção pode incluir um ou mais dos mecanismos que seguem, que inclui todos os sete, de modo a equilibrar a característica de umidade retentiva da semente artificial enquanto possibilita o escape e proliferação eventuais do tecido micropropagado:

1) Em uma forma de realização da invenção, regiões fracas da semente artificial ou sua(s) tampa(s) são consideradas que bloqueiam a perda

"5 de umidade enquanto possibilita que brotos e raízes da planta em desenvolvimento perfurá-las. Não é praticável que o recipiente inteiro seja composto de um tal material fraco, visto que isto colocaria problemas para o manuseio, armazenagem e plantio;

2) Em uma outra forma de realização da invenção, a(s) semente(s) artificial(is) compreende(m) regiões degradáveis ou suas tampas

que bloqueiam a perda de umidade e degradam em uma taxa comensurada com o crescimento e desenvolvimento de estruturas protetivas dentro da própria planta, tal que o recipiente libera a planta em um estágio de desenvolvimento favorável. O mecanismo de degradação inclui, mas não é limitado a, um dos que seguem: biodegradação, degradação hidrolítica, fotodegradação ou degradação oxidativa. Em uma forma de realização particular, a semente artificial compreende, ou alternativamente consiste de, dois materiais degradáveis tendo taxas de degradação diferentes, em que a taxa de degradação da porção de subsuperfície é mais rápida do que a taxa de degradação da porção aérea. Em um exemplo não limitante, uma vez que a porção de subsuperfície degradou, a porção aérea é deslocada com o crescimento dos brotos;

3) Em uma outra forma de realização da invenção, a(s) semente(s) artificial(is) compreende(m) estruturas como abas em que uma

pluralidade de abas flexíveis convergem para fechar substancialmente uma ou ambas as extremidades da estrutura, preferivelmente a extremidade de topo da estrutura. O comportamento mecânico das abas é projetado através da escolha do material e características geométricas (espessura, ângulo relativo aos brotos emergentes) para permitir que plantas fracas flexionem e deste modo escapem da semente artificial;

4) Já em uma outra forma de realização da invenção, a(s) semente(s) artificial(is) compreende(m) estruturas de cobertas, tampas ou prendedores que são deslocadas pela planta em crescimento. Em uma forma

'5 de realização particular, as estruturas de cobertas, tampas ou prendedores são deslocadas por uma ação de encaixe telescópico ou por intermédio da ruptura de uma junta de adesivo fraco;

5) Em uma outra forma de realização da invenção, a(s) semente(s) artificial(is) compreende(m) regiões afuniladas no topo, que levam

a aberturas que são pequenas em relação ao diâmetro ou seção transversal da semente artificial. Estas regiões afuniladas guiam os brotos do tecido micropropagado na direção da(s) abertura(s) através da(s) qual(is) elas podem escapar;

6) Em uma outra forma de realização da invenção, a(s)

semente(s) artificial(is) compreende(m) uma região ou fechamento de topo

solúvel em água, em que o fechamento é dissolvido pela irrigação ou chuva, possibilitando deste modo que os brotos do tecido micropropagado cresçam para fora da estrutura de semente artificial;

7) Em uma outra forma de realização da invenção, a(s)

semente(s) artificial(is) compreende(m) uma região ou fechamento em que o

fechamento ou região flui(em) ou desliza(m) em uma temperatura entre 1 e 50° C. Esta faixa de temperatura é comensurada com temperaturas ambientes típicas experienciadas em ambientes no campo onde esta invenção é direcionada.

Em uma outra forma de realização, o recipiente compreende

uma borda de costura ou encaixe telescópico fracos, possibilitando que se abram e liberem o tecido em crescimento. A costura fraca pode ser criada no recipiente por qualquer meio conhecido na técnica, que inclui, mas não é limitado à perfuração, afinamento de uma região da parede do recipiente, pré- estresse, pregueado, ou craqueamento de uma região do recipiente. Em uma forma de realização, o recipiente é um tubo cilíndrico extrusado em que uma costura fraca é criada ao longo de uma ou mais bordas pela extrusão de uma região de material mais fino ao longo da costura. Em uma outra forma de realização, o recipiente é um tubo cilíndrico com uma fenda cortada ao longo de uma borda. O material do recipiente é depois flexível o bastante para possibilitar que a plantinha empurre o recipiente aberto. Em uma forma de realização, o recipiente pode ser construído de dois ou mais pedaços ou partes, que podem ser separáveis pelo crescimento do tecido ou pela dissolução ou degradação de um adesivo que os conectem. Em uma forma de realização, o recipiente consiste de um tubo cilíndrico extrusado com faixas de material solúvel ou degradável ao longo do comprimento do cilindro. Isto pode ser obtido através da extrusão de um bicomponente ou multicomponente, ou através da montagem de pedaços usando adesivo ou selagem por calor. Em uma outra forma de realização, o recipiente consiste de duas metades longitudinais de um tubo, que são conectadas pelo adesivo. Em uma outra forma de realização, duas metades são conectadas ao longo de uma borda através de meios que incluem, mas não são limitados a, selagem por calor ou adesivos, tal que uma estrutura articulada é criada. Em uma forma de realização, o adesivo consiste de um polímero solúvel em água, que inclui, mas não é limitado a poli(álcool vinílico) ou poli(vinil pirrolidona). As duas metades podem ser conectadas usando um adesivo ou material degradável. O adesivo pode ser solúvel em água ou fluível em uma faixa de temperaturas de cerca de 1 a 5 0°C. O material degradável pode ser hidrolíticamente degradável, oxidativamente degradável, biodegradável, compostável, ou fotodegradável. Em uma outra forma de realização, o recipiente consiste de duas seções conectadas de um tubo. As seções conectadas podem possuir porosidade e/ou degradabilidade diferentes. As seções podem ser conectadas por meios que incluem, mas não são limitados a, inserção, fita ou um adesivo. Em uma forma de realização a seção de topo é composta de plástico e a seção de fundo é composta de papel.

O recipiente pode possuir uma característica cônica ou afunilada. O ângulo da característica cônica, medido de um lado da seção cônica ao lado oposto, pode ser variado, preferivelmente menos do que 179 graus, mais preferivelmente menos do que 135 graus e o mais preferivelmente menor do que 100 graus. Um tubo cônico é definido aqui como um tubo cilíndrico com uma ou mais características cônicas conectadas a ele. A característica cônica pode ser feita do mesmo material como o tubo cilíndrico, ou um material diferente. A característica cônica ou afunilada pode possuir um ou mais furos, através dos quais a planta pode crescer. Adicionalmente, os furos fornecem troca gasosa rápida. O tamanho dos furos pode variar de 0,1 a mm, preferivelmente de 1 a 20 mm e mais preferivelmente de 3 a 15 mm.

O recipiente pode ser expansível ou colapsável, tal que antes do plantio (por exemplo, durante a armazenagem) a semente ocupa um volume menor do que depois do plantio. O recipiente pode possuir uma porção ou componente expansíveis. Como aqui usado, "expansível" significa a capacidade de aumentar em tamanho. Isto é obtido, por exemplo, com recipientes tubulares ou cilíndricos concêntricos que podem ser encaixados para formar um tubo mais longo.

Como aqui usado, "encaixe telescópico" significa o movimento de dois objetos em contato em direções opostas sem quebrar o contato. Também, o recipiente pode ser parcial ou completamente dobrável, tal que o recipiente dobrado, antes do plantio, ocupa menos espaço do que o' recipiente não dobrado depois do plantio. O recipiente pode ter seções dobradas ou reforçadas, que possibilita colapsar enquanto mantém o mesmo formato global como a versão expandida. O recipiente pode expandir através do desdobramento de uma estrutura como sanfona. O recipiente pode possuir elementos de rigidificação. Como aqui usado, "um elemento de rigidificação" significa um elemento que aumenta a rigidez de um objeto. Os elementos de rigidificação incluem, mas não são limitados a, rugas, dobras, compartimentos inflados, e regiões espessas ou reforçadas do recipiente. O recipiente pode ser formado de uma folha ou tubo enrolados, tal que a estrutura pode desenrolar ou deslindar, no tempo de plantio ou depois disso através do crescimento do tecido. Como aqui usado, "descosturamento" significa o desenrolar de um objeto enrolado sem a perda do formato global do objeto. O recipiente pode possuir uma película colapsável que pode ser expandida para formar uma tenda protetiva em torno da semente artificial. Em uma forma de realização, o recipiente da semente artificial também pode ser estirável. Como aqui usado, "estiramento" significa o ato de alongamento através da deformação em uma ou mais direções. Em uma forma de realização, o recipiente pode ser deflatável e inflável. A deflação pode ser obtida através da aplicação de pressão externa ou através da selagem a vácuo. No rompimento do selo, o recipiente pode espontaneamente reinflar. Alternativamente, pressão gasosa pode ser aplicada para causar a inflação. Em muitos casos, uma contenção pode ser usada para manter o recipiente em uma forma compacta ou colapsada antes do plantio. Esta contenção inclui, mas não é limitada a, uma faixa ou fita, uma cola ou outros prendedores. Em uma forma de realização a semente artificial possui uma

extremidade de fundo fechada, que contém umidade. Esta extremidade fechada impede a umidade de drenar no solo circundante. Furos nas laterais do recipiente são depois situados para possibilitar o crescimento da raiz, enquanto mantém a natureza fechada da extremidade do fundo da semente artificial.

0 recipiente pode compreender um pacote ou uma bolsa. O pacote pode ser completamente selado ou pode possuir aberturas múltiplas. O pacote pode ser fabricado de material biodegradável, fotodegradável, oxidativamente degradável ou hidrolíticamente degradável. O pacote pode ser flexível ou semiflexível. Semiflexível é definido como sendo capaz de deformação através de uma força externa, mas retornando a uma forma similar à sua forma original depois da remoção da força externa. O pacote pode possuir elementos de rigidificação. O pacote pode ter formas que incluem, mas não são limitadas às formas tubulares, cilíndricos, retangulares, quadradas ou redondas. /

O recipiente pode ser transparente, translúcido, semiopaco ou opaco. Os materiais transparentes incluem, mas não são limitados a policarbonato e vidro. Os materiais translúcidos incluem, mas não são limitados a polietileno e polipropileno de alta densidade. Materiais semitranslúcidos incluem, mas não são limitados a vidro gravado e plásticos revestidos. Os materiais opacos incluem, mas não são limitados a plásticos enchidos, madeira e papel.

O tamanho do recipiente pode variar. Entretanto, em uma forma de realização, o recipiente possui uma forma cilíndrica com uma espessura de parede variando de 0,01 a 0,25 cm e dimensões de 0,5 a 5 cm de diâmetro e 1 a 30 cm de comprimento.

Vários materiais podem ser usados para fabricar o recipiente, e em uma forma de realização da invenção os materiais usados para fabricar o recipiente compreendem, ou alternativamente consistem de: material celulósico, tal como, por exemplo, celulose, etil celulose, nitrocelulose, acetato de celulose, priopionato de celulose, acetato butirato de celulose; com ou sem ceras e óleos, polímeros sintéticos e naturais e plásticos tais como, por exemplo, gelatina, quitosano, zeína, poliolefinas, polipropileno, polietileno, poliolefinas, polímeros fotodegradáveis, polímeros oxidativamente degradáveis, poliestireno, copolímeros de acrílico, poli((met)acrilatos de alquila), poliésteres, poliéteres, poli(acetato de vinila) copolímeros, poli(acrilamida), poli(vinil pirrolidona), poli(vinil piridina), borracha natural, poli(óxido de etileno), poliamidas, polissacarídeos e policarbonatos, materiais porosos e não tecidos, assim como versões reticuladas destes, combinações destes, copolímeros destes e versões plastificadoras destes; plásticos biodegradáveis que incluem poli(hidróxi alcanoatos), poli(ácido láctico), poli(L-lactídeo), poli(D-lactídeo), poli(D,L-lactídeo), estereocomplexos de poli(L-lactídeo) com poli(D-lactídeo), poli(succinato de 1,2-propanodiol), e copolímeros destes e versões reticuladas destes.

Os materiais porosos incluem, mas não são limitados a, cerâmicas, não tecidos e têxteis. O recipiente também pode ser não poroso. Os materiais não porosos incluem, mas não são limitados a plástico, vidro e metal. O recipiente pode ser fabricado a partir de um material permeável. A permeabilidade inclui, mas não é limitada à permeabilidade à água, permeabilidade a gás e permeabilidade a oxigênio. Os materiais permeáveis incluem poli(álcool vinílico), poli(dimetil siloxano) e borracha natural. O recipiente pode ser fabricado a partir de materiais impermeáveis. A impermeabilidade inclui, mas não é limitada a impermeável à umidade ou materiais de barreira, impermeáveis a gás ou materiais de barreira e impermeável a oxigênio ou materiais de barreira. Os materiais impermeáveis incluem, mas não são limitados a vidro, metal e tereftalato de polietileno. Ceras e/ou óleos podem ser usados para revestir as paredes do recipiente. As ceras incluem, mas não são limitadas à cera de parafina, cera de espermacete, cera de abelhas e cera de carnaúba.

É preferido que a semente artificial aqui descrita substancialmente ou completamente degrade no ambiente de campo tal que os recipientes plantados não se acumulem no campo durante anos de plantio repetido. De modo a realizar isto, materiais biodegradáveis podem ser usados para construir o recipiente e fechamentos. Os materiais biodegradáveis tradicionais que incluem poli(ácido láctico), poli(succinato de 1,3- propanodiol), poli(succinato de propileno), poli(hidroxibutiratos), poli(caprolactona) e derivados de celulose são materiais biodegradáveis candidatos. Em uma forma de realização preferida de poli(ácido láctico), graus amorfos tendo um teor de ácido D-láctico mais alto (tipicamente > 6 % em mol de ácido D-láctico) são incorporados para fornecer taxas de degradação mais altas comparadas com poli(ácido lácticos) contendo mais cristalinos (< 6 % em mol de ácido D-láctico).

Um outro método de degradabilidade crescente enqiíanto se reduz a fragilidade envolve misturar poli(ácido láctico) ou poli(ácido láctico) amorfo com polímeros mais rapidamente degradáveis, tais como poli(caprolactona), poli(hidroxibutiratos) ou amido termoplástico (Rychter et ai. Biomacromolecules 2006, 7, 3125). Misturas podem ser formadas por qualquer método conhecido na técnica, que inclui mistura em solução, mistura por fusão, extrusão, combinação, extrusão reativa, etc. Como aqui usado, "misturas" significa misturas de dois ou mais componentes. As misturas podem ser miscíveis, imiscíveis, parcialmente miscíveis e podem consistir de domínios separados de cada componente. Em uma forma de realização da invenção, os materiais usados para produzir o recipiente podem compreender, ou alternativamente consistir de, misturas de poli(ácido láctico), poli(hidroxibutirato), poli(hidroxibutirato-co-valerato), amido, celulose, e quitosano, opcionalmente com plastificadores que incluem mas não são limitados a sorbitol, glicerol, ésteres de citrato, ésteres de ftalato e água. Os plastificadores são definidos como substâncias que reduzem a temperatura de transição vítrea de um material.

Em uma outra forma de realização da invenção, o recipiente compreende, ou alternativamente consiste de, misturas de poli(ácido láctico) com poli(succinato de 1,3-propanodiol). Tais misturas são opticamente translúcidas a translúcidas, que é vantajoso para possibilitar que a luz atinjam o tecido. Misturas de poli(ácido láctico) cristalino com poli(succinato de 1,3- propanodiol) são parcialmente miscíveis, como evidenciado pela presença de duas temperaturas de transição vítrea que mudam como uma função da composição. Adicionalmente, a claridade óptica permanece boa mesmo em concentrações altas (mesmo a 50 % em peso) de poli(succinato de 1,3- propanodiol). Adicionalmente, poli(succinato de 1,3-propanodiol) é divulgado aqui exibir degradabilidade em solo rápida, ideal para uma aplicação em

semente artificial.

Um outro método de aumentar a degradabilidade enquanto

reduz a fragilidade envolve plastificar o poli(ácido láctico) com plastificadores que incluem, mas não são limitados a derivados de citrato, ésteres de citrato, citrato de acetil butila, citrato de trietila, citrato de tributila, malonato de dietil bishidroximetila, ésteres de ftalato, glicerol, poli(etileno glicol), monolaurato de poli(etileno glicol), poli(ácido láctico) oligomérico.

Em uma outra forma de realização, o recipiente é degradável em uma taxa que é comensurada com o crescimento do tecido. Nesta forma de realização, o recipiente compreende, ou alternativamente consiste de, ρο1ΐ(γ- caprolactona) ou poli(hidroxialcanoato). Em uma forma de realização, o recipiente inteiro é fabricado de poli(y-caprolactona) ou poli(hidroxialcanoato) tal que a porção em contato com o solo degrade em uma taxa suficiente para possibilitar que as raízes escapem e proliferem no solo circundante, e subseqüentemente a porção de topo é depois empurrada para fora ou projetada pelas forças exercidas pelos brotos em crescimento.

Em uma outra forma de realização, o recipiente e/ou seu(s) fechamento(s) compreendem, ou alternativamente consistem de, materiais dissolvíveis. Em uma tal forma de realização, o recipiente e/ou seu(s) fechamento(s) compreendem, ou alternativamente consistem de, misturas de poli(álcool vinílico) com amido, fibras de celulose e glicerol, opcionalmente com reticulação com um agente adequado, que inclui mas não é limitado a hexametoximetilmelamina ou glutaraldeído. Isto fornece materiais que são rapidamente degradáveis nas condições de solo úmidas, permitindo o crescimento rápido do tecido dentro do mesmo. O amido pode ser de fontes que incluem, mas não são limitadas à batata, milho, arroz, trigo e mandioca e pode ser modificado ou não modificado. Adicionalmente os aditivos podem incluir, mas não são limitados a, poli(etileno glicol), ácido cítrico, uréia, água, sais que incluem, mas não são limitados a acetato de sódio, nitrato de potássio e nitrato de amônio, fertilizantes, ágar, goma xantana, alginato, e derivados de celulose que incluem, mas não são limitados a hidroxipropilcelulose, metilcelulose e carboximetilcelulose.

O recipiente também pode compreender plastificadores, antioxidantes, agentes de nucleação, endurecedores, corantes, enchedores, modificadores de impacto, auxiliares de processamento, estabilizantes, e retardantes de chama. Os antioxidantes incluem, mas não são limitados a hidroquinona, Irganox® 1010, e vitamina E. Os agentes de nucleação incluem, mas não são limitados a carbonato de cálcio, ciclodextrina e ácido fenilfosfônico zinco. Os endurecedores incluem, mas não são limitados a copolímeros de bloco estirênicos, Biomax® Forte, e óleos. Os corantes incluem, mas não são limitados a pigmentos e corantes. Os enchedores incluem, mas não são limitados a amido, mica e sílica. Os modificadores de impacto incluem, mas não são limitados a Paraloid® BPM-520, Biostrength® 280, e borracha de butadieno. Os auxiliares de processamento incluem, mas não são limitados a erucamida e estearil erucamida. Os estabilizantes incluem, mas não são limitados a estabilizantes de UV, estabilizantes de luz de amina impedida, antiozonantes e compostos de organoenxofre. Os retardantes de chama incluem, mas não são limitados a tri-idróxido de alumínio (ΑΤΗ), hidróxido de magnésio (MDH), ésteres de fosfonato, fosfato de trifenila, ésteres de fosfato, pirofosfato de amônio e polifosfato de melamina.

Quando o recipiente é construído de material celulósico, o mesmo pode opcionalmente conter argila, alume, ceras, aglutinantes, colas, tensoativos e barreiras tais como camadas de plástico ou metalizadas. O material celulósico pode ser poroso e pode possuir camadas múltiplas que compreendem, ou alternativamente consistem de, uma variedade de papeis que incluem, mas não são limitados a papel kraft, papel de carta, papel reciclado, papel de jornal reciclado, papel de construção, aglomerado, matéria prima para copos, papel de copiadora, papel de cera, e papeis revestidos.

Na invenção presentemente divulgada, as sementes artificiais

podem ser produzidas usando um recipiente de papel ou um plástico. O papel ou plástico, a serem usados para a construção do recipiente, tem as propriedades que seguem para serem adequados para tal aplicação: eles não amoleçam excessivamente de modo imediato pela fonte de nutriente aquoso contida dentro deles. Os recipientes de papel podem ser porosos por natureza, e podem ser degradáveis durante o curso de pelo menos 5 anos no solo. Os recipientes plásticos podem ser porosos ou não porosos, e podem ser degradáveis ou não no solo. O material plástico é de material termoplástico ou termofixo.

Em uma forma de realização, papel encerado pode ser usado

para preparar os recipientes de papel. Neste caso o tamanho do recipiente de papel encerado pode ser em torno de 1,19 cm no diâmetro e de 4 a 6 cm no comprimento.

Os recipientes cilíndricos podem ter extremidades planas no topo e no fundo. Em uma forma de realização, a extremidade de fundo do recipiente é provida de ameias (ver a Figura 2). Como aqui usado, "ameiação" significa a criação de uma borda irregular por intermédio do uso de abas de material que se estendem da borda e indentações na borda. O tamanho da ameiação pode ser de 0,65 cm a cerca de 2 cm no comprimento, com 2 a 6 abas. Em uma outra forma de realização, a ameiação pode ser de 0,8 cm a cerca de 1,2 cm no comprimento, com 3 a 4 abas.

As sementes artificiais também podem compreender uma ou mais de uma fonte de nutriente (Figura 1, (5)), objetos sólidos tais como pedaços de algodão (Figura 1, (6)), inseticidas, fungicidas, nematicidas, compostos antimicrobianos, antibióticos, biocidas, herbicidas, reguladores ou estimuladores do crescimento de planta, micróbios, moluscicidas, miticidas, acaricidas, repelente(s) de pássaro, repelente(s) de inseto, hormônios de planta, repelente(s) de roedor, fertilizantes, hidrogéis, superabsorventes, enchedores, solo, corretores de solo e água. Biocidas incluem, mas não são limitados a, hipoclorito, dicloro-s-triazinotriona de sódio, Plant Preservative Mixture®, obtido da Plant Cell Technology e tricloro-s-triazinotriona. Os moluscicidas incluem, mas não são limitados a, metaldeído ou metiocarb. Os acaricidas incluem, mas não são limitados a, ivermectina ou permetrina. Um repelente de pássaro é definido como uma substância que repele pássaros. Os repelentes de pássaro incluem, mas não são limitados a, antranilato de metila, metiocarb, clorpirifos e propiconazol. Um repelente de roedor é definido como uma substância que repele roedores. Os repelentes de roedor incluem, mas não são limitados a, tiram e metiocarb. Os repelentes de inseto incluem, mas não são limitados a, N,N-dietil-m-toluamida, óleos essenciais e óleo de citronela. Os miticidas incluem, mas não são limitados a, abamectin e clorfenapir. Os hormônios de planta incluem, mas não são limitados ao ácido abscísico, auxinas, citocininas, etileno e giberelinas. Os reguladores do crescimento de plantas incluem, mas não são limitados a, paclobutirazol, etefon, e ancimidol. Como aqui usado, "superabsorventes" significa absorventes que absorvem água ou soluções aquosas que resultam em um gel hidratado tal que o peso do gel é 30 vezes ou maior o peso do superabsorvente seco. Os superabsorventes incluem, mas não são limitados a, polímeros superabsorventes, poli(acrilato de sódio) reticulado, poli(ácido acrílico) reticulado, sais de poli(ácido acrílico) reticulados, amido modificado com ácido acrílico, copolímeros reticulados do ácido acrílico com acrilato de poli(etileno glicol), metacrilato de poli(etileno glicol), diacrilato de poli(etileno glicol), acrilamida, acetato de vinila, sais do ácido acrílico, bisacrilamida, N-vinil pirrolidona, ésteres de acrilato, ésteres de metacrilato, monômeros estirênicos, monômeros de dieno e reticuladores. O superabsorvente pode estar presente na semente artificial em um estado seco ou intumescido. O mesmo pode ser intumescido com água ou soluções aquosas, que incluem, mas não são limitados a soluções nutrientes, soluções fertilizantes e soluções antimicrobianas. O superabsorvente também pode ser misturado com o solo ou outros componentes do meio nutriente. Em uma forma de realização, o superabsorvente pode estar presente em um compartimento separado da semente. O compartimento pode ser conectado ou não com o compartimento contendo o tecido vegetal regenerável. O compartimento pode ser separado por uma tela ou malha do compartimento contendo o tecido. Os micróbios incluem, mas não são limitados a micróbios benéficos, bactérias que fixam nitrogênio, rizóbio, fungos, azotobacter, microrriza, micróbios que liberam celulases, e micróbios que participam na degradação do recipiente semente artificial. O solo adequado para a aplicação dentro do recipiente onde o

tecido vegetal regenerável deva ser inserido para crescer deve ser capaz de fornecer aeração, água, nutrição, e ancoragem para o tecido vegetal regenerável em crescimento. Vários tipos de solo que podem ser usados no recipiente incluem óleos sintéticos como MetroMix® e vermiculita. O mesmo também pode incluir solos naturais tais como areia, silte, greda, turfa, e misturas destes solos. O solo adequado pode estar presente tal que o recipiente esteja no máximo 99 % cheio.

A semente artificial da invenção divulgada compreende espaço aéreo (2) dentro do recipiente. A semente artificial também pode conter fechamentos (Figura 1, (1)). Os fechamentos são definidos como tampas, cobertas ou objetos que cobrem as aberturas. Em uma forma de realização o fechamento pode ser separável do recipiente. O tecido vegetal regenerável pode ser capaz de levantar ou remover o fechamento separável durante o seu crescimento. Os fechamentos separáveis incluem, mas não são limitados a cobertas, insertos, películas planas, cobertas abobadadas e cobertas cônica. O fechamento separável pode ser ligado ao recipiente usando um adesivo ou material degradável. O adesivo pode ser solúvel em água ou fluível em uma faixa de temperaturas de cerca de 1 a 50°C. O material degradável pode ser hidrolíticamente degradável, oxidativamente degradável, biodegradável, compostável ou fotodegradável. As cobertas ou tampas também podem ser ligadas por meios físicos simples que incluem, mas não são limitados à inserção ou plissagem.

Como aqui usado, "fonte de nutriente" significa nutrientes que podem ajudar a sustentar e fornecer o crescimento da planta a partir do tecido regenerável. Os nutrientes adequados incluem, mas não são limitados a, um ou mais de água, solo, fibra de coco, vermiculita, um meio de crescimento artificial, ágar, um regulador do crescimento de planta, um hormônio de planta, um polímero superabsorvente, macronutrientes, micronutrientes, fertilizantes, sais inorgânicos (que inclui, mas não são limitados aos sais de nitrato, amônio, fosfato, potássio e cálcio), vitaminas, açúcares e outros carboidratos, proteínas, lipídeos, fórmula nutriente de Murashige e Skoog (MS), fórmula nutriente de Hoagland, meio B-5 de Gamborg, fórmula nutriente e solos nativos e sintéticos, turfa e vinhaça, e combinações destes. Os macronutrientes incluem, mas não são limitados a nitrato, fosfato e potássio. Os micronutrientes incluem, mas não são limitados a cloreto de cobalto, ácido bórico, sulfato ferroso e sulfato de manganês. A fonte de nutriente também pode conter polissacarídeos extracelulares tais como aqueles descritos em Mager, D. M. e Thomas, A. D. Journal of Arid Enviroments, 2011, 75, 2, 91-7.

A fonte de nutriente também pode conter hormônios e reguladores do crescimento de planta que incluem, mas não são limitados a, ácido giberélico, ácido indol acético, ácido naftaleno acético (NAA)5 etefon, 6-benzilamino purina (6-ABP), ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D), paclobutrazol, ancimidol e ácido abcíssico.

Os nutrientes podem estar presentes em uma solução aquosa ou solução em gel aquoso, tal como aqueles bem conhecidos na técnica da propagação de planta, que incluem, mas não são limitados a géis naturais e sintéticos que incluem: ágar, agarose, goma gelan, goma guar, goma arábica, / Gelrite®, Phytagel®, polímeros superabsorventes, carragenina, amilose, carboximetil-celulose, dextrano, goma de alfarrobeira, alginato, goma xantana, gelatina, pectina, amidos, zeína, poliacrilamida, ácido poliacrílico, poli(etileno glicol) e versões reticuladas destes. Em uma forma de realização, os nutrientes podem estar

presentes em um gel de silicato. Um tal gel de silicato pode ser formado pela neutralização de uma solução de silicato de sódio ou potássio com ácido. Em uma forma de realização, as etapas de lavagem ou embebeção subsequentes podem ser usadas para remover os sais em excesso. Opcionalmente, o gel pode ser depois infundido com nutrientes através da embebeção ou outros processos. Alternativamente, o gel de silicato pode ser formado de ácido silícico, ou de outros precursores, que incluem, mas não são limitados a alcoxissilanos, haletos de silila, ou silazanos.

Quando o recipiente compreende uma fonte de nutriente, o tecido vegetal regenerável dentro do recipiente é parcialmente embutido ou em contato com a fonte de nutriente e pode ser parcialmente exposto para o espaço aéreo dentro do recipiente. O termo "parcialmente exposto a um espaço aéreo", como aqui usado, refere-se a um tecido vegetal regenerável que está em contato com ou foi parcialmente embutido (isto é, de 0 a 90 % do tecido submergido) na fonte de nutriente presente no recipiente, com o resto exposto para o espaço aéreo dentro do recipiente. O tecido vegetal regenerável pode ser parcial ou totalmente circundado pela fonte de nutriente. O tecido vegetal regenerável também pode ser colocado no topo da fonte de nutriente. Como aqui usado, "espaço aéreo" significa um vazio no recipiente que é esvaziado de qualquer material sólido ou líquido, e enchido pelos gases atmosféricos tais como ar, por exemplo. Um espaço aéreo, como definido aqui não inclui os vazios coletivos em um material poroso ou particulado.

É vantajoso para a função da semente artificial que o espaço aéreo seja livre de obstruções que limitam o crescimento do tecido vegetal regeríerável com exceção dos limites da parede do recipiente. Como aqui usado, "um espaço aéreo não obstruído" significa um espaço aéreo que é contínuo e não interrompido entre qualquer parte do tecido vegetal regenerável e qualquer região do recipiente. Como aqui usado, "afunilada" significa estreitando ou tornando-se progressivamente mais estreita ao longo de uma dimensão.

Para os propósitos da invenção divulgada, os tecidos vegetais regeneráveis podem ser preparados usando vários métodos bem conhecidos na técnica relevante, tal como o método de cultura de tecido de tecido meristemático descrito na Publicação Internacional Número W02011/085446, a divulgação da qual é aqui incorporada por referência. Outros métodos possíveis incluem o uso de cortes de planta, embriões de sementes naturais ou embriões somáticos obtidos através da embriogênese somática. Em uma forma de realização meristemas podem ser excisados para formar explantes e cultivadas para aumentar a massa de tecido. O termo "explante" como aqui usado, refere-se a tecidos que foram excisados de uma planta a ser usada em cultura de tecido vegetal.

O tecido vegetal regenerável da invenção também pode ser geneticamente modificado. Esta modificação genética inclui, mas não é limitada a, resistência a herbicida, resistência a doença, tolerância à seca, e resistência a inseto. As plantas geneticamente modificadas (também conhecidas como transgênicas) podem compreender um único traço transgênico ou uma pilha de um ou mais polinucleotídeos de transgene com um ou mais polinucleotídeos adicionais que resultam na produção ou supressão de seqüências de polipeptídeo múltiplas. As plantas transgênicas que compreendem pilhas de seqüências de polinucleotídeo podem ser obtidas por cada um ou ambos dos métodos de cruzamento tradicionais ou através de métodos de engenheiramento genético. Estes métodos incluem, mas não são limitados a, cruzamento de linhagens individuais cada uma das quais compreende umr polinucleotídeo de interesse, que transformam uma planta transgênica que compreende um gene com um gene subsequente e cotransformação de genes em uma única célula de planta.

Como aqui usado, o termo "empilhado" inclui ter os traços múltiplos presentes na mesma planta (isto é, ambos os traços são incorporados no genoma nuclear, um traço é incorporado dentro do genoma nuclear e um traço é incorporado no genoma de um plastídeo ou ambos os traços são incorporados no genoma de um plastídeo). Em um exemplo não limitante, "traços empilhados" compreendem uma pilha molecular onde as seqüências são fisicamente adjacentes entre si. Um traço, como aqui usado, refere-se ao fenótipo derivado de uma seqüência particular ou grupos de seqüências. A cotransformação de genes pode ser realizada usando vetores de transformação única que compreendem genes múltiplos ou genes carregados separadamente em vetores múltiplos. Se as seqüências são empilhadas pela transformação genética das plantas, as seqüências de polinucleotídeo de interesse podem ser combinadas em qualquer tempo e em qualquer ordem. Os traços podem ser introduzidos simultaneamente em um protocolo de cotransformação com os polinucleotídeos de interesse fornecidos por qualquer combinação de cassetes de transformação. Por exemplo, se duas seqüências serão introduzidas, as duas seqüências podem estar contidas em cassetes de transformação separadas (trans) ou contidas no mesmo cassete de transformação (eis). A expressão das seqüências podem ser direcionadas pelo mesmo promotor ou pelos promotores diferentes. Em certos casos, pode ser desejável introduzir um cassete de transformação que suprimirá a expressão do polinucleotídeo de interesse. Isto pode ser combinado com qualquer combinação de outros cassetes de supressão ou cassetes de superexpressão para gerar a combinação desejada de traços na planta. É reconhecido ainda que as seqüências de polinucleotídeo podem ser empilhadas em um local genômico desejado usando um sistema de recombinação específico de sítio. Ver, por exemplo, Publicações Internacionais Números WO 1999/25821, WO 1999/25854, WO 1999/25840, WO 1999/25855 e WO 1999/25853, as divulgações de cada uma das quais são aqui incorporadas por referência.

Em algumas formas de realização os polinucleotídeos que codificam os polipeptídeos, sozinhos ou empilhados com um ou mais traços de resistência a inseto adicionais podem ser empilhados com um ou mais traços de entrada adicionais (por exemplo, resistência a herbicida, resistência fungica, resistência a vírus, tolerância ao estresse, resistência às doenças, esterilidade masculina, dureza do talo, e os semelhantes) ou traços de entrada (por exemplo, rendimento aumentado, amidos modificados, perfil de óleo melhorado, aminoácidos balanceados, lisina alta ou metionina, digestibilidade aumentada, qualidade de fibra melhorada, resistência à seca, e os semelhantes). Assim, as formas de realização de polinucleotídeo podem ser usadas para fornecer um pacote agronômico completo de qualidade de safra melhorada com a capacidade para controlar eficazmente e com custo flexível qualquer número de pragas agronômicas.

Os transgenes úteis para preparar plantas transgênicas incluem, mas não são limitados aos que seguem:

1. Transgenes Que Confere Resistência aos Insetos ou

Doença:

(A) Genes de resistência a doença de planta. As defesas da planta são freqüentemente ativadas pela interação específica entre o produto de um gene de resistência a doença (R) na planta e o produto de um gene de avirulência (Avr) correspondente no patógeno. Uma variedade de planta pode ser transformada com gene de resistência clonado para engendrar plantas que são resistentes às cepas de patógeno específicas. Ver, por exemplo, Jones, et al., (1994) Science 266: 789 (clonagem do gene Cf-9 do tomate quanto à resistência a Cladosporium fulva); Martin, et al., (1993) Science 262: 1432 (gene de Pto do tomate quanto à resistência a Pseudomonas syringae pv. tomato codifica uma cinase de proteína); Mindrinos, et al., (1994) Cell 78: 1089 (gene RSP2 de Arabidopsis quanto à resistência a Pseudomonas syringae), McDobem e Woffenden, (2003) Trends Biotechnol. 21(4): 178-83 e Toyoda, et al., (2002) Transgenic Res. 11(6): 567-82. Uma planta resistente a uma doença é uma que é mais resistente a um patógeno quando comparada com a planta do tipo selvagem.

(B) Genes que codificam uma proteína de Bacillus thuringiensis, um derivado desta ou um polipeptídeo sintético modelado a partir da mesma. Ver, por exemplo, Geiser, et al., (1986) Gene 48: 109, que divulga a clonagem e seqüência de nucleotídeo de um gene da delta- endotoxina Bt. Além disso, as moléculas de DNA que codificam os genes da delta-endotoxina podem ser adquiridas da American Type Culture Colection (Rockville, Md.), por exemplo, sob os Números de Acesso da ATCC 40098, 67136, 31995 e 31998. Outros exemplos não limitantes de transgenes de Bacillus thuringiensis que são geneticamente engendrados são dados nas patentes e pedidos de patente que seguem e são por meio deste incorporadas por referência para este propósito: Os Números de Patente US 5.188.960, 5.689.052, 5.880.275, 5.986.177, 6.023.013, 6.060.594, 6.063.597, 6.077.824, 6.620.988, 6.642.030, 6.713.259, 6.893.826, 7.105.332, 7.179.965, 7.208.474, 7.227.056, 7.288.643, 7.323.556, 7.329.736, 7.449.552, 7.468.278, 7.510.878, 7.521.235, 7.544.862, 7.605.304, 7.696.412, 7.629.504, 7.705.216, 7.772.465, 7.790.846, 7.858.849 e WO 1991/14778, WO 1999/31248, WO 2001/12731, WO 1999/24581 e WO 1997/40162, a divulgação de cada uma das quais é aqui incorporada por referência. (C) Um polinucleotídeo que codifica um hormônio específico de inseto ou feromônio tal como um ecdisteroide e hormônio juvenil, uma variante destes, um mimético fundamentado nestes ou um antagonista ou agonista destes. Ver, por exemplo, a divulgação por Hammock, et al., (1990) Nature 344: 458, da expressão em baculovírus da esterase de hormônio juvenil clonada, um inativador do hormônio juvenik

(D) Um polinucleotídeo que codifica um peptídeo específico de inseto que, na expressão, rompe a fisiologia da praga afetada. Por exemplo, ver a divulgação de Regan, (1994) J. BioL Chem. 269: 9 (a clonagem de expressão produz o DNA que codifica o receptor do hormônio diurético de inseto); Pratt, et al., (1989) Biochem. Biophys. Res. Comm. 163: 1243 (uma alostatina é identificada em Diploptera puntata); Chattopadhyay, et al., (2004) Criticai Reviews in Microbiology 30(1): 33-54; Zjawiony, (2004) J Nat Prod 67(2): 300-310; Carlini e Grossi-de-Sa, (2002) Toxicon 40(11): 1515-1539; Ussuf, et al., (2001) Curr Sei. 80(7): 847-853 e Vasconcelos e Oliveira, (2004) Toxicon 44(4): 385-403. Ver também, a Patente US Número 5.266.317 concedida a Tomalski, et al, que divulga genes que codificam toxinas específicas de inseto.

(E) Um polinucleotídeo que codifica uma enzima responsável por um hiperacúmulo de um monoterpeno, um sesquiterpeno, um esteroide, ácido hidroxâmico, um derivado de fenilpropanoide ou uma outra molécula que não de proteína com atividade inseticida.

(F) Um polinucleotídeo que codifica uma enzima envolvida na modificação, que inclui a modificação pós-traducional, de uma molécula biologicamente ativa; por exemplo, uma enzima glicolítica, uma enzima proteolítica, uma enzima lipolítica, uma nuclease, uma ciclase, uma transaminase, uma esterase, uma hidrolase, uma fosfatase, uma cinase, uma fosforilase, uma polimerase, uma elastase, uma quitinase e uma glicanase, sejam naturais ou sintéticas. Ver, Pedido PCT WO 1993/02197 no nome de Scott, et al, que divulga a seqüência de nucleotídeo de um gene da calase. As moléculas de DNA que contêm as seqüências que codificam a quitinase podem ser obtidas, por exemplo, da ATCC sob os Números de Acesso 39637 e 67152. Ver também, Kramer, et al, (1993) Insect Biochem. Molec. Biol. 23: 691, que divulgam a seqüência de nucleotídeo de um cDNA que codifica a quitinase do ancilóstomo do tabaco e Kawalleck, et al, (1993) Plant Molec. Biol. 21: 673, que fornecem a seqüência de nucleotídeo do gene da poliubiquitina ubi4-2 da salsa, e Patente US Números 6.563.020; 7.145.060 e 7.087.810.

(G) Um polinucleotídeo que codifica uma molécula que

estimula a tradução de sinal. Por exemplo, ver a divulgação por Botella, et al, (1994) Plant Molec. Biol. 24: 757, das seqüências de nucleotídeo para os clones de cDNA da calmodulina do feijão mungo verde, e Griess, et al, (1994) Plant Physiol. 104: 1467, que fornecem a seqüência de nucleotídeo de

um clone de cDNA de calmodulina do milho.

(H) Um polinucleotídeo que codifica um peptídeo de momento hidrofóbico. Ver, o pedido PCT WO 1995/16776 e Patente US Número 5.580.852 (divulgação de peptídeos derivados de Taquiplesina que inibem patógenos de planta füngicos) e Pedido PCT WO 1995/18855 e Patente US

Número 5.607.914 (divulgam peptídeos antimicrobianos sintéticos que conferem resistência a doença).

(I) Um polinucleotídeo que codifica uma permease de membrana, um fomador de canal ou um bloqueador de canal. Por exemplo, ver a divulgação por Jaynes, et al, (1993) Planta Sei. 89: 43, da expressão

heteróloga de um análogo de peptídeo lítico de cesafrain-beta para tornar plantas de tabaco transgênicas resistentes a Pseudomonas solanacearum.

(J) Um gene que codifica uma proteína invasiva viral ou uma toxina complexa derivada desta. Por exemplo, o acúmulo das proteínas de revestimento viral em células de planta transformadas comunica resistência à infecção viral e/ou desenvolvimento de doença efetuada pelo vírus a partir do qual o gene da proteína de revestimento é derivada, assim como pelos vírus relacionados. Ver, Beachy, et al, (1990) Ann. Rev. Phytopathol. 28: 451. A resistência mediada pela proteína de revestimento foi conferida nas plantas transformadas contra o vírus mosaico da alfafa, vírus mosaico do pepino, vírus da listra do tabaco, vírus X da batata, vírus Y da batata, vírus cáustico do tabaco, vírus rattle do tabaco e vírus mosaico do tabaco. Id.

(K) Um gene que codifica um anticorpo específico de inseto ou uma imunotoxina derivada deste. Assim, um anticorpo alvejado em uma função metabólica crítica no intestino do inseto inativaria uma enzima afetada, matando o inseto. Cf. Taylor, et al., Abstract #497, SEVENTH INT'L SYMPOSIUM ON MOLECULAR PLANT-MICROBE INTERACTIONS (Edimburgo, Escócia, 1994) (inativação enzimática em tabaco transgênico por intermédio da produção de fragmentos de anticorpo de cadeia única).

(L) Um gene que codifica um anticorpo específico de vírus. Ver, por exemplo, Tavladoraki, et al, (1993) Nature 366: 469, que mostram que as plantas transgênicas que expressam genes de anticorpo recombinante são protegidas do ataque por vírus. (M) Um polinucleotídeo que codifica uma proteína

desenvolvimentalmente atraente produzida na natureza por um patógeno ou um parasita. Assim, as endo alfa-l,4-D-poligalacturonases fungicas facilitam a colonização fungica e a liberação de nutriente da planta pela solubilização da homo-alfa-l,4-D-galacturonase da parede celular da planta. Ver, Lamb, et al., (1992) Bio/Technology 10: 1436. A clonagem e caracterização de um gene que codifica uma proteína que inibe a endopoligalacturonase do feijão é descrita por Toubart, et al, (1992) Plant J. 2: 367.

(N) Um polinucleotídeo que codifica uma proteína desenvolvimentalmente atraente produzida na natureza por uma planta. Por exemplo, Logemann, et al., (1992) Bio/Technology 10: 305, têm mostrado que as plantas transgênicas que expressam o gene que inativa o ribossoma da cevada têm uma resistência aumentada à doença fungica.

(O) Genes envolvidos na Resposta à Resistência Adquirida Sistêmica (SAR) e/ou os genes relacionados com a patogênese. Briggs, (1995) Current Biology 5(2), Pieterse e Van Loon, (2004) Curr. Opin. Plant Bio. 7(4): 456-64 e Somssich, (2003) Cell 113(7): 815-6.

(P) Os genes antifüngicos (Milhoelissen e Melchers, (1993) PL Physiol. 101: 709-712 e Parijs, et al., (1991) Planta 183: 258-264 e Bushnell, et al., (1998) Can. J. of Plant Path. 20(2): 137-149. Também ver, os Pedidos de Patente US Serial Números 09/950.933, 11/619.645, 11/657.710, 11/748.994, 11/774,121 e Patente US Números 6.891.085 e 7.306.946. as cinases equivalentes ao Receptor de LysM para a percepção de fragmentos de quitina como uma primeira etapa na resposta de defesa de planta contra patógenos fungicos (US 2012/0110696).

(Q) Genes da destoxificação, tais como para fumonisina, beauvericina, moniliformina e zearalenona e seus derivados estruturalmente relacionados. Por exemplo, ver, as Patentes US Números 5.716.820, 5.792.931, 5.798.255, 5.846.812, 6.083.736, 6.538.177, 6.388.171 e 6.812.380.

(R) Um polinucleotídeo que codifica uma Cistatina e inibidores da proteinase de cisteína. Ver, a Patente US Número 7.205.453.

(S) Genes da defensina. Ver, a WO 2003/000863 e Patentes US Números 6.911.577, 6.855.865, 6.777.592 e 7.238.781. (T) Genes que conferem resistência aos nematoides. Ver, por

exemplo, o Pedido PCT WO 1996/30517; Pedido PCT WO 1993/19181, WO 2003/033651 e Urwin, et al., (1998) Planta 204: 472-479, Williamson, (1999) Curr Opin Plant Bio. 2(4): 327-31; Patentes US Números 6.284.948 e 7.301.069 e genes miR164 (WO 2012/058266). (U) Genes que conferem resistência ao Podridão de Raiz de Phytophthora, tal como o Rps 1, Rps 1-a, Rps 1-b, Rps 1-c, Rps 1-d, Rps 1-e, Rps 1-k, Rps 2, Rps 3-a, Rps 3-b, Rps 3-c, Rps 4, Rps 5, Rps 6, Rps 7 e outros genes Rps. Ver, por exemplo, Shoemaker, et al, Phytophthora Root Rot Resistence Gene Mapping in Soybean, Plant Genome IV Conference, San Diego5 Calif. (1995).

(V) Genes que conferem resistência à Podridão de Haste Marrom, tal como descrita na Patente US Número 5.689.035 e incorporada por referência para este propósito.

(W) Genes que conferem resistência a Colletotrichum, tal como descritos na Publicação do Pedido de Patente US 2009/0035765 e incorporada por referência para este propósito. Isto inclui o local Rcg que pode ser utilizado como uma conversão de local único.

2. Transgenes que Conferem Resistência a um Herbicida:

(A) Um polinucleotídeo que codifica resistência a um herbicida que inibe o ponto de crescimento ou meristema, tal como uma imidazolinona ou uma sulfonilureia. Os genes exemplares nesta categoria codificam uma enzima ALS e AHAS mutante como descrito, por exemplo, por Lee, et al., (1988) EMBO J. 7: 1241 e Miki, et al, (1990) Theor. Appl. Genet. 80: 449, respectivamente. Ver também, as Patentes US Números 5.605.011, 5.013.659, 5.141.870, 5.767.361, 5.731.180, 5.304.732, 4.761.373, 5.331.107, 5.928.937 e 5.378.824; Pedido de Patente US Serial Número 11/683.737 e Publicação Internacional WO 1996/33270.

(B) Um polinucleotídeo que codifica uma proteína para a resistência ao Glifosato (resistência comunicada pela 5-enolpiruvil-3- fosfiquimato sintase (EPSP) mutante e genes aroA, respectivamente) e outros compostos de fosfono tais como glifosinato (genes da fosfinotricina acetil transferase (PAT) e fosfinotricina acetil transferase (bar) de Streptomyces hygroscopicus), e ácidos piridinóxi ou fenóxi propiônicos e cicloexonas (genes que codificam o inibidor da ACCase). Ver, por exemplo, a Patente US Número 4.940.835 concedida a Shah, et al., que divulga a seqüência de nucleotídeo de uma forma de EPSPS que pode conferir resistência a glifosato. Patente US Número 5.627.061 concedida a Barry, et al., também descreve genes que codificam enzimas de EPSPS. Ver também, as Patentes US Números 6.566.587, 6.338.961, 6.248.876 BI, 6.040.497, 5.804.425, 5.633.435, 5.145.783, 4.971.908, 5.312.910, 5.188.642, 5.094.945. 4.940.835, 5.866.775, 6.225.114 Bl5 6.130.366, 5.310.667, 4.535.060, 4.769.061, 5.633.448, 5.510.471, Re. 36.449, RE 37.287 E e 5.491.288 e Publicações Internacionais EP 1173580; WO 2001/66704; EP 1173581 e EP 1173582, que são aqui incorporadas por referência para este propósito. A resistência ao glifosato também é comunicada às plantas que expressam um gene que codifica uma enzima da glifosato óxido-redutase como descrito mais totalmente nas Patentes US Números 5.776.760 e 5.463.175, que são aqui incorporadas por referência para este propósito. Além disso, a resistência ao glifosato pode ser comunicada às plantas pela super expressão de genes que codificam a glifosato N-acetiltransferase. Ver, por exemplo, as Patentes US Números 7.462.481; 7.405.074 e Publicação do Pedido de Patente US Número US 2008/0234130. Uma molécula de DNA que codifica um gene aroA mutante pode ser obtido sob o Número de Acesso ATCC 39256, e a seqüência de nucleotídeo do gene mutante é divulgado na Patente US Número 4.769.061 concedida a Cornai. Pedido EP Número 0 333 033 concedido a Kumada, et al., e Patente US Número 4.975.374 concedida a Goodman, et al., divulgam seqüências de nucleotídeo de genes da glutamina sintetase que conferem resistência a herbicidas tais como L-fosfinotricina. A seqüência de nucleotídeo de um gene da fosfinotricina-acetil-transferase é fornecido nos Pedidos EP Números 0 242 246 e 0 242 236 condedidos a Leemans, et ai; De Greef, et al., (1989) Bio/Technology 7: 61, descrevem a produção de plantas transgênicas que expressam genes bar quiméricos que codificam a atividade da fosfinotricina acetil transferase. Ver também, as Patentes US Números 5.969.213, 5.489.520, 5.550.318, 5.874.265, 5.919.675, 5.561.236, 5.648.477, 5.646.024, 6.177.616 Bl e 5.879.903, que são aqui incorporados por referência para este propósito. Os genes exemplares que conferem resistência aos ácidos fenóxi propriônicos e cicloexonas, tais como setoxidim e haloxifop, são os genes Accl-SI, Accl-S2 e Accl-S3 descritos por Marshall, et al., (1992) Theor.Appl. Genet. 83: 435.

(C) Um polinucleotídeo que codifica uma proteína para a resistência ao herbicida que inibe a fotossíntese, tal como uma triazina (genes

psbA e gs+) e uma benzonitrila (gene da nitrilase). Przibilla, et al., (1991) Plant Cell 3: 169, descrevem a transformação de Chlamydomonas com plasmídeos que codificam genes psbA mutantes. As seqüências de nucleotídeo para os genes da nitrilase são divulgados na Patente US Número 4.810.648 concedida a Stalker e moléculas de DNA contendo estes genes são disponíveis sob os Números de Acesso ATCC 53435, 67441 e 67442. A clonagem e expressão de DNA que codifica uma glutationa S-transferase é descrita por Hayes, et al., (1992) Biochem. J. 285: 173.

(D) Um polinucleotídeo que codifica uma proteína para a resistência à Acetoidróxi ácido sintase, que foi descoberto fabricar plantas que

expressam esta enzima resistente a tipos múltiplos de herbicidas, foi introduzido em uma variedade de plantas (ver, por exemplo, Hattori, et al. , (1995) Mol Gen Genet. 246: 419). Outros genes que conferem resistência aos herbicidas incluem: um gene que codifica uma proteína quimérica de citocromo de rato P4507A1 e NADPH-citocromo de levedura P450 oxidorredutase (Shiota, et al., (1994) Plant Physiol 106: 17), genes para a glutationa redutase e superóxido dismutase (Aono, et al., (1995) Plant Cell Physiol 36: 1687) e genes para várias fosfotransferases (Datta, et al., (1992) Plant Mol Biol 20: 619).

(E) Um polinucleotídeo que codifica resistência a um herbicida que alveja a Protoporfirinogênio oxidase (protox) que é necessária para a produção de clorofila. A enzima protox serve como o alvo para uma variedade de compostos herbicidas. Estes herbicidas também inibem o crescimento de todas as espécies diferentes de plantas presentes, causando a sua destruição total. O desenvolvimento de plantas contendo atividade de protox alterada que são resistentes a estes herbicidas é descrito nas Patentes US Números 6.288.306 BI, 6.282.837 Bl e 5.767.373 e Publicação Internacional WO 2001/12825.

(F) O gene aad-1 (originalmente de Sphingobium herbicidovorans) codifica a proteína da ariloxialcanoato dioxigenase (AAD-

1). O traço confere tolerância aos herbicidas ácido 2,4-diclorofenoxiacético e ariloxifenoxipropionato (habitualmente aludidos como herbicidas "fop" tal como quizalofop). O gene aad-1, por si só, para a tolerância a herbicida em plantas foi primeiro divulgado na WO 2005/107437 (ver também, a US 2009/0093366). O gene aad-12, derivado de Delftia acidovorans, que codifica a proteína da ariloxialcanoato dioxigenase (AAD-12) que confere tolerância aos herbicidas de ácido 2,4-diclorofenoxiacético e piridiloxiacetato pela desativação de diversos herbicidas com uma porção de ariloxialcanoato, que inclui fenoxi auxina (por exemplo, 2,4-D, MCPA), assim como piridilóxi auxinas (por exemplo, fluroxipir, triclopir).

(G) Um polinucleotídeo que codifica um herbicida resistente a dicamba mono-oxigenase divulgado na Publicação do Pedido de Patente US 2003/0135879 para comunicar tolerância a dicamba;

(H) Uma molécula de polinucleotídeo que codifica a bromoxinil nitrilase (Bxn) divulgada na Patente US Número 4.810.648 para

comunicar tolerância a bromoxinila;

(I) Uma molécula de polinucleotídeo que codifica fitoeno (crtl) descrita em Misawa, et al., (1993) Plant J. 4: 833-840 e em Misawa, et al., (1994) Plant J. 6: 481-489 quanto à tolerância a norflurazon. 3. Transgenes que conferem ou Contribuem para uma Característica de Grão Alterada

(A) Ácidos graxos alterados, por exemplo, pela

(1) Infrarregulagem de estearoil-ACP para aumentar o teor de ácido esteárico da planta. Ver, Knultzon, et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sei.

USA 89: 2624 e WO 1999/64579 (Genes para Alterar os Perfis de Lipídeo no Milho).

(2) Elevação de ácido oleico por intermédio da modificação do gene FAD-2 e/ou diminuição do ácido linolênico por intermédio da

modificação do gene FAD-3 (ver, Patentes US Números 6.063.947, 6.323.392, 6.372.965 e WO 1993/11245).

(3) Alterar o teor de ácido linolênico ou linoleico conjugado,

tal como na WO 2001/12800.

(4) Alterar LEC1, AGP, Dekl, Superai 1, mil ps, vários genes Ipa tal como Ipal, Ipa3, hpt ou hggt. Por exemplo, ver, a WO 2002/42424,

WO 1998/22604, WO 2003/011015, WO 2002/057439, WO 2003/011015, Patente US Números 6.423.886. 6.197.561. 6.825.397 e Publicação do pedido de Patente US Números US 2003/0079247, US 2003/0204870 e Rivera- Madrid, et al, (1995) Proe. Natl. Acad. Sei. 92: 5620-5624. (5) Genes que codificam a delta-8 desaturase para fabricar

ácidos graxos poli-insaturados de cadeia longa (Patente US Número 8.058.571), delta-9 desaturase para diminuir gorduras saturadas (Patente US Número 8.063.269), A6-desaturase de Prímula para melhorar os perfis de

ácido graxo ômega-3. (6) ácidos nucleicos isolados e proteínas associadas com a

regulagem do metabolismo de lipídeo e açúcar, em particular, proteína do metabolismo de lipídeo (LMP) usado nos métodos de produzir plantas transgênicas e níveis de modulação de compostos de armazenagem de semente que incluem lipídeos, ácidos graxos, amidos ou proteínas de armazenagem de semente e uso nos métodos de modular o tamanho da semente, número de sementes, pesos de semente, comprimento de raiz e tamanho da folha de plantas (EP 2404499).

(7) Alterar a expressão de uma Expressão de Alto Nível de proteína Indutível com Açúcar 2 (HSI2) na planta para aumentar ou diminuir / a expressão de HSI2 na planta. O aumento da expressão de HSI2 aumenta o teor de óleo enquanto diminui a expressão de HSI2 diminui a sensibilidade ao ácido abscísico e/ou aumenta a resistência à seca (Publicação do Pedido de Patente US Número 2012/0066794).

(B) Teor de fósforo alterado, por exemplo, pela

(1) Introdução de um gene que codifica a fitase realçaria a ruptura de fitato, adicionando mais fosfato livre à planta transformada. Por exemplo, ver, Van Hartingsveldt, et al., (1993) Gene 127: 87, para uma divulgação da seqüência de nucleotídeo de um gene da fitase de Aspergillus

nige r.

(2) Modulação de um gene que reduz o teor de ftato. No milho, isto, por exemplo, pode ser realizada, pela clonagem e depois reintrodução do DNA associado com um ou mais dos alelos, tais como os alelos LPA, identificados em mutantes do milho caracterizados pelos níveis

baixos de ácido fítico, tal como na WO 2005/113778 e/ou pela alteração da atividade de inositol cinase como na WO 2002/059324, Publicação do Pedido de Patente US Número 2003/0009011, WO 2003/027243, Publicação do Pedido de Patente US Número 2003/0079247, WO 1999/05298, Patente US Número 6.197.561, Patente US Número 6.291.224, Patente US Número

6.391.348, WO 2002/059324, Publicação do Pedido de Patente US Número 2003/0079247, WO 1998/45448, WO 1999/55882, WO 2001/04147.

(C) Carboidratos alterados afetados, por exemplo, pela alteração de um gene para uma enzima que afeta o padrão de ramificação de amido ou, um gene que altera a tiorredoxina tal como NTR e/ou TRX (ver, a Patente US Número 6.531.648. que é incorporada por referência para este propósito) e/ou um gama zeína silenciada ou mutante tal como cs27 ou TUSC27 ou en27 (ver, Patente US Número 6.858.778 e Publicação do Pedido de Patente US Número 2005/0160488, Publicação do Pedido de Patente US Número 2005/0204418, que são incorporadas por referência para este propósito)^ Ver, Shiroza, et al, (1988) J. Bacteriol. 170: 810 (seqüência de nucleotídeo do gene de frutosiltransferase mutante de Streptoeoecus), Steinmetz, et al., (1985) Mol. Gen. Genet. 200: 220 (seqüência de nucleotídeo do gene da levansucrase de Bacillus subtilis), Pen, et al, (1992) Bio/Teehnology 10: 292 (produção de plantas transgênicas que expressam a alfa-amilase de Bacillus lieheniformis), Elliot, et al, (1993) Plant Molee. Biol. 21: 515 (seqüências de nucleotídeo dos genes da invertase do tomate), S0gaard, et al, (1993) J. Biol. Chem. 268: 22480 (mutagênse loco-dirigida do gene da alfa-amilase da cevada) e Fisher, et al, (1993) Plant Physiol. 102: 1045 (enzima da ramificação do amido do endosperma do milho II), WO 1999/10498 (digestibilidade melhorada e/ou extração de amido através da modificação da UDP-D-xilose 4-epimerase, Fragile 1 e 2, Refl, HCHL, C4H), Patente US Número 6.232.529 (método de produzir semente com alto teor de óleo pela modificação dos níveis de amido (AGP)). Os genes de modificação do ácido graxo mencionado aqui também pode ser usado para afetar o teor de amido e/ou composição através das interrelações dos caminhos do amido e óleo.

(D) Teor ou composição de antioxidante alterados, tais como alteração de tocoferol ou tocotrienóis. Por exemplo, ver, a Patente US Número 6.787.683, Publicação do Pedido de Patente US Número 2004/0034886 e WO 2000/68393 envolvendo a manipulação dos níveis de antioxidante e WO 2003/082899 através da alteração de uma homogentisato geranil transferase (hggt).

(E) Aminoácidos de semente essencial alterada. Por exemplo, ver, a Patente US Número 6.127.600 (método de aumentar o acúmulo de aminoácidos essenciais em sementes), Patente US Número 6.080.913 (métodos binários de acúmulo crescente de aminoácidos essenciais em sementes), Patente US Número 5.990.389 (lisina alta), WO 1999/40209 (alteração de composições de aminoácido em sementes), WO 1999/29882 (métodos para alterai o teor de aminoácido das proteínas), Patente US Número 5.850.016 (alteração das composições de aminoácido em sementes), WO 1998/20133 (proteínas com níveis realçados de aminoácidos essenciais), Patente US Número 5.885.802 (metionina alto), Patente US Número 5.885.801 (treonina alto), Patente US Número 6.664.445 (enzimas biossintéticas de aminoácido de planta), Patente US Número 6.459.019 (lisina e treonina aumentadas), Patente US Número 6.441.274 (subunidade beta da triptofano sintase de planta), Patente US Número 6.346.403 (enzimas metabólicas da metionina), Patente US Número 5.939.599 (enxofre alto), Patente US Número 5.912.414 (metionina aumentada), WO 1998/56935 (enzimas biossintéticas de aminoácido de planta), WO 1998/45458 (proteína de semente engendrada tendo porcentagem mais alta de aminoácidos essenciais), WO 1998/42831 (lisina aumentada), Patente US Número 5.633.436 (teor de aminoácido com enxofre aumentado), Patente US Número 5.559.223 (proteínas de armazenagem sintéticas com estrutura definida contendo níveis programáveis de aminoácidos essenciais para a melhora do valor nutricional de plantas), WO 1996/01905 (treonina aumentada), WO 1995/15392 (lisina aumentada), Publicação do Pedido de Patente US Número 2003/0163838, Publicação do Pedido de Patente US Número 2003/0150014, Publicação do Pedido de Patente US Número 2004/0068767, Patente US Número 6.803.498, WO 2001/79516.

4. Genes que criam um sítio para a integração de DNA loco-específica.

Isto inclui a introdução de sítios de FRT que podem ser usados no sistema FLP/FRT e/ou sítios Lox que podem ser usados no sistema Cre/Loxp. Por exemplo, ver, Lyznik, et al, (2003) Plant Cell Rep 21: 925- 932 e WO 1999/25821, que são por meio deste incorporadas por referência. Outros sistemas que podem ser usados incluem a recombinase Gin de fago Mu (Maeser, et al., (1991)) Vicki Chandler, The Maize Handbook cap. 118 (Springer-Verlag 1994), a recombinase Pin da E. coli (Enomoto, et al, 1983) e o sistema R/RS do plasmídeo pSRi (Araki, et al, 1992).

5. Genes que afetam a resistência ao estresse abiótico Que incluem mas não são limitados ao florescimento, desenvolvimento de espiga e semente, realce da eficiência da utilização de nitrogênio, responsividade ao nitrogênio alterada, resistência ou tolerância à seca, resistência ou tolerância ao frio e resistência ou tolerância ao sal e rendimento aumentado sob estresse.

(A) Por exemplo, ver: a WO 2000/73475 onde a eficiência do uso da água é alterado através da alteração de malato; Patentes US Números

5.892.009. 5.965.705. 5.929.305. 5.891.859. 6.417.428. 6.664.446. 6.706.866. 6.717.034. 6.801.104, WO 2000/060089, WO 2001/026459, WO 2001/035725, WO 2001/034726, WO 2001/035727, WO 2001/036444, WO 2001/036597, WO 2001/036598, WO 2002/015675, WO 2002/017430, WO 2002/077185, WO 2002/079403, WO 2003/013227, WO 2003/013228, WO 2003/014327, WO 2004/031349, WO 2004/076638, WO 199809521.

(B) A WO 199938977 descreve genes, que incluem genes CBF e fatores de transcrição eficazes na mitigação dos efeitos negativos do congelamento, salinidade alta e seca sobre as plantas, assim como conferindo

outros efeitos positivos no fenótipo da planta.

(C) Publicação do Pedido de Patente US Número 2004/0148654 e WO 2001/36596 onde o ácido abscísico é alterado em plantas que resulta no fenótipo de planta melhorado tal como rendimento aumentado e/ou tolerância aumentada ao estresse abiótico. (D) WO 2000/006341, WO 2004/090143, Patentes US Números 7.531.723 e 6.992.237 onde a expressão de citocina é modificada resultando em plantas com tolerância ao estresse aumentada, tal como tolerância à seca, e/ou rendimento aumentado. Também ver, a WO

2002/02776, WO 2003/052063, JP 2002/281975, Patente US Número 6.084.153, WO 2001/64898, Patente US Número 6.177.275 e Patente US Número 6.107.547 (realce da utilização de nitrogênio e responsividade ao nitrogênio alterada).

(E) Para a alteração de etileno, ver, a Publicação do Pedido de Patente US Número 2004/0128719, Publicação do Pedido de Patente US

Número 2003/0166197 e WO 2000/32761.

(F) Para os fatores de transcrição de planta ou reguladores transcricionais de estresse abiótico, ver, por exemplo, a Publicação do Pedido de Patente US Número 2004/0098764 ou Publicação do Pedido de Patente US

Número 2004/0078852.

(G) Genes que aumentam a expressão de pirofosfatase vacuolar tal como AVPl (Patente US Número 8.058.515) para o rendimento aumentado; ácido nucleico que codifica um polipeptídeo HSFA4 ou um HSFA5 (Fator de Choque Térmico da classe A4 ou A5), um polipeptídeo da

proteína transportadora de oligopeptídeo (equivalente a OPT4); um polipeptídeo equivalente a plastocron2 (equivalente a PLA2) ou um polipeptídeo equivalente à homeocaixa 1 relacionado com Wuschel (equivalente a WOX1) (Pedido de Patente U.S. Número US 2011/0283420).

(H) Infra regulagem de polinucleotídeos que codificam as proteínas da poli (ADP-ribose) polimerase (PARP) para modular a morte de

célula programada (Patente US Número 8.058.510) para aumentar o vigor.

(I) Polinucleotídeo que codifica polipeptídeos DTP21 para conferir resistência à seca (Publicação do Pedido de Patente US Número US 2011/0277181). (J) Seqüência de nucleotídeos que codificam as proteínas ACC Sintase 3 (ACS3) para modular o desenvolvimento, modular a resposta ao estresse, e modular a tolerância ao estresse (Publicação do Pedido de Patente US Número US 2010/0287669).

(K) Polinucleotídeos que codificam proteínas que conferem um fenótipo de tolerância à seca (DTP) para conferir resistência à seca (WO 2012/058528).

Outros genes e fatores de transcrição que afetam o crescimento da planta e traços agronômicos tais como rendimento, florescimento, o crescimento da planta e/ou estrutura da planta, podem ser introduzidos ou introgredidos em plantas, ver por exemplo, WO 1997/49811 (LHY), WO 1998/56918 (ESD4), WO 1997/10339 e Patente US Número 6.573.430 (TFL), Patente US Número 6.713.663 (FT), WO 1996/14414 (CON), WO 1996/38560, WO 2001/21822 (VRN1), WO 2000/44918 (VRN2), WO 1999/49064 (GI), WO 2000/46358 (FR1), WO 1997/29123, Patente US Número 6.794.560, Patente US Número 6.307.126 (GAI), WO 1999/09174 (D8 e Rht) e WO 2004/076638 e WO 2004/031349 (fatores de transcrição).

6. Genes que conferem rendimento aumentado

(A) Uma planta de safra transgênica transformada por um ácido nucleico que codifica o Polipeptídeo equivalente a I-Amino- Ciclopropano-I-Carboxilato Desaminase (ACCDP), em que a expressão da seqüência de ácido nucleico na planta de safra resulta no crescimento de raiz aumentado da planta, e/ou rendimento aumentado, e/ou tolerância aumentada ao estresse ambiental quando comparado com uma variedade do tipo selvagem da planta (Patente US Número 8.097.769).

(B) Superexpressão do gene da proteína de dedo de zinco do milho (Zm-ZFPl) usando um promotor preferido de semente foi mostrado realçar o crescimento da planta, número de grão e peso total de grão por planta aumentados (Publicação do Pedido de Patente US Número 2012/0079623).

(C) Superexpressão constitutiva da proteína de domínio dos limites do órgão lateral do milho (LOB) (Zm-LOBDPl) foi mostrado aumentar o número de grão e peso de grão total por planta (Publicação do

Pedido de Patente US Número 2012/0079622).

(D) Realçar traços relacionados com o rendimento em plantas pela modulação da expressão em uma planta de um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo equivalente a VIMl (Variante na Metilação 1) ou um polipeptídeo equivalente a VTC2 (GDP-L-galactose fosforilase) ou um

polipeptídeo DUF1685 ou um polipeptídeo equivalente a ARF6 (Fator Responsivo à Auxina) (WO 2012/038893).

(E) Modular a expressão em uma planta de um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo equivalente a Ste20 ou um homólogo deste dá plantas tendo rendimento aumentado em relação às plantas de controle (EP

2431472).

7. Silenciamento de gene

Em algumas formas de realização o traço empilhado pode estar na forma de silenciamento de um ou mais polinucleotídeos de interesse que resulta na supressão de um ou mais polipeptídeos da praga alvo. Em algumas formas de realização o silenciamento é obtido através do uso de uma construção de DNA de supressão.

Em algumas formas de realização um ou mais polinucleotídeos que codificam os polipeptídeos ou fragmentos ou variantes destes podem ser empilhados com um ou mais polinucleotídeos que codifica um ou mais polipeptídeos tendo atividade inseticida ou traços agronômicos como apresentado supra e opcionalmente pode incluir ainda um ou mais polinucleotídeos que fornecem silenciamento de gene de um ou mais polinucleotídeos alvo como debatido infra.

A "construção de DNA de supressão" é uma construção de DNA recombinante que quando transformada ou estavelmente integrada dentro do genoma da planta, resulta no "silenciamento" de um gene alvo na planta. O gene alvo pode ser endógeno ou transgênico para a planta. "Silenciamento," como aqui usado com respeito ao gene alvo, refere-se no geral à supressão de níveis de mRNA ou proteína/enzima expressados pelo gene alvo, e/ou o nível da atividade da enzima ou funcionalidade da proteína. O termo "supressão" inclui abaixar, reduzir, degenerar, diminuir, inibir, eliminar e prevenir. "Silenciamento" ou "silenciamento de gene" não especifica mecanismo e é inclusivo, e não limitado a, antessentido, cossupressão, supressão viral, supressão de grampo de cabelo, supressão de haste-alça, métodos com base em RNAi e métodos com base em RNA pequenos.

Uma construção de DNA de supressão pode compreender uma região derivada de um gene alvo de interesse e pode compreender toda ou parte da seqüência de ácido nucleico do filamento de sentido (ou filamento de antessentido) do gene alvo de interesse. Dependendo do método a ser utilizado, a região pode ser 100 % idêntica ou menos do que 100 % idêntica (por exemplo, pelo menos 50 % ou qualquer número inteiro entre 51 % e 100 % idêntico) a todo ou parte do filamento de sentido (ou filamento de antissentido) do gene de interesse.

As construções de DNA de supressão são bem conhecidas na técnica, são facilmente construídas uma vez que o gene alvo de interesse é selecionado, e incluem, sem limitação, construções de cossupressão, construções de antessentido, construções de supressão viral, construções de supressão de grampo de cabelo, construções de supressão de haste-alça, construções que produzem RNA de filamento duplo e mais no geral, construções de RNAi (interferência de RNA) e construções de RNA pequeno tais como construções de siRNA (RNA interferente curto) e construções de miRNA (microRNA). "Inibição de antessentido" refere-se à produção de transcritos de RNA de antessentido capazes de suprimir a expressão da proteína alvo.

"RNA de antessentido" refere-se a um transcrito de RNA que é complementar a todo ou parte de um transcrito primário alvo ou mRNA e que bloqueia a expressão de um fragmento de ácido nucleico isolado alvo (Patente US Número 5.107.065). A complementaridade de um RNA de antessentido pode ser com qualquer parte do transcrito de gene específico, isto é, na seqüência não codificadora 5', seqüência não codificadora 3', íntrons ou na seqüência codificadora. "Cossupressão" refere-se à produção de transcritos de RNA de

sentido capazes de suprimir a expressão da proteína alvo. RNA "de sentido" refere-se ao transcrito de RNA que inclui o mRNA e pode ser traduzido em proteína dentro de uma célula ou in vitro. As construções de cossupressão em plantas foram anteriormente planejadas pela focalização na superexpressão de uma seqüência de ácido nucleico tendo homologia para um mRNA nativo, na orientação de sentido, que resulta na redução de todo RNA que tem homologia com a seqüência superexpressada (ver, Vaucheret, et al., (1998) Plant J. 16: 651-659 e Gura, (2000) Nature 404: 804-808).

Uma outra variação descreve o uso de seqüências virais de planta para direcionar a supressão de seqüências que codificam mRNA próximas (Publicação PCT WO 1998/36083).

Trabalho recente descreveu o uso de estruturas de "grampo de cabelo" que incorporam todo ou parte, de uma seqüência que codifica mRNA em uma orientação complementar que resulta em uma estrutura de "haste- alça" potencial para o RNA expressado (Publicação PCT WO 1999/53050). Neste caso a haste é formada pelos polinucleotídeos que correspondem ao gene de interesse inserido na orientação de sentido ou antessentido com respeito ao promotor e a alça é formada por alguns polinucleotídeos do gene de interesse, que não têm um complemento na construção. Isto aumenta a freqüência de cossupressão ou silenciamento nas plantas transgênicas recuperadas. Para a revisão da supressão de grampo de cabelo, ver, Wesley, et al, (2003) Methods in Molecular Biology, Functional Plant Genomics: Methods and Protocols 236: 273-286.

Uma construção onde a haste é formada por pelo menos 30 nucleotídeos de um gene a ser suprimido e a alça é formada por uma seqüência de nucleotídeo aleatória também foi eficazmente usada para a supressão (Publicação PCT WO 1999/61632).

O uso de seqüências poli-T e poli-A para gerar a haste na estrutura de haste-alça também foi descrito (Publicação PCT WO 2002/00894).

Já uma outra variação inclui o uso de repetições sintéticas para promover a formação de uma haste na estrutura de haste-alça. Os organismos transgênicos preparados com tais fragmentos de DNA recombinante mostraram ter níveis reduzidos da proteína codificada pelo fragmento de nucleotídeo que forma a alça como descrita na Publicação PCT WO 2002/00904.

A interferência de RNA refere-se ao processo de silenciamento de gene pós-transcricional específico de seqüência em animais mediados pelos RNAs interferentes curtos (siRNAs) (Fire, et al, (1998) Nature 391: 806). O processo correspondente em plantas é habitualmente aludido como silenciamento de gene pós-transcricional (PTGS) ou silenciamento de RNA e é também aludido como supressão nos fungos. O processo de silenciamento de gene pós-transcricional é considerado ser um mecanismo de defesa celular evolucionariamente conservado usado para prevenir a expressão de genes estranhos e é habitualmente compartilhado por diversas flora e fllos (Fire, et al, (1999) Trends Genet. 15: 358). Tal proteção da expressão de gene estranho pode ter evoluído em resposta à produção de RNAs de filamento duplo (dsRNAs) derivados de infecção viral ou da integração aleatória de elementos de transposon em um genoma hospedeiro por intermédio de uma resposta celular que especificamente destrói o RNA de filamento único homólogo de RNA genômico viral. A presença de dsRNA nas células deflagra a resposta de RNAi através de um mecanismo que tem que ser ainda totalmente caracterizado.

A presença de dsRNAs longos nas células estimula a atividade de uma enzima de ribonuclease III aludida como dicer. Dicer está envolvido no processamento do dsRNA em pedaços curtos de dsRNA conhecidos como RNAs interferentes curtos (siRNAs) (Berstein, et al, (2001) Nature 409: 363). Os RNAs interferentes curtos derivados da atividade de dicer são tipicamente de cerca de 21 a cerca de 23 nucleotídeos no comprimento e compreendem cerca de 19 pares de base duplexes (Elbashir, et al, (2001) Genes Dev. 15: 188). Dicer também foi implicado na excisão de RNAs temporais pequenos de 21 e 22 nucleotídeos (stRNAs) do RNA precursor de estrutura conservada que são implicados no controle translacional (Hutvagner, et al, (2001) Science 293: 834). A resposta de RNAi também caracteriza um complexo de endonuclease, habitualmente aludido como um complexo silenciador induzido por RNA (RISC), que medeia a clivagem de RNA de filamento único tendo complementaridade de seqüência para o filamento de antessentido do duplex de siRNA. A clivagem do RNA alvo ocorre no meio da região complementar para o filamento de antessentido do duplex de siRNA (Elbashir, et al, (2001) Genes Dev. 15: 188). Além disso, a interferência de RNA também pode envolver o silenciamento de gene mediado por RNA pequeno (por exemplo, miRNA), presumivelmente através de mecanismos celulares que regulam a estrutura da cromatina e deste modo impedem a transcrição das seqüências do gene alvo (ver, por exemplo, Allshire, (2002) Science 297: 1818-1819; Volpe, et al, (2002) Science 297: 1833-1837; Jenuwein, (2002) Science 297: 2215-2218 e Hall, et al, (2002) Science 297: 2232-2237). Como tal, as moléculas de miRNA da invenção podem ser usadas para mediar o silenciamento de gene por intermédio da interação com transcritos de RNA ou alternativamente pela interação com seqüências de gene particulares, em que tal interação resulta no silenciamento de gene ao nível transcricional ou pós-transcricional.

Métodos e composições são fornecidas ainda que possibilitam

um aumento no RNAi produzido a partir do elemento de silenciamento. em tais formas de realização, os métodos e composições utilizam um primeiro polinucleotídeo que compreende um elemento de silenciamento para uma seqüência de praga alvo operavelmente ligada a um promotor ativo na célula vegetal; e, um segundo polinucleotídeo que compreende um elemento realçador de supressor que compreende a seqüência da praga alvo ou uma variante ou fragmento ativos desta operavelmente ligada a um promotor ativo na célula vegetal. A expressão combinada do elemento de silenciamento com elemento realçador de supressor leva a uma amplificação aumentada do RNA inibidor produzido a partir do elemento de silenciamento em relação a aquele obtenível com a expressão apenas do elemento de silenciamento sozinho. Além da amplificação aumentada da própria espécie de RNAi específica, os métodos e composições possibilitam ainda a produção de uma população diversa de espécies de RNAi que pode realçar a eficácia do rompimento da expressão do gene alvo. Como tal, quando o elemento realçador de supressor é expressado em uma célula vegetal em combinação com o elemento de silenciamento, os métodos e composição podem possibilitar a produção sistêmica de RNAi por toda a planta; a produção de quantidades maiores de RNAi do que seria observado apenas com a construção de elemento de silenciamento sozinha; e, o carregamento melhorado do RNAi dentro do floema da planta, fornecendo assim melhor controle dos insetos que se alimentam do floema por um método do RNAi. Assim, os vários métodos e composições fornecem métodos melhorados para a liberação de RNA inibidor ao organismo alvo. Ver, por exemplo, a Publicação do Pedido de Patente US 2009/0188008.

Como aqui usado, um "elemento realçador de supressor" compreende um polinucleotídeo que compreende a seqüência alvo a ser suprimida ou um fragmento ativo ou variante desta. É reconhecido que o elemento realçador de supressor não necessita ser idêntico à seqüência alvo, mas ao invés, o elemento realçador de supressor pode compreender uma variante da seqüência alvo, contanto que o elemento realçador de supressor tenha identidade de seqüência suficiente com a seqüência alvo para possibilitar um nível aumentado do RNAi produzido pelo elemento de silenciamento em relação a aquele obtenível apenas com a expressão do elemento de silenciamento. Similarmente, o elemento realçador de supressor pode compreender um fragmento da seqüência alvo, em que o fragmento é de dimensão suficiente para possibilitar um nível aumentado do RNAi produzido pelo elemento de silenciamento em relação a aquele obtenível apenas com a expressão do elemento de silenciamento.

É reconhecido que elementos realçadores de supressor múltiplos da mesma seqüência alvo ou de seqüências alvo diferentes ou de regiões diferentes da mesma seqüência alvo podem ser utilizados. Por exemplo, os elementos realçadores de supressor utilizados podem compreender fragmentos da seqüência alvo derivada de região diferente da seqüência alvo (isto é, da 3'UTR, seqüência codificadora, íntron, e/ou 5'UTR). Além disso, o elemento realçador de supressor pode estar contido em um cassete de expressão, como descrito aqui em outro lugar, e nas formas de realização específicas, o elemento realçador de supressor está no mesmo vetor ou construção de DNA ou em um diferente como o elemento de silenciamento. O elemento realçador de supressor pode estar operavelmente ligado a um promotor. É reconhecido que o elemento realçador de supressor pode ser expressado constitutivamente ou de modo alternativo, o mesmo pode ser produzido em uma maneira específica de estágio utilizando os vários promotores indutíveis ou preferidos de tecido ou desenvolvimentos regulados que são debatidos aqui em outro lugar.

Em formas de realização específicas, utilizando tanto um elemento de silenciamento quanto o elemento realçador de supressor a produção sistêmica de RNAi ocorre por toda a planta inteira. Em outras formas de realização, a planta ou partes da planta da invenção têm um carregamento melhorado de RNAi dentro do floema da planta do que seria observado com a construção de expressão do elemento de silenciamento sozinha e, assim fornece melhor controle dos insetos que se alimentam do floema por um método de RNAi. Em formas de realização específicas, as plantas, partes de planta e células vegetais da invenção podem ser caracterizadas ainda como possibilitando a produção de uma diversidade de espécies de RNAi que podem realçar a eficácia de romper a expressão do gene alvo.

Em formas de realização específicas, a expressão combinada do elemento de silenciamento e do elemento realçador de supressor aumenta a concentração do RNA inibidor na célula vegetal, planta, parte de planta, tecido vegetal ou floema em relação ao nível que é obtido quando o elemento de silenciamento é expressado sozinho.

Como aqui usado, um "nível aumentado de RNA inibidor" compreende qualquer aumento estatisticamente significante no nível de RNAi produzido em uma planta tendo a expressão combinada quando comparada com uma planta de controle apropriada. Por exemplo, um aumento no nível de RNAi na planta, parte de planta ou da célula vegetal pode compreender um aumento de pelo menos cerca de 1 %, de cerca de 1 % a 5 %, de cerca de 5 % a 10 %, de cerca de 10 % a 20 %, de cerca de 20 % a 30 %, de cerca de 30 % a 40 %, de cerca de 40 % a 50 %, de cerca de 50 % a 60 %, de cerca de 60 a 70 %, de cerca de 70 % a 80 %, de cerca de 80 % a 90 %, de cerca de 90 % a 100 % ou maior no nível de RNAi na planta, parte de planta, célula vegetal ou floema quando comparado com um controle apropriado. Em outras formas de realização, o aumento no nível de RNAi na planta, parte de planta, célula vegetal ou floema pode compreender pelo menos um aumento de cerca de 1 vez, de cerca de 1 vez a 5 vezes, de cerca de 5 vezes a 10 vezes, de cerca de 10 vezes a 20 vezes, de cerca de 20 vezes a 30 vezes, de cerca de 30 vezes a 40 vezes, de cerca de 40 vezes a 50 vezes, de cerca de 50 vezes a 60 vezes, de cerca de 60 vezes a 70 vezes, de cerca de 70 vezes a 80 vezes, de cerca de 80 vezes a 90 vezes, de cerca de 90 vezes a 100 vezes ou maior no nível de RNAi na planta, parte de planta, célula vegetal ou floema quando comparada com um controle apropriado. Os exemplos de expressão combinada do elemento de silenciamento com elemento realçador de supressor para o controle de percevejos fedorentos e Lygus podem ser encontrado na Publicação do Pedido de Patente US 2011/0301223 e Publicação do Pedido de Patente US 2009/0192117. Algumas formas de realização dizem respeito à

infrarregulagem da expressão de genes alvos em espécies de praga de inseto pelas moléculas de ácido ribonucleico (RNA) interferentes. A publicação PCT WO 2007/074405 descreve métodos de inibir a expressão de genes alvos em pragas invertebradas que incluem o besouro da batata do Colorado. A Publicação PCT WO 2005/110068 descreve métodos de inibir a expressão de genes alvos em pragas invertebradas que incluem em particular crisomelídeo do sistema radicular do milho ocidental como um meio para controlar a infestação de inseto. Além disso, a Publicação PCT WO 2009/091864 descreve composições e métodos para a supressão de genes alvos de espécies de praga de inseto que inclui pragas do gênero Lygus. A Publicação PCT WO 2012/055982 descreve ácido ribonucleico (RNA ou RNA de filamento duplo) que inibe ou infra regula a expressão de um gene alvo que codifica: uma proteína ribossômica de inseto tal como a proteína ribossômica L19, a proteína ribossômica L40 ou a proteína ribossômica S27A; uma subunidade de proteassoma de inseto tal como a proteína Rpn6, a Pros 25, a proteína Rpn2, a proteína da subunidade beta 1 de proteassoma ou a proteína Pros beta 2; um $-coatomer de inseto da vesícula COPI, o y-coatomer da cesícula COPI, a proteína β'- coatomer ou a IrCoatomer da vesícula COPI; uma Tetraspanina 2 de inseto; uma proteína que é uma proteína de domínio de transmembrana/putativa; uma proteína de inseto pertencente à família de actina tal como Actina 5C; uma proteína de ubiquitina-5E de inseto; uma proteína Sec23 de inseto que é um ativador da GTPase envolvida no transporte da proteína intracelular; uma proteína enrugada de inseto que é uma miosina não convencional que está envolvida na atividade motora; uma proteína de pescoço curvo de inseto que está envolvida na regulagem da junção de mRNA alternativo nuclear; uma proteína da subunidade H+- ATPase G vacuolar de inseto e um Tbp-I de inseto tal como a proteína que liga Tat.

"Seca" refere-se a uma diminuição na disponibilidade de água

a uma planta que, especialmente quando prolongada, pode causar dano à planta ou impedir o seu crescimento bem sucedido (por exemplo, limitando o crescimento da planta ou rendimento de semente). "Tolerância à seca" é um traço de uma planta para sobreviver sob condições de seca em períodos prolongados de tempo sem exibir deterioração fisiológica ou física substancial. "Tolerância à seca aumentada" de uma planta é medida em relação a uma planta de referência ou controle, e é um traço da planta para sobreviver sob condições de seca em períodos prolongados de tempo, sem exibir o mesmo grau de deterioração fisiológica ou física em relação à planta de referência ou de controle cultivada sob condições de seca similares. Tipicamente, quando uma planta transgênica que compreende uma construção de DNA recombinante ou construção de DNA de supressão no seu genoma exibe tolerância aumentada à seca em relação a uma planta de referência ou de controle, a planta de referência ou de controle não compreende no seu genoma a construção de DNA recombinante ou construção de DNA de supressão.

Uma pessoa de habilidade comum na técnica está familiarizado com protocolos para simular as condições de seca e para avaliar a tolerância à seca de plantas que foram submetidas às condições de seca simuladas ou que ocorrem naturalmente. Por exemplo, pode-se simular as condições de seca dando às plantas menos água do que normalmente requerido ou nenhuma água em um período de tempo, e pode-se avaliar a tolerância à seca procurando por diferenças na condição fisiológica e/ou física, que incluem (mas não são limitados a) vigor, o crescimento, tamanho, ou comprimento da raiz, ou em particular, a cor da folha ou tamanho da área da folha. Outras técnicas para avaliar a tolerância à seca incluem medir a fluorescência da clorofila, taxas fotossintéticas e taxas de troca de gás.

Um experimento de estresse pela seca pode envolver um estresse crônico (isto é, secagem lenta) e/ou pode envolver dois estresses agudos (isto é, remoção abrupta de água) separada por um dia ou dois de recuperação.

O tecido vegetal regenerável pode ser obtido de qualquer espécie de planta, que inclui safras tais como, mas não limitadas a: uma planta graminácea, saccharum spp., saccharum spp. híbridos, cana de açúcar, miscanthus, switchgrass, cana energética, gramas estéreis, bambu, mandioca, arroz, batata, batata doce, inhame, banana, abacaxi, cítricos, árvores, salgueiro, álamo, amoreira, ficus spp., dendezeiro, tamareira, poaceae, verbena, baunilha, chá, lúpulos, Erianthus spp., híbridos intergênicos de Saccharum, Erianthus e Sorghum spp., violeta africana, tâmara, figo, coníferas, maçã, goiaba, manga, bordo, ameixa, romã, mamão, abacate, amora silvestre, morango silvestre, uvas, cana, canabis, limão, laranja, toranja, tangerina, lima, milho, trigo, sorgo e algodão.

Em uma forma de realização, o tecido vegetal regenerável usado na semente artificial pode ser de cana de açúcar. O tecido vegetal regenerável pode ser preparado usando vários métodos que incluem a excisão de meristemas do topo dos talos da cana de açúcar, seguida pela cultura de tecido em meios sólidos ou líquidos, ou temporariamente imerso em nutrientes líquidos e combinações destes. Em uma forma de realização, o tecido de cana de açúcar regenerável ^pode ser preparado usando cultura de tecido em um meio sólido, seguida pela imersão temporária em meio nutriente líquido.

O tecido de meristema pode ser deixado crescer e proliferar usando um meio de proliferação. O meio de proliferação pode incluir, mas não é limitada a, cultivar em vários meios nutrientes líquidos, cultivar em meios sólidos, imersão temporária em meios nutrientes líquidos, e qualquer variações destes. Em uma forma de realização, o meio de proliferação usado no método corrente compreende nutrientes MS e podem adicionalmente compreender ingredientes não limitados a: 30 g/L de sacarose, uma ou mais citoquininas, que incluem 6-BAP, auxinas, ou combinações de citoquinina e auxina, com ou sem inibidores do hormônio de planta, giberelina. Entretanto, outras formulações nutrientes tais como o meio B-5 de Gamborg bem conhecidos na técnica, outras fontes de carbono tais como glicose e manitol, outras citoquininas, tais como cinetina e zeatina também podem ser usadas.

Os tecidos de meristema podem ser deixados proliferar de cerca de 3 semanas a cerca de 52 semanas. A temperatura usada para a proliferação pode variar de cerca de 15°C a cerca de 45°C. O controle da temperatura para o crescimento dos tecidos vegetais regeneráveis pode ser obtido usando incubadores de temperatura constante como é bem conhecido na técnica relevante.

A seguir do crescimento do tecido de meristema, brotos proliferados são formados que contêm estruturas de meristema independentes capazes de diferenciar em brotos, e subseqüentemente em plantinhas bem formadas em estágios posteriores. Como aqui usado, "tecido de broto proliferado" significa um tecido meristemático com a capacidade para multiplicar e autorregenerar em estruturas de meristema similares. Com o tempo, a base deste tecido, que foi o tecido vegetal original, pode ficar preto devido à produção de polifenol e pode ser removido pelos métodos de corte mecânico bem conhecido na técnica relevante. /

Durante as etapas descritas acima, o tecido de meristema pode ser submetido à luz para possibilitar o crescimento. A intensidade de luz adequada para a invenção corrente pode ser de 1 micro (μ) Einstein por metro quadrado por segundo ^E/m2/s) a cerca de 1500 ^E/m2/s). A luz pode ser produzida por vários dispositivos adequados para este propósito tais como bulbos fluorescentes, bulbos incandescentes, o sol, os bulbos de crescimento da planta e diodos que emitem luz (LEDs). A quantidade de luz requerida para o crescimento do tecido de meristema pode variar de fotoperíodo de 1 hora a fotoperíodo de 24 horas. Em uma forma de realização, um fotoperíodo de 16 horas usando 30 μE/m2/spode ser usado.

Depois que o tecido de meristema forma o tecido de broto proliferado, pode ser depois cortado em pedaços pequenos (fragmentados) para formar fragmentos de tecido. Estes fragmentos de tecido podem ser de 0,5 a 10 mm no tamanho. Alternativamente, eles podem ser de 1 a 5 mm no tamanho. Estes fragmentos de tecido podem ser depois cultivados por 0 a 5 semanas mais para formar plantinhas, que são adequadas para encapsulação nas sementes artificiais. Os processos de cultivo para formar as plantinhas podem incluir, mas não são limitados a, cultivar em vários meio nutrientes líquidos, cultivar em meios sólidos, imersão temporária em cultura líquida, e qualquer uma de suas variações. As plantinhas que são formadas nestes processos possuem brotos, com ou sem raízes.

As sementes artificiais do tipo descrito na presente invenção compreendem uma montagem de recipiente. A montagem de recipiente pode ser preparada usando qualquer variedade de materiais divulgados acima. No presente método, o tecido vegetal regenerável, que foi cultivado ainda para produzir um plantinha pode ser usado. A plantinha pode ser parcialmente embutida em um tampão de ágar contendo nutriente no fundo do recipiente da semente artificial tal que parte do tecido (por exemplo, aproximadamente 80 %) seja opcionalmente exposto ao espaço aéreo acima da fonte de nutriente. Alternativamente a plantinha pode ser colocada tal que entre cerca de 1 % e 99,9 % sejam expostos ao espaço aéreo. A plantinha pode ser orientada ou não, e pode ser aparada para se ajustar dentro do recipiente. Alternativamente, a plantinha pode ser colocada em uma camada de solo no recipiente, tal que o

espaço aéreo esteja presente acima dela.

No presente método é desejável criar um espaço aéreo dentro do recipiente. O propósito do espaço aéreo é possibilitar a troca gasosa rápida com a plantinha, ajudando a sustentar o tecido e possibilitar o mesmo de crescer. O recipiente pode possuir porosidade que pode possibilitar uma taxa de transporte de gás tal que o equilíbrio possa ser mantido entre o espaço aéreo e o ambiente externo. Assim, conforme a plantinha consome ou libera oxigênio ou dióxido de carbono, devido à respiração ou fotossíntese, estes gases são rapidamente equilibrados com a atmosfera externa. Além disso, a exposição da plantinha ao espaço aéreo estimula o desenvolvimento de tecido que é melhor adaptado para as condições agressivas às quais a plantinha pode ser exposto uma vez que ela imerge da semente (por exemplo umidade reduzida, vento, luz mais alta). Na semente artificial, a plantinha é exposta a condições menos agressivas devido à proteção do recipiente. Na presente invenção, o espaço aéreo é também transparente à luz visível, o que possibilita que a plantinha realize fotossíntese. O espaço aéreo também pode fornecer alguma isolação térmica para a plantinha. O espaço aéreo pode consistir de compartimentos múltiplos. Estes compartimentos podem ser conectados ou unidos e podem estar em comunicação entre si. O espaço aéreo dentro do recipiente da semente artificial é de pelo menos 1 % do volume

total do recipiente.

Para prevenir a contaminação fungica da semente artificial, o

recipiente pode ser tratado com uma solução de um fungicida antes da sua montagem. Muitos fungicidas podem ser usados para este propósito. Os exemplos incluem, mas não são limitados a: Maxim® XL, Maxim® 4FS, Ridomil Gold®, Uniform®, Quilt®, anfotericina B, cicloeximida, nistatina, griseofulvin, pentacloronitrobenzeno, tiabendazol, benomila, 2-(tiocianato- metiltio)-1,3-benzotiazol, carbendazim, fuberidazol, tiofanato, tiofanato- metila, clozolinato, iprodiona, procimidona, vinclozolin, imazalila, oxpoconazol, pefurazoato, procloraz, triflumizol, triforine, pirifenox, fenarimol, nuarimol, azaconazol, bitertanol, bromuconazol, ciproconazol, difenoconazol, diniconazol, epoxiconazol, fenbuconazol, fluquinconazol, fiusilazol, fiutriafol, hexaconazol, imibenconazol, ipconazol, metconazol, miclobutanila, penconazol, propiconazol, protioconazol, simeconazol, tebuconazol, tetraconazol, triadimefon, triadimenol, triticonazol, benalaxil, furalaxil, metalaxil, metalaxil-M (mefenoxam), oxadixil, ofurace, aldimorf, dodemorph, fenpropimorf, tridemorf, fenpropidin, piperalin, espiroxamina, edifenfos, iprobenfos, (IBP), pirazofos, isoprotiolano, benodanil, fiutolanil, mepronil, fenfuram, carboxin, oxicarboxin, tifiuzamida, furametpir, pentiopirad, boscalid, bupirimato, dimetirimol, etirimol, ciprodinil, mepanipirim, pirimetanil, dietofencarb, azoxistrobin, estrobilurins, enestrobin, picoxistrobin, piraclostrobin, cresoxim-metila, trifloxistrobin, dimoxistrobin, metominostrobin, orisastrobin, famoxadona, fluoxastrobin, fenamidona, piribencarb, fenpiclonil, fludioxonil, quinoxifen, bifenila, cloroneb, dicloran, quintozeno (PCNB), tecnazeno (TCNB), tolclofos-metila, etridiazol, etazol, ftalida, piroquilon, triciclazol, carpropamid, diclocimet, fenoxanil, fenhexamid, piributicarb, naftifina, terbinafina, polioxin, pencicuron, ciazofamid, amisulbrom, zoxamida, blasticidin-S, casugamicina, Tl estreptomicina, sulfato de estreptomicina, validamicina, cimoxanil, iodocarb, propamocarb, protiocarb, binapacril, dinocap, ferimzona, fluazinam, acetato de fentina, cloreto de fentina, hidróxido de fentina, ácido oxolínico, himexazol, octilinona, fosetil-Al, ácido fosforoso e sais, tecloftalam, triazóxido, flusulfamida, diclomezina, siltiofam, diflumetorim, dimetomorf, flumorf, bentiavalicarb, iprovalicarb, valifenal, mandipropamid, oxitetraciclina, metasulfocarb, fluopicolida, acibenzolar-S-metila, probenazol, tiadinil, isotianil, etaboxam, ciflufenamid, proquinazid, metrafenona, cobre (diferente, sais), enxifre, ferbam, mancozeb, maneb, metiram, propineb, tiram, zineb, ziram, captan, captafol, folpet, clorotalonil, diclofluanid, tolilfluanid, dodina, guazatina, iminoctadina, anilazina, ditianon, óleos minerais, óleos orgânicos, bicarbonato de potássio, tridemorf anilinopirimidinas, antibióticos, cicloeximid, griseofulvin, dinitroconazol, etridazol, perfurazoato, 5-Cloro-7- (4-metil-piperidin-l-il)-6-(2,4,6-trifluoro-fenil)-[l,2,4]triazolo[l,5-a]- pirimidina, 2-Butóxi-6-iodo-3-propil-cromen-4-ona, dimetilamida do ácido 3- (3-Bromo-6-fluoro-2-metil-indol-1 -sulfonil)- [ 1,2,4]triazol-1 -sulfônico, nabam, metam, policarbamato, dazomet, 3-[5-(4-Cloro-fenil)-2,3-dimetil- isoxazolidin-3-il]-piridina, mistura Bordeaux, acetato de cobre, hidróxido de cobre, oxicloreto de cobre, sulfato de cobre básico, derivados de nitrofenila, dinobuton, nitroftalisopropil fenilpirróis, enxofre, compostos organometálicos de enxofre, ftalida, toloclofos-metila, N-(2-{4-[3-(4-Cloro-fenil)-prop-2- inilóxi]-3-metóxi-fenil}-etil)-2-metanossulfonilamino-3-metil-butiramida, N- (2-{4-[3-(4-Cloro-fenil)-prop-2-inilóxi]-3-metóxi-fenil}-etil)-2- etanossulfonilamino-3-metil-butiramida; (2-ciano-fenil)-amida do ácido 3,4- Dicloro-isotiazol-5-carboxílico, Flubentiavalicarb, éster metílico do ácido 3- (4-Cloro-fenil)-3-(2-isopropoxicarbonilamino-3-metil-butirilamino)- propiônico, éster metílico do ácido {2-Cloro-5-[l-(6-metil-piridin-2- ilmetoxiimino)-etil]-benzil}-carbâmico, éster metílico do ácido {2-Cloro-5-[I- (3-metil-benziloxiimino)-etil]-benzil}-carbâmico, hexaclorbenzeno amidas da seguinte fórmula em que X é CHF2 ou CH3; e RI, R2 são independentemente um do outro halógeno, metila ou halometila; enestroburin, derivados do ácido sulfênico, cinemamidas e análogos tais como, fungicidas de flumetover amida tais como ciclofenamid ou (Z)-N-[a-(ciclopropilmetoxiimino)-2,3-difluoro-6- (difluorometóxi) benzil]-2-fenilacetamida, tiabendozol, e trifumizol.

Adicionalmente, o recipiente pode compreender um ou mais antimicrobianos, que incluem mas não são limitados a: água sanitária, Plant Preservative Mixture®, amônio quaternário ou sais de piridínio, o sal de cobre de sorbitol cianoetilado (como descrito na US6978724), sais de prata e nanopartículas de prata podem ser usados. Adicionalmente, o recipiente pode compreender um ou mais antibióticos, que incluem mas não são limitados a: cefotaxima, carbenicilina, cloranfenicóis, tetraciclina, eritromicina, canamicina, sulfato de neomicina, sulfato de estreptomicina, sulfato de gentamicina, ampicilina, penicilina, ticarcilina, polimixina-B e rifampicina clorexidina, acetato de clorexidina, gliconato de clorexidina, cloridreto de clorexidina, sulfato de clorexidina, hexametileno biguanidas, oligo-hexametil biguanidas, acetato de prata, benzoato de prata, carbonato de prata, cloreto de prata, iodato de prata, iodeto de prata, lactato de prata, laurato de prata, nitrato de prata, óxido de prata, palmitato de prata, proteína de prata, sulfadiazina de prata, polimixina, tetraciclina, tobramicina, gentamicina, rifampicina, bacitracina, neomicina, cloramfenicol, miconazol, tolnaftato, ácido oxolínico, norfloxacina, ácido nalidix, pefloxacina, enoxacina, ciprofloxacina, ampicilina, amoxicilina, piracila, vancomicina, poliexametileno biguanida, cloridreto de poliexametileno biguanida, bromidreto de poliexametileno biguanida, borato de poliexametileno biguanida, acetato de poliexametileno biguanida, gliconato de poliexametileno biguanida, sulfonato de poliexametileno biguanida, maleato de poliexametileno biguanida, ascorbato de poliexametileno biguanida, estearato de poliexametileno biguanida, tartarato de poliexametileno biguanida, citrato de poliexametileno biguanida e combinações destes.

De modo a prevenir o dano por inseto, a semente artificial também pode compreender um ou mais inseticidas. Os exemplos de compostos pesticidas adequados incluem, mas não são limitados a, abamectina, cianoimina, acetamiprid, nitrometileno, nitenpiram, clotianidin, dimetoato, dinotefuran, fipronil, lufenuron, flubendamida, piripfoxifeno, tiacloprid, fluxofenima, imidacloprid, tiametoxam, beta ciflutrin, fenoxicarb, lamda cialotrina, diafentiuron, pimetrozina, diazinon, dissulfoton; profenofos, furatiocarb, ciromazin, cipermetrin, tau-fluvalinato, teflutrin, clorantraniliprol, flonicamid, metaflumizona, espirotetramat, produtos de Bacillus thuringiensís, azoxistrobina, acibenzolor s-metila, bitertanol, carboxina, Cu2O, cimoxanil, ciproconazol, ciprodinil, diclofluamid, difenoconazol, diniconazol, epoxiconazol, fenpiclonil, fludioxonil, fluoxastrobina, fluquiconazol, flusilazol, flutriafol, furalaxil, guazatin, hexaconazol, himexazol, imazalila, imibenconazol, ipconazol, cresoxim-metila, mancozeb, metalaxil, R-metalaxil, mefenoxam, metconazol, miclobutanil, oxadixil, pefurazoato, paclobutrazol, penconazol, pencicuron, picoxistrobina, procloraz, propiconazol, piroquilona, SSF-109, espiroxamin, tebuconazol, tiabendazol, tiram, tolifluamida, triazóxido, triadimefon, triadimenol, trifloxistrobina, triflumizol, triticonazol, uniconazol.

A semente artificial pode compreender outros produtos químicos de proteção de safra, que incluem mas não são limitados a nematicidas, termiticidas, moluscicidas, miticidas e acaricidas.

No processo de preparação da semente artificial e a seguir da adição da plantinha, e em alguns casos, os nutrientes, a abertura no recipiente pode ser presa. Um recipiente pode ter mais do que uma abertura. Alternativamente, um recipiente pode ter uma abertura de topo e uma abertura de fundo. Dependendo do projeto e método de plantio, opcionalmente uma ou ambas aberturas podem ser presas. Materiais idênticos podem ser usados como fechamentos para a abertura de topo e a abertura de fundo do recipiente. Alternativamente, materiais diferentes podem ser usados como fechamentos para prender a(s) abertura(s). Os materiais adequados a serem usados como fechamentos na invenção divulgada incluem, mas não são limitados a: vários tipos de papel, cera, Parafilm®, Parafilm® pré-estirado, polímeros biodegradáveis que incluem poli(lactídeo), poli(L-lactídeo), poli(D-lactídeo), poli(D,L-lactídeo), estereocomplexos de poli(L-lactídeo) com poli(D- lactídeo) e poli(hidroxil alcanoato)s, polímeros naturais e sintéticos que incluem mas não são limitados a poli(etileno glicol), poli(ácido acrílico) e seus sais, poli(álcool vinílico), poli(estireno), poli((met)acrilatos de alquila), poli(acetato de vinila), poli(vinil pirrolidinona), poli(vinil piridina), poliacrilamida, policarbonato, resinas de epóxi, resinas alquídicas, poliolefinas, polímeros fotodegradáveis, poliésteres, poliamidas, amido, gelatina, borracha natural, polissacarídeos que incluem mas não são limitados a alginato, carragenina, celulose, carboximetilcelulose e seus sais, goma xantana, goma guar, zeína, quitosano, goma de alfarrobeira, goma arábica, pectina, ágar, agarose, versões reticuladas destes, versões plastificadoras destes, copolímeros destes e combinações destes. Em uma forma de realização, o fechamento possui um revestimento de cera. As ceras incluem mas não são limitadas a cera de parafina, cera espermaceti, cera de abelhas e cera de carnaúba.

Em uma forma de realização da invenção, o fechamento é feito de materiais plásticos biodegradáveis tais como poli(ácido láctico), poli(hidroxibutirato), poli(hidroxibutirato-co-valerato), ou misturas destes, opcionalmente com amido, celulose, quitosano e plastificadores, que incluem mas não são limitados a sorbitol, glicerol, ésteres de citrato, ésteres de ftalato e água. Estas misturas podem ser formadas pela mistura em solução ou mistura em fusão.

Em uma outra forma de realização, o fechamento compreende, ou alternativamente consiste de, misturas rapidamente dissolvíveis de poli(álcool vinílico) com amido, fibras de celulose e glicerol, opcionalmente reticulados, com um agente adequado, que incluem mas não são limitados a hexametoximetilmelamina ou glutaraldeído. Isto fornece materiais que são rapidamente degradáveis nas condições úmidas do solo, permitindo rápido crescimento do tecido dentro. O amido pode ser de fontes que incluem mas não são limitados à batata, milho, arroz, trigo e mandioca, e pode ser modificado ou não modificado. Aditivos adicionais podem incluir, mas não são limitados a poli(etileno glicol), ácido cítrico, uréia, água, sais que inclui mas não são limitados a acetato de sódio, nitrato de potássio e nitrato de amônio, fertilizantes, ágar, goma xantana, alginato, derivados de celulose que incluem mas não são limitados a hidroxipropilcelulose, metilcelulose e carboximetilcelulose.

Na invenção divulgada, o recipiente pode ter uma abertura de topo e uma de fiando que podem ser presas. Em uma forma de realização da invenção divulgada, Parafilm® F pré-estirado pode ser usado para prender tanto a abertura de topo quanto a abertura de fundo do recipiente. Em uma outra forma de realização, o fechamento para a abertura de fundo pode ser Parafilm® M pré-estirado e o fechamento para a abertura de topo pode ser uma película plástica solúvel em água, possivelmente composta de poli(álcool vinílico), poli(vinil pirrolidona), poli(ácido (met)acrílico) e seus sais ou poli(etileno glicol). Já em uma outra forma de realização, o fechamento para a abertura de topo pode ser Parafilm® M pré-estirado e o fechamento para a abertura de fundo pode ser um papel solúvel em água impregnado com cera. Como aqui usado, papel solúvel em água impregnado com cera significa papel solúvel em água em que cera foi introduzido nos poros e/ou superfície do material.

Em uma outra forma de realização, o fechamento para as aberturas compreende, ou alternativamente consiste de, películas de resina alquídica. Tais resinas alquídicas são bem conhecidas na técnica, e podem ser formadas através da reação de óleos vegetais insaturados com polióis e curadas com catalisadores metálicos. As resinas alquídicas adequadas incluem, mas não são limitadas a Beckosol® 11-035 e Amberlac® 1074 (Reichhold Corp, Durham, NC).

Em uma outra forma de realização, o fechamento para as aberturas compreende, ou alternativamente consiste de, copolímeros de bloco. Estes polímeros incluem dois ou mais segmentos de unidades de repetição constitucional quimicamente distintas, covalentemente ligadas. Estes copolímeros de bloco podem ser biodegradáveis. Em uma forma de realização, copolímeros de bloco de poliéster são usados. Tais polímeros podem ser elastomérico, possibilitando que as plantinhas os perfurem facilmente. Os copolímeros de bloco contêm blocos que incluem mas não são limitados a: poli(ácido láctico), poli(lactídeo), poli(L-ácido láctico), poli(D- ácido láctico), poli(D,L-ácido láctico), poli(caprolactona), poli(caprolactona- co-ácido láctico), poli(dimetilsiloxano), poli(álcool vinílico), poli(acetato de vinila), poli(etileno glicol), poli(propileno glicol), poli(carbonato)s, poliéteres, poliésteres. Em uma forma de realização, os copolímeros de bloco podem consistir de poli(L-ácido láctico-b-caprolactona-co-D,L-ácido láctico-b-L- ácido láctico). Em uma outra forma de realização, o copolímero de bloco consiste de poli(D,L-ácido láctico-b-dimetil siloxano-b-D,L-ácido láctico).

O fechamento útil na invenção corrente pode compreender óleo. O óleo adequado para aplicação na invenção corrente tem as características que seguem: deve fundir entre cerca de 3 O0C e 38°C e ser sólido na temperatura ambiente (de cerca de 20°C a cerca de 25°C). Vários tipos de óleo e triglicerídeos (gordura) podem ser usados. Os exemplos não limitantes incluem manteiga, manteiga de cacau, azeite de dendê, estearina palma e banha. Em uma forma de realização, gordura de óleo vegetal, por exemplo, Crisco®, pode ser usada. Em uma outra forma de realização, o fechamento pode ser composto de um óleo-gel. Um óleo-gel é definido como um óleo que, através da combinação com um ou mais aditivos, não flui em uma faixa finita de temperatura adequada para a aplicação. Em uma forma de realização, o óleo-gel é formado pela dissolução de um composto em um óleo em temperatura elevada, e depois esfriando esta solução para formar um gel.

/ Os óleos adequados incluem, mas não são limitados a, óleo vegetal, óleo de mamona, óleo de soja, miristato de isopropila, óleo de semente de colza, e óleo mineral. Os compostos adequados incluem, mas não são limitados a polímeros de bloco e substâncias associativas, de peso molecular baixo. Os polímeros de bloco incluem, mas não são limitados a, copolímeros de bloco estirênicos tais como aqueles vendidos sob o nome comercial Kraton® (Kraton Polymers, Houston, TX), copolímeros de bloco de óxido de etileno e óxido de propileno, tais como aqueles vendidos sob o nome Pluronic® (BASF, Ludwigshafen, Alemanha). Os copolímeros de bloco estirênicos incluem mas não são limitados a poli(estireno-b-isopreno-b-estireno), poli(estireno-b-butadieno-b-estireno) e suas versões hidrogenadas. Os óleos- gel adequados para esta aplicação terão propriedades mecânicas fracas o bastante para permitir a penetração pelo tecido vegetal regenerável em crescimento.

Em uma outra forma de realização as aberturas podem ser

presas usando materiais porosos, que incluem mas não são limitados a, peneiras, malhas, gaze, algodão, argila, tecido de algodão, e lã de rocha.

Alternativamente, as aberturas de topo e fundo podem ser presas por dobradura, plissagem, compressão, grampeamento, ou amarração dos lados opostos do recipiente juntos. Em uma forma de realização, a abertura de fundo pode ser presa grampeando-se seus lados juntos usando um

grampo comum, de aço galvanizado.

Em uma outra forma de realização, as aberturas podem ser

presas pelas estruturas como abas, em que uma ou mais abas flexíveis se projetam sobre a abertura. As abas são flexíveis o bastante para possibilitar que a plantinha as empurrem para longe conforme elas crescem. Em uma forma de realização, as abas formam uma tampa fendida ou tampa na forma de "flor".

Em uma outra forma de realização, o recipiente pode ter uma ou mais aberturas na lateral do recipiente. Estas aberturas laterais podem ser além das aberturas de topo e fundo. Alternativamente, o recipiente pode ter apenas aberturas laterais sem aberturas de topo ou fundo. Estas aberturas também podem ser presas usando os métodos e materiais descritos acima.

Em uma outra forma de realização, o recipiente pode possuir dispositivos de ancoramento. Tais dispositivos incluem, mas não são limitados a abas, farpas, estacas e nervuras. Os dispositivos de ancoramento podem ser dobráveis ou colapsados, para reduzir espaço antes do plantio. Em tais casos, uma contenção pode ser usada para conter o dispositivo de ancoramento em um estado dobrado ou colapsado. Tais contenções podem incluir, mas não são limitados a fitas, faixas, e adesivos.

A seguir dos métodos de montagem do recipiente, adicionar a plantinha ou o tecido vegetal regenerável, o meio nutriente, se requerido, e prender a abertura de topo e a abertura de fundo, as sementes artificiais assim criadas, podem ser plantadas no solo. Qualquer tipo de solo tal como solo de campo, solo arenoso, solo siltoso, solo argiloso, solo rico em orgânicos, solo pobre em orgânicos, solo com pH alto, solo com pH baixo, greda, solo sintético, vermiculita, solo de vaso, solo de viveiro, solo arável, solo de cogumelos e suas versões esterilizadas podem ser usados para este propósito. Em uma forma de realização, Metro-Mix® 360 (e solo de campo - tal como aquele das fazendas ou outras fontes naturais por todo o mundo) podem ser usados para o plantio das plantinhas ou do tecido vegetal regenerável nos recipientes. As sementes artificiais depois brotarão ou germinarão em alguma freqüência depois disso. Como aqui usado, "brotação" e "germinação" significam a protrusão do tecido regenerável dos limites do recipiente da semente artificial devido ao crescimento do tecido regenerável.

As sementes artificiais aqui descritas são adaptadas para a armazenagem antes do plantio. As condições de armazenagem podem incluir, mas não são limitadas à temperatura ambiente, temperatura refrigerada, temperatura subambiente, concentração de oxigênio subambiente, iluminação subambiente, na luz ou na escuridão, em embalagem externa, sob ar ou em uma atmosfera inerte. A temperatura subambiente é definida como a temperatura abaixo da temperatura ambiente. Iluminação subambiente é definida como níveis de iluminação abaixo da iluminação ambiente. Oxigênio subambiente é definido como níveis de oxigênio abaixo daquele presente na atmosfera natural. A duração da armazenagem pode ser tão longa quanto um ano, ou uns poucos meses, mas também pode ser da ordem de semanas ou dias.

Em uma forma de realização, furos, cortes, brechas ou fendas

podem ser feitas na semente artificial no momento do plantio de modo a facilitar o crescimento do tecido vegetal regenerável. Isto pode possibilitar que os brotos ou as raízes cresçam para fora e escapem do recipiente.

A presente invenção fornece a produção de sementes artificiais de plantas que podem se desenvolver em safras totalmente cultivadas para a propagação no campo. Por exemplo, a invenção divulgada pode fornecer um método econômico de propagar plantas difíceis de crescer tais como cana de açúcar que pode possibilitar a sua rápida propagação para atingir a demanda global crescente quanto à produção de cana de açúcar. Também, a presente invenção pode fornecer um método de plantio mais simples, mais seguro e mais econômico comparado com o plantio de talos e pedaços de cana de açúcar tradicional por intermédio de meios mecânicos ou manuais. Simplesmente reduzindo o peso e volume do material de plantio, dos talos e pedaços de cana de açúcar às sementes artificiais, pode economizar a energia e tempo requerido para transportar materiais de plantio para o campo para o plantio.

A descrição acima de várias formas de realização ilustradas da invenção não é intencionada a ser exaustiva ou limitar a invenção à forma precisa divulgada. Embora as formas de realização específicas, e exemplos, da invenção sejam aqui deseütas com propósitos ilustrativos, várias modificações equivalentes são possíveis dentro do escopo da invenção, como aqueles habilitados na técnica relevante reconhecerão. As divulgações aqui fornecidas da invenção podem ser aplicadas para outros propósitos, outros que não os exemplos descritos acima. A invenção pode ser praticada em modos outros que não aqueles particularmente descritos na descrição e exemplos precedentes. Numerosas modificações e variações da invenção são possíveis considerando-se as divulgações acima e, portanto, estão dentro do escopo das reivindicações anexas. Estas e outras mudanças podem ser feitas à invenção

considerando-se a descrição detalhada acima. No geral, nas reivindicações que seguem, os termos usados não devem ser interpretados para limitar a invenção às formas de realização específicas divulgadas no relatório descritivo e nas reivindicações. Certas divulgações relacionadas com as sementes artificiais de

planta viáveis foram divulgadas no pedido de patente provisória U.S. No. 61/578.410, depositado em 21 de dezembro de 2011, a divulgação do qual é aqui incorporada por referência em sua totalidade.

A divulgação inteira de cada documento citado (que inclui patentes, pedidos de patente, artigos de jornal, abstratos, manuais, livros, ou outras divulgações) no Fundamento da Invenção, Descrição Detalhada, e Exemplos é aqui incorporada por referência em suas totalidades.

Os exemplos que seguem são oferecidos de modo a prover aqueles de habilidade comum na técnica com uma divulgação e descrição completa de como fabricar e usar a invenção objeto, e não são intencionados a limitar o escopo do que é considerado como a invenção. Esforços foram feitos para garantir a precisão com respeito aos números usados (por exemplo, quantidades, temperatura, concentrações, etc.) mas alguns erros e desvios experimentais devem ser permitidos. A menos que de outro modo indicado, partes são partes em peso, peso molecular é peso molecular médio; temperatura é em graus centígrado; e pressão é na ou próximo da atmosférica.

EXEMPLOS

Materiais

RECIPIENTES DE PAPEL ENCERADO (1,19 cm OD, Aardvark, tamanho "Colossal") foram obtidos da Precision Products Group, Inc, 245 Falley Dr, Westfield, MA.

VERMICULITA (parte número 65-3120, Whittemore, grau D3, fino) foi obtida da Griffin Greenhouse and Nursery Supplies em Morgantown, Pa.

Conviron modelo BDW-120 e Conviron CGR-962 foram adquiridos da Conviron, Manitoba Canadá.

Fita de filtração porosa foi da Carolina Biological Supply Company, Burlington, NC.

Sonda Decagon EC-5 foi da Decagon Devices, Inc,, Pullman, WA.

Solo Metro-Mix®-360 foi da Sun Gro Horticulture, Vancouver, Canada. Osmocote® foi da Scotts Company, Marysville, OH.

FUNGICIDA (Maxim 4FS) foi da Syngenta, Wilmington, DE.

Thrive® foi da Yates (Padstow, NSW, Austrália)

Os cristais aquosos foram da (Searles®, Kilcoy, QLD,

Austrália)

Canudos plásticos de 1,1 cm e 0,8 cm de diâmetro compostos de polipropileno foram obtidos de uma loja local em Brisbane, Austrália. Sacos plásticos solúveis em água fria foram obtidos da Extra Packaging Corp, Boca Raton, FL.

Sacos plásticos solúveis em água QUENTE foram obtidos da Extra Packaging Corp. 736 Glouchester St. Boca Raton, Flórida).

POLI(succinato de 1,3-propanodiol) (película prensada por

fusão com 177 a 330 μηι de espessura) foi preparado a/partir de monômeros usando o método descrito em Chrissafis, K. et ai. Polymer Degradation and Stabilization 2006, 91, 60-68.

Parafilm® F e Parafilm® M foram obtidos da Pechiney Plastic Packaging, Chicago, IL.

PAPEL SOLÚVEL EM ÁGUA (Aquasol® ASW-60) foi obtido da Aquasol Corporation, North Tonawanda, NY.

POLI (3 -hidroxibutirato-co-3 -hidroxivalerato) contendo 12 % de comonômero de valerato foi obtido da Sigma Aldrich, St. Louis, MO. Poli(ácido láctico) (Ingeo® 4032D) foi obtido da NatureWorks,

LLC (Minnetonka, MN).

Macozeb foi obtido da Searles®.

Óleo Crisco® foi obtido da J. M. Smucker Co. Orrville, Ohio.

O ácido 1-naftalenoacético (NAA, >95 % de pureza) foi obtido da Sigma Aldrich.

Perlita e musgo turfoso foram obtidos da Centenary Landscaping supplies (Darra, QLD)

Poli(8-caprolactona) foi obtida da Sigma Aldrich (St. Louis,

MO).

A resina alquídica Beckosol® 11-035 foi obtida da Reichhold

Inc (Durham, NC).

ε-caprolactona, 3,6-Dimetil-l,4-dioxano-2,5-diona, e 2- etilexanoato de estanho (II) foram obtidos da Sigma Aldrich (St. Louis, MO).

Kraton® Al535 copolímero de bloco de poli(estireno-ò- etileno-co-butileno-co-estireno-ò-estireno) foi obtido da Kraton Polymers (Houston, TX).

Tubo rígido de acetato butirato de celulose (CAB) de 0,625 polegada (1,6 cm) de diâmetro externo e 0,5 polegada (1,27 cm) de diâmetro interno foi adquirido da McMaster-Carr.

Tubo rígido de polietileno poroso (PPE) de 0,75 polegada (1,9 cm) de diâmetro externo, 0,5 polegada (1,27 cm) de diâmetro interno, e 20 μηι de tamanho de poro foi adquirido da Interstate Specialty Products e cortado em comprimentos de 6 polegadas (15,2 cm).

PDMS terminado em aminopropila de viscosidade de 900 a 1100 cSt foi adquirido da Gelest (Morrisville, PA).

O óleo de soja foi obtido da MP Biomedicals, (Solon, OH).

Ágar BD Difco foi obtido da VWR.

Phytatray® II, foi obtido da Sigma Aldrich, St. Louis MO.

Meio Basal de Murashige & Skoog (MS) com Vitaminas foi obtido da PhytoTechnology Laboratories (Shawnee Mission, KS).

Plant Preservative Mixture® (PPM) foi obtido da Plant Cell Technology, Lavarton, DC.

Naftenato de Cobalto (II) (55 % em peso em álcoois minerais) foi obtido da Electron Microscopy Sciences, Hatfield PA.

Tubos de centrífuga de 15 ml e 50 ml foram obtidos da VWR5

Radnor PA.

A fita de autoclave foi obtida da VWR, Radnor PA.

Alças descartáveis de 10 μΐ foram obtidas da Becton Dickinson e Co., Sparks, MD.

Solventes de tetraidrofiirano (THF), hexanos e clorofórmio foram obtidos da EMD Chemical Products, uma ramificação da Merck KGaA, Darmstadt, Alemanha.

Poli(ácido acrílico), poli(óxido de etileno) enxertado com sal de sódio parcial foi obtido da Sigma Aldrich, St Louis, MO.

Papel de copiadora Rite in the Rain foi obtido da J. L. Darling Corp, Tacoma, WA.

Mistura de Coco Especial, Gold Label Special Mix® Substrates foi obtido da Gold Label Américas, Olivehurst, CA.

Tropstrato HT® - solo de vaso foi obtido da Vida Verde, Mogi / Mirim, SP, Brasil.

O Glicerol e a Ureia foram adquiridos da Synth, Diadema, SP,

Brasil.

Amido de Milho (não modificado, 73 % de amilopectina e 27

% de amilose), foi obtido da Sigma Aldrich.

Agente antiespumante, Hypermaster 602 foi fornecido da Montenegro Química, Piracaia, SP, Brasil.

O ácido cítrico pode ser obtido da Sigma Aldrich (St. Louis,

MO).

Hexametoximetilmelamina (HMMM) (resina Cymel® 303 LF) agente de reticulação com um grau médio de metilação de 97 % foi obtido da Cytec, Barcelona, Espanha.

POLI(álcool vinílico) (Elvanol® 52-22) foi obtido da E.I. DuPont de Nemours and Company, Wilmington, DE.

Fibras de celulose longa foram fornecidas pela MD Papéis, Formitex, Caieiras, SP, Brasil.

Meio de cultivo

O meio de proliferação de ágar conteve meio basal de Murashige e Skoog (MS) com vitaminas (Phytotechnology Laboratories, Shawnee Mission, KS) mais 30 g/L de sacarose (sacarose Grau 1, Sigma, St. Louis, MO), 8 g/L de Difco® Ágar, e 6-benzilaminopurina 0,9 miligrama por litro (mg/L) (Phytotechnology Laboratories, Shawnee Mission, KS), no pH

5,7). Meio de regeneração, conteve meio MS basal com vitaminas (Phytotechnology Laboratories, Shawnee Mission, KS) mais 30 g/L de sacarose e 0,2 % de Plant Preservative Mixture® (PPM, Plant Cell Technology, Lavarton, DC), no pH 5,7).

O meio de crescimento de Hoagland foi preparado como

segue:

Primeiro, soluções de estoque individuais foram preparadas: KNO3 2 M (202 gramas por litro, g/L); Ca(NO3)2 x 2 H2O 2 M (236 g/L); Ferro (quelato de Fe Sprint 300, 38,5 g/L); MgSO4 x 7 H2O 2 M (493 g/L); NKUNO3 1 M (80 g/L). Os micronutrientes com fosfato foram preparado usando: H3BO3 (2,86 g/L); MnCl2 χ 4H20 (1,81 g/L); ZnSO4 x 7HzO (0,22 g/L); CuSO4 (0,051 g/L); H3MoO4 χ H2O (0,09 g/L); KH2PO4 1 M (pH até 6,0 com KOH 3 M (136 g/L). Para preparar o meio de crescimento de Hoagland, as soluções de estoque foram combinadas com cerca de 0,5 L de água como segue: KNO3 2 M (2,5 mililitros, ml); Ca(NO3)2 2 M (2,5 ml); Ferro (1,5 ml); MgSO4 2 M (1,0 ml); NH4NO3 1 M (1,0 ml); Solução de Micronutriente (1,0 ml). Finalmente, a mistura foi diluída a um volume total de 1 L com água.

EXEMPLO 1 - PRODUÇÃO DE TECIDO VEGETAL REGENERÁVEL DE CANA DE AÇÚCAR, FRAGMENTAÇÃO E PREPARAÇÃO SUBSEQUENTES DE PLANTINHAS

O exemplo abaixo foi designado para preparar plantinhas que podem ser usadas para a encapsulação nos recipientes de papel e plástico para a produção de sementes artificiais de cana de açúcar. Semana 1- Início da cultura

1. Talos de cana de açúcar de plantas com 2 a 12 meses de idade das variedades CPOl-1372 ou KQ228 foram cortados no dia ou um dia antes da excisão do tecido meristemático (daqui em diante chamada de explante) para cultivar. As lâminas de folha foram aparado tentes, deixando as bainhas das folhas intactas. Os talos foram armazenados em sacos plásticos durante a noite na temperatura ambiente se necessário.

2. Os talos foram aparados ficar mais próximo ao meristema e depois de duas a três bainhas de folha externas foram removidas. Os talos foram pulverizados com etanol a 70 % até saturar a superfície externa. Etanol foi pulverizado para manter a esterilidade na superfície de cada bainha de folha. Os talos foram depois transferidos para dentro de capelas de fluxo laminar.

3. As bainhas de folha foram depois removidas para estabelecer a posição do meristema, o talo foi cortados de 2 a 3 centímetro (cm) abaixo deste ponto e 2 a 3 cm acima deste ponto e foi colocado na superfície estéril de uma placa de petri.

4. Finalmente, o meristema foi dividido na metade longitudinalmente e as duas metades aparadas colocadas diretamente sobre o meio de proliferação. A superfície cortada foi embutida no meio e as placas de petri foram seladas com fita de filtração porosa para possibilitar a troca de gases e manter a esterilidade.

5. O explante foi cultivado a 26°C, com tubos fluorescentes de watts F32T8/ADV841/XEN com intensidade de luz de 30 microEinsteins/m2/s da Philips.

Semanas 2 a 3: Estabelecimento da cultura e estágio inicial de crescimento e proliferação do explante

1. Os explantes tornam-se marrons nas superfícies cortadas devido aos polifenóis que exudam no meio.

2. Sob condições estéreis, as extremidades cortadas de explante foram aparadas tomando-se o cuidado para não cortar os tecidos regeneráveis a partir dos quais os brotos surgem. O tecido externo enegrecido do explante foi removido como necessário com excisão de tecido mínima.

3. Os brotos de qualquer um dos brotos laterais que surgem do lado superior da seção foram aparados.

4. Folhas e brotos foram aparados como necessário.

5. Os explantes em crescimento foram transferidos para meio fresco uma vez por semana.

Semanas de 4 a 5: Desenvolvimento de broto proliferado

1. Uma vez que os explantes começam a proliferar, eles foram divididos em pedaços menores de brotos proliferantes.

2. O tecido enegrecido de brotos proliferantes foi removido e a cada pedaço de broto foi dada uma superfície cortada fresca para bom contato com o meio de ágar de proliferação fresco.

3. As folhas e brotos que crescem a partir dos brotos foram aparados a < 1 cm com tesouras ou bisturis estéreis.

4. Outro tanto do tecido de talo original quanto possível foi removido deixando atrás apenas os brotos proliferantes.

5. Os brotos foram transferidos para meio fresco.

Semanas de 5 a 6: Fragmentação e regeneração da plantinha

1. O tecido de broto proliferado foi tipicamente pronto para a fragmentação e regeneração de plantinhas depois de 7 semanas de crescimento. Entretanto, os brotos proliferados foram ocasionalmente usados tão jovens quanto 6 semanas ou tão velhos quanto 9 semanas depois do início.

2. A fragmentação foi feita pelo corte das massas de broto proliferados com tesouras para encurtar os brotos para 2 e 3 milímetros (mm).

3. Os brotos proliferados 'aparados' foram depois fragmentados usando bisturis estéreis para cortar a massa de broto em pedaços de 2 a 3 mm usando um padrão de grade de 2 mm como uma guia.

4. Os fragmentos cúbicos de aproximadamente 2 mm foram colocados diretamente dentro do meio de geração da plantinha (MS com 30 g/L de sacarose sem regulador do crescimento de plantas).

5. Fragmentos foram cultivados em 50 a 100 ml do meio de regeneração líquido em frascos de policarbonato de 250 mililitros (ml) estéreis com filtros de ar com 15 a 20 fragmentos por frasco em um agitador rotativo a 75 revoluções por minuto (rpm) para formar plantinhas.

6. As culturas foram incubadas a 26°C com tubo fluorescente branco frio de 25 watt F32T8/ADV841/XEN com 60 microEinsteins/m2/s de luz da Philips nos recipientes por um período de 2 a 3 semanas para fornecer plantinhas para o uso na semente artificial.

EXEMPLO 2 - ENCAPSULACÃO DE PLANTINHAS DE CANA DE ACÚCAR EM RECIPIENTES DE PAPEL ENCERADO PARA FORNECER SEMENTES ARTIFICIAIS

Sementes artificiais foram construídas como mostrado na Figura 1. Um recipiente de papel encerado cilíndrico (4) (Canudo de refresco colossal Aardvark5 1,19 cm de diâmetro externo) foi cortado em comprimentos de 6 cm. Um pedaço pequeno de algodão (6) foi inserido em uma abertura do recipiente de papel encerado e o recipiente foi autoclavado. Em uma capela de fluxo laminar, a outra abertura do recipiente de papel encerado, que não conteve o algodão, foi espetada em uma PLACA DE PETRI contendo uma camada de aproximadamente 1 cm de ágar Difco® a 0,8 porcento em peso (% em peso) contendo nutrientes MS, 0,2 % em peso de Plant Preservative Mixture® (PPM) e 30 g/L de sacarose, duas vezes para se obter um tampão de aproximadamente 2 cm de ágar (5) que foi empurrado para baixo, usando um recipiente de papel encerado mais fino, sobre a camada de algodão no recipiente de papel encerado. As plantinhas de cana de açúcar, que foram regeneradas (3) a partir dos fragmentos de tecido de broto proliferado em meio de regeneração de plantinha por 14 dias após a fragmentação (como descrito no Exemplo 1) foram colocados no topo do ágar e depois ambas as aberturas do recipiente de papel encerado foram presas (1) com Parafilm® M manualmente pré-estirado para fornecer sementes artificiais. As sementes artificiais foram plantadas em vermiculita autoclavada em 10 cm de vasos plásticos com bandejas de plástico por baixo para coletar água, e orientado verticalmente, de modo que as aberturas de topo das sementes artificiais estivessem a cerca de 0,5 cm acima da superfície de vermiculita. As sementes artificiais foram deixadas em uma câmara de crescimento do tipo armário grande (Conviron modelo BDW-120) a 22°C (dia) e 20°C (noite), com 16 horas de fotoperíodo a 220 uE/m /s. A vermiculita foi regada diariamente com água destilada filtrada e os vasos foram cobertos com uma cúpula plástica clara.

Depois de 6 dias na câmara de crescimento, uma plantinha de cana de açúcar começou a brotar (aparecer folha) através do fechamento de topo de Parafilm® M. Depois de 13 dias, 3 das sementes artificiais tiveram plantinhas crescendo através do fechamento de topo e uma plantinha teve raízes brotaram através do fechamento de fundo. A cúpula de plástico claro foi removida dos casos contendo as sementes artificiais brotaram e elas foram regadas com meio nutriente de Hoagland na metade da concentração. Depois de 17 dias, uma quarta semente artificial teve uma plantinha crescendo através do topo. Quando o experimento foi interrompido em 38 dias, 4 das 6 sementes artificiais sem plantinhas brotaram contiveram plantas vivas dentro do recipiente. Em uma outra semente artificial não crescida crescimento fungico foi observado, embora o tecido estivesse ainda verde e vivo. As 4 plantinhas que cresceram continuaram a crescer e pareceram saudáveis. EXEMPLO 3 - COMPARAÇÃO DO EFEITO DE ABERTURAS PLANAS VERSUS ABERTURAS PROVIDAS DE AMEIAS EM SEMENTES ARTIFICIAIS SOBRE O CRESCIMENTO DAS PLANTINHAS

Este Exemplo foi planejado para estudar o efeito de ameiação na abertura de fundo das sementes artificiais sobre a melhora da penetração da raiz. Recipientes de papel encerados foram cortados em comprimentos de 4 cm com aberturas de topo e fiando planas, e comparada com recipientes de papel de 5 cm com aberturas providas de ameias. A ameiação foi o resultado do corte de três abas de 1 cm de comprimento e 3 a 4 mm de largura para fora de uma abertura do recipiente (Figura 2). A ameiação foi usada apenas na abertura de fundo do recipiente de papel encerado. Uma comparação também foi feita entre a presença e ausência de ágar nas sementes artificiais sobre o crescimento do tecido neste Exemplo. Sementes artificiais (com ou sem ameiação e com ou sem ágar) foram construídas em uma capela de fluxo laminar. Neste experimento, ágar teve a mesma composição como descrita no Exemplo 2, exceto que 20 g/L de sacarose foram usados ao invés de 30 g/L de sacarose. Parafilm® M manualmente pré-estirado foi usado para fechar as aberturas de topo e fundo dos recipientes depois que as plantinhas de cana de açúcar, que foram regeneradas dos fragmentos de tecido de meristema (variedade CPO1-1372) no meio de regeneração por 15 dias após a fragmentação foram adicionadas ao recipiente de papel encerados. Nenhum algodão foi usado neste experimento.

As sementes artificiais foram plantadas em uma câmara de crescimento (Conviron CGR-962) a 31°C dia, 22°C noite, 14 horas de fotoperíodo, 220 uE/m2) em solo Metro-Mix®-360, em vasos plásticos de 10 cm com uma bandeja no fundo e fechamentos de plástico claro no topo. Inicialmente, no dia 0, o solo foi regado a 100 ml por vaso de 10 cm, e foi regado com a mesma quantidade semanalmente daí em diante. Grânulos de fertilizante Osmocote® foram aplicados ao solo como recomendado pelo fabricante. A Tabela 1 resume os resultados deste experimento.

TABELA 1

Efeito de aberturas providas de ameias e a presença ou ausência de ágar sobre o crescimento de cana de açúcar a partir das sementes artificiais

# inicial de recipientes % de Crescimento no dia 23 % de brotos com 10 cm ou mais altos no dia 23 Abertura plana - ágar 10 90 50 Abertura provida de ameias - ágar 10 100 50 Abertura plana - nenhum ágar 6 67 33 Abertura provida de ameias - nenhum ágar 4 50 50 Como mostrado na Tabela 1, a ameiação na abertura do recipiente nãoo teve nenhum efeito substancial sobre o brotamento ou o crescimento do tecido vegetal em sementes artificiais. Pareceu haver um leve efeito nocivo de omitir ágar no brotamento do tecido vegetal.

EXEMPLO 4 - EFEITO DE PLANTIO SEMENTES ARTIFICIAIS NA SUPERFÍCIE OU LEVEMENTE MAIS PROFUNDO NA VERMICULITA Recipientes cilíndricos de papel encerado (5 cm de comprimento, 1,19 cm de diâmetro) foram preparados com aberturas planas, autoclavados, e espetados em ágar como descrito no Exemplo 2. Plantinhas de cana de açúcar, que foram regeneradas a partir dos fragmentos de tecido de meristema (variedade KQ228) em meio de regeneração de plantinha por 14 dias após a fragmentação foram colocadas dentro dos recipientes com as aberturas de topo presas pelo Parafilm® M pré- estirado. As sementes artificiais assim preparadas foram plantadas em vermiculita, com protrusão leve acima da superfície (<0,5 cm), ou com enterramento leve abaixo da superfície (<0,5 cm). As sementes artificiais foram incubadas em vasos plásticos de 10 cm em uma câmara de crescimento do tipo armário grande a 31°C durante o dia, 22°C durante a noite, e 14 horas de fotoperíodo, 220 uE/m2). Os resultados deste experimento são mostrados na Tabela 2.

TABELA 2

Efeito do enterramento das sementes artificiais em vermiculita sobre o brotamento e crescimento da planta. A presença de brotos ou raízes se projetando através do fechamento de Parafilm® M é indicada em cada ponto

de tempo. ND = não determinado.

Dias depois do plantio Enterramento leve abaixo da superfície (<0,5 cm) 5 sementes artificiais plantadas inicialmente # brotando # com raízes emergindo Protrusão leve acima da superfície (<0,5 cm) 5 sementes artificiais plantadas inicialmente # brotando # com raízes emergindo 3 ND 1 ND 7 4 ND 3 ND 9 4 ND 3 ND 12 4 4 4 0 22 4 4 4 1 No geral, nenhuma diferença substancial no brotamento e no crescimento das plantinhas foi observada entre as sementes artificiais que foram enterradas versus aquelas que foram ajustadas na superfície da vermiculita.

EXEMPLO 5 - EFEITO DE FUNGICIDAS SOBRE A

VIABILIDADE DE PLANTINHAS EM SEMENTES ARTIFICIAIS

Este experimento foi realizado para estudar o efeito de fungicidas sobre a prevenção do ataque fungico e sobre a viabilidade das plantinhas nas sementes artificiais. Recipientes cilíndricos de papel encerado ameiados (5 cm de comprimento total, como no Exemplo 3) foram utilizados. Uma solução de fungicida, Maxim 4FS, foi criada pela dispersão de 80 mg de Maxim 4FS em 30 ml de água deionizada (Dl), seguida pela adição de 70 ml de etanol a 70 %. A solução resultante foi clara. Finalmente, doze recipientes foram imersos nesta solução em uma capela de fluxo laminar por aproximadamente 1 minuto (min), seguido pela secagem em uma toalha de papel estéril por 30 min. Um conjunto de controle de 17 recipientes foram imersos em etanol a 70 % e deixados secar na capela de fluxo laminar. Os recipientes foram montados com o meio de ágar padrão como descrito no Exemplo 2 e as plantinhas (cultivar CPO1-1372), que foram cultivadas por 14 dias a partir dos fragmentos de tecido de broto proliferado, foram inseridas dentro do meio de crescimento. Ambas as aberturas das sementes artificiais assim preparadas foram presas com Parafilm® M pré-estirado.

As sementes artificiais foram plantadas em Metro-Mix® 360 em vasos plásticos de 10 cm com cúpula de plástico claro e bandejas em uma câmara de crescimento a 310C durante o dia, 22°C durante a noite, e um fotoperíodo de 13 horas (220 uE/m2). A rega foi realizada a partir do fundo, em aproximadamente 100 ml/vaso/semana. O crescimento de algas foi observado na superfície do solo depois de 9 dias, indicando o alto teor de umidade do solo. A umidade do solo (medido com uma sonda Decagon EC-5) • 3 3

variou de -0,3 a 0,7 metros cúbicos por metros cúbicos (m /m ) do teor volumétrico de água durante o curso do experimento. O número de plantinhas crescendo fora da abertura de topo das sementes artificiais foi monitorado periodicamente pela inspeção visual. Como pode ser observado na Figura 3, a presença do fungicida teve um efeito substancial sobre a melhora do brotamento das sementes artificiais (representado pela curva com quadrados brancos na Figura 3) comparada com aquelas sementes artificiais que não contiveram o fungicida (representado pelos quadrados pretos na Figura 3). Além disso, o vigor da planta pareceu ser inferior no conjunto isento de fungicida. Na conclusão do experimento, as sementes artificiais foram removidas do solo e seus conteúdos foram examinados. Uma quantidade substancialmente maior de crescimento füngico foi observado na superfície interna das sementes artificiais que não foram tratadas com fungicida comparadas com as amostras tratadas com fungicida. EXEMPLO 6 - ADEOUABILIDADE DE VÁRIOS MATERIAIS DE FECHAMENTO DE TOPO PARA APLICAÇÃO EM SEMENTES

ARTIFICIAIS

Este experimento foi conduzido para triar uma série de materiais alternativos para serem usados como fechamento de topo para as sementes artificiais usando os recipientes de papel encerados. Recipientes cilíndricos de papel encerado (4 cm de comprimento total) com ameiação na abertura de fundo foram usados e foram montados como descrito no Exemplo 5, com a exceção do material usado para o fechamento da abertura de topo. Os fechamentos da abertura de fundo neste experimento foram compostos de Parafilm® M pré-estirado. Os recipientes foram também embebidos na solução de fungicida Maxim 4FS antes da montagem como descrito no Exemplo 5. Os materiais de fechamento de topo usados neste teste incluíram sacos plásticos solúveis em água fria com base em poli(álcool vinílico) (Empacotamento extra), sacos plásticos solúveis em água quente também com 10

15

20

base no poli(álcool vinílico) (Empacotamento extra), poli(succinato de 1,3- propanodiol) (película prensada por fusão de 177 a 330 mícrons de espessura), Parafilm® F pré-estirado e Parafilm® M pré-estirado. A película de saco solúvel em água fria foi ligada à abertura de topo do recipiente de papel usando vedação de silicona doméstica enquanto que o poli(succinato de 1,3- propanodiol) foi ligado usando uma pistola de cola quente. Os recipientes foram montados com o meio de ágar padrão descrito no Exemplo 2 e as plantinhas derivadas da cultura líquida de 15 dias de idade foram usadas (cultivar CP01-1372). As sementes artificiais foram plantadas em Metro- Mix® 360 em vasos de plástico de 10 cm com bandejas sem cúpulas de plástico claro em uma câmara de crescimento (Conviron modelo BDW-120) a 310C durante o dia, a 22°C durante a noite, e um fotoperíodo de 13 horas (220 uE/m2). A rega foi realizada a partir do fundo, em aproximadamente 100 ml/vaso/semana. A umidade do solo (medida com uma sonda Decagon EC-5) variou de -0,3 a 0,6 m3/m3 de teor de água volumétrico durante o curso do experimento. O brotamento das plantinhas a partir do topo das sementes artificiais foi monitorado pela inspeção visual durante o curso do experimento

e os resultados são mostrados na Tabela 3.

TABELA 3

Efeito de vários materiais usados para prender a abertura de topo das

Material de Fechamento de Topo Número de sementes artificiais plantados Número de brotamento no dia 47 Porcentagemde brotamento no dia 47 Película de saco plástico solúvel em água fria 10 10 100% Película de saco plástico solúvel em _água quente_ 10 3 30% poli(succinato de 1,3-propanodiol) 10 1 10% Parafilm® F 10 9 90% ParafilmliyM 10 9 90%

Como pode ser observado a partir da tabela acima, os fechamentos de topo com plástico solúvel em água fria forneceram o melhor desempenho de brotamento, e foram comparáveis com o Parafilm® M e Parafilm® F. Os fechamentos que foram mais fortes, ou menos sensíveis à umidade (sacos plásticos solúveis em água quente e poli(succinato de 1,3- propanodiol)) produziram uma porcentagem mais baixa de plantinhas brotando.

EXEMPLO 7 - TRIAGEM DOS MATERIAIS DE FECHAMENTO DE

FUNDO PARA AS SEMENTES ARTIFICIAIS Este experimento foi realizado para triar vários materiais para o fechamento da abertura de fundo para o recipiente de papel encerado para a preparação de sementes artificiais. Neste caso, recipientes cilíndricos de papel encerado de 4 cm de comprimento de extremidade plana foram preparados. Os recipientes foram também embebidos em solução Maxim 4FS antes da montagem como descrito no Exemplo 5. Parafilm® M foi usado como o fechamento de topo em todos os testes. Os materiais de fechamento de fundo incluíram os mesmos materiais descritos no Exemplo 6, com a adição de um papel solúvel em água (Aquasol® ASW-60), composto de carboximetil celulose de sódio, que foi impregnado com cera. A impregnação com cera foi realizada pela embebeção da folha de papel solúvel em água em uma solução a 12 por cento em peso (% em peso) de cera de parafina (ponto de fusão 53 a 57°C) m cicloexano, e possibilitando o solvente de evaporar em uma capela por 18 horas de 20 a 25°C. A impregnação com cera foi intencionado para diminuir a taxa de dissolução do papel solúvel em água. Adicionalmente, poli (3-hidroxibutirato-co-3-hidroxivalerato que inclui 2 % de comonômero de valerato) foi investigado como um dos materiais de fechamento da abertura de fundo. Este fechamento foi preparado pelas pelotas de prensagem por fusão de polímero em uma película de 125 a 177 micrômetro (μηι) de espessura. Estes novos materiais foram ligados ao fundo do recipiente usando uma pistola de cola quente. No topo dos materiais de fechamento sensíveis à umidade (por exemplo, sacos solúveis em água fria e quente e papel solúvel em água impregnado com cera) umas poucas gotas de óleo Crisco® fundido (Τ de aproximadamente 60°C) foram aplicadas para prevenir a umidade do tampão de ágar, dentro do recipiente de papel encerado, de dissolver ou amolecer o fechamento da abertura de fundo antes de adicionar o tecido regenerável. O óleo Crisco® foi deixado esfriar e endurecer antes que o tampão de ágar fosse adicionada. As sementes artificiais foram montadas com o meio de ágar padrão como descrito no Exemplo 2 e tecidos de cana de açúcar regeneráveis cultivados em líquido de 20 dias de idade foram usados (cultivar KQ228). As sementes artificiais foram manualmente colocadas em depressões feitas no Metro-Mix® 360 Metro-Mix® 360 em vasos plásticos de

10 cm com bandejas (sem cúpulas de plástico claro) em uma câmara de crescimento (Conviron modelo BDW-120) a 31°C durante o dia, 22°C

Λ

durante a noite, e um fotoperíodo de 13 horas, 220 uE/m ). A rega foi realizado a partir do fundo, em aproximadamente 100 ml/vaso/semana. A umidade do solo foi medida com uma sonda Decagon EC-5 e variou de -0,3 a

•3 Λ

0,6 m

/m de teor de água volumétrico durante o curso do experimento. O brotamento das plantinhas de sementes artificiais foi monitorado pela inspeção visual durante o curso do experimento e os resultados são mostrados na Tabela 4.

TABELA 4

Examinação de vários materiais para aplicação como o fechamento da

abertura de fundo em sementes artificiais

Material de fechamento da abertura de fundo Número de sementes artificiais plantadas Número de brotamento em dia 45 Porcentagem de brotamento no dia 45 Sacos plásticos solúveis em água fria 10 3 30% Sacos plásticos solúveis em água quente 11 1 9% poli(succinato de 1,3- propanodiol) 6 3 50% ASW60 impregnado com cera 12 9 75% Parafilm® M 18 4 22% poli(3-hidróxi butirato-co- 3-hidróxi valerato) 10 2 20%

Os resultados resumidos na Tabela 4 indicam que o papel solúvel em água ASW 60 impregnado com cera e poli(succinato de 1,3- propanodiol) excedeu o Parafilm® M como o material de fechamento da abertura de fundo, sob as condições de teste. Fechamentos com sacos plásticos solúveis em água fria e poli(3-hidróxi butirato-co-3-hidróxi valerato) desempenharam comparavelmente ao Parafilm® M.

EXEMPLO 8- TRIAGEM DE MATERIAIS A SEREM USADOS PARA A MONTAGEM DO RECIPIENTE DE SEMENTES ARTIFICIAIS

Este experimento foi realizado para triar vários materiais a serem usados para a montagem do recipiente cilíndrico da semente artificial. Quando papel encerado foi usado como o material, recipientes de papel encerado de 4 cm de comprimento com aberturas planas foram preparados. Estes recipientes de papel foram embebidos em solução de Maxim 4FS antes da montagem. Outro material testado foi o poli(3-hidróxi butirato-co-3- hidroxivalerato). O recipiente com este material foi preparado pelas pelotas de prensagem por fusão de polímero em uma película de 125 a 177 μπι de espessura. Um outro material testado foi poli(ácido láctico) (Ingeo® 4032D, NatureWorks, Minnetonka, MN), que foi prensado por fusão em uma película com espessura variando de 245 a 490 μηι. Estes dois materiais de película plástica foram manualmente enrolados em recipientes de parede única de comprimento e diâmetro similares ao papel encerado, e ligado usando uma pistola de cola quente. Para todos os recipientes neste experimento, o Parafilm® M pré-estirado foi usado para o fechamento tanto da abertura de topo quanto da abertura de fundos. Os materiais de película plástica não foram tratados com fungicida.

As sementes artificiais foram montadas com o meio de ágar padrão descrito no Exemplo 2 e tecidos de cana de açúcar regeneráveis de 20 dias de idade foram usados (cultivar KQ228). As sementes artificiais foram plantadas em Metro-Mix® 360 em vasos de plástico de 10 cm com bandejas (nenhuma cúpula de plástico claro) em uma câmara de crescimento (Conviron modelo BDW-120), a 31°C durante o dia, a 22°C durante a noite, e um 15

99

fotoperíodo de 13 horas, (220 uE/m2). A rega foi realizado a partir do fundo das sementes artificiais, em aproximadamente 100 ml/vaso/semana. A umidade do solo foi medida com uma sonda Decagon EC-5 e a mesma vanou de -0,3 a 0,6 m3/m3 de teor de água volumétrico durante o curso do experimento. O brotamento de tecidos a partir das sementes artificiais foi monitorado pela inspeção visual durante o curso do experimento como

mostrado na Tabela 5.

TABELA 5

Comparação do efeito de vários materiais usados para a montagem de

20

25

ieraio) _-------

Os resultados resumidos na Tabela 5 indicam que uma porcentagem mais alta dos tecidos crescidos a partir das sementes artificiais de recipiente de papel encerado comparada com aquelas feitas de poli(ácido láctico) ou poli(3-hidróxi butirato-co-3-hidróxi valerato). Depois que o experimento foi completado, os recipientes foram removidos do solo para inspeção (dia 55). As sementes artificiais de poli(ácido láctico) não apresentaram nenhum sinal de degradação, a» passo que apenas decomposição leve foi observada no caso do poli(3-hidróxi butirato-co-3- hidróxi valerato). Por outro lado, recipientes das sementes artaficims preparadas com papel encerado mostraram níveis altos de degradação. PVFMPT .O 9 - FFFTTO ηκ PT .TMINAR O FSP Λ ΓΠ AKREO NOS

BFriPTENTFS DA SEMENTP. ARTIFICIAL

O propósito do experimento foi estudar o efeito de encher

completamente o recipiente cilíndrico de papel encerado com o meio de ágar descrito acima, eliminando deste modo o espaço aéreo dentro da semente artificial. Isto foi comparado com o projeto padrão em que o espaço aéreo foi deixado acima da plantinha. Recipientes de papel encerado (canudos de papel encerado "Colossal" Aardvark) foram cortados em comprimentos de 4 cm com aberturas planas. Neste experimento, ágar teve a mesma composição como no Exemplo 2, exceto 0,6 % de ágar Difco foi usado ao invés de 8 g/L de ágar. Para os canudos de papel encerado que foram completamente enchidos, uma camada de ~3 cm de ágar foi adicionada ao canudo, seguida por empurrar a plantinha e finalmente adicionando mais ágar até o topo do canudo de papel encerado. Os recipientes de controle foram feitos com um tampão de ágar de ~2 cm. Parafilm® M manualmente pré-estirado foi usado para prender ambas aberturas do recipiente depois que plantinhas de cana de açúcar de 14 dias de idade (CP01-1372) foram introduzidas para completar a semente artificial.

As sementes artificiais foram plantadas em uma câmara de crescimento (Conviron CGR-962, 31°C dia, 22°C noite, 14 horas de fotoperíodo (220 μΕ/m2) em solo Metro-Mix®-360 com 0,5 % em peso de Osmocote® 17 em vasos de plástico de 10 cm com uma bandeja no fundo e tampa de plástico claro no topo (removido em 10 dias). Inicialmente, o solo foi regado a 100 ml por vaso de 10 cm, e foi regado com a mesma quantidade semanalmente daí em diante. Os resultados são dados abaixo na Tabela 6.

TABELA 6

Efeito de encher os recipientes sobre o brotamento e crescimento._

Sementes artificiais plantadas # de Brotadas no dia 10 # Brotadas no dia 17 Altura aproximada das plantas dia 35 (cm) Cheio - nenhum espaço aéreo 10 5 9 5 a 12,5 Controle - com espaço aéreo 10 9 10 20 a 45

Os resultados resumidos na Tabela 6 indicam que encher os

recipientes com ágar teve um efeito nocivo sobre a taxa de brotamento, taxa de crescimento e tamanho final das plantinhas de cana de açúcar das sementes artificiais.

EXEMPLO IO-A IDADE DA PLANTINHA REGENERADA DETERMINA A FREQÜÊNCIA DE BROTAMENTO DAS PLANTINHAS

EM SEMENTES ARTIFICIAIS Preparação de plantinhas de cana de açúcar e sementes

artificiais

Neste experimento fragmentos de tecido de meristema de 3 mm de cana de açúcar variedade KQ228 foram produzidos sob as mesmas condições experimentais como descrito no Exemplo 1 exceto no mencionado abaixo. Eles foram cultivados em meio de regeneração de plantinha (cultura líquida) por 10, 15 e 20 dias para gerar plantinhas de idades diferentes para a encapsulação em sementes artificiais. Visto que as plantinhas de 10 dias de idade foram muito pequenas e não desenvolveram bem, todas as culturas foram transferidas para um meio MS solidificado com ágar (6 g/L) e cultivado por mais 10 dias. As culturas foram mantidas em uma câmara de crescimento

Λ

ajustada a 26°C com 16 h de fotoperíodo (30 microEinsteins/m /s de tubos fluorescentes de 25 watts da Philips). A partir de cada uma destas três idades, plantinhas de 1 a 1,5 cm de comprimento foram separadas e designadas Grupo 1, ao passo que as plantinhas maiores foram aparadas até 1,6 a 2,0 cm de comprimento e designadas como Grupo 2 (Figura 4). As sementes artificiais foram construídas com recipientes plásticos cilíndricos de dois tamanhos diferentes (4,0 cm de comprimento χ 0,8 cm de diâmetro e 6,0 cm de comprimento χ 1,1 cm de diâmetro; abertos em ambas as extremidades), produzidos a partir de cilindros plásticos comercialmente disponíveis (canudos de refrigerante de polipropileno, obtidos de uma loja local em Brisbane, Austrália). Os recipientes menores receberam plantinhas com 1 a 1,5 cm de comprimento (Grupo 1) enquanto que os maiores tiveram plantinhas com 1,5 a 2 cm de comprimento (Grupo 2). Com as combinações de idade da plantinha e tamanho do recipiente um total de seis combinações diferentes [2 tamanhos de recipientes cilíndricos (4 e 6 cm de comprimento) χ 3 idades de plantinha (10, 15, 20 dias em meio de regeneração líquido e seguidos por 10 dias em mio de ágar)] foram testadas. A abertura de fundo do plástico recipiente foi mantida parcialmente fechada por grampos. Esta montagem facilitou o crescimento desimpedido da raiz. Outros componentes e as etapas envolvidas na construção das sementes artificiais de acordo com este Exemplo são detalhados abaixo.

O recipiente plástico foi empacotado em 3/4 do volume com solo de jardim (comercialmente vendido como cobertura de topo para viveiros de planta) com um cristal de água de 2 mm de comprimento (Searles® Cristais aquosos), um composto sintético altamente higroscópico capaz de conter quantidades grandes de água e nutrientes, colocado no meio da coluna de solo. Plantinhas de cana de açúcar como preparadas acima foram depois inseridas dentro dos recipientes de plástico em um tal modo que pelo menos metade do comprimento da plantinha foi enterrada no solo, deixando as porções remanescentes expostas ao espaço aéreo. Em seguida, nutrientes MS líquidos contendo 1 g/L de meio Mancozeb (Searles®), um fungicida para propósito geral comercial foi adicionado ao solo até a capacidade de contensão de água completa. A construção da semente artificial foi completada prendendo-se a abertura de topo com Nescofilm® totalmente estirado (Bando Chemical Industries, Japão), uma película de selagem termoplástica flexível, à prova de umidade (Figura 5).

Plantando sementes artificiais na estufa As sementes artificiais preparadas como descrito acima foram

plantadas em bandejas plásticas para mudas (35 χ 29 cm; 64 cavidades, 4 cm de profundidade) contendo solo de jardim (cobertura de topo comercialmente disponíveis) enchidas até o topo. Cada semente artificial foi plantada em um tal modo que pelo menos 1 cm das sementes artificiais pequenas (4 cm de comprimento) e 2 cm das maiores (6 cm de comprimento) foram mantidos acima do solo (Figura 6). Pelo menos 20 sementes artificiais foram plantadas para cada tipo de construção de recipiente. Como um tratamento de controle, plantinhas do grupo 1 de cada idade de cultura (10, 15, 20 dias em meio de regeneração líquido e 10 dias em meio de ágar daí em diante), foram plantadas diretamente no solo. Todas as bandejas foram cobertas com folhas planas de plástico transparente por 12 dias. As bandejas foram irrigadas ate a capacidade de campo completa duas vezes por semana alternadamente com água de torneira e Thrive® (4 g / 9 L), uma preparação nutriente para

propósito geral comercialmente disponível.

A porcentagem de plantas brotaram a partir das sementes

artificiais (definidas como aquelas com brotos que emergiram através do Nescofilm®) foi registrada três semanas depois do plantio (Figura 7). Os dados mostram que a idade das plantinhas na semente artificial desempenhou um papel significante na sua sobrevivência e capacidade de brotamento. Neste teste, depois de 3 semanas, a porcentagem de brotamento das plantinhas que foram inicialmente cultivadas em culturas líquidas por 20 dias (Figura 7, coluna cinza claro), foi substancialmente mais alto (pelo menos 70 % de crescimento) independente de se elas foram encapsuladas em uma semente artificial (Figura 7, colunas cinza médio e cinza escuro) ou se elas foram plantadas diretamente no solo. A porcentagem de sobrevivência das plantinhas obtidas de uma cultura líquida de 10 dias variou de 25 a 40 % nas sementes artificiais e levemente mais alto quando plantadas diretamente no solo. A taxa alta de mortalidade nas sementes artificiais foi devido à alta

incidência de contaminação fungica.

EXEMPLO Jl- COMPARAÇÃO. DH SUBSl^TO^D^^N™

^FS^^msmmBmmÈmA^^ÈmASAiLmmsA

DF, SEMENTF.S ARTIFICIAIS

P^rKn das dar**··, de cana de wflcr e sementes

artificiais

Este experimento foi realizado para determinar se me.o sem solo (por exemplo, Perlita, musgo turfoso e cristais aquosos Searles®) melhoraram a sobrevivência e o crescimento de plantinhas em sementes artificiais. A variedade de cana de açúcar KQ228 foi usada. A preparação de fragmentos de tecido foi similar àquela descrita no Exemplo 1. Os fragmentos de broto proliferados (3 mm) foram depois cultivados no meio de regeneração de plantinha com a adição de 2 μΜ de NAA por 17 dias para que as mesmas começassem a enraizar. No final deste estágio o tamanho das plantinhas formadas variou de 1,2 a 3,2 cm. Estas plantinhas foram usadas para a encapsulação nas sementes artificiais. Para a maior parte delas o desenvolvimento de raiz não foi visível (Figura 8).

Recipientes plásticos cilíndricos (canudos de refrigerante de polipropileno com 6 cm de comprimento, 1,1 cm de diâmetro) foram usados neste experimento e eles foram preparados seguindo o procedimento descrito no Exemplo 10 exceto que 5 composições diferentes (T), como listado abaixo, foram usados neste experimento. A composição dos tratamentos foram: em Tla plantinha foi plantada diretamente no solo sem o uso de um recipiente de semente; em T2 a semente artificial conteve solo de jardim (similar a aquele usado no Exemplo 10); em T3 a semente artificial conteve solo de jardim, e cristais aquosos (1 g de cristais secos por L de solo; Searles®); em T4 a semente artificial conteve mistura de musgo turfoso e perlita em volume igual mais cristal aquoso (1 g de cristais secos por L de solo); em T5 a semente artificial conteve apenas cristal aquoso. O fungicida Ridomil (1 g/L de solo) e nutrientes Thrive® (Yates), fornecidos como líquido (0,44 g / L de solução), foram adicionados a todos os tratamentos.

Detalhes Experimentais

Pelo menos 30 sementes artificiais foram preparadas para cada tratamento e um número similar de plantinhas foi também usado para o plantio direto (controle). Cerca de 75 % do volume de cada recipiente foi enchido com meio sem solo e os recipientes foram irrigados até a capacidade de campo completa com solução de Thrive®. Experimentos foram realizados em bandejas plásticas (500 mm χ 380 mm χ 80 mm) perfuradas com 20 furos (1 cm no diâmetro) em uma estufa sem nenhum controle ambiental. Todas as bandejas foram revestidas com 2 camadas de toalhas de papel e depois enchidas com solo de jardim, e umedecidas com água até a capacidade de campo completa. Sementes artificiais foram plantadas com suas aberturas de topo mantidas pelo menos 1 cm acima do solo. Todos os tratamentos foram irrigados com água no dia 0 e uma vez a cada semana daí em diante. Todos os / tratamentos foram fertilizados no dia 0 e depois quinzenalmente com 2,0 L por bandeja de Thrive® (4 g / 9 L). O número de plantinhas que sobreviveram no controle (Tl) e emergência de broto nos tratamentos (T2 - T5) foram registrados nos dias 7, 14, 21, 28, 31, 40 e 63. Os resultados resumidos na Figura 9 indicam que a

sobrevivência mais alta (80 %) foi observada com o controle Tl em que a plantinha foi plantada diretamente no solo sem um recipiente. O recipiente T4, com mistura de musgo turfoso e perlita em volume igual mais cristal aquoso, teve a porcentagem de brotamento mais alta de plantinhas (63 %) entre os testes com recipientes seguido por T2, contendo apenas solo de jardim (37 %), e T3, contendo solo de jardim e cristais aquosos (33 %). T5, contendo apenas cristais aquosos, demonstrou o brotamento mais baixo (7 %).

Os resultados resumidos na Figura 10 indicam que a altura do broto e o número de brotos foram similares em T1-T4, mas foram significantemente mais baixos para o tratamento T5.

Os resultados deste teste demonstraram que o uso combinado de cristais aquosos com outros substratos tais como musgo turfoso e perlita é uma boa escolha para estabelecer plantinhas sem raízes bem desenvolvidas. EXEMPLO 12 - DESEMPENHO DE SEMENTES ARTIFICIAIS NO CAMPO

Preparação de construções de semente artificial

Este experimento foi planejado para demonstrar o brotamento e estabelecimento bem sucedido de plantinhas derivadas de sementes artificiais de cana de açúcar. A variedade de cana de açúcar KQ228 foi usada neste experimento. A preparação das sementes artificiais foi similar àquela descrita no Exemplo 10, exceto que recipientes cilíndricos tanto de plástico quanto de papel encerado (Canudo de refresco colossal Aardvark5 1,19 cm de diâmetro) foram utilizados para comparação. Os recipientes plásticos foram de 6 cm de comprimento 1,1 cm de diâmetro com abertura de fundo grampeado para fechamento parcial. Além disso, a mistura de solo de jardim usada foi suplementada com o fungicida Ridomil (1 g por L de solo) e Cristais aquosos Searles® (1 g de cristais secos por L de solo), e saturado com Thrive® líquido na metade da concentração (Yates). Os cristais aquosos foram pré-hidratados com Thrive® na metade da concentração (2 g / 9 L) e depois misturadas com o solo antes de preparar a construção. As plantinhas de cana de açúcar foram cultivadas por 2 a 3 semanas em cultura líquida e depois cultivada por um adicional de 4 a 6 semanas de idade (as plantinhas foram cultivadas em ágar com 30 g/L de sacarose e nutrientes MS; Figura 11), e foram aparadas a 3 a 4 cm de altura antes da inserção dentro dos recipientes. Tanto os brotos quanto as raízes das plantinhas foram aparadas. As plantinhas foram colocadas a cerca de 1,5 cm de profundidade no solo no recipiente.

Plantando no campo

O teste de campo foi conduzido em uma fazenda experimental em BSES Burdekin Research Station, Ayr, Austrália. O campo foi preparado similar à prática comercial (isto é, espaçamento de fileira de 1,5 m) usado para o plantio de pedaços de cana de açúcar convencional como é bem conhecido na técnica relevante. Sulcos de cerca de 100 metros de comprimento foram preparados com 1,5 m de intervalo entre os sulcos e irrigados até a capacidade de campo completa 2 a 3 dias antes do plantio. As sementes artificiais foram plantadas dentro dos sulcos em covas que foram de a 6 cm de profundidade e 1,2 cm de diâmetro, e pulverizadas com água imediatamente depois do plantio para estabelecer boas conexões entre o solo e a semente artificial. Os sulcos plantados foram irrigados a cada terceiro dia durante os primeiros 10 dias e depois a irrigação continuou uma vez por semana. Quase 100 sementes artificiais cada de papel e plástico foram plantadas (Figura 12). Como controle, mudas de idade similar, e similarmente produzidas, foram plantadas diretamente no campo e receberam tratamentos de campo similares.

Cincox semanas depois do plantio, o número de plantas que emergiu das sementes artificiais foi registrado. A Figura 13 mostra que aproximadamente 55 % das plantinhas nas sementes artificiais com recipientes plásticos cresceram e emergiram através dos fechamentos com Nescofilm® e sobreviveram. Estes resultados mostram uma taxa muito mais alta de emergência de plantinha quando recipientes plásticos são usados para a construção das sementes artificiais comparada com as sementes artificiais construídas com recipientes de papel ou plantio direto. A Figura 14 mostra fotografias de plantas produzidas a partir de sementes artificiais fabricadas a partir de recipientes plásticos (painel de topo) e em plantinhas diretamente plantadas no solo (painel de fundo à direita) depois de 5 semanas de crescimento. O sistema de raiz foi bem desenvolvido nas plantas em sementes artificiais (painel de fundo à esquerda)

Os resultados obtidos a partir deste experimento de campo indicam que usar sementes artificiais em recipientes de papel ou plástico permitiu o estabelecimento de plantinhas no campo sob condições similares às práticas de plantio comercial.

EXEMPLO 13 - EFEITO DE ABERTURAS LATERAIS SOBRE A SOBREVIVÊNCIA E BROTAMENTO DE PLANTINHAS EM SEMENTES ARTIFICIAIS NAS SEMENTES ARTIFICIAIS HORIZONTALMENTE PLANTADAS

O propósito do exemplo foi comparar o crescimento e sobrevivência de plantinhas em sementes artificiais plantadas no solo na orientação horizontal que teve aberturas adicionais na lateral do recipiente (Figura 15, 8), com recipientes que tiveram aberturas apenas no topo e na extremidade de fundos da semente artificial.

Recipientes de papel encerado (5 cm de comprimento) foram

esterilizados pela autoclavagem. Os recipientes foram providos com ameias

(Figura 15, 7) em uma abertura ou planos em ambas as extremidades (Figura

15, 9). As aberturas circulares/(5 mm de diâmetro) foram perfuradas nas

paredes dos recipientes próximo à extremidade plana no caso dos recipientes

providos com ameias, ou próximo a ambas as extremidades no caso dos

recipientes terminados planos. Os recipientes foram montados com tampões

de ágar contendo nutrientes como descrito no Exemplo 2 e as plantinhas de

cana de açúcar, que foram regeneradas a partir de fragmentos de tecido de

meristema (variedade KQ228) no meio de regeneração de plantinha por 15

dias após a fragmentação foram colocadas dentro dos recipientes. Todas as

aberturas foram presas com Parafilm® M pré-estirado. As sementes artificiais

assim preparadas foram plantadas em Metro-Mix® 360 com as aberturas

laterais expostas, ou levemente enterradas sob o solo. Um conjunto de

controle foi criado sem aberturas laterais e foram plantados horizontalmente,

mas deixados parcialmente expostos à superfície em que a lateral da semente

artificial foi visível através do solo, mas as aberturas da semente artificial não

se estenderam acima da superfície do solo. As sementes artificiais foram

cultivadas em vasos de plástico de 10 cm em uma câmara de crescimento

(Conviron CGR-962, 31°C dia, 22°C noite, 14 horas de fotoperíodo, 220 ^ 2 · · ·

uE/m ), inicialmente com cúpulas plásticas cobrindo os vasos. As coberturas plásticas foram removidas depois de 16 dias. Os resultados do experimento são dados abaixo na Tabela 7. TABELA 7

Efeito de janelas sobre a sobrevivência e brotamento de plantinhas nas sementes artificiais quando plantadas horizontalmente

Recipiente Orientação de plantio # de sementes artificiais plantadas inicialmente # Brotaram através das aberturas laterais no dia 19 # Brotaram através das abertura de topo no dia 19 # Vivas mas não brotadas no dia 19 # mortas no dia 19 Providas com ameias com 2 aberturas laterais na abertura plana Horizontal, parcialmente coberta com solo 10 3 / 0 2 5 Aberturas planas, com 2 aberturas laterais em cada extremidade Horizontal, parcialmente cobertas com solo 5 1 1 1 2 Aberturas planas, com 2 aberturas laterais em cada extremidade Horizontal, leve e completamente cobertas com solo 5 0 0 0 5 Providas com ameias sem aberturas laterais Horizontal, parcialmente coberta com solo 5 0 0 0 5 Providas com ameias sem aberturas laterais Vertical, expostas no topo à superfície 5 N/A 2 0 3

Os resultados na Tabela 7 indicam que a presença de aberturas

laterais melhorou a sobrevivência das plantinhas quando as sementes artificiais são plantadas horizontalmente.

EXEMPLO 14 - EFEITO DE PLANTIO DE SEMENTES ARTIFICIAIS DE CABECA PARA BAIXO

O propósito do experimento foi para estudar o efeito do plantio de sementes artificiais em uma orientação de cabeça para baixo, vertical (com os brotos das plantinha apontando para baixo). Recipientes de papel encerado (5 cm de comprimento) foram preparados com ameiação, mas sem aberturas laterais. Os recipientes foram montados com tampões de ágar contendo nutrientes como descrito no Exemplo 2 e as plantinhas de cana de açúcar, que foram regeneradas a partir de tecido de meristema fragmentado (variedade CP01-1372) em meio de regeneração de plantinha por 14 dias após a fragmentação foram colocados dentro dos recipientes. Todas as aberturas foram presas com Parafilm® M pré-estirado. As sementes artificiais assim preparadas foram plantadas em Metro-Mix® 360 verticalmente em uma orientação de cabeça para baixo ou normal (o lado certo para cima). As sementes artificiais foram incubadas em vasos de plástico de 10 cm em uma câmara de crescimento (Conviron CGR-962, 3 IoC dia, 22oC noite, 14 h de fotoperíodo, 220 uE/m2), inicialmente com cúpulas plásticas cobrindo os vasos. As coberturas plásticas foram removidas depois de aproximadamente 14 dias. Os resultados são dados abaixo na Tabela 8.

TABELA 8

Efeito do plantio de sementes artificiais em uma configuração de

cabeça para baixo

Orientação de plantio # sementes artificiais plantadas inicialmente # Brotaram no dia 18 # Vivas porém não brotadas no dia 18 # Mortas no dia 18 Vertical, de cabeça para baixo 8 5 1 2 Vertical, controle com o lado certo para cima 9 8 0 1

Os resultados resumidos na Tabela 8, indicam que as sementes

artificiais que foram plantadas na configuração de cabeça para baixo resultaram em brotamento inferior comparado com o controle de sementes artificiais plantadas na configuração com o lado certo para cima. EXEMPLO 15 - SÍNTESE DE COPOLÍMEROS DE BLOCO DE POLIÉTER PARA O USO EM SEMENTES ARTIFICIAIS

A síntese de uma série de copolímero de bloco de poliéster foi empreendida de modo a criar um material biodegradável adequado para o uso como tampas de semente sintética, que tivesse propriedades mecânicas adequadas para possibilitar a penetração pelos brotos da planta que emergem. Primeiro, 3,00 g de 3,6-Dimetil~l,4-dioxano-2,5-diona foram pesados em um frasco de fundo redondo de 50 ml contendo uma barra agitadora magnética em uma atmosfera de nitrogênio em uma caixa de luvas. Em seguida, 0,020 g de 2-etilexanoato de estanho (II) foi pesado dentro do frasco. 3,00 g de ε- caprolactona foi adicionada ao frasco, junto com 0,025 g de 1,4- benzenodimetanol. Um condensador foi ligado ao frasco e o mesmo foi removido da caixa de luvas e imediatamente purgado com gás nitrogênio. O frasco foi depois aquecido a 140°C sob uma atmosfera de nitrogênio com um banho de óleo e magneticamente agitado por 24 horas. Depois de 24 horas, uma pequena quantidade de polímero foi amostrada para análise, e um adicional de 3,00 g de 3,6-Dimetil-l,4-dioxano-2,5-diona foi adicionado. O

aquecimento e a agitação foram retomados por 3 horas. O produto final fin

esfriado até a temperatura ambiente, dissolvido em clorofórmio e gotejado em

um excesso de hexano/metanol (90/10 v/v) de modo a precipitar o polímero.

O produto final foi secado em uma estufa a vácuo a 60°C por 3 dias.

Uma série de polímeros foi sintetizada usando esta

metodologia, com as variações descritas na Tabela 9, que inclui o uso de agitação mecânica, e monômeros quirais, de modo a se obter vanas propriedades. Os pesos moleculares do polímero foram caracterizados usando a cromatografia de exclusão de tamanho em solvente de tetraidrofurano (THF), com um detetor de dispersão de luz de laser de ângulo múltiplo. O peso molecular do bloco intermediário foi determinado a partir da amostra tomada no final da primeira etapa, e este foi subtraído do peso molecular do produto final para determinar os pesos moleculares do primeiro e ultimo blocos (eles foram assumidos serem igualmente distribuídos devtdo a

disfuncionalidade do iniciador).

TARRT A 9. Comrrtgi^aft » narâmetros de j^s^^S-Mm*^

copolímeros de bloco de poliéster.

Amostra

PLA-7

Composição

PLA-8

PLA-9

PnlifD-T.-lactldeo-b- ΓΤΤ .-lactfdeo-co-ε- caprolactona-b-D.L- lactideo)

Método de agitação

Magnético

duração da 2a

aquecimento

3 horas

Poli(L-lactideo-b-D.L- iactldeo-co-ε- caprolactona-b-L- Iactideo)

Poli(L-lactideo-b-D.L- lactideo-co-ε- caprol actona-b-L- lactídeo)

Mecânico

mnlw.nlares dos hlnms alvejados (primeiro, intermediário, último, kg/mol)

8 7. ■ 33.1 . 8,2

8 horas

8 7 33.1 . 8,2

^ccnc moleculares do bloco medidos.

usando a ^rnmatografia de

exclusão de tamanho, média numérica

7,0. 19.4.2.0

Polidispersivi- Hade medida {PDIlEelâ rxnmatografia rfp. reclusão de tamanho

1.83

I1S 18.0. 1.5

8 7..65.4.8,2

ND

1.43

1,40

_Ia^uucuiJ___._______ρ

PYPMPm - ηο>-π>ΑΤ?ΑΓΑΟ DE COMPQSIgÕESDAIMffiADE

PFT ,TCIILA ΑΡ'ΓΤΠΝΑΙ ΕΜ SE^mtps ARTIFICIAIS

Recipientes de papel encerado (5 cm de comprimento, 1,19 cm

de diâmetro) foram cortados a partir de seções mais longas. As extremidades do fundo foram manualmente plissadas (Figura 16). Depois, Metro-Mix® 360 foi adicionado ao tubo, para criar uma camada de aproximadamente 1 cm de espessura no fundo do tubo. Uma plantinha de cana de açúcar, que foi aparada até aproximadamente 3 cm de comprimento foi depois colocada no topo do tampão de solo, e solo adicional foi adicionado ao tubo de modo que o tubo fosse aproximadamente 75 % cheio, e 1 ml de água foi adicionado. O topo do tubo foi preso com um dos vários métodos descritos abaixo. Em um caso, Parafilm® M pré-estirado foi usado para cobrir o topo da semente artificial. Em um outro caso, uma película de 38 μπι de espessura foi formada pela moldagem de PLA-8 (Exemplo 15) a partir de uma solução a 25 % em peso em THF sobre uma folha de poli(tetrafluoroetileno) (PTFE) usando uma lâmina doctor de 10 mil (254 μπι). A película foi depois secada na temperatura ambiente por 5 horas, seguida pela secagem em uma estufa a vácuo a aproximadamente 60°C por 18 horas. Finalmente a película foi ligada à extremidade do tubo pelo aquecimento da película até que a mesma amolecesse (~80°C) sobre uma folha revestida com poli(tetrafluoroetileno) (PTFE) sobre uma placa quente, seguida pela pressagem manual contra o topo do tubo. Em um outro caso, uma película alquídica foi formada misturando-se 2,20 g de Beckosol® 11-035 (Reichhold Inc, Durham, NC) com 0,545 g de azeite de dendê (Sigma Aldrich, St. Louis, MO), e 0,020 g de naftenato de cobalto (II) (55 % em peso em alcoóis minerais, Electron Microscopy Sciences, Hatfield PA) usando uma barra agitadora magnética, depois de revestir esta mistura sobre uma folha de poli(tetrafluoroetileno) (PTFE) usando uma lâmina doctor de 245 μπι e possibilitando curar na temperatura ambiente por 24 horas na temperatura ambiente. A espessura final da película foi de 75 μπι, e a mesma foi aderida à extremidade de topo do tubo de papel usando fita de mascaramento. Em um outro caso, coberturas plásticas cilíndricas translúcidas de 3/8" (1 cm) de diâmetro (Alliance Express, Erie, PA) foram inseridas no topo do tubo. Em um outro caso, uma tampa cônica foi criada cortando-se a tampa fora de um tubo de microcentrífiiga de 1,7 ml (SafeSeal Microcentrifuge Tubes, Sorenson BioScience Ine5 Salt Lake City, UT), e depois cortando-se a ponta fora da extremidade afunilada, para produzir um furo de ~3 a 5 mm na extremidade afunilada do tubo, e depois inserindo a extremidade aberta deste tubo na extremidade de topo do tubo de papel (Figura 17). Em um outro caso, um tubo de microcentrífuga foi preparado similarmente, exceto que o corte na extremidade de fundo foi em um ângulo de ~45 graus em relação ao eixo do tubo, e uma película Milar® com espessura de 100 μιη, cortada em um retângulo de ~1 cm χ ~2 cm foi dobrada em um ângulo tal que o mesmo fosse colado na lateral do tubo plástico e cobrisse o furo inclinado (Figura 18). Isto criou uma aba sobre o furo que seria empurrado para um lado pelos brotos em crescimento da plantinha. Em um outro caso, a tampa foi cortada fora de um tubo de microcentrífuga de 1,7 ml, mas nenhum furo foi criado na extremidade de fundo, e este foi aderido ao topo do tubo de papel usando PLA-7 fundido (Exemplo 15), mergulhando primeiro o tubo de microcentrífuga no PLA-7 fundido que foi mantido a 140°C em uma placa quente, e depois prenssando-o no topo da seção de papel. Em um outro caso, um pedaço quadrado de -1,5 cm de película Milar® com 100 μιη de espessura foi aderido às extremidades do tubo de papel usando PLA-7 fundido. Em uma forma de realização final, um pedaço retangular de película Milar® (-1,5 χ 2,5 cm) foi curvada em um ângulo de 90 graus no meio da dimensão mais longa, e depois colada a quente ao lado do tubo de papel tal que a porção curvada cobrisse a extremidade aberta do tubo, formando uma aba. As sementes artificiais assim preparadas foram plantadas em Metro-Mix® 360 tal que o topo das seções de papel fossem de aproximadamente 0,3 a 0,5 cm acima da superfície do solo, em vasos de plástico de 10 cm e cultivados em um (Conviron modelo BDW-120) a 31°C durante o dia, 22°C durante a noite, e um fotoperíodo de 13 horas, 220 uE/m2). TABELA 10. Efeitos de vários tipos de planta sobre o brotamento de

Fechamento de topo Parafilm® M Pré-estirado # sementes artificiais plantadas inicialmente 15 # Brotaram no dia 30 11 13 Película PLA 8 Película alquídica Tampa plástica cilíndrico de 3/8" (1 cm) _ Tampa cônica com Iuro 15 16 15 14 7 10 Tampa cônica com furo e aba Tampa cônica sem luro, 15 9 8 7 película Milar® colada na extremidade do tubo 10 6 Aba de Milar® no ângulo de 90 graus ___ Plantas expostas__ 10 42 4 42

ι^οπιυ puuc wu-owx»—-------------

películas Alquídicas excederam o Parafilm® M pré-estirado. em vários casos, as plantinhas foram capazes de estender seus brotos através do tubo cônico com projetos de aba, assim como o tubo de papel com abas de Milar® a 90 graus. Também, as plantinhas foram capazes de empurrar várias das cobertas

plásticas cilíndricas de 3/8" (1 cm).

FYFMPTO 17 - MKnrrAo DAS TOOFRTKDADES MECÂNICAS DE

rOPOT,ÍMEPOS OE BLOCO DF POT.TÉSTER

As propriedades mecânicas de materiais de tampa selecionados

foram medidas no modo de perfuração, de modo a avaliar a facilidade de penetração pelos brotos da plantinha. Isto foi realizado em um Analisador de textura TA-XT2Í (Texture Technologies, Scarsdale, NY). Uma sonda de metal cilíndrica de 2 mm no diâmetro e 38 mm no comprimento, afunilada na extremidade com uma ponta arredondada de 1 mm foi montada sobre o braço da célula de carga do analisador de textura. As películas foram montadas nas extremidades abertas de tubos de papel de 1,19 cm de diâmetro. A sonda foi ajustada para se mover para baixo tal que a mesma impingisse sobre a película no centro do tubo de papel em um ângulo de 90 ^us em relação à superfície da película. Estudos foram conduzidos em ambos os modos de deformação constante e carga constante (arraste). Tabela 11. Propriedades mecânicas de materiais de película de tampa. Valores separados por vírgulas representam réplicas do teste.

Película Espessura ia) Tensão na ruptura (mm), taxa de tensão constante (0,2 mm/s) Forca na ruptura (ε), taxa de tensão constante (0.2 mm/s) Tempo para colapso (s) (carga constante, 20 e) Parafilm® M Pré- estirado 50 3.0. 11.1 24.5. 44.7 914, >1500 PLA-8 ("Exemplo 15) 43 Ll 48,3 170, 255 Película alauídica (Exemplo 16) 100 4.5. 6.6 34.4. 32.2 63, 86

Na Tabela 11, as amostras de película PLA-8 e a Alquídica

tiveram força comparável na ruptura quando testadas em taxa de deformação constante e tempo mais rápido para colapsar sob carga constante, sugerindo que seriam mais facilmente perfurados do que o Parafilm® M pré-estirado. EXEMPLO 18 - COMPARAÇÃO DE TAMPA CÔNICA COM TAMPA DE PELÍCULA NA SEMENTE ARTIFICIAL

Recipientes de papel encerado (5 cm de comprimento, 1,19 cm de diâmetro) foram preparados cortando-se seções de um tubo mais longo. As extremidades de fundo foram manualmente plissadas (Figura 16), ou um tampão pequeno (~1 cm de espessura) de lã de rocha foi inserido no fundo. Depois, Metro-Mix® 360 foi adicionada ao tubo, para criar uma camada de aproximadamente 1 cm de espessura. Uma plantinha de cana de açúcar aparada foi depois colocada no topo do tampão de solo, e solo adicional foi adicionado ao tubo de modo que o tubo fosse aproximadamente 75 % cheio. Depois, 1 ml de água foi adicionado ao solo em cada tubo. O topo do tubo foi preso com Parafilm® M pré-estirado, uma película PLA-7 de 150 a 225 μιη de espessura (Exemplo 15) ou um tubo cônico, que foi criado como no Exemplo 16 cortando-se a tampa e a ponta de fundo fora de um tubo de microcentrífuga de 1,7 ml (Tubos de microcentrífuga SafeSeal, Sorenson BioScience Inc, Salt Lake City, UT), produzindo um furo de ~3 a 5 mm na extremidade estreita do tubo, e inserindo a extremidade da largura deste tubo na extremidade de topo do tubo de papel (Figura 17). As sementes artificiais assim preparadas foram plantadas em Metro-Mix® 360 tal que o topo das seções de papel fossem de aproximadamente 0,3 a 0,5 cm acima da superfície do solo, em vasos de plástico de 10 cm e cultivados em um (Conviron modelo BDW-120) a 31°C durante o dia, 22°C durante a noite, e um fotoperíodo de

13 horas, 220 uE/m2).

_TABELA 12. Efeito de vários tipos de tampa sobre o brotamento.

Fechamento de topo Fechamento de Fundo # sementes artificiais plantadas inicialmente # Brotaram no dia 25 # Visivelmente presa no dia 14 Tampa cônica com fiiro Manualmente Plissado 20 19 1 Parafilm® M Pré- estirado Manualmente Plissado 20 13 4 PLA-7 Manualmente Plissado 15 10 0 Parafilm M Pré- estirado Tampão de lã de rocha 16 11 3

Na Tabela 12, os resultados do experimento mostraram que

uma fração mais alta de plantinhas rotadas com êxito através da tampa cônica, comparada com tampas tipo película, incluindo Parafilm® pré-estirado e PLA-7. Além disso, foi observado que as tampas de Parafilm® pré-estirado tiveram um número mais alto de plantinhas presas (onde os brotos foram visivelmente impingentes sobre a superfície de tampa interna) comparada com tampas cônicas.

EXEMPLO 19 - TESTE DE CAMPO DE SEMENTE ARTIFICIAL COM TAMPA CÔNICA

Recipientes de papel encerado (6 cm de comprimento, 2 cm de diâmetro) foram preparados cortando-se de seções mais longas. As seções de tubo de papel foram planas em ambas as extremidades. As tampas foram removidas de tubos de centrífuga de polipropileno de 15 ml (VWR International, LLC, Radnor, PA), e a ponta cônica foi cortada em um ângulo de 90 graus em relação ao eixo do tubo, revelando um furo de ~5 a 8 mm de diâmetro. Seções curtas (~2 cm de comprimento) de tubo de papel com 2 cm de diâmetro foram cortadas e depois cortado ao longo do seu comprimento para atuar como uma cunha ou calço para manter os tubos plásticos de modo firme dentro dos tubos de papel. As plantinhas de cana de açúcar de cultura de tecido foram aparadas a ~8 cm de comprimento. As extremidades da raiz das plantinhas de cana de açúcar foram enroladas em Metro-Mix® 360 para criar uma bola de raiz coberta com solo. A plantinha foi depois inserida na seção de tubo de papel de 6 cm de comprimento tal que a bola de raiz estivesse a aproximadamente 1 cm acima do fundo, e a extremidade do broto foi projetada para fora da extremidade de topo. Depois, Metro-Mix® 360 foi adicionado do topo e fundo em torno da planta tal que o fundo fosse enchido até a abertura, e cerca de 1 cm fosse deixado sem encher no topo. O mesmo foi suavemente compactado com uma caneta e mais solo foi adicionada até que o tubo fosse enchido aproximadamente 1 cm a partir do topo. Depois o inserto de papel foi prensado no topo do tubo de papel, em torno dos brotos de plantinha. O tubo de centrífuga de 15 ml foi depois inserido, da extremidade aberta para baixo, sobre os brotos da plantinha, dentro do tubo de papel, de modo que o mesmo fosse inserido a cerca de 2 cm dentro do tubo de papel. Depois, 4 ml de água foram adicionados ao solo em cada tubo através do furo na seção de plástico. As sementes artificiais foram plantadas em um ambiente de campo na DuPont Stine Haskell Research Center em Newark, DE. O solo foi arado e preparado em uma maneira plana e foi fertilizado usando uréia. As sementes artificiais foram plantadas em fileiras com 30 cm de espaçamento em uma orientação vertical em várias condições diferentes. Em uma condição, elas foram plantadas a 8 cm de profundidade no solo. Em uma outra condição elas foram plantadas a 8 cm de profundidade com aproximadamente 30 ml de pérolas superabsorventes (Magic Water Beads, magicwaterbeads.com) pré- intumescidas em água, colocadas em torno da base de cada tubo (Figura 19). Em uma outra condição, elas foram plantadas a 12,5 cm de profundidade, com aproximadamente 30 ml de pérolas superabsorventes (Magic water beads, magicwaterbeads.com) pré-intumescidas em água, colocadas em torno da base de cada tubo (Figura 19). Em uma outra condição, elas foram plantadas a 12,5 cm de profundidade, com aproximadamente 30 ml de pérolas superabsorvente beads (Magic water beads, magicwaterbeads.com) pré- intumescidas em meio nutriente de Murashige e Skoog (MS), colocadas em torno da base de cada tubo. Em uma outra condição, um furo de 20 cm de profundidade e 20 cm de diâmetro foi escavado, e o solo de campo foi recolocado com Metro-Mix® 360, e as sementes artificiais foram plantadas a 8 cm de profundidade com aproximadamente 30 ml de pérolas superabsorventes (Magic water beads, magicwaterbeads.com) pré- intumescidas em água, colocadas em torno da base de cada tubo. Como uma comparação, plantinhas descobertas foram também plantadas diretamente no campo, tal que as raízes estivessem a aproximadamente 1 cm de profundidade. O campo foi irrigado imediatamente depois do plantio e no geral 3 vezes por semana daí em diante.

TABELA 13. Os resultados do experimento de campo com sementes

artificiais com tampa cônica de 15 ml

Condição de Plantio Superabsorvente # sementes artificiais plantadas inicialmente % de brotadas no dia 33 8 cm de profundidade nenhum 20 75% 8 cm de profundidade Intumescidas com água 50 80% 12,5 cm de profundidade Intumescidas com água 30 23% 8 cm de profundidade em Metro Mix® 360 Intumescidas com água 33 60% 8 cm de profundidade Intumescidas com MS 20 85% Plantinhas expostas nenhuma 72 6%

Na Tabela 13, sementes artificiais DE 15 ml forneceram sobrevivência aumentada comparada com plantinhas expostas. O uso de plantio mais raso resultou na sobrevivência aumentada. Adicionalmente, foi observado que o tubo cônico plástico serviu para coletar orvalho em certos momentos durante o experimento. Adicionalmente, foi observado que conforme as plantas cresceram grandes o bastante para que os brotos impingissem no furo que foi feito no tubo cônico, que várias das plantas (68 % no dia 90) desenvolveram brotos adjacentes ao corpo do tubo plástico. Isto pareceu ocorrer pelo crescimento através da região da semente composta da seção de papel que degradou no solo.

EXEMPLO 20 - EFEITO DO TAMANHO E DIMENSÃO DA TAMPA CÔNICA NA SOBREVIVÊNCIA NO CAMPO DE SEMENTES

25

ARTIFICIAIS Recipientes de papel encerado com tampas cônicas de 15 ml foram fabricadas como descrito no Exemplo 19. Além disso, as plantinhas de cana de açúcar foram plantadas em vasos de 2" (5 cm) em Metro-Mix® 360 que foi saturado com água e foram aparadas até aproximadamente 6 a 8 cm de comprimento. As cobertas foram removidas de tubos de centrífuga de 15 ml cônicos (VWR International, LLC, Radnor, PA) e as pontas de fundo afuniladas foram cortadas tal que um furo de ~5 a 8 mm fosse criado. As tampas foram removidas de tubos de centrífuga de 50 ml cônicos (VWR International, LLC, Radnor, PA) e as pontas de fundo afuniladas foram cortadas tal que um furo de —1,5 cm fosse criado. Os tubos cônicos de 15 ml e 50 ml foram posicionados sobre os brotos das plantinhas de cana de açúcar plantadas e depois pressionadas para baixo através do uso de força com um movimento giratório, tal que a plantinha assim como o solo circundante fossem coletados no tubo cônico. Isto resultou em um tampão de solo de aproximadamente 3 a 6 cm de altura dentro da base do tubo. Para um tratamento, um segundo tubo de 50 ml foi empilhado no topo do primeiro tubo de 50 ml contendo a plantinha (Figura 20). Isto criou uma segunda "câmara" acima da plantinha. Os tubos foram depois levantados dos vasos, armazenados durante a noite em sacos plásticos e transportados para o campo para o plantio pela manhã. As sementes artificiais foram plantadas em um ambiente de campo na DuPont Stine Haskell Research Center em Newark, DE. O solo foi arado e preparado em uma maneira plana e foi fertilizada usando uréia. As sementes artificiais foram plantadas em fileiras com 30 cm de espaçamento, 8 cm de profundidade no solo, em uma orientação vertical. Como uma comparação, plantinhas expostas foram também plantadas diretamente no campo, tal que as raízes estivessem a aproximadamente 1 cm de profundidade. O campo foi irrigado imediatamente depois do plantio e no geral 3 vezes por semana daí em diante. TABELA 14. Os resultados de experimento de campo com vários projetos de

semente artificial com tampa cônica.

Projeto # Sementes artificiais plantadas inicialmente % Brotadas no dia 37 Média de altura da superfície do solo para a aba dobrada (cm) dia 60 tubo cônico de 15 ml com seção de papel 30 53 % 5,82 tubo cônico de 15 ml sem papel 30 50% 3,60 tubo cônico de 50 ml sem papel 31 77% 7,17 Dois tubos cônicos de 50 ml empilhados no topo urn dó outro 30 93 % 12,74 Controles de plantilíha exposta 72 55 % 6,44

Na Tabela 14, é observado que os tubos de 50 ml tiveram

sobrevivência mais alta do que os tubos de 15 ml e que os tubos de 50 ml empilhados tiveram sobrevivência mais alta do que os tubos de 50 ml únicos tanto no brotamento assim como na altura da planta. Além disso, os tubos cônicos de 50 ml e de 50 ml empilhados forneceram sobrevivência aumentada comparada com os controles de plantinha exposta.

EXEMPLO 21 - EFEITO DA EXTREMIDADE DO TUBO CÔNICO E ABAS PROTETIVAS SOBRE A SOBREVIVÊNCIA EM CAMPO DE SEMENTES ARTIFICIAIS

Sementes artificiais de tubo cônico de 15 ml e 50 ml foram fabricadas como descrito no Exemplo 20. Além disso, as plantinhas de cana de açúcar foram plantadas em vasos de 2" (5 cm) em Metro-Mix® 360 que foi saturado com água e foram aparadas até aproximadamente 6 a 8 cm de comprimento. As tampas foram removidas dos tubos de centrífuga de 50 ml cônicos (VWR International, LLC, Radnor, PA) e as pontas cônicas inteiras foram cortados fora, resultando em um tubo cilíndrico aberto em ambas as extremidades. Em um outro tratamento, as tampas foram removidas dos tubos de centrífuga de 50 ml cônicos (VWR International, LLC, Radnor, PA) e a ponta das extremidades cônicas foram cortadas, revelando um furo de ~5 a 8 mm. Uma película retangular Milar® com 100 μιη de espessura (~2 cm χ ~1 cm) foi curvada em um tal ângulo que quando colada a quente ao lado da ponta do tubo cônico, a extremidade livre cobriu de modo solto o furo de ~5 a 8 mm (Figura 21). Em um outro tratamento, as tampas foram removidas de tubos de centrífuga de 15 ml (VWR International, LLC, Radnor, PA) e as pontas da extremidade cônica foram cortadas deixando um furo de 5 a 8 mm. Quatro fendas de 4,5 cm foram cortadas ao longo do eixo do tubo da extremidade com a abertura maior para a ponta afunilada. As tampas foram removidas dos tubos de centrífuga de 50 ml cônicos (VWR International, LLC, Radnor, PA) e as pontas foram cortadas para criar um furo grande o bastante para o tubo cônico de 15 ml a ser inserido de cabeça para baixo. A estrutura foi invertida de modo que a extremidade aberta do tubo de 50 ml foi apontada para cima. Um pó superabsorvente, poli(ácido acrílico), poli(óxido de etileno) enxertado com sal de sódio parcial (Sigma Aldrich, St Louis, MO) foi intumescido em água deionizada em uma razão de 1:223 (peso de póipeso de água). Este gel foi depois inserido dentro da cavidade anelar entre os dois tubos. Parafilm® M foi depois estirado sobre a extremidade aberta do tubo de 50 ml, com um furo no centro onde o tubo de 15 ml se projetou (Figura 22). A abertura no tubo de 15 ml foi deixada aberta. Todos os tipos de tubos cônicos foram posicionados sobre os brotos das plantinhas de cana de açúcar plantadas e depois pressionados para baixo com o uso de força com um movimento giratório, tal que a planta assim como o solo que a circunda fossem coletados no tubo cônico. Isto resultou em um tampão de solo de aproximadamente 3 a 6 cm de altura dentro da base da estrutura. Os tubos foram depois levantados dos vasos e transportados para o campo para o plantio. As sementes artificiais foram plantadas em 24 de agosto de 2012 em um ambiente de campo na DuPont Stine Haskell Research Center in Newark, DE. O solo foi arado e preparado em uma maneira plana e foi fertilizado usando uréia. As sementes artificiais foram plantadas em fileiras com 30 cm de espaçamento, 8 cm de profundidade no solo, em uma orientação vertical. Como uma comparação, plantinhas expostas foram também plantadas diretamente no campo, tal que as raízes estivessem a aproximadamente 1 cm de profundidade. O campo foi irrigado imediatamente depois do plantio e no geral 3 vezes por semana daí em diante.

TARRLA 15. O* resultados do* ferimentos de campo com vários projetos

de semente artificial com tarrma cônica.

Planejamento # sementes artificiais plantadas inicialmente % de brotadas no dia 35 Média de altura da superfície do solo até a aba dobrada (cm) dia 47 tubo cônico de 15 ml 55 73% 7,81 tubo cônico de 50 ml 85 y 89 % 9,03 tubo cilíndrico de 50 ml (nenhum papel) com 46 78% 6,94 tubo cônico de 50 ml (nenhum papel) com aba de Milar que 44 66% 8,44 tubo de 50 ml com tubo de 15 ml dentro, gel superabsorvente _no espaço anelar_ Controles de plantinha exposta 40 58 73 % 67% 7,87 8.19

Na Tabela 15, os resultados do experimento mostraram que o tubo cônico de 50 ml com um furo no topo sem papel desempenhou o melhor em termos de sobrevivência. Este resultado foi melhor do que o tubo

cilíndrico do mesmo tamanho que carecem da ponta cônica.

χ^ΛΛΡΤ η 99 - RFFTTO DE VÁRIOS PLANETAMKNTOS DE TUBO

rnxnrn F AR AMAZENAGFlvr SOBRE A SOBRFVTVRNCIA EM

ΓIAMPO DE SEMENTES ARTIFICIAIS

As sementes artificiais de tubo cônico de 15 ml e 50 ml foram

fabricadas como descrito no Exemplo 20. Além disso, as plantinhas de cana

de açúcar foram plantadas em vasos de 2" (5 cm) em Metro-Mix® 360 que

foi saturado com água e foram aparadas até aproximadamente 6 a 8 cm de

comprimento. As tampas foram removidas de tubos de centrífoga cônicos de

ml (VWR International, LLC, Radnor, PA) e as pontas foram cortadas,

resultando em um furo de 5 a 8 mm nas pontas. As tampas foram removidas

de tubos de centrífuga de 50 ml cônicos (VWR International, LLC, Radnor,

PA) e as pontas foram cortadas de modo a fazer um foro grande o bastante

para o tubo cônico de 15 ml se ajustar. O tubo cônico de 15 ml foi depois

inserido dentro do tubo cônico de 50 ml em uma orientação tal que ambas as

extremidades cônicas fossem apontadas para cima e o tubo de 15 ml ajustado firmemente dentro do tubo de 50 ml (Figura 23). Em um outro tratamento, as tampas foram removidas de tubos de centrífuga cônicos de 15 ml (VWR International, LLC, Radnor, PA) e a ponta das extremidades cônicas foram cortadas, resultando em um furo de ~5 a 8 mm. Um canto do saco de amostra de polietileno foi cortado para formar uma tenda na forma triangular, com a altura da extremidade aberta grande para o Cantoxaproximadamente igual ao comprimento do tubo cônico de 15 ml. Um furo pequeno de aproximadamente 1 cm foi feito cortando-se fora o canto deste triângulo, de modo a possibilitar que a ponta do tubo cônico de 15 ml seja inserida. Isto resultou em uma tenda de película plástico circundando o tubo cônico de 15 ml. Fita de autoclave foi dobrada sobre si mesma para formar uma faixa grande o bastante para conter a seção de tenda em torno do tubo. Esta faixa foi removida antes do plantio, e a tenda foi expandida até a sua cobertura máxima (Figura 24). Esta estrutura foi plantada tal que as bordas da tenda fossem cobertas pelo solo. Em um outro tratamento, as tampas foram removidas de os tubos de centrífuga de 50 ml cônicos (VWR International, LLC, Radnor, PA) e a ponta das extremidades cônicas foram cortadas, resultando em um furo de ~2 cm. Um canto do saco de amostra de polietileno foi cortado para formar uma tenda na forma triangular, com a altura da extremidade maior aberta para o canto aproximadamente igual à altura da seção cônica original do tubo cônico de 50 ml. O canto do saco de amostra foi colado a quente à abertura no tubo cônico de modo a formar uma cobertura igual à tenda sobre o furo. Depois, tesouras foram usadas para cortar dois cortes de aproximadamente 1 cm nesta tenda como cobrindo em ângulo de 90 graus entre si, com a direção cortada orientada ao longo do eixo do tubo. Isto criou uma abertura através da qual os brotos da plantinha puderam crescer (Figura 25). Em um outro tratamento, pelotas de poli(ácido láctico) (PLA2002D, NatureWorks, Minnetonka, MN) foram prensadas a quente a 190°C em películas que tiveram de 200 a 380 μιη de espessura. Estas películas foram cortadas em pedaços retangulares de aproximadamente 12 cm x 10 cm. Um padrão de dente de serra com características triangulares de aproximadamente 2 cm de profundidade e 3 cm de largura foi cortado ao longo de uma das bordas de 10 cm. Em seguida, as películas foram enroladas em formas de tubo sobrepostas, e inseridas dentro dos tubos de centrífuga de 50 ml cônicos (VWR International, LLC, Radnor, PA) com o^adrão de dente de serra apontando para dentro do cone. Os tubos cônicos foram depois colocados em uma estufa a 120°C com um pino cônico feito de poli(acetal) (22 mm de diâmetro, 15 cm de comprimento) inserido no meio do tubo por 2 a 5 minutos de modo a amolecer a película para se conformar à forma do tubo. Esta foi depois removida e esfriada até a temperatura ambiente em um topo de bancada de laboratório, resultando nas características triangulares do padrão de dente de serra apontando na direção uma da outra em uma forma como cone (Figura 26). A película de poli(ácido láctico) enrolada e o pino foram removidos do tubo de centrífoga de 50 ml. Os tubos descritos acima foram posicionados sobre os brotos das plantinhas de cana de açúcar plantadas e depois pressionados para baixo com o uso de força com um movimento giratório, tal que a planta assim como o solo que a circunda fossem coletados no tubo cônico. Isto resultou em um tampão de solo de aproximadamente 4 a 6 cm de altura dentro da base da estrutura. Os tubos foram depois levantados dos vasos e transportados para o campo para o plantio. As sementes artificiais foram plantadas em 13 de setembro de 2012 em um ambiente de campo na DuPont Stine Haskell Research Center em Newark, DE. Como uma comparação, plantinhas expostas também foram plantadas diretamente no campo, tal que as raízes fossem de aproximadamente 1 cm de profundidade. O campo foi irrigado imediatamente depois do plantio e nenhuma irrigação foi fornecida daí em diante. O solo foi arado e preparado em uma maneira plana e foi fertilizado usando uréia. As sementes artificiais foram plantadas em fileiras com 30 cm de espaçamento, 8 cm de profundidade no solo, em uma orientação vertical. Em um outro tratamento, pelotas de poli(ácido láctico) (PLA2002D, NatureWorks, Minnetonka, MN) foram dissolvidas em clorofórmio a 12,5 % em peso. Esta solução foi vertida dentro de tubos de centrífuga de 50 ml (VWR International, LLC, Radnor, PA). A solução em excesso foi vertida fora dos tubos e o resíduo nas paredes internas foi deixado secar nas condições ambientes dentro de uma capela por 24 h. Depois, os tubos foram colocados em uma estufa a vácuo e secados a 5 O0C por 3 dias com um fluxo constante de ar através da câmara. As moldagens de poli(ácido láctico) foram puxadas para fora dos tubos de centrífuga de 50 ml. Estes tubos moldados em solução foram posicionados sobre os brotos das plantinhas de cana de açúcar plantadas e depois pressionados para baixo com o uso de força com um movimento giratório, tal que a planta assim como o solo que a circunda fossem coletados no tubo cônico. Isto resultou em um tampão de solo de aproximadamente 4 a 6 cm de altura dentro da base da estrutura. Os tubos foram depois levantados dos vasos e selado por calor ao longo da borda de fundo usando um selador de impulso Quick Seal (National Instrument Co, Baltimore, MD). Estas sementes foram separadas em dois grupos e armazenadas na temperatura ambiente ou 15°C por 9 dias antes que fossem plantadas no campo. O plantio foi realizado cortando-se fora a borda de fundo que foi selada por calor, e cortando a ponta da seção cônica com dois cortes perpendiculares direcionados ao longo do eixo a cerca de 1 cm de comprimento (Figura 27). O tubo foi depois plantado aproximadamente a 5 cm de profundidade no solo. TABELA 16. Os resultados de experimentos de campo com vários projetos de

semente artificial com tampa cônica.

Planejamento # Sementes artificiais plantadas inicialmente % de brotadas no dia 22 % de brotadas no dia 29 tubo cônico de 15 ml 31 42% 58% tubo cônico de 50 ml 31 32% 42% tubo cônico de 15 ml abrigado dentro do tubo cônico de 50 ml 30 67% 80% tubo cônico de 15 ml com tenda de saco de PE 33 48% 54% tubo cônico de 50 ml com topo de canto de saco de PE 30 37% 50% tubos de poli(ácido láctico) enrolados 24 29% 46% Tubos de poli(ácido láctico) armazenados na temperatura ambiente/1 semana 13 38% Tubos de poli(ácido láctico) armazenados a 15° C/l semana 12 25% Plantinhas expostas 168 8% (dia 21)

Como mostrado na Tabela 16, o melhor desempenho de semente artificial foi o tubo de 15 ml abrigado dentro do tubo cônico de 50 ml. As estruturas de tenda apresentaram sobrevivência similar comparada com as estruturas não abrigadas por tenda. Todas as estruturas de semente forneceram sobrevivência melhorado comparada com as plantinhas expostas. EXEMPLO 23 - VARIAÇÕES NA SEMENTE ARTIFICIAL EM TUBO CÔNICO

Este estudo foi realizado de modo a explorar várias implementações práticas de sementes artificiais em tubo cônico, e para tratar problemas potenciais tais como solo e retenção de umidade durante manuseio e armazenagem. As sementes artificiais em tubo cônico de 15 ml sem seções de papel foram fabricadas como descrito no Exemplo 20. Além deste planejamento, as modificações que seguem foram incluídas como tratamentos. Em um caso, uma película de poli(álcool vinílico) solúvel em água fria (Extra Packaging, Boca Raton, FL) foi colada a quente para cobrir a abertura no topo da semente artificial em tubo cônico de 15 ml. Isto foi intencionado para melhorar a retenção de umidade na semente. Depois do plantio, estas sementes foram regadas a partir do topo, simulando chuva, de modo a dissolver a película. Em um tratamento, uma vareta de plástico fina foi fabricada cortando-se fora a extremidade da alça de alças descartáveis de 10 uL (Becton Dickinson e Co., Sparks, MD), produzindo uma vareta plástica de aproximadamente 11 cm de comprimento. Estas foram depois coladas a quente ao lado da semente artificial em tubo cônico de 15 ml tal que elas se estendessem aproximadamente 5 cm abaixo do fundo do tubo, com a extremidade aguda apontando para baixo. Isto foi intencionado para ancorar o tubo no solo (Figura 28). Em um outro caso, fita de autoclave (VWR International, LLC, Radnor, PA) foi usada para cobrir tanto o topo quanto o fundo da semente artificial em tubo cônico de 15 ml. Esta semente foi armazenada por 1 semana na temperatura ambiente antes do plantio, e a fita foi removida no momento do plantio. Em um outro tratamento, um círculo pequeno de tela de janela de plástico (Lowe's Home Improvement, Newark DE) foi colada a quente no fundo da semente artificial em tubo cônico de 15 ml. Isto foi intencionado para facilitar a retenção de solo durante a armazenagem e manuseio. Em um outro tratamento, sementes artificiais em tubo cônico de 15 ml foram criadas usando um solo de vaso contendo fibra de coco (Special Mix Coco, Gold Label Special Mix® Substrates, Gold Label Américas, Olivehurst, CA) ao invés de Metro-Mix ® 360. Em um outro tratamento, pedaços triangulares de película Milar® de 100 μιη de espessura foram colados a quente à base das sementes artificiais em tubo cônico de 15 ml de modo a servir como uma âncora dobrável (Figura 29). Em um outro tratamento, tubos de papel foram fabricados da Rite in the Rain® todos de papel de copiadora exposto ao ar (J. L. Darling Corp, Tacoma, WA), que melhorou a resistência à umidade comparada com papel kraft ou de carta. Os tubos foram formados enrolando-se este papel em torno de um tubo de centrífuga de 15 ml e colado a quente ao longo da borda. Os tubos foram cortados em seções de 5 cm e foram cobertos por Parafilm® M pré-estirado. As sementes artificiais de tubo de papel foram plantadas em Metro-Mix® 360 tal que o topo das seções de papel foram aproximadamente 0,3 cm acima da superfície do solo, em vasos de plástico de 10 cm e cultivados em um (Conviron modelo BDW-120) a 31° C durante o dia, 22° C durante a noite, 80 % de umidade relativa e um fotoperíodo de 13 horas, 220 uE/m2). As sementes artificiais em tubo plástico cônico de 15 ml, foram plantados em vasos de plástico de 10 cm em Metro-Mix® 360 em uma profundidade de 4 a cm.

Tabela 17. Os resultados de comparar várias estruturas de tubo de semente na

câmara de crescimento.

Planejamento # Sementes artificiais olantadas inicialmente Número de brotamento no dia 28 tubo cônico de 15 ml CreDroduzido do Exemplo 20) 20 19 tubo cônico de 15 ml com tamoa de Delicula solúvel em áeua 18 10 tubo cônico de 15 ml com tela de ianela de Dlástico cobrindo a base 24 21 tubo cônico de 15 ml com âncora de estaca plástica 20 19 tubo cônico de 15 ml com âncora de película Milar® 20 20 tubo cônico de 15 ml com extremidades amarradas com fita. armazenado Dor 1 semana antes do plantio 24 21 tubo cônico de 15 ml com fibra de coco contendo solo de vaso 20 20 tubo de Dapel Rite in the Rain® com tamDas de Parafilm® M pré-estirado 24 15

Como pode ser determinado a partir da Tabela 17, várias

modificações práticas de semente sintética em tubo cônico, que inclui o uso de fundos em tela, estacas e âncoras não tiveram efeito nocivos significantes sobre a sobrevivência. As raízes também foram observadas penetrando a tela de janela quando as sementes artificiais foram exumadas no final do experimento, no dia 40. EXEMPLO 24 - EFEITO DO ÂNGULO DO CONE DE SEMENTE ARTIFICIAL EM TUBO CÔNICO NO BROTAMENTO

O propósito deste estudo foi determinar o ângulo de cone ideal para o planejamento de semente artificial em tubo cônico. As sementes artificiais em tubo cônico de 50 ml sem seções de papel foram fabricadas como descrito no Exemplo 20. Além deste planejamento, as modificações que seguem foram incluídas como tratamentos. Em um tratamento, as pontas cônicas foram totalmente cortadas fora das extremidades dos tubos de centrífuga de 50 ml cônicos (VWR International, LLC5 Radnor, PA), criando tubos cilíndricos. Película Milar® de 100 um espessura foi cortada em círculos do mesmo diâmetro como os tubos de 50 ml. Um punção de furo foi usado para fabricar um furo de 5 mm no centro do círculo. O círculo foi depois colado a quente ao topo do tubo. Em um outro tratamento, as pontas cônicas foram totalmente cortadas fora das extremidades dos tubos de centrífuga de 50 ml cônicos (VWR International, LLC, Radnor, PA), criando tubo cilíndricos, a película Milar® de 100 μιη de espessura foi cortada em círculos do diâmetro levemente maior do que os tubos de 50 ml. Um furo foi puncionado no centro, e uma fenda única foi cortada radialmente fora do furo do centro até a borda externa. O arco fechado resultante foi forçadamente enrolado para criar um cone com um ângulo de mais amplo (aproximadamente 135 graus) do que os tubos cônicos de 50 ml padrão (65 graus). Os tubos com vários ângulos de cone foram montados com plantinhas e solo dentro, como descrito no Exemplo 20. Eles foram plantados em vasos de plástico de 10 cm em uma profundidade de 4 a 5 cm e cultivado em um (Conviron modelo BDW-120) a 31°C durante o dia, 250C durante a noite, e um fotoperíodo de 13 horas, 220 uE/m ). Tabela 18. Os resultados de comparar várias estruturas de semente em tubo na

câmara de crescimento.

Estrutura da Semente Ângulo do Cone Número Dlantado Número de brotamento no dia 21 Número de tubos nos auais os toDos foram emDurrados para fora no dia 21 Número de brotamento através do furo no dia 21 Número visivelmente preso mas vivo no dia 21 tubo cônico de 50 ml Creproduzido do Exemolo 20) 65 20 20 0 20 0 tubo cilíndrico de 50 ml com t0D0 de Milar® levemente cônico com furo -135 20 5 0 5 15 tubo cilíndrico de 50 ml com toDO de Milar® plano com furo 180 ("nenhum cone) 20 5 3 2 15

A tabela 18 mostra que os tubos com o ângulo de cone menor

produziu melhor resultado de brotamento. No caso com o topo plano ou cone raso, a maior parte das da plantas foram presas embora vivas. EXEMPLO 25 - PRODUÇÃO DE PELÍCULA DE POLÍMERO DE BLOCO DE POLIÉSTER-POLISSILOXANO PARA FECHAMENTOS DE SEMENTE ARTIFICIAL O procedimento sintético descrito abaixo foi realizado para

fornecer um material alternativo com biodegradabilidade realçada para o uso como um fechamento de semente artificial. O material é um polímero de bloco compreendido de poli(lactídeo) (PLA) - um polímero rígido, vítreo na temperatura ambiente - e poli(dimetilsiloxano) (PDMS) - um líquido na temperatura ambiente. Os conteúdos relativos de PLA e PDMS no material são selecionados para produzir uma resposta mecânica global que é similar ao Parafilm® M manualmente pré-estirado.

PDMS terminado em aminopropila de 900 a 1100 cSt de viscosidade foi adquirido da Gelest (DMS-A31) e usado como um macroiniciador difuncional para a polimerização de lactídeo. Sob condições isentas de oxigênio e água, 40 g do PDMS foram adicionados a um frasco de fundo redondo de 1 L. Ao frasco, 60 g de lactídeo (Sigma-Aldrich), 40 μΕ de 2-etilexanoato de estanho (II) (Sigma-Aldrich), e 461 ml de tolueno (EMD Chemical Products) foram adicionados. A mistura de reação foi aquecida sob agitação a IOO0C por 24 horas. A solução resultante de polímero de tribloco de poli(lactídeo-ò-dimetilsiloxano-Z)-lactídeo) (LDL) foi secado usando um evaporador rotativo. O polímero de LDL sólido foi redissolvido em 435 g de cloreto de metileno (EMD Chemical Products), precipitada em um excesso volumétrico de 10 vezes de metanol (EMD Chemical Products), filtrado e lavado com metanol, e depois secado sob vácuo a 45°C. Aproximadamente 87 g de LDL foram obtidos.

O peso molecular médio numérico Mn total e a composição Tpla (fração em peso de PLA) do LDL, determinada pela espectroscopia de ressonância nuclear, e o índice de polidispersividade PDI, determinado pela cromatografia de exclusão de tamanho, são fornecidos na Tabela A. Uma película de LDL foi preparada dissolvendo-se primeiro o polímero em clorofórmio (EMD Chemical Products) a 20 % em peso. Esta solução foi moldada em um substrato de Teflon® usando uma lâmina doctor com uma largura de 5 cm e intervalo de espessura de 254 μπι. Depois de secar sob condições ambientes por 5 dias, uma película de aproximadamente 75 μπι de espessura foi obtida. O módulo elástico E, resistência à tensão af, e tensão na ruptura Sf da LDL foram medidos sob tensão uniaxial, como mostrado na Tabela 19. Para comparação, os valores correspondentes de Parafilm® M pré- estirado também são fornecidos. Neste caso, antes da medição, a amostra de Parafilm® M, tendo comprimento e largura iniciais iguais, foi submetida a 200 % de tensão uniaxial ao longo do seu comprimento, seguido por 200 % tensão uniaxial ao longo da sua largura.

TABELA 19

Propriedades moleculares e mecânicas de LDL e Parafilm® M

Material M„(kg/mol) fPLA PDI £ (MPa) (Tf(MPa) ef(%) LDL 50 0,57 1,37 52 5,2 210 Parafilm® M_=_—_—_19_3,6_130

EXEMPLO 26 - EFEITO DO COMPRIMENTO DO RECIPIENTE E TIPO DE FECHAMENTO SOBRE A VIABILIDADE DAS SEMENTES ARTIFICIAIS

Recipientes de papel encerado foram cortados em 4 cm e 7 cm de comprimento. Uma extremidade aberta de cada recipiente foi presa com uma película de LDL com 38 μηι de espessura, preparado como descrito no Exemplo 25, ou uma película de gel de óleo de soja de 254 μπι de espessura. A última foi preparada dissolvendo-se polímero de tribloco de poli(estireno-6- etileno-co-butileno-co-estireno-ò-estireno) Kraton® A1535 em óleo de soja (MP Biomedicals, Solon, OH) a 9 % em peso e 155°C, e moldando a solução quente em um substrato de vidro usando uma lâmina doctor com uma largura de 5 cm e intervalo de espessura de 254 μπι, pré-aquecida a 155°C. No esfriamento até a temperatura ambiente, a formação de gel física do polímero de tribloco no óleo produziu uma película sólida, mas altamente deformável. A película de LDL foi fixada ao recipiente de papel encerado usando uma camada fina de adesivo de cianoacrilato (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). A película de gel de óleo de soja foi fixada por aquecimento da película, ainda aderida ao substrato de vidro, até próximo à sua transição de sol-gel (aproximadamente 80°C), prensando a extremidade do recipiente de papel encerado na película amolecida, e esfriando até a temperatura ambiente para

ressolidificar a película.

Os recipientes de papel encerado de 4 e 7 cm, tendo as suas

extremidades de fundo presas com LDL ou a película de gel de óleo de soja, foram depois carregadas aproximadamente um terço cheio com meio de crescimento de Metro-Mix® 360 seco. Uma plantinha de cana de açúcar regenerada foi depois adicionada a cada recipiente. As plantinhas regeneradas foram preparadas a partir do cultivar CPO-1372 de acordo com um procedimento similar a aquele descrito no Exemplo 1. As plantinhas regeneradas variaram no comprimento de vários centímetros a mais de 10 cm. Depois de adicionar uma plantinha a um recipiente de 4 cm, os brotos da plantinha foram aparados para se ajustar dentro dos 4 cm de comprimento. Para os recipientes de 7 cm, os brotos das plantinhas foram aparadas ainda para ajustar dentro de um recipiente de 4 cm, isto é, todas as plantinhas foram aparadas no mesmo comprimento, independente do tamanho do recipiente. Os recipientes de 4 cm foram depois enchidos até o topo com Metro-Mix® 360 adicional e 1 ml de água deionizada foi adicionada ao recipiente por intermédio de pipeta. Depois da adição de água, o nível de solo no tubo de 4 cm compactou para encher aproximadamente dois terços do recipiente. Os recipientes de 7 cm foram depois enchidos com uma camada de 4 cm de espessura de Metro-Mix® 360 e 1 ml de água deionizada foi adicionada ao recipiente por intermédio de pipeta. A extremidade de topo do recipiente foi preso com LDL ou a película de gel de óleo de soja como anteriormente descrito. Materiais idênticos foram usados para o fechamento de topo e fundo de cada recipiente, isto é, cada recipiente foi fechado exclusivamente pela película de LDL ou exclusivamente pela película de gel de óleo de soja.

As sementes artificiais foram plantadas em vasos de plástico de 10 cm com fendas cortadas ao longo da superfície de fundo e enchido com Metro-Mix® 360. Os vasos foram colocados ainda em uma bandeja de plástico para coletar água. Todas as sementes artificiais foram plantadas em uma orientação vertical; recipientes de 4 cm foram plantadas com o fechamento de topo nivelado com o nível do solo e os recipientes de 7 cm foram plantados com o fechamento de topo 3 cm acima do nível do solo. Os potes foram mantidos em uma câmara ambiental com um fotoperíodo de 16 horas de luminosidade de 3000 lum/ft2 (32.292 lum/m2) e um ciclo de dia/noite de 31/20°C. Os vasos foram regados, no geral, em freqüências de vários dias.

O número de sementes artificiais plantadas de cada

combinação de recipiente de comprimento e tipo de fechamento é fornecido na Tabela 20, assim como a porcentagem de sementes artificiais que brotaram e sobreviveram a duração de 4 semana de observação e as suas médias de altura. As sementes artificiais exibiram altas taxas de brotamento e sobrevivência, um mínimo de 60 %. Para comparação, plantinhas expostas transplantadas diretamente da regeneração para Metro-Mix® 360 na mesma câmara ambiental exibiram 46 % de sobrevivência, respectivamente, depois de 4 semanas. Portanto, a inclusão das plantinhas regeneradas nos recipientes de papel encerado forneceu um aumento acentuado na viabilidade. Está evidente ainda que os fechamentos LDL forneceram viabilidade realçada - um mínimo de 90 % - em comparação com fechamentos com gel de óleo de soja. Embora os últimos sejam mais deformáveis, e consequentemente mais facilmente perfurados pelos brotos da plantinha encapsulada, a descoloração dos brotos da plantinha foi observada quando em contato com o fechamento de topo. Isto sugere um certos grau de fitotoxicidade do gel de óleo de soja para as plantinhas, que provavelmente explica o grau mais baixo de sucesso das sementes artificiais correspondentes. Ao contrário, nenhuma descoloração de brotos de plantinha em contato com fechamentos de LDL foi observada.

TABELA 20

Viabilidade drplantas de cana de açúcar de sementes artificiais de comprimento de recipiente, tipo de fechamento, e tipo de plantinha variáveis

_ , XT/ j Sobrevivência das Média de Altura das

Compnmenodo Tipo de Fechamento _ ? , Plantas Depois de 4 Plantas Depois de 4

Recipiente (cm) _Sementes Plantadas Seman^(./o) Semanas (cm)

4 LDL 58 90 19

4 Gel de óleo de soja 59 80 18

7 LDL 29 97 27

7 Gel de óleo de soja 30 60 17

EXEMPLO 27 - VIABILIDADE DE SEMENTES ARTIFICIAIS DE RECIPIENTES CILÍNDRICOS EM TESTE DE CAMPO Este experimento comparou o crescimento de plantinhas de

cana de açúcar em um ambiente de campo de três sementes artificiais diferentes, primariamente distinguidas pelo material que compreende o corpo do recipiente de semente. Os recipientes de papel encerado foram cortados em comprimentos de 21,6 cm. Tubo rígido de acetato butirato de celulose (CAB) de 1,59 cm de diâmetro externo e 1,25 cm de diâmetro interno foi adquirido da McMaster-Carr (Santa Fe Springs, CA) e cortados em comprimentos de 21,6 cm. Tubo rígido de polietileno poroso (PPE) de 1,90 cm de diâmetro externo, 1,25 cm de diâmetro interno, e 20 μπι de tamanho de poro foi adquirido da Interstate Specialty Products (Sutton, MA) e cortados em comprimentos de 15,24 cm. Uma extremidade aberta de cada recipiente de papel encerado, CAB, e PPE foi presa com uma película de LDL com 38,1 μηι de espessura, como descrito no Exemplo 26. Os recipientes foram depois carregados com 1 g de meio de crescimento de Metro-Mix® 360 seco. Uma plantinha de cana de açúcar regenerada do cultivar CPO-1372, preparada por um procedimento similar a aquele descrito no Exemplo 1, foi adicionada a cada recipiente. Nenhuma plantinha foi aparada antes ou depois da adição a um recipiente. Depois da adição da plantinha, todos os recipientes foram carregados com um adicional de 1 g de Metro-Mix®-360 seco e 2 ml de água deionizada, depois a extremidade de topo do recipiente foi presa com película LDL usando adesivo de cianoacrilato (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO).

As sementes artificiais foram plantadas em um campo na

DuPont Stine-Haskell ResearclvCenter localizada na Newark, DE. O campo foi preparado para dar uma superfície de plantio plana. As sementes artificiais foram plantadas em fileiras, com 1,5 m entre as fileiras e 15 cm entre sementes adjacentes dentro de uma fileira. As sementes artificiais foram plantadas em uma orientação vertical tal que os brotos da plantinha encapsulada foram voltadas para cima e aproximadamente 4 cm do recipiente foi abaixo do nível do solo. O campo foi irrigado imediatamente depois do plantio e no geral 3 vezes por semana daí em diante. O número de sementes artificiais de cada tipo de recipiente plantado, assim como a porcentagem de sementes que brotaram e sobreviveram a duração de 4 semanas de observação são listadas na Tabela 21. Os recipientes de CAB e PPE levaram a uma razão de sobrevivência substancialmente mais alta, em comparação aos recipientes de papel encerado.

TABELA 21

Viabilidade de plantas de cana de açúcar de sementes artificiais de tipo de

recipiente variável no campo

, _ . . XT' j o χ τ* χ j Sobrevivência de Plantas Depois de

Tipo de Recipiente Numero de Sementes Plantadas ^ Semanas (%)

Papelencerado 33 15

CAB 32 69

PPE 18 67

EXEMPLO 29 - ENCAPSULAÇÂO DE PLANTINHAS DE CANA DE ACÚCAR EM RECIPIENTES RAPIDAMENTE BIODEGRADÁVEIS PARA FORNECER SEMENTES ARTIFICIAIS O poliéster poli(8-caprolactona) (PCL) alifático foi usado para

construir recipientes rapidamente biodegradáveis. O PCL foi adquirido da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) e dissolvido em clorofórmio a 10 % em peso. Esta solução foi moldada em um substrato de vidro usando uma lâmina doctor de aço inoxidável com uma largura de 5 cm e intervalo de espessura de 254 μιη. A película de PCL resultante foi secada, produzindo uma espessura final de 0,001 a 0,002 polegada (24,4 a 50,8 μπι). Depois da remoção do substrato de vidro, dois pedaços de película, cada uma medindo 5 cm de largura e 10,2 cm no comprimento, foram revestidas e seládas por calor ao longo das duas bordas mais longas e uma das bordas mais curtas para criar uma bolsa aberta. A bolsa foi carregada com 1 g de Metro-Mix® 360 seco. Uma plantinha de cana de açúcar regenerada foi depois adicionada à bolsa, seguida por um adicional de 1,2 g de Metro-Mix® 360 seco e 2,1 g de água deionizada. As plantinhas foram preparadas a partir do cultivar CPO-1372 de acordo com um procedimento similar a aquele descrito no Exemplo 1. Os brotos da plantinha foram aparados, se necessário, para se ajustarem dentro da bolsa e a borda aberta remanescente foi selada, formando um recipiente de PCL fechado, impermeável ao ar em torno da plantinha.

As sementes artificiais como preparadas foram plantadas em vasos de plástico de 10 cm com fendas cortadas ao longo da superfície de fundo e enchidos com Metro-Mix® 360. Os vasos foram colocados ainda em uma bandeja de plástico para coletar água. Todas as sementes artificiais foram plantadas aproximadamente de 2 a 3 polegadas de profundidade em uma orientação vertical tal que os brotos da plantinha encapsulada foram voltados para cima. Os vasos foram mantidos em uma câmara ambiental com um fotoperíodo de 13 horas de 1900 lum/ft2 (20.451,6 lum/cm2) de luminosidade e um ciclo de 31/22°C dia/noite. A umidade relativa foi controlada em um valor constante de 80 %. Os vasos foram regados em uma freqüência de 1 a 2 vezes por semana. Para comparação, as plantinhas do mesmo lote usado para preparar as sementes artificiais foram plantados expostas em vasos identicamente preparados e mantidos.

Por causa da biodegradabilidade rápida do PCL e a forma relativamente fina em que o mesmo é utilizado nas sementes artificiais descritas acima, as plantas de cana de açúcar que resultam das ditas sementes artificiais exibem um processo de estabelecimento que é distinto das sementes artificiais tubulares anteriormente descritas. A amostragem periódica das sementes artificiais indicou que decomposição e fragmentação macroscópicas - um resultado direto da biodegradação - da porção enterrada do recipiente de PCL ocorreu em uma escala de tempo de aproximadamente uma a duas semanas depois do plantio. Este fenômeno permitiu o estabelecimento de raízes da planta no solo que circunda o recipiente de PCL original. Durante o mesmo período de tempo e, de fato, nas seis semanas de duração do experimento, nenhuma evidência visual de degradação da porção acima da superfície do PCL foi observada. Entretanto, os brotos da planta claramente aumentaram no tamanho dentro dos limites do recipiente de PCL. Várias semanas a mais de um mês depois do plantio, os brotos das plantas em crescimento são capazes de empurrar a porção não degradada do recipiente de PCL para fora da superfície do solo e o crescimento da planta de cana de açúcar continua em uma maneira regular daí em diante. Por fim, a porção não degradada do recipiente de PCL cai ou permanece aderida à ponta de um broto de planta em crescimento. Das 30 sementes artificiais plantadas, 22 (73 %) brotaram e

sobreviveram as seis semanas de duração do experimento. Das 20 plantinhas expostas plantadas, 12 (60 %) sobreviveram durante a mesma duração. As massas e pesos de raiz das plantas expostas sobreviventes substancialmente excederam aquelas das plantas que sobreviveram das sementes artificiais. Isto é uma conseqüência da liberação demorada das raízes e brotos das plantinhas de cana de açúcar encapsuladas de seus recipientes de PCL. Nenhum levantamento para fora do recipiente de PCL a partir do solo pela planta em crescimento - foi observado no período de tempo de uma semana ou menos depois do plantio. Por fim, todas as amostras sobreviventes brotaram, embora o brotamento fosse demorado em várias sementes artificiais em mais do que um mês. Coletivamente, os resultados demonstram a viabilidade de sementes artificiais compreendidas de plantinhas de cana de açúcar encapsuladas pelos recipientes finos, fechados, e rapidamente biodegradáveis.

vi-hilM,*, de Semnrltiao Oficiais <™e ™"^eendenl

r^jpientes rapidamente Moi^ratwis "" camp0

As sementes artificiais que compreendem plantinhas de cana

de açúcar encapsuladas pelos recipientes de película de PCL foram

preparados e plantados em um campo na DuPont Stine-Haskell Research

Center localizado em Newark, DE em duas ocasiões separadas. Em todos os

casos, as sementes artificiais foram plantadas em uma preparação de campo

plano. As sementes artificiais foram plantadas aproximadamente 5 a 7,5 cm

de profundidade em uma orientação vertical tal que os brotos da plantinha

encapsulada ficassem voltados pam cima. Durante o primeiro experimento, o

campo foi irrigado imediatamente depois do plantio e de uma a duas vezes

por semana dai em diante. Durante o segundo experimento, o campo foi

irrigado imediatamente depois do plantio, mas nenhuma irrigação foi

fornecida daí em diante.

A Tabela 22 mostra o número de sementes artificiais plantadas

para cada experimento, assim como a porcentagem que brotaram durante a

duração do experimento (sete e quatro semanas para o primeiro e segundo

experimentos, respectivamente) e a porcentagem que sobreviveram. O

processo pelo qual as plantas de cana de açúcar se estabeleceram no solo

circundante a partir destas sementes artificiais foi similar a aquele observado

no experimento da câmara de crescimento. Durante o curso do prime,ro de

uma a duas semanas depois do plantio, a porção enterrada do recipiente de

PCL rapidamente biodegradou, liberando deste modo as raízes da plantinha

para o solo circundante. Durante o mesmo período, o crescimento do broto

ocorre dentro do confmamento da porção não degradada, acima da superfície do recipiente de PCL. Em tempos mais longos, o crescimento de broto continuado levanta o resto do recipiente de PCL para fora da superfície do solo e o crescimento continua em uma maneira regular daí em diante. A sobrevivência, como anteriormente mencionada, é definida pela evidência visual de uma planta saudável, viva. Um número significante de amostras do primeiro plantio sobreviveram, mas não brotaram. O brotamento foi primeiro observado entra a população plantada depois de aproximadamente duas semanas e a porcentagem de amostras que brotaram subseqüentemente aumentou em uma maneira linear com respeito ao tempo. Ao contrário, depois das quatro semanas de duração do segundo experimento, nenhum brotamento foi observado. Isto é uma conseqüência de temperaturas mais baixas, que significantemente reduziu a taxa de crescimento da planta; as temperaturas da superfície do solo médias medidas durante o curso dos dois experimentos foram de 24°C e 20°C para o primeiro e segundo, respectivamente. A Tabela 22 indica que sobrevivência moderada a alta foi obtida com estas sementes artificiais. Considerando as temperaturas de crescimento subótimas encontradas na segunda, os dados demonstram a viabilidade de recipientes rapidamente biodegradáveis para as sementes

artificiais.

TABELA 22

Brotamento e sobrevivência de plantas de cana de açúcar de recipientes de

película de PCL no campo

Levantamento do

, /n/x ijcvauuuii&iiw wv

Datadoplantio Número Plantado_Sobrevivência (/o) recipiente de PCL (%)

-P=" 39" f

Segunda_ 85 _66^---O-

tRegistrados 7 semanas depois do plantio tRegistrados 4 semanas depois do plantio

EXEMPLO 30 - MEIO NUTRIENTE DE STUCATO PARA SEMENTES ARTIFICIAIS

O propósito deste estudo foi examinar o uso de géis de silicato como um meio nutriente para o crescimento de plantinhas de cana de açúcar. 45 g de solução de silicato de potássio em água (29,1 % em peso sólidos, .140 Kasil® 1, PQ Corporation, Malvern, PA) foram adicionados a 255 g de água deionizada e 300 g de meio de Murashige e Skoog (MS) com 3 % em peso de sacarose e 0,2 % em peso de Plant Preservative Mixture (PPM) em um béquer. A mistura foi ajustada ao pH 7 usando ácido nítrico. Esta solução foi depois esterilizada por filtração usando uma montagem de filtro de 1 L com tamanho de poro de 0,22 μιη (Corning Inc., Corning NY). Depois de repousar por 2 horas, a solução formou um gel. O gel foi depois submergido em um excesso de água deionizada e deixado embeber de modo a remover os sais residuais (nitrato de potássio). O gel embebido por 4 dias e a água deionizada foi substituída no 4o dia. No 5o dia, o meio foi substituído com um excesso de meio MS com 3 % em peso de sacarose e 0,2 % em peso de PPM. Depois de embeber no meio de MS/sacarose por 24 h, o líquido em excesso foi drenado e o gel foi autoclavado antes do teste. Um outro gel foi fabricado usando Kasil® 2135. 45 g de solução de silicato de potássio em água (35,5 % em peso de sólidos, Kasil® 2135, PQ Corporation, Malvern, PA) foram adicionados a 255 g de água deionizada e 300 g de meio de Murashige e Skoog com 3 % em peso de sacarose em um béquer. A mistura foi ajustada ao pH 7 usando ácido nítrico. Esta solução foi depois esterilizada por filtração usando uma montagem de filtro de 1 L com tamanho de poro de 0,22 μπι (Corning Inc., Corning NY). Depois de 2 horas, isto formou um gel. O gel foi depois submergido em um excesso de água deionizada e deixado embeber de modo a remover os sais residuais (nitrato de potássio). O gel embebido por 4 dias e a água deionizada foram substituídos no 4o dia. No 5o dia, o meio foi substituído com um excesso de meio MS com 3 % em peso de sacarose e 0,2 % em peso de PPM. Depois de embeber no meio por 24 h, o líquido em excesso foi drenado e o gel foi autoclavado antes de testar. A condutividade destes géis foi de aproximadamente 5 mS, ao passo que a condutividade do próprio meio foi de aproximadamente 3 mS. Como um controle, um gel foi preparado usando ágar Difco® aquecendo-se 0,7 % em peso de ágar Difco® em meio MS com 3 % em peso de sacarose e 0,2 % em peso de PPM em aproximadamente 80°C até que o mesmo dissolvesse, depois de verter dentro do Phytatray® (Phytatray® II, Sigma Aldrich, St. Louis MO) e esfriar. Sob condições estéreis em uma capela de fluxo laminar, as plantinhas de cana de açúcar de cultura de tecido de tecido meristemático, que foram cultivadas por 4 semanas em cultura líquida após a fragmentação foram divididas em grupos de 12, enxugadas com uma toalha de papel e pesadas. Estas foram colocadas no topo dos vários materiais de gel em um padrão de arranjo de 3 χ 4 em Phytatray®. O Phytatrai® foi fechado com fita estéril, permeável a gás (Fita filtro, Carolina Biological Supply Company, Burlington, NC) e foram

Λ

incubadas a 26°C com 60 microEinsteins/m /s de luz de tubo fluorescente branco frio de 25 watt F32T8/ADV841/XEN da Philips nos recipientes por um período de 16 dias. Depois deste período de tempo, as plantinhas de cada Phytatray® foram removidas do gel, secadas e mais uma vez pesadas (peso fresco). A razão do peso depois de 16 dias para o peso inicial foi determinada.

Em um experimento separado, géis de silicato foram fabricados em uma maneira similar como descrita acima, exceto que a etapa de embebeção para remover os sais residuais não foi realizada. Devido à falta de uma etapa de embebeção, a concentração resultante dos nutrientes de Murashige e Skoog e sacarose foi de 45 a 50 % da concentração do meio MS padrão. Uma segunda diferença foi que os géis foram neutralizados com ácido acético, ao invés de ácido nítrico. Uma diferença final foi que as plantinhas de cana de açúcar foram 15 dias na cultura líquida no tempo do experimento ao invés de 4 semanas. Para este experimento, agarose de baixa fusão a 0,5 % em peso na 1A da concentração do meio nutriente de Murashige e Skoog foi usada como um gel de controle ao invés de ágar Difco®. Três réplicas das bandejas foram criadas neste experimento. As condutividades dos géis de silicato com base em Kasil® sem embebeção foram 13,5 mS para o gel com base em Kasil® 1, e além da capacidade do dispositivo de medição (VWR® Traceable® Conducitivity Pen) para o gel com base em Kasil® 2135. Tabela 23. O crescimento de plantinhas de cana de açúcar em meio nutriente

de gel de silicato. "A", "B" e "C" denotam réplicas do mesmo tratamento.

---- Tdade das plantinhas Duração dã Peso Razão d°

em cultura líquida embebecão em inicial/12 Peso final/ 12 peso final

antes do experimento áeuadeionizada plantinhas plantinhas fe) Earao

(dias-)_ (dias)_ígl_

Gel

Nutriente

inicial

Gel de silicato com base em

Kasil® 1 Gel de silicato com base em Kasil® 2135 0-7 % em peso de àsar Difco®

Gel de silicato com base em Kasil® 1

Gel de silicato com base em Kasil® 2135

Agarose de baixa fusão

meio MS + 3 % de sacarose

meio MS + 3 %

de sacarose Ά Concentração de meio MS + 1.5% de sacarose 45% da Concentração de meio MS + 1.35 % de sacarose Vi Concentração de meio MS + 1.5% de sacarose

28

28 28

15 15 15

nenhuma nenhuma

nenhuma

5.05

6.80

6.78

A= 1.42 B = 1.54 C = 1.61

A=LlO B = 0.95 C = 1.37

A= 1.41 B = 1.52 C = 1.55

14.56

17.19

20.34

A= 1.74 B = 1.70 C = 1.38

A= 1.17 B = 0.92 C = 1.19

A = 5.34 B = 5.43 C = 6.67

2.53

3.00

A= 1.22 B = 1.10 C = 0.86

A= 1.06 B = 0.97 C = 0.87

A = 3.78 B = 3.57 C = 4.30

Como pode ser observado na Tabela 23, a etapa de embebeção para remover sais dos géis de silicato melhorou o crescimento das plantinhas de cana de açúcar comparadas com os géis que não foram embebidos. Com a etapa de embebeção, os géis de silicato servem como meio de cultivo bem sucedido para as plantinhas de cana de açúcar, ao passo que sem a etapa de embebeção, nenhum crescimento ocorreu. Além disso, as plantinhas incubadas nos géis de silicato não embebidos exibiram descoloração e sinais

de estresse.

Uso de géis nutrientes de silicato em sementes artificiais em

tubo de papel encerado

O propósito deste estudo foi examinar o uso de géis de silicato

como um meio nutriente em sementes artificiais. 15 g de solução de silicato

de potássio em água (29,1 % em peso de sólidos, Kasil® 1, PQ Corporation)

foram adicionados a 85 g de água deionizada e 100 g de meio de Murashige e

Skoog com 3 % em peso de sacarose em um béquer. A mistura foi ajustada ao

pH 7 usando ácido nítrico. Esta solução foi depois esterilizada por filtração

usando uma montagem de filtro de 1 L 0,22 μπι (Corning Inc., Corning NY). Depois de 2 horas, isto formou um gel. O gel foi depois submergido em um excesso de água deionizada e deixado embeber de modo a remover os sais residuais (nitrato de potássio). O gel embebido por 5 dias e a água deionizada foi substituída três vezes durante este período. No 6o dia, os meios foram substituídos com um excesso de meio de Murashige e Skoog com 3 % em peso de sacarose. Depois da embebeção no meio de MS/sacarose por 24 h, o líquido em excesso foi decantado. A condutividade final do gel foi de 3,8 mS. O gel foi depois autoclavado para esterilidade antes do teste. Tubos de papel encerado (1,19 cm de diâmetro) foram cortados em comprimentos de 4 cm com aberturas planas. O fundo dos tubos foi fechado usando Parafilm® M pré-estirado. Depois, um tampão de meio nutriente de gel de silicato de aproximadamente 2 cm de espessura foi adicionado ao tubo. Em seguida, uma plantinha de cana de açúcar foi colocada no topo do gel nutriente. Em seguida o topo do tubo foi fechado com Parafilm® M pré-estirado. Além disso, outros tratamentos foram estudados. Isto incluiu o teste de meio nutriente de ágar que foi embebido em um meio nutriente de Murashige e Skoog contendo 0,57 ppm de etefon (ácido2-cloroetilfosfônico) e 3 % em peso de sacarose por 24 horas. Isto foi montado em sementes artificiais de tubo de papel encerado como descrito acima para o outro meio. Em um outro tratamento, sementes artificiais em tubo de papel encerado como descritas acima foram criadas contendo meio de ágar com nutrientes de Murashige e Skoog e 3 % em peso de sacarose, exceto que uma película de polietileno fina (produz saco de mercearia) foi cortada em um retângulo de aproximadamente 4 χ 7 cm e enrolada em torno da extremidade da extremidade de topo do tubo de papel e mantida no lugar usando uma faixa de borracha, que forma uma estrutura de tubo flexível de extremidade aberta, ao invés de cobrir o tubo com Parafilm® pré-estirado. Em um outro tratamento, película solúvel em água fria (Extra Packaging, Boca Raton, FL), foi cortada em pedaços quadrados de aproximadamente 7,5 cm. Vermiculita autoclavada foi colocada no centro de cada quadrado, que forma uma pilha ocupando um círculo de aproximadamente 3 cm de diâmetro. Em seguida, pedaços de meio ágar contendo nutrientes de Murashige e Skoog e 3 % em peso de sacarose totalizando aproximadamente 2 a 4 g foram colocados no topo da vermiculita. Em seguida, uma plantinha de cana de açúcar foi colocada entre eles e em contato com os pedaços de ágar. Mais vermiculita foi adicionada para cobrir a plantinha de cana de açúcar e o meio. Finalmente, as bordas da película solúvel em água Ma foram juntadas formando um pacote, e foram amarradas juntas com fita no topo, resultando em uma semente artificial de forma semiesférica.

As sementes artificiais na forma de tubo foram plantadas em Metro-Mix® 360 tal que o topo das seções de papel encerado foram aproximadamente 0,3 a 0,5 cm acima da superfície do solo, em vasos de plástico de 10 cm e cultivadas em um (Conviron modelo BDW-120) a 310C durante o dia, 22°C durante a noite, 80 % de umidade relativa e um

λ

fotoperíodo de 13 horas, 220 uE/m ). As sementes tipo pacote foram enterradas em Metro-Mix® 360 tal que o topo das bolsas estivessem em contato com a superfície de solo, em vasos de plástico de 10 cm e foram incubadas sob as mesmas condições como as sementes artificiais na forma de tubo.

TABELA 24. Os resultados de sementes artificiais cultivadas com vários

tipos de meio e estruturas.

Estrutura da Semente Gel contendo Nutriente Número de sementes Número de sementes nutriente artificiais inicialmente plantadas germinadas no dia 29 tubo de papel encerado de 0,7 % em peso de meio MS + 3 % em 12 6 4 cm ágar Difco® peso de sacarose tubo de papel encerado de Gel de silicato meio MS + 3 % em 12 12 4 cm com base em Kasil® 1 peso de sacarose tubo de papel encerado de 0,7 % em peso de meio MS + 3 % em 14 7 4 cm ágar Difco® peso de sacarose (encharcado em 0,57 ppm etephon solução) tubo de papel encerado de 0,7 % em peso de meio MS + 3 % em 13 4 4 cm - saco de polietileno ágar Difco® peso sacarose aberto no topo Pacote solúvel em água fria 0,7 % em peso de ágar Difco® meio MS + 3 % em peso de sacarose 7 1

A partir da Tabela 24, o meio nutriente com base em gel de silicato resultou na germinação melhorada de sementes artificiais comparada com meio nutriente com base em ágar.

EXEMPLO 31 - SEMENTES ARTIFICIAIS EM TUBO DE PAPEL ENCERADO COM PLANTINHAS INSERIDAS DE UMA ABERTURA LATERAL

Neste exemplo, nós estudamos a inserção de uma plantinha de uma abertura lateral, no centro de uma seção de tubo de papel encerado de 5 cm. Tubos de papel encerado de 1,19 cm de diâmetro foram cortados em seções de 5 cm e autoclavados. Uma extremidade do tubo de papel encerado foi fechada com Parafilm® M pré-estirado. Depois, meio nutriente que consiste de 4 % em peso de agarose de baixa fusão com nutrientes de Murashige e Skoog, 3 % em peso de sacarose e 0,2 % em peso de Plant Preservative Mixture com 150 ppm de Maxim® 4FS (Syngenta, Wilmington, DE) e 100 ppm de Apron® XL (Syngenta, Wilmington, DE) foram adicionados para encher o tubo de papel, a segunda abertura do tubo de papel encerado foi fechada com Parafilm® M pré-estirado. Em seguida, um furo de aproximadamente 4 mm de diâmetro no centro do tubo de papel encerado de cm foi feito usando a extremidade aguda de pinça de metal. Depois, uma plantinha de cana de açúcar, que foi previamente cultivada por 10 dias em meios nutrientes líquidos foi inserida dentro do furo, deixando os brotos apontando para fora (Figura 30). A montagem final foi plantada em Metro- Mix® 360 em vasos de plástico de 10 cm com bandejas em uma câmara de crescimento (Conviron modelo BDW-120) a 31°C durante o dia, a 22°C durante a noite, 80 % de umidade relativa e um fotoperíodo de 13 horas (220 uE/m2). Os tubos foram plantados horizontalmente tal que a superfície do tubo superior foi nivelada com a superfície do solo e a plantinha foi apontada para cima. A taxa de sobrevivência destes tubos foi de 3 dos 12 plantados no dia 27. As plantinhas expostas foram também plantadas, que exibiram uma taxa de sobrevivência de 12 das 24 plantadas no dia 27. EXEMPLO 32 - EFEITO DO COMPRIMENTO DO TUBO PARA AS SEMENTES ARTIFICIAIS EM TUBO DE PAPEL ENCERADO

O propósito deste exemplo foi estudar o efeito do comprimento do tubo de papel encerado sobre a sobrevivência das sementes artificiais. Tubos de papel encerado (1,19 cm de diâmetro) foram cortados em 4,/8 e 12 cm de comprimento. Os recipientes foram também embebidos em solução Maxim 4FS antes da montagem como descrita no Exemplo 5. As extremidades de fundo dos tubos foram ameadas, e cobertas com Parafilm® M pré-estirado. Metro-Mix® 360 foi colocado dentro dos tubos como uma fonte de nutriente tal que uma camada de aproximadamente 1 cm de espessura foi criada. Em seguida, uma plantinha de cana de açúcar, que foi em cultura por 14 dias em meio de proliferação líquido foi colocada no topo da camada de solo. Mais Metro-Mix® 360 foi adicionado de modo que o tubo tivesse uma camada de aproximadamente 3 a 4 cm de espessura de solo. 1 ml de água deionizada foi adicionada ao tubo e o topo foi fechado com Parafilm® M pré- estirado. Os tubos foram plantados em Metro-Mix® 360 em vasos de plástico de 10 cm com bandejas em uma câmara de crescimento (Conviron modelo BDW-120) a 310C durante o dia, a 22°C durante a noite, 80 % de umidade relativa e um fotoperíodo de 13 horas (220 uE/m ). Os tubos foram todos plantados em aproximadamente 4 cm de profundidade.

TABELA 25. Efeito do comprimento do tubo sobre a germinação de sementes artificiais em tubo de papel encerado em profundidade de plantio

constante (4 cm).

ComDrimento do tubo Cem) Número plantado Número de brotamento no dia 39 4 15 4 8 16 2 12 14 0

A Tabela 25 mostra que os tubos de papel encerado de 4 cm produziram níveis mais altos de brotamento comparados com os tubos de papel com 8 cm ou 12 cm de comprimento.

Em um experimento separado, relacionado, os mesmos três comprimentos de semente artificial em tubo de papel encerado foram estudados, desta vez sem tampas no topo e com fundos manualmente plissados (Figura 16). Estas foram plantadas de modo que os topos dos tubos estivessem aproximadamente 0,5 a 1 cm para fora da superfície do solo (plantio mais profundo do que no estudo mais fácil que variou com o comprimento-do tubo). Para os tubos mais compridos, isto necessitou do uso de vasos de 8" (20,3 cm) de diâmetro mais profundos.

TABELA 26. Efeito do comprimento do tubo sobre a germinação de sementes artificiais em tubo de papel encerado em profundidades de plantio variáveis.

ComDrimento do tubo Profundidade de ülantio Número Dlantado Número de brotamento no Ccml Aproximada (cm) dia 35 4 M 15 14 8 7 15 12 12 11 16 3

A partir da Tabela 26, pode ser observado que os tubos de 12

cm de comprimento tiveram taxas de brotamento mais baixas comparadas com os tubos mais curtos (4 cm, 8 cm).

Um experimento similar foi realizado no campo brasileiro na DuPont do Brasil, em Paulínia. Similarmente, os tubos de 4 e 8 cm desempenharam melhor do que os tubos de 12 cm de comprimento.

EXEMPLO 33 - VARIAÇÃO DO TIPO DE PAPEL E DIÂMETRO PARA AS SEMENTES ARTIFICIAIS EM TUBO DE PAPEL ENCERADO

Neste experimento, uma série de tipos de papel e diâmetros diferentes foi usada como sementes artificiais em tubo de papel encerado. Tubos de papel reciclado de 1,0 cm de diâmetro, tubos de papel reciclado de 2,0 cm de diâmetro e tubos de 1,2 cm de diâmetro fabricados de papel solúvel em água (carboximetilcelulose de sódio, ASW 60, Aquasol Corp) foram obtidos da Precision Products Group, Intl (Westfield, Massachusetts). Estes foram cortados em comprimentos de 5 cm. Os tubos de papel foram montados fechando-se primeiro o fundo com Parafilm® M pré-estirado, depois adicionando uma camada de cerca de 1 cm de Metro-Mix® 360. Em seguida, plantinhas de cana de açúcar, que foram cultivadas por 5 semanas em meio líquido antes do experimento foram colocadas no topo do solo. Em seguida, mais solo foi adicionado para criar uma camada de aproximadamente 4 cm de espessura no tubo. 1 ml de água deionizada foi adicionada. Finalmente, o topo do tubo foi fechado com Parafílm® M pré-estirado. Os tubos foram plantados em Metro-Mix® 360 em vasos de plástico de 10 cm com bandejas em uma câmara de crescimento (Cònviron modelo BDW-120) a 31°C durante o dia, a 22°C durante a noite, 80 % de umidade relativa e um fotoperíodo de 13 horas (220 uE/m2). Os tubos foram plantados em profundidade de aproximadamente 4,5 cm.

TABELA 27. Efeito da composição e diâmetro do tubo sobre a germinação de

sementes artificiais em tubo de papel encerado.

Material de Coroo de Tubo Diâmetro do Tubo (cm) Número plantado Número de brotamento no dia 32 Porcentagem de brotamento no dia 32 Papel encerado oadrâo Cdo Exemolo 2) 12 24 lá 58% Papel reciclado I1O 29 8 28% Papel reciclado 2j0 24 11 46% Paoel solúvel em água L2 12 8 67% Plantinhas exoostas 36 26 72%

A partir da Tabela 27, pode ser observado que os tubos de

papel solúvel em água forneceram um nível de brotamento comparável comparado com tubos de papel encerado reciclado e padrão. Um experimento similar foi realizado no ambiente de campo

brasileiro, na DuPont do Brasil, em Paulínia, comparando os tubos solúveis em água com sementes artificiais em tubo de papel encerado não solúveis em água, usando um fundo grampeado, entretanto, sobrevivência insuficiente foi observado para os tubos de papel solúvel em água, por razões incertas. EXEMPLO 34 - VIABILIDADE DE SEMENTES ARTIFICIAIS OUE COMPREENDEM RECIPIENTES LENTAMENTE BIODEGRADÁVEIS NOCAMPO

Sementes artificiais que compreendem plantinhas de cana de açúcar encapsuladas por recipientes de película de polilactídeo (PLA) foram preparadas em uma maneira similar aos recipientes de película de PCL descritos no Exemplo 29. As pelotas de PLA foram obtidas da NatureWorks (Minnetonka, MN, grau 4032D) e dissolvidas em clorofórmio (EMD Chemical Products) a 10 % em peso. Esta solução foi moldada sobre um substrato de vidro usando uma lâmina doctor de aço inoxidável com uma largura de 5 cm e 254 μπι de intervalo de espessura. A película de PLA resultante foi secada, produzindo uma espessura final de 25,4 μηι. Depois da remoção do substrato de vidro, dois-pedaços de película, medindo 5 cm de largura, foram revestidos e selados por calor ao longo das duas bordas mais longas e uma das bordas mais curta para criar uma bolsa aberta. As bolsas tanto de 17,8 quanto 10 cm35,6 cm no comprimento foram construídas. Cada bolsa foi carregada com 1 g de meio de crescimento de Metro-Mix® 360 seco. Uma plantinha de cana de açúcar regenerada foi depois adicionada à bolsa, seguida por um adicional de 2 g de Metro-Mix® 360 seco e 3 g de água deionizada. As plantinhas foram preparadas a partir do cultivar CPO-1372 de acordo com um procedimento similar a aquele descrito no Exemplo 1. Nenhum corte dos brotos das plantinha foi necessário para a plantinha se ajustar totalmente dentro da bolsa. Finalmente, a borda aberta remanescente da bolsa foi selada, que forma um recipiente de PLA fechado, impermeável ao ar em torno da plantinha.

Estas sementes artificiais foram plantadas em um campo na DuPont Stine-Haskell Research Center localizada em Newark, DE. O campo foi preparado para dar uma superfície de plantio plana. Ao contrário dos recipientes com película PCL descritos nos Exemplos 29 e 30, os recipientes de película de PLA deste exemplo biodegrada no solo durante períodos relativamente longos de tempo - em excesso de meses. Portanto, os recipientes com película de PLA, como construídos, não fornecem um mecanismo para a liberação das raízes e brotos da plantinha em uma escala de tempo que se iguale com as características de crescimento da planta. Portanto, caminhos para escapar foram criados cortando-se aberturas nos recipientes em vários locais e tempos. Os selos tanto do topo quanto do fundo das bolsas foram cortados abertos, criando deste modo fendas de 5 cm de largura. Em todas as amostras, o selo de fundo foi removido imediatamente antes do plantio. Para metade das amostras, o selo de topo foi removido imediatamente antes do plantio, ao passo que para a metade remanescente das amostras, o selo de topo foi removido 19 dias depois do plantio. As sementes artificiais foram plantadas aproximadamente 5 a 7,6 cm de profundidade em uma orientação vertical tal que os brotos da plantinha encapsulada foram voltados para cima. O campo foi irrigado imediatamente depois do plantio e no geral 3 vezes por semana daí em diante.

A Tabela 28 mostra o número de sementes artificiais plantadas para cada tamanho de recipiente e tempo de remoção do selo de topo, assim como a porcentagem de plantas que sobreviveram, 4 semanas depois do plantio. Pouca diferença na ultima sobrevivência foi observado entre as quatro combinações de comprimento de bolsa e o tempo no qual o selo de topo da bolsa foi removido. Entretanto, em comparação com os recipientes de PCL rapidamente biodegradáveis descritos no Exemplo 29, para o qual a plantinha de cana de açúcar é totalmente fechada pelo recipiente nos primeiros vários dias depois do plantio, as sementes artificiais deste exemplo exibiram viabilidade relativamente baixa. Isto é provavelmente devido em parte às condições de crescimento mais favoráveis no primeiro caso; a temperatura média e a fração de volume de água presente no solo na duração do Exemplo 29 foi de 29°C e 21 %, respectivamente, ao passo que os valores correspondentes na duração do presente experimento foram 24°C e 32 %. Entretanto, a biodegradação comparativamente baixa de PLA, que necessitou a remoção dos selos do recipiente durante e depois do plantio, é também provavelmente um fator contribuinte por detrás das taxas de sobrevivência reduzidas. No plantio, os meios nutritivos da semente artificial entram em contato direto com o solo circundante através da abertura no fundo do recipiente. Isto certamente induz uma diminuição no teor de umidade do meio nutritivo na colocação das raízes da plantinha durante os primeiro dias críticos depois do plantio. Ao contrário, o uso de um recipiente rapidamente biodegradável como descrito no Exemplo 29 impede o contato entre o meio nutritivo e o solo de campo circundante durante este estágio inicial, e a sua degradação macroscópica permite um estabelecimento gradual das raízes da plantinha no solo circundante daí em diante. /

TABELA 28

Sobrevivência de plantas de cana de açúcar a partir de recipientes de película

de PLA no campo

Comprimento da bolsa „ , _ , , , , Número Sobrevivência das Plantas

P (Cm)_Tempo de remoção do selo de topo plantado Depois de 4 Semana$ (0/o)

17,8 19 dias depois do plantio 25 32

17,8 no plantio 28 39

35,6 19 dias depois do plantio 25 28

35,6 no plantio 25 16

EXEMPLO 35 - SEMENTES ARTIFICIAIS TIPO PACOTE COM FUROS

O propósito deste exemplo foi testar sementes artificiais do tipo pacote que possuem furos múltiplos. Os pacotes foram fabricados de sacos de amostra de polietileno de-6,5 por 10 cm (100 μιη de espessura) (Minigrip, Kennesaw, GA). Em um tratamento, um punção de furo foi usado para fazer aproximadamente 12 furos de 6 mm na metade do fundo do saco de amostra. Em seguida, meio de cultivo Metro-Mix®-360 úmido e uma plantinha de cana de açúcar foi adicionada ao saco de amostra. O meio de cultivo encheu o saco de amostra aproximadamente pela metade. Os brotos da plantinha foram aparados até aproximadamente 8 cm e o topo do saco foi deixado aberto com os brotos projetando-se (Figura 31). Em um segundo tratamento, aproximadamente 20, furos de 6 mm foram feitos ao longo do comprimento inteiro do saco de amostra. Uma plantinha de cana de açúcar foi aparada a cerca de 4 cm e meio de cultivo Metro-Mix®-360 foi adicionado para encher o saco de amostra. O topo do saco de amostra foi preso com o selo incorporado (Figura 32). Os pacotes foram plantados em uma orientação vertical em Metro-Mix® 360 meio de cultivo com os seus topos se projetando aproximadamente 3 cm em vasos de plástico de 10 cm com bandejas em uma câmara de crescimento (Conviron modelo BDW-120) a 31°C durante o dia, a 22°C durante a noite, 80 % de umidade relativa e um fotoperíodo de 13 horas (220 uE/m2).

Tabela 29. Os resultados do experimento do pacote.

Planejamento Topo aberto/fechado Número inicialmente Número de brotamento no plantado dia 28 Furos ao Ιοηεο da metade de Aberto 8 6 ^ fundo do Dacote / Furos por todo o pacote Fechado 8 0 Plantinhas exoostas N/A 8 7

Na Tabela 29, os pacotes com furos e o topo aberto

forneceram a melhor sobrevivência, comparável com as plantinhas expostas. No dia 43, as sementes artificiais foram removidas do solo, mostrando que as raízes cresceram para fora dos furos nos pacotes para as sementes com o topo aberto. Nenhum sinal das plantinhas permaneceu para os pacotes com os topos fechados.

EXEMPLO 36 - PLANEJAMENTOS DE SEMENTE ARTICULADA E EXPANSÍVEL

O propósito deste experimento foi estudar o uso de planejamentos de semente articulada ou expansível. As pontas foram cortadas fora de tubos de centrífuga de 50 ml (VWR International, LLC, Radnor, PA) resultando em furos de 5 a 8 mm na extremidade. Os tubos foram depois cortados longitudinalmente na metade. As duas metades dos tubos foram depois reconectadas pelas listras de cola quente (aproximadamente 2 cm de largura por aproximadamente 9 cm de comprimento) de película plástica solúvel em água fria (cortadas de sacos solúveis em água fria da Extra Packaging Corp, Boca Raton, FL). Para este planejamento, água amoleceria as duas metades, possibilitando a plantinha de crescer e empurra separadamente as duas metades do tubo (Figura 33). Em um outro tratamento, as duas metades foram reconectadas coando-se com cola quente uma borda junta enquanto deixando o outro lado aberto, criando deste modo uma articulação flexível (Figura 34). Estes tubos foram posicionados sobre os brotos de pré-plantinhas de cana de açúcar plantadas em Metro-Mix® 360 em 10

15

20

25

vasos de 2" (5 cm) e depois pressionados para baixo com o uso de força com um movimento giratório, tal que a planta assim como o solo que a circunda fossem coletados no tubo. Em um outro tratamento, a película Milar® de 100 μιη de espessura foi cortada em pedaços retangulares de aproximadamente 11 cm χ 12 cm. Os retângulos da película Milar® foram enrolados em um rolo de aproximadamente 11 cm de comprimento e inseridos dentro dos tubos de centrífuga de 50 ml e aquecidos em uma estufa de convecção a 100 0C por 18 h de modo a conformá-los ao diâmetro do tubo de centrífuga de 50 ml (28 mm). Depois, os rolos foram removidos da estufa e esfriados até a temperatura ambiente. Seções de aproximadamente 2 cm de comprimento de tubo de papel encerado de 2 cm de diâmetro foram cortadas. Os rolos foram enrolados mais firmemente mais e inseridos dentro de faixas de papel (Figura 35). As plantinhas de cana de açúcar com vermiculita úmida foram depois inseridas nos rolos para criar um tampão de 4 a 6 cm de espessura. As sementes como rolos foram plantadas em uma orientação vertical em Metro- Mix® 360 aproximadamente a 4 cm de profundidade em vasos de plástico de cm com bandejas em uma câmara de crescimento (Conviron modelo BDW-120) a 31°C durante o dia, a 22°C durante a noite, 80 % de umidade relativa e um fotoperíodo de 13 horas (220 uE/m2). As faixas de papel foram cortadas imediatamente depois do plantio, possibilitando que os rolos se expandam de volta até próximo do seu diâmetro original (28 mm). Os planejamentos de tubo articulado foram plantados de 4 a 5 cm de profundidade nos mesmos planos com as sementes do tipo rolo.

Tabela 30. Os resultados do experimento de planejamento semente articulada

Planeiamento Tnho de 50 ml com bordas de película solúvel em áeua fria Número inicialmente plantado 15 Número de brotamento no dia 28 14 Tnhn de 50 ml com articulação colada a quente Tipo "rolo" expansível Plantinhas expostas 15 11 36 li 10 34

Como pode ser observado na Tabela 30, todas as estruturas desempenharam bem em termos de germinação e comparavelmente às plantinhas expostas. No dia 23, houve evidência de que algumas das sementes articuladas expandiram para acomodar as plantinhas em crescimento. EXEMPLO 37 - ESTRUTURA EXPANSÍVEL DE SEMENTES ARTIFICIAIS E OUTRAS VARIAÇÕES

O propósito deste experimento foi testar uma variedade de estrutura expansível de sementes artificiais. Isto incluiu encaixe telescópico e estrutura como sanfonas dobráveis. O propósito destas estruturas de semente foi atingir um tamanho menor em condições de armazenagem e um tamanho maior no campo após o plantio. Isto deve ser benéfico para aumentar a densidade de armazenagem em um plantador e, como observado no Exemplo 20, o tamanho aumentado de sementes resultou em taxas de sobrevivência mais altas. Tubulação interna de 1,25 cm de diâmetro Tygon® (1,59 cm de diâmetro externo, MSC Industrial Supply Co., Melville, NY) foi cortada em 16,5 cm de comprimento. A seguir, uma plantinha de cana de açúcar e Metro- Mix® 360 úmido foram inseridos na extremidade de fundo do tubo, criando um tampão de solo aproximadamente 4 cm de comprimento. O topo de 6 cm da tubulação foi dobrado e presas com um faixa de borracha (Figura 36). A faixa de borracha foi removida no momento do plantio, resultando no desdobramento do tubo. Em um outro tratamento, um encaixe telescópico estrutura de semente foi feito usando tubo plástico transparente. Tubos de PVC schedule 40 claros de dois diâmetros diferentes, 3,35 cm de diâmetro externo / 2,62 cm de diâmetro interno e 4,22 cm de diâmetro externo / 3,45 cm de diâmetro interno (MSC Industrial Supply Co., Melville, NY) foram cortados em comprimentos de 7,6 cm. A peça mais estreita foi embrulhada com uma faixa de aproximadamente 2 cm de largura de Parafllm® M e inseridas na peça mais ampla de maneira concêntrica para criar um ajuste bem arranjado. A montagem foi posicionada nos brotos das plantinhas de cana de açúcar que foram plantados em Metro-Mix® 360 úmido em potes de 10 cm e depois pressionados para baixo com o uso de força com um movimento giratório, tal que a plantinha assim como o solo que a circunda fossem coletados no tubo. O tubo foi depois levantado, resultando em um tampão de solo de aproximadamente 3 cm espessura. Ambas as extremidades do tubo foram deixadas abertas. A seção externa do tubo plástico transparente foi deslizado para cima em relação à seção interna no momento do plantio, deixando uma sobreposição de aproximadamente 2 cm, de modo a criar uma estrutura de semente mais alta (~13 cm) (Figura 37). Em um outro tratamento, uma semente expansível tipo sanfona foi feita usando-se o tubo de saída reforçado de uma bomba de tambor de sifao operada manualmente de plástico (MSC Industrial supply co, Melville, NY). O tubo de saída reforçado consiste de um segmento de mais nervuras espaçadas de maneira estreita compressíveis, (a cada 3 mm) com plástico mais fino, unindo um segmento de parede mais espessa, nervuras mais amplamente espaçadas menos compressíveis (a cada 6 mm) e é aproximadamente 1,5 cm no diâmetro. O tubo de saída reforçado foi cortado tal que um segmento de 5 cm de comprimento da tubulação mais rígida unida a um segmento de 4 cm de comprimento da tubulação mais flexível. A montagem foi posicionada sobre os brotos das plantinhas de cana de açúcar que foram plantadas em Metro- Mix® 360 úmido em vasos de 2" (5 cm) e depois pressionados para baixo com o uso de força com um movimento giratório, tal que a plantinha assim como o solo que a circunda fossem coletados no tubo. O tubo foi depois levantado, resultando em um tampão de solo de aproximadamente 2 cm espessura. A seção superior mais flexível foi depois manualmente comprimida a um comprimento de aproximadamente 2 cm e presa com fita na posição usando-se fita de tubo. A fita foi removida no momento do plantio, deste modo permitindo a expansão do tubo a um comprimento de 9 cm a partir de um comprimento comprimido de 7 cm (Figura 38). Todas as sementes foram plantadas em um orientação vertical em Metro-Mix® 360 aproximadamente 3 cm de profundidade em vasos de plástico de 10 cm com bandejas em uma câmara de crescimento (Conviron modelo BDW-120) a 31°C durante o dia, a 22°C durante a noite, 80 % de umidade relativa e um fotoperíodo de 13 horas (220 uE/m2). As plantinhas expostas foram plantados

como controles.

Tabela 31. Resultados de experimento de semente artificial expansível.

Planejamento

Semente artificial dobràvel

TWimero inicialmente plantado

10

Ni'imero de brotamento no dia 21

10

Fnraive Telesc. de semente artificial

Semente expansível tipo sanfona

10

Controles de plantinha exposta

21

18

Como observado na Tabela 31, as sementes artificiais expansíveis produziram taxas de sobrevivência altas.

FVFMPT ,O 38 - SEMENTES ARTIFICIAIS COM SUPER ABSORVENTES

F OTTTRA VARIAÇÕES

O propósito deste experimento foi estudar o uso de

superabsorventes em várias configurações na sementes artificiais, assim como

outra variações que inclui tampa na forma de funil e tampas de película com

fendas. Em um tratamento, as pontas cônicas foram totalmente cortadas fora

tubo de centrífuga de 15 mis (VWR International, LLC, Radnor, PA). O tubo

foi posicionado sobre os brotos de plantinhas de cana de açúcar que foram

plantados Metro-Mix® 360 úmido em vasos de 2" (5 cm) e depois

pressionados para baixo com o uso de força com um movimento giratório, tal

que a plantinha assim como o solo que a circunda fossem coletados no tubo.

Unstretched Parafilm® M foi depois colada a quente a ambas as extremidades

do tubo. Uma lâmina foi usada para cortar um "X" com os cortes estendendo-

se às bordas do tubo tanto no topo e fundo. Isto criou uma abertura de tampa

com fendas em ambas as extremidades do tubo (Figura 39). Em um outro

tratamento, o tubo de centrífuga de 15 mis foi usado para fabricar sementes

artificiais como no Exemplo 20, exceto que os fundos foram cobertos

colando-se a quente a película plástica solúvel em água que foi cortada a

partir de sacos quadrados ~2 cm (Extra Packaging Corp., Boca Raton, Florida). Em um outro tratamento, as pontas afuniladas foram cortadas dos tubos de centrífuga de 50 ml (VWR International, LLC, Radnor, PA) revelando um furo de 5 a 8 mm e o tubos foram cortados na graduação de 30 ml (a partir da abertura filamentada de 4,5 cm de largura). Depois, o tubo com a seção cônica foi posicionado sobre os brotos de plantinhas de cana de açúcar que foram plantados em Metro-Mix® 360 úmido em vasos de 2" (5 cm) e depois pressionados para baixo com o uso de força com um movimento giratório, tal que a plantinha assim como o solo que a circunda fossem coletados no tubo, resultando em uma camada de solo de 3 cm. Depois, a tela de janela de plástico (Lowe's Home Improvement, Newark, DE) foi colada a quente ao fundo abaixo o tampão de solo. A segunda peça do tubo foi depois colada novamente no fundo e polímero superabsorvente (pérolas Magic water, magicwaterbeads.com) que foi pré-intumescido em água deionizada foi adicionado à seção inferior do tubo. Finalmente, uma segunda camada de tela de janela de plástico foi colada a quente ao fundo da estrutura (Figura 40). Em um outro tratamento, tubos de centrífuga de 50 ml foram usado para a fabricação de sementes artificiais como no Exemplo 20, exceto pérolas superabsorventes (pérolas Magic water) pré-intumescidas em água deionizada foram misturadas com o solo em uma razão volumeivolume de 1:1 aproximado com o Metro-Mix® 360 úmido. Também, um segmento mais espesso de solo com pérolas foi usado, aproximadamente 5,5 cm espessura. Em um tratamento relacionado, o mesmo procedimento foi seguido, exceto metade das pérolas Magic water foram pré-intumescidas em água deionizada e metade em Miracle-Gro® (The Scotts Company, LLC) fertilizante solução. Em um outro tratamento, os tubos de centrífuga de 50 ml (VWR International, LLC, Radnor, PA) foram usados para fabricar sementes artificiais como no Exemplo 20, exceto dois tubos de centrífuga de 15 mis com extremidades afuniladas cortadas e tampas, contendo pérolas superabsorventes (pérolas Magic water) pré-intumescidas em água deionizada (para um dos tubos) e pré-intumescidas em solução de fertilizante Miracle-Gro® (The Scotts Company5 LLC) (para um outro tubo), foram coladas a quente aos lados opostos do tubo de 50 ml e os fundos cobertos com tela de janela de plástico (Lowe's Home Improvement, Newark, DE) por colagem a quente. Os tubos de 15 ml foram posicionados paralelos ao tubo de 50 ml e mudados de maneira descendente tal que estenderam 2 cm abaixo do fundo aberto do tubo de 50 ml. Em um outro tratamento, os tubos de centrífuga de 50 ml foram usados para a fabricação de sementes artificiais como no Exemplo 20, exceto que uma peça na forma de funil, fabricada cortando-se fora a extremidade cônica, afunilada, um outro tubo de 50 ml foi colado a quente ao topo do tubo de 50 ml, com a extremidade aberta apontando para cima (Figura 41). Em um outro tratamento, tubos de centrífuga de 50 ml foram usados para a fabricação de sementes artificiais como no Exemplo 20, exceto que a cobertura de fundo plástico foi colocada de volta na extremidade do tubo e duas fendas foram cortadas em lados opostos do tubo, 3,5 cm da extremidade coberta, que foram perpendiculares ao eixo do tubo e foram de aproximadamente 23 mm de comprimento e de 5 mm de largura (Figura 42). Este planejamento resultou em um copo fechado enchido com Metro-Mix® 360 úmido no fundo da semente e as fendas atuaram como pontos através dos quais as raízes podem crescer. Todas as sementes foram plantadas em um orientação vertical em Metro-Mix® 360 aproximadamente 3 cm de profundidade em vasos de plástico de 10 cm com bandejas em uma câmara de crescimento (Conviron modelo BDW-120) a 31°C durante o dia, a 22°C durante a noite, 60 % de

IJ

umidade relativa, e um fotoperíodo de 13 horas (220 uE/m ). As plantinhas expostas foram plantadas como controles. Algumas sementes artificiais e plantinhas expostas foram plantadas em Metro-Mix® 360 seco, enquanto outras foram plantadas em Metro-Mix® 360 úmido como mostrado na Tabela 32. Neste experimento, o solo não foi regado subsequente ao plantio. Tabela 32. Resultados de teste de várias sementes contendo superabsorvente e Proieto

tubo cônico de 15 ml revestido com Parafílm® não esticado com fendas

M

tiihn r.Ânico de 15 ml revestido n" fiindo solúvel ern Agua quente

TTTBO CONICO DE 50

MT. com Plantinhas expostas n" topo da forma de funil _

Plantinhas expostas Snperabsorvente no tubo r.ônico de 50 ml de seção avaliada__

Condição de umidade de Mp.trr.-Mix® 360 inicial

outros projetos.

úmido

Número inicialmente plantado_

15

úmido

seco

12

11

Número de hrotamento no dia 15 _

13

12

11

tubo cônico de 50 ml com pérolas superabsorventes intumescidas com água misturadas com solo

seco

15

tubo cônico de 50 ml com

pérolas superabsorventes intumescidas com solução fertilizante misturadas com

seco

14

tilho cônico de 50 ml com dois tubos de 15 ml tubos r.nntendo pérolas superabsorventes

seco

11

Tubo com fenda lateral com extremidade fechada rontendo Metro-Mix® 360 úmido _

seco

18

14

10

Plantinhas expostas

seco

Na tabela 32, está claro que sob condições de solo iniciais úmidas, todas as estruturas de semente bem realizadas, assim como as plantinhas expostas. Para sementes plantadas em solo seco, houve uma diferença grande na sobrevivência, com sobrevivência mais alta para as estruturas de semente do que para as plantinhas expostas. No dia 24 após o plantio, as sementes com as laterais com fendas com extremidades fechadas foram exumadas e foi observado que as raízes da plantas emergiram de maneira bem sucedida através as aberturas com fendas laterais para as

sementes que brotaram.

FYFMPLO 39 - SEMENTES ARTIFICIAIS COM PLANTINHAS MÍTLTIPLAS

O propósito deste exemplo foi estudar o uso de plantinhas múltiplas na mesma estrutura de semente artificial. Tubos de papel encerado com 2 cm de diâmetro foram cortados em seções de 6 cm de comprimento. As plantinhas de cana de açúcar foram aparadas a 4 cm de comprimento. A extremidade do fundo dos tubos foram cobertas com Parafilm® M pré- estirado. Uma camada de Metro-Mix® 360 de aproximadamente 2 cm de espessura foi adicionada ao fundo. 1 ou 2 plantinhas aparadas foram colocadas no topo, e mais Metro-Mix(S) 360 foi adicionado até o tubo estar aproximadamente 75 % cheio. Aproximadamente 3 ml água foi adicionada. O topo foi depois coberto com Parafilm® M pré-estirado. As sementes artificiais foram plantadas em um orientação vertical em solo Matapeake/areia (um mistura de solo Mariland com areia, criando um solo com alto teor de areia) tal que tal que seus topos estiveram aproximadamente 0,5 cm acima do solo superfície em vasos de plástico de 10 cm com bandejas em uma câmara de crescimento (Conviron modelo BDW-120) a 31°C durante o dia, a 22°C durante a noite, 40 % de umidade relativa e um fotoperíodo de 13 horas (220 uE/m2). Os resultados são resumidos na Tabela 33. O brotamento das sementes artificiais de tubo de papel contendo 2 plantinhas foi comparável sob estas condições àquelas das sementes artificiais contendo 1 plantinha.

TABELA 33. Resultados de planta múltipla por experimento de semente.

Planeiamento Número de olantinhas oor semente Número inicialmente Dlantado Número brotamento no dia 26 Tubo de naoel encerado com 2 cm com Parafilm® pré-estirado em ambas ás extremidades I IZ 10 Tubo de Danei encerado com 2 cm com Parafilm® pré-estirado em ambas as extremidades 2 16 7

EXEMPLO 40 - EFEITO DA ESPESSURA DA CAMADA DO SOLO E

TAMPA DE FUNDO SOB CONDIÇÕES INFLUENCIADAS PELA SECA

O propósito deste experimento foi estudar o efeito de mudar o tampão de solo espessura em sementes artificiais com tubo cônico e usando tampas de fundo sob condições influenciadas pela seca. Em um tratamento, sementes artificiais com tubo de centrífuga cônicos de 15 ml foram criados como no Exemplo 20, com tampões de solo com 4 cm de espessura, estes foram plantados cerca de 4 cm de profundidade em potes 10 CM em solo seco 50:50 Matapeakee/areia (uma mistura de um solo Mariland local com areia, criando um solo com alto teor de areia). Em um outro tratamento, Metro- Mix® 360 úmido ADICIONAL foi adicionado a partir de uma extremidade de fundo do tubo até o topo da camada de solo foi de 9 cm de espessura. O fundo do tubo foi deixado aberto ou coberto com Parafilm® M pré-estirado. Estas foram plantados cerca de 9 cm de profundidade em potes de 10 cm em solo seco 50:50 Matapeake/areia (uma mistura de um solo Mariland local com areia, criando um solo com alto teor de areia). Em um outro tratamento, luvas de poli(s-caprolactona) (75 um de espessura) foram criadas vertendo-se uma solução de 8 % em peso poli(s-caprolactona) (Sigma Aldrich, St. Louis, MO) em clorofórmio (EMD Chemical Products, uma divisão da Merck KGaA, Darmstadt, Alemanha) em tubos de centrífuga de 50 ml, verter o excesso e possibilitar que a película seque em uma capela de laboratório em temperatura ambiente por 2 dias. As luvas encolheram de maneira espontânea além das paredes do tubo de centrífuga e foram manualmente puxadas. Estas foram eixadas secar por um adicional de 1 semana em temperatura ambiente na capela. As luvas foram depois enchidas a 2 cm do topo com Metro-Mix® 360 úmido e uma planta de cana de açúcar foi depois plantada no topo. Metro- Mix® 360 úmido adicional foi adicionado até o solo estar a cerca de 0,5 cm do topo da luva. A ponta de um tubo de centrífuga de polipropileno cônico de 50 ml (VWR International, LLC, Radnor, PA) foi cortada, revelando um furo de 5 a 8 mm. Este tubo foi depois colocado na luva e deslizado para baixo para formar dois tubos concêntricos (Figura 43). Antes do plantio, o tubo de centrífuga foi encaixado de maneira ascendente, deixando cerca de 2 cm de sobreposição com a luva interna. A montagem foi plantada em mistura de Matapeakee/areia seca tal que o topo da seção de luva foi quase nivelada com a superfície do solo. Os potes de semente artificial foram colocados em uma câmara de crescimento (Conviron modelo BDW-120) a 31°C durante o dia, a 22°C durante a noite, 40 % de umidade relativa e um fotoperíodo de 13 horas (220 uE/m2). As sementes artificiais foram não foram regadas durante este experimento.

Tabela 34. Os resultados do experimento que estuda o efeito da espessura da camada de solo e da tampa de fundo sob condições influenciadas pela seca.

Planejamento EsDessura da seção de solo Ccml Jífimero inicialmente plantado Número de sobrevivência no dia 10 sem irrieacão Número de sobrevivência no dia 17 sem irrigação tubo cônico de 15 ml fundo aberto 4 30 11 0 tubo cônico de 15 ml fundo aberto 9 30 29 0 tubo cônico de 15 ml com Parafilm® pré- estirado no fundo 9 30 30 2 Luva de Polife- caDrolactona) com encaixe Telesc. de tubo cônico de 50 ml IO 18 18 16

Como na Tabela 34, está claro que a camada de solo mais

espessa resultou em taxas de sobrevivência mais altas sob condições influenciadas pela seca. Uma observação adicional foi que as sementes artificiais com tampas de Parafilm® M no fundo apresentaram vigor melhor na extremidade do período de 10 dias, em comparação com o tratamento com o fundo aberto. Também, o planejamento de encaixe telescópico com a luva de poli(D-caprolactona) mostrou sobrevivência melhor do que o tubo de 15 ml com camada de solo com 4 cm. Depois de 31 dias, o planejamento de encaixe telescópico com as luvas de poli(D-caprolactona) foi exumado e foi observado que as raízes e foi observado que as raízes desenvolveram dos fundos das luvas no solo circundante.

EXEMPLO 41 - EFEITO DE TAMPAS CÔNICA (TUBOS PLÁSTICOS CÔNICOS DE 15 ml) NO TOPO DE TUBOS DE PAPEL ENCERADO EM TESTE DE CAMPO PARA SEMENTES ARTIFICIAIS NO BRASIL

Recipientes cilíndricos de papel encerado (Colossal drinking straw, Aardvark®, Precision Product Group, Ft Modone, IN, 1,19 cm de diâmetro externo) foram cortados em 5 cm e 8 cm de comprimento. As plantinhas de cana de açúcar, cultivar Vl 1 (SP813250) que foram regeneradas por 28 dias a partir os fragmentos de broto de tecido em meio de regeneração de plantinha foram usadas para este experimento. Os brotos de plantinhas foram aparados para ajustar no comprimento dos tubos. Os fundos dos tubos de papel foram fechados embrulhando-se com Parafilm® pré-estirado M através do fundo. Uma camada fina de aproximadamente 1 de solo de base submetido à autoclave (Tropstrato® HT) forcolocado no fundo dos tubos. As plantinhas foram colocadas na camada de solo, e depois solo de vaso adicional foi adicionado para encher o tubo até a plantinha ser quase coberta. Um volume de aproximadamente 1 ml de água foi adicionado na estrutura, e depois os topos dos tubos foram fechados com Parafilm® M pré-estirado ou cônica tampas (tubos de centrífuga de polipropileno de 15 ml (Milhoing®) sem furos.

As sementes artificiais foram plantadas em um orientação vertical em leitos elevados no local da DuPont do Brasil em Paulínia (SP), Brasil tal que o topos dos tubos estiveram menos do que 0,5 cm acima da superfície do solo. As plantinhas expostas sem poda foram plantadas tanto no campo, tanto em um local de estufa próximo (usando-se o mesmo solo de base submetido à autoclave usado dentro das estruturas) em potes de 8 cm (240 ml de volume)). O solo do campo foi preparado antes do experimento usando-se enxadas rotativas e um formador de leito. Após o plantio, a irrigação foi realizada diariamente e a sobrevivência foi monitorada a cada dois dias. TABELA 35

Resultados do experimento de campo com sementes artificiais de tubo de

papel encerado.

Estrutura de semente fechamento de topo Fechamento de tubo # inicial de recipientes % de Sobrevivência no dia 30 tubo de papel encerado de 5 cm Parafilm® M pré- estirado Parafilm® M pré- estirado 30 20,0 tubo de papel encerado de 5 cm tubo de centrífuga de 15 ml Parafilm® M pré- estirado 30 / 46,7 tubo de papel encerado de 8 cm Parafilm® M pré- estirado Parafilm® M pré- estirado 30 13,3 tubo de papel encerado de 8 cm tubo de centrífuga de 15 ml Parafilm® M pré- estirado 30 10,0 Plantinha exposta - Campo Nenhum Nenhum 35 68,6 Plantinha exposta - Estufa Nenhum Nenhum 30 66,7

Como mostrado na Tabela 35, o menor (5 cm) dos tubos

fornecidos mais alto níveis de sobrevivência comparada com os tubos de 8 cm. Para os tubos de 5 cm, o tratamento com um tampa plástica cônica fornecida uma mais alto taxa sobrevivência do que um com Parafilm® M pré- estirado tampas. As plantinhas foram observadas para ruptura das tampas de Parafilm® neste experimento. EXEMPLO 42 - EFEITO OF SUPERABSORVENTE POLIMER INSIDE TUBO DE PAPEL ENCERADOS

Recipientes cilíndricos de papel encerado (Colossal drinking straw, Aardvark®, Precision Product Group, Ft Modone, IN, 1,19 cm de diâmetro externo) foram cortados em comprimentos de 4 cm. As plantinhas de cana de açúcar, cultivar Vll (SP813250) que foram regeneradas por 28 dias a partir dos fragmentos de tecido de broto em meio de regeneração de plantinha foram usadas para este experimento. Os brotos de plantinhas foram aparados a aproximadamente 3 cm de comprimento antes da encapsulação. Os fundos do tubos de papel foram grampeados ao longo do eixo do tubo com metade do grampo estendendo-se além da extremidade do tubo ou fechado embrulhando-se Parafilm® M pré-estirado através do fundo. Aproximadamente 1 cm do tubo foi enchido com uma solução de polímero superabsorvente (Stockosorb®) misturada com meio nutriente Murashige e 10

15

Skoog ou com solo de base submetido à autoclave. Os topos dos tubos foram fechados com Parafilm® M pré-estirado.

As sementes artificiais foram plantadas em uma orientação vertical em potes de 8 cm (240 ml de volume) enchido com uma mistura de razão 1 : 1 peso para peso de solo de campo Paulínia para areia na câmara de crescimento. As plantinhas expostas sem poda foram plantadas^sm potes enchidos com a mesma mistura (controle de campo) e também em potes cobertos com tampas de plástico enchidos com solo de base submetido à autoclave (controle de estufa). Os potes foram deixados em uma câmara de crescimento. Após o plantio, a irrigação foi realizada diariamente apenas para os potes enchidos com solo de vaso e a sobrevivência foi monitorada a cada dois dias. Para todos os tratamentos, as autópsias foram feitas depois de 5, 14 e 33 dias.

TABELA 36

Resultados do experimento de câmara de crescimento com sementes artificiais de tubo de papel encerado.

Estrutura de semente Material dentro da estrutura Fechamento de topo Fechamento de tubo Autópsia # inicial de recipientes % de Sobrevivência no dia de autópsia Tubo de Papel encerado lOg/L de polímero misturado com sal MS Parafilm® M pré-estirado Parafilm® M pré-estirado 5 dias 15 100,0 Tubo de papel encerado lOg/Lde polímero misturado, com sal MS Parafilm® M pré-estirado Parafilm® M pré-estirado 14 dias 15 100,0 Tubo de papel encerado lOg/Lde polímero misturado com sal MS Parafilm® M pré-estirado Parafilm® M pré-estirado 33 dias 15 0,0 Tubo de papel encerado Solo de base submetido à autoclave Parafilm® M pré-estirado Grampo 5 dias 15 100,0 Tubo de papel encerado Solo de base submetido à autoclave Parafilm® M pré-estirado Grampo 14 dias 15 0,0 Tubo de papel encerado Solo de base submetido à autoclave Parafilm® M pré-estirado Grampo 33 dias 15 0,0 Plantinha exposta - Campo - Nenhum Nenhum S dias 15 100,0 Plantinha exposta - Campo - Nenhum Nenhum 14 dias 15 87,0 PIantinha exposta - Campo - Nenhum Nenhum 33 dias 15 93,3 Plantinha exposta - Estufa - Nenhum Nenhum 5 dias 15 100,0 Estrutura de semente Material dentro da estrutura Fechamento de topo Fechamento de tubo Autópsia # inicial de recipientes % de Sobrevivência no dia de autópsia Plantinha exposta - Estufa - Nenhum Nenhum 14 dias 15 33,3 Plantinha exposta - Estufa - Nenhum Nenhum 33 dias 15 6,7

Como mostrado na Tabela 36, a visibilidade final (autópsia

depois de 33 dias) para os tratamentos com encapsulação é a mesma (0 %), mas o tratamento com polímero superabsorvente dentro dos tubos mantidos, as plantinhas viveram por um período mais longo de tempo. Neste experimento, as plantinhas romperam as tampas de Parafilm® na maioria dos casos, embora algumas tampas de Parafilm® tenham apresentado ruptura espontânea no ambiente de campo.

EXEMPLO 43 - EFEITO DA PERMEABILIDADE DE ESTRUTURA EM SEMENTES ARTIFICIAIS EM TESTE DE CAMPO NO BRASIL Recipientes cilíndricos de papel encerado (Colossal drinking

straw, Aardvark®, Precision Product Group, Ft Modone, IN, 1,19 cm de diâmetro externo), tubos de centrífuga de polipropileno (Milhoing®) de 15 ml e 50 ml foram cortados em comprimentos de 4 cm. Para os tubo de centrífugas, a seção de 4 cm consistiu apenas na porção de tubo cilíndrico (não cônica). As plantinhas de cana de açúcar, cultivar Vl 1 (SP813250) que foram regeneradas por 37 dias a partir dos fragmentos de tecido de broto em meio de regeneração de plantinha foram usadas para este experimento. Os brotos de plantinhas foram aparados a aproximadamente 3 cm de comprimento antes da encapsulação. Os fundos dos tubos foram fechados embrulhando-se com Parafilm® M pré-estirado através do fundo ou foram deixados abertos. Em um tratamento, as pontas dos tubos de centrífuga de 50 ml foram cortados, criando um furo de 1,5 cm e foi usado como a estrutura de fundo. Uma camada de solo de base fina de aproximadamente 1 cm submetido à autoclave (Tropstrato® HT) foi colocado no fundo dos tubos. As plantinhas foram colocadas na camada de solo e depois, o solo de vaso adicional foi adicionado para encher o tubo até a plantinha ser quase coberta. Um volume de aproximadamente 1 ml de água foi adicionado na estrutura. Os .167 topos dos tubos foram fechados com Parafilm® M pré-estirado, com tubos de centrífuga de 15 ml ou 50 ml invertidos. O tamanho do furo no topo do tubo variou no furo (impermeável a furo de 1,0 cm).

As sementes artificiais foram plantadas em um orientação vertical em leitos elevados no local da DuPont do Brasil em Paulínia (SP), Brasil tal que o topos do tubos estiveram a menos do que 0,5 cm acima da superfície do solo. Plantinhas expostas sem poda foram plantadas tanto no campo, quanto no local de estufa próxima (usando-se o mesmo solo de base submetido à autoclave usado dentro das estruturas) em potes de 8 cm (240 ml de volume)). O solo de campo foi preparado antes do experimento usando-se enxadas rotativas e um formador de leito. Após o plantio, nenhuma irrigação foi realizada. A sobrevivência foi monitorado a cada dois dias.

TABELA 37

Resultados de experimento de campo com sementes artificiais de tubo de papel encerado.

Estrutura de semente fechamento de topo Fechamento de tubo # inicial de recipientes % de Sobrevivência no dia 30 Tubo de papel encerado de 4 cm Parafilm® M pré- estirado Parafilm® M pré- estirado 22 0,0 Tubo de papel encerado de 4 cm tubo de centrífuga de 15 ml sem furo Nenhum 22 4,5 Tubo de papel encerado de 4 cm tubo de centrífuga de 15 ml com furo de 0,2 cm Nenhum 22 0,0 Tubo de papel encerado de 4 cm tubo de centrífuga de 15 ml com fura de 0,5 cm Nenhum 22 0,0 4 cm tubo de centrífuga de 15 ml tubo de centrífuga de 15 ml com furo de 0,5 cm Nenhum 22 4,5 4 cm 50ml tubo de centrífuga tubo de centrífuga de 50 ml com furo de 0,5 cm Nenhum 22 9,0 tubo de centrífuga de 50 ml com furo de 1,5 cm tubo de centrífuga de 50 ml com 1,0 cm furo Nenhum 22 13,6 Plantinha exposta - Campo Nenhum Nenhum 22 0,0 Plantinha exposta - Estufa Nenhum Nenhum 22 50,0

Como mostrado na Tabela 37, neste experimento, todos os tratamentos com encapsulação tiveram taxa de sobrevivência baixa (de 0 % a 14 %). o tratamento com os dois tubos de centrífuga de 50 ml no topo um do outro tiveram a sobrevivência mais alta. O tubo de tamanho maior forneceu sobrevivência aumentada para o tubo de centrífuga de 15 ml com base em sementes artificiais. As plantinhas expostas no campo tiveram uma viabilidade de 0 %, indicando que as sementes artificiais forneceram sobrevivência melhorada. Neste experimento, 91 % das tampas de Parafilm® M foram observadas romper de maneira espontânea em um período de vários dias no ambiente de campo, antes das plantinhas puderem rompê-las. A temperatura máxima neste experimento variou de cerca de 32-35° C para os primeiros 6 dias.

EXEMPLO 44 - SEMENTES SINTÉTICAS DE TUBOS E COPOS BIODEGRADÁVEIS

Os tubos e copos biodegradáveis foram preparados a partir de poli(ácido láctico) (4032D grau PLA, NatureWorks, Minnetonka, MN), Amido (Sigma Aldrich), α-Celulose (Sigma Aldrich, St. Louis, MO), Quitosano (Sigma Aldrich, St. Louis, MO), poli(hidroxil-butirato) (PHB, Sigma Aldrich, St. Louis, MO), e/ou poli(hidróxi-butirato)-co-poli(hidróxi- valerato) (PHB-PHV, Sigma Aldrich, St. Louis, MO). Para algumas misturas D-sorbitol (Sigma Aldrich, St. Louis, MO) e glicerol (Sigma Aldrich, St. Louis, MO) foram adicionadas como plastificadores. Os tubos e copos foram formados vertendo-se uma mistura de solução de 20 % de polímero/polímero dissolvida em clorofórmio em um tubo de centrífuga de 15 ml ou um béquer plástico de 100 ml, garantindo a solução polimérica polímero revestida na superfície interna total do recipiente. Na evaporação do clorofórmio, o tubo ou copo deslaminaram da superfície do recipiente, e o tubo/copo foram removidos e secados durante a noite em temperatura ambiente. A Tabela 38 descreve as misturas poliméricas específicas usadas para fabricar tubos e copos. Tabela 38. Composições poliméricas usadas para formar estrutura de tubo e

copo de semente sintética biodegradável.

(Razão de peso) Composição Poli(L-ácido láctico) 1 1: 0,5 Poli(L-ácido láctico)/Amido/Sorbitol 1 1: 0,5 Poli(L-ácido láctico)/Celulose/Sorbitol 1 1: 0,5 Poli(L-ácido láctico)/Quitosano/Sorbitol 1 1 PHB/PHB-PHV 1 1: 2: 0,05 PHB/PHB-PHV/Amido/ Sorbitol 1 1: 2: 0,05 PHB/PHB-PHV/Celulose/Sorbitol 1 1: 2: 0,05 PHB/PHB-PHV/Quitosano/Sorbitol 1 PLA/Amido/ Sorbitol 1 1: 0,1 Poli(L-ácido láctico)/Amido/Glicerol 1 1: 0,1 Poli(L-ácido láctico)/Celulose/Glicerol 1 1: 0,1 Poli(L-ácido láctico)/Quitosano/Glicerol 10/1/1 PLA/PHB/PHB-PHV 3: 2: 1:1 PLA/Amido/PHB/PHB-PHV

Plantinhas de cana de açúcar (preparadas de uma maneira similar ao Exemplo 1) foram plantadas em solo de vaso (Metro-Mix® 360). A semente foi montada colocando-se o tubo sobre a planta e comprimindo-a no solo. Vinte sementes sintéticas biodegradáveis foram plantadas em uma caixa de flor (12 cm de profundidade χ 60 cm de comprimento χ 20 cm de largura) contendo solo 50 : 50 matapeake/areia (uma mistura de um solo Mariland local com areia, criando um solo com alto teor de areia). A plantas foram cultivadas em uma câmara de crescimento Conviron modelo BDW-120) a 31°C durante o dia, a 22°C durante a noite, 60 % de umidade relativa, e um fotoperíodo de 13 horas (220 uE/m2) por 4 semanas e dado 1 litro de água 3 vezes per semana. As plantas de cana de açúcar tiveram taxa de 95 % de sobrevivência para todas as estruturas depois de 8 semanas. As plantas nos tubos feitas de materiais mais flexíveis, isto é, PLA/quitosano e PLA/PHB/PHB-PHV, foram capazes de quebrar os tubos mais facilmente do que as plantas empacotadas em tubos mais rígidos, isto é, PLA. EXEMPLO 45 - SEMENTES SINTÉTICAS O VUL ARES BIODEGRADÁVEIS

As cascas de forma ovular biodegradáveis oram feitas de poli(D,L-ácido láctico) amorfo (636ID Grade, NatureWorks, Minnetonka, MN) e poli(s-caprolactona) (Sigma Aldrich, St. Louis, MO). Os ovos foram formados vertendo-se solução polimérica de 25 % em peso de clorofórmio em um ovo de Páscoa de plástico (de forma ovoide, 7,5 χ 3,75 cm). Na evaporação do clorofórmio, a casca do ovo deslaminou a partir da superfície interna do ovo de Páscoa. A casca ovoide foi removida do ovo de Páscoa e um furo de 1 cm foi perfurado nas partes de topo e fundo do ovo. A metade do fundo da casca do ovo foi enchida com solo de vaso (Metro-Mix® 360) úmido e uma plantinha de cana de açúcar (ver Exemplo 1) foi plantada dentro. O metade do topo do ovo foi colocada no topo (Figura 44) e presas com cola multipropósito Elmer ou Parafilm® M pré-estirado. Os ovos de semente sintéticos foram plantados em uma caixa de flor (12 cm de profundidade χ 60 cm de comprimento χ 20 cm de largura) com 50 : 50 de solo matapeake/areia (uma mistura de um solo Mariland local com areia, criando um solo com alto teor de areia), tal que 2/3 da casca ovoide foi coberta com solo. A plantas foram cultivadas em uma câmara de crescimento Conviron modelo BDW- 120) a 31°C durante o dia, a 22°C durante a noite, 60 % umidade relativa e um fotoperíodo de 13 horas (220 uE/m2) e regadas com 1 litro água 3 vezes por semana. As plantas de cana de açúcar na estrutura de semente de ovo sintético tiveram uma taxa de sobrevivência de 50 % no dia 21. EXEMPLO 46 - SEMENTES SINTÉTICAS COM TOPO DE TUBO EXPANSÍVEL

As sementes sintéticas com um top ode tubo expansível foram preparadas a partir de uma estrutura e tubo com duas partes, onde a metade do fundo foi rígida e a metade do topo foi flexível. A metade rígida do fundo foi feita cortando-se fora a extremidade cônica de um tubo de centrífuga de 50 ml. A metade de topo flexível foi feita de película fina fundindo-se uma solução polimérica diluída em clorofórmio em um tubo de centrífuga de 50 ml. Para o material flexível uma mistura 1 : 1 de amido (Sigma Aldrich, St. Louis, MO) e poli(D,L-ácido láctico) amorfo (PLA 636ID Resin, NatureWorks, Minnetonka, MN) ou uma mistura 3: 2: 1: 1 (peso) de PLA,

20

25 amido, poli(hidróxi butirato) (PHB, Sigma Aldrich, St. Louis, MO) e poli(hidroxibutirato-co-hidroxivalerato) (PHB-PHV, Sigma Aldrich, St. Louis, MO) foi usado. Uma vez que o clorofórmio foi evaporado a película fina na forma do tubo foi removida de dentro do tubo. Uma fenda pequena foi cortada (0,5 cm) no topo do tubo flexível e depois este foi comprimido para formar um anel. O anel foi colado ao topo interno da estrutura de tubo rígido usando Scotch® Super Glue (3M, St. Paul, MN). As plantinhas de cana de açúcar (Exemplo 1) foram plantadas em Metro-Mix® 360 úmido. A estrutura de semente foi colocada acima da planta e comprimida no solo para montar as sementes sintéticas. Metro-Mix® 360 úmido adicional foi colocado no fundo do tubo de modo que o solo encheu 2/3 da porção rígida. As sementes sintéticas foram plantadas em uma caixa de flor (12 cm de profundidade χ 60 cm de comprimento χ 20 cm de largura) com solo 50 : 50 matapeake/areia (uma mistura de um solo Mariland local com areia, criando um solo com alto teor de areia) tal que 2/3 do tubo rígido esteve abaixo do solo. A plantas foram cultivadas na câmara de crescimento Conviron modelo BDW-120) a 31°C durante o dia, a 22°C durante a noite, 60 % de umidade relativa, e um fotoperíodo de 13 horas (220 uE/m2) e regadas 1 litro 3 vezes por semana. Quando a cana de açúcar se desenvolveu a planta empurrou o tubo flexível do tubo rígido, essencialmente para expandir a estrutura com o crescimento da planta (Figura 45). Os tubos expansíveis tiveram uma taxa de sobrevivência de 100% no dia 21.

EXEMPLO 47 - TESTE DE ARMAZENAGEM DO TUBO E PACOTE TIPO SEMENTES ARTIFICIAIS

Dois tipos de sementes artificiais foram preparados por um estudo de armazenagem para determinar sua vida de prateleira: 1) poli(s- caprolactona) pacotes (como no Exemplo 29) e 2) 50 ml de tubos cônicos de polipropileno com abertura de topo e inferior (como no Exemplo 20). 160 cópias de cada tipo foram preparadas e embaladas em um saco de armazenagem (saco de armazenagem VWR Red Line, 32 χ 48 cm, 100 um de espessura), com 20 sementes/embalagem. Para as estruturas de semente do tubo cônico, fita (fita de rotulação de laboratório de propósito geral VWR) foi colocado no topo e inferior da estrutura para cobrir as aberturas. Um adicional de cada tipo da estrutura de semente foi preparado ser plantado no início do experimento. Quatro embalagens de tubos e pacotes foram armazenado em temperatura ambiente (20 ± 1°C) no escuro por 1 a 4 semanas. 4 sacos de tubos e pacotes foram armazenado em subtemperatura ambiente (10 ± 2°C) no escuro por 1 a 4 semanas.

No início do experimento de armazenagem 15 tubos, 15 pacotes, e 20 plantas expostas foram plantadas em uma caixa de flor de 12 cm de profundidade χ 60 cm de comprimento χ 20 cm de largura com 47,5: 47,5: matapeake: areia: Metro-Mix® 360 solo. As plantas foram cultivadas em uma câmara de crescimento, modelo Conviron BDW-120) a 31°C durante o dia, a 22°C durante a noite, 60 % de umidade relativa, e um fotoperíodo de 13 horas (220 uE/m2). As plantas foram dadas IL de água 3 vezes uma semana. Depois de cada semana, 1 embalagem de tubos e pacotes foram removidos a partir do ambiente e armazenagem da subtemperatura ambiente. Para as sementes do tubo da fita foi removido a partir das aberturas antes do plantio. A cada semana as sementes foram plantadas em caixas de flores usando com 47,5: 47,5: 5 matapeake: areia: Metro-Mix® 360 solo, cultivado na câmara de crescimento, e dados IL de água 3 vezes em uma semana. As plantas foram cultivadas por 4 semanas. Na extremidade de 4 semanas, as plantas foram desenterradas de caixas de flores, o broto de comprimento foi medido, e a taxa de sobrevivência foi calculada. Os resultados de quatro semanas de estudo são mostrados abaixo na Tabela 39. Estes resultados indicam que armazenagem em subtemperaturas de ambiente atingem uma taxa de sobrevivência de planta mais alta do que armazenagem em temperatura ambiente. Também o comprimento das diminuições do broto com o aumento do tempo de armazenagem quando as estruturas de sementes de tubos sintéticos são armazenados em temperatura ambiente.

Tabela 39. Os resultados da armazenagem das sementes sintéticas

Tipo de Temperatura de Comprimento de Taxade Comprimento médio Semente armazenagem armazenagem (semanas) sobrevivência (%) do broto (cm) exposta — 0 55 30,2±10,6 Tubo — 0 100 37,8±8,0 Pacote — 0 100 20,1 ±3,6 Tubo 20°C 1 100 50,2±13,4 Tubo 20°C 2 85 41,2±12,1 Tubo 20°C 3 25 33,8±3,7 Tubo 20°C 4 5 20,8 Pacote 20°C 1 100 23,0±5,5 Pacote 20°C 2 90 19,8±5,6 Pacote 20°C 3 40 13,8±8,1 Pacote 20°C 4 0 ~ Tubo IO0C 1 100 49,9±5,4 Tubo IO0C 2 100 49,6±8,7 Tubo IO0C 3 65 49,8±12,2 Tubo IO0C 4 30 49,7±10,5 Pacote IO0C 1 75 24,4±3,1 Pacote IO0C 2 85 23,0±3,0 Pacote 10°C 3 60 15,1±4,4 Pacote IO0C 4 20 23,5±3,8

EXEMPLO 48 - SEMENTES ARTIFICIAIS DE TUBO DOBRÁVEL

FLEXÍVEL

O propósito deste exemplo foi para estudar as sementes artificiais formados pelo tubo dobrável flexível. A película de poli(caprolactona) (50 um de espessura) foi fabricada de grânulos de ρο1ί(ε- caprolactona) (Capa™ 6800, Perstorp Company, Perstoip, Sweden) usando LO uma extrusora de parafuso duplo 28 mm e uma linha de película. A temperatura da matriz foi mantida a 155°C e as temperaturas de barril variou de 127 a 160°C. A película foi cortada em retângulos de aproximadamente 12 cm por 12 cm e selado por calor em um forma cilíndrica. Três ou quatro subcompartimentos tubulares menores foram criada pelas pressão das porções do tubo paralela do eixo do tubo principal. As extremidades dos subcompartimentos foram também selados por calor, enquanto o tubo mais amplo foi deixado aberto no topo da extremidade e selado por calor ao longo do fundo em um tratamento (Figura 46). Este dá a rigidez aumentada de estrutura ampla. A vantagem do uso do material flexível foi aquela da espessura e portanto quantidade de polímero foi reduzida, e também este produz uma estrutura que deve ser dobrada para ocupar menos espaço antes do plantio e expandiria novamente a sua conformação maior na remoção de uma contenção. Uma plantinha de cana de açúcar e Metro-Mix® 360 úmido foram inseridos a partir do fundo do tubo, criando um tampão de solo aproximadamente 5 cm de espessura. A estrutura foi plantada em uma orientação vertical de aproximadamente 5 cm de profundidade nos vasos de plástico de 10 cm com bandejas em uma câmara de crescimento (modelo Conviron BDW-120) a 31°C durante o dia, a 22°C durante a noite, 40 % de umidade relativa, e um fotoperíodo de 13 horas (220 uE/m2). 6 sementes foram fabricadas e todas as 6 brotaram em 25 dias.

EXEMPLO 49 - PRODUÇÃO DE POLIÍÁLCOOL VINÍLICO), PELÍCULAS DE COMPÓSITO COM BASE NA FIBRA DE CELULOSE E AMIDO PARA AS ESTRUTURAS DE SEMENTES ARTIFICIAIS

O procedimento descrito abaixo fornece um material plástico alternativo a partir das recursos renováveis, com boas propriedades mecânicas e biodegradáveis para o uso como uma estrutura de semente artificial. O material é um polímero de compósito que compreende poli (álcool vinílico) (PVOH), um polímero solúvel em água; amido de milho, com aproximadamente 27 % de amilose e 73 % de amilopectina, e fibras de celulose como um material de reforço com alta capacidade de absorção de água. A estrutura polar de PVOH capaz de uma boa compatibilização com materiais poliméricos naturais, resultando nas películas biodegradáveis homogêneas.

Em um béquer de 1 L aproximadamente 21 g de PVOH foi adicionado a 200 ml de água destilada a 90°C sob agitação, até uma solução homogênea ser formada. Em torno de 50 ml de água foi adicionada para compensar qualquer perda de evaporação, seguida pela adição de 12 g de glicerol e 7,5 g de uréia. Esta solução foi agitada por 10 minutos, 16,5 g de amido de milho foi dissolvida em 100 ml de água em temperatura ambiente, e esta mistura foi adicionada à solução aquosa. Depois de 30 minutos, 3 g de fibras de celulose e 100 ml de água a 70°C foram adicionadas e agitadas por 40 minutos extras, quando 10 gotas do agente antiespumante de Hypermaster 602 (Montenegro Química, Brasil) foi adicionado. A solução foi vertida em um recipiente de largura com revestimento não pegajoso e deixado secar durante a noite em um /forno a 40°C. Este material foi triturado em um moinho de faca e compressão moldada, resultando nas películas aproximadamente 350 μπι de espessura.

Para as amostras ligadas cruzadas, hexametoximetilmelamina (HMMM), um imino melamina-formaldeído baixo, e uma quantidade catalítica de ácido cítrico foi adicionada depois das fibras celulósicas, e a mistura foi agitada por 45 minutos adicionais a 70°C antes da adição do agente antiespumante. A variação das composições é listada na Tabela 40.

TABELA 40

Composição das películas de compósitos

Amostra PVOH Fibra de Glicerol Ureia Amido de HMMM Acido (%) celulose (%) (%) (%) milho (%) (%) cítrico (%) Compósito 1 36,7 1,5 24,3 12,5 25 - - Compósito 2 35,0 5,0 12,5 12,5 27,5 - - Compósito 3 33,2 6,3 16,6 16,6 16,6 9,7 1,0 Compósito 4 30,8 41,0 7,7 7,7 7,7 4,6 0,5

Encapsulação de brotos de brotos de arroz nos pacotes

biodegradáveis

A compressão das películas de compósitos moldadas usando compósitos 2 e 3 a partir da descrição acima foi usada para construir os recipientes rapidamente biodegradáveis. Uma porção de película medindo 7,0 cm na largura e 9,5 cm no comprimento foi dobrável sobrepondo os lados, que foram selados por calor ao longo de duas extremidades mais curtas para criar uma bolsa aberta. Ambas as películas foram divididas em dois tratamentos: uma bolsa foi carregada com solo de vaso pré-umidificado (Tropstrato® HT) e um broto de arroz, germinado por dois dias no papel de germinação; a outra bolsa foi carregada apenas com o broto de arroz.

As estruturas com e sem solo de vaso foram plantadas lado a lado em potes plásticos de 1,16 L com fendas no fundo, enchidos com solo de campo Paulínia. Todos os pacotes foram plantados 5 cm de profundidade em uma orientação vertical tal que os pacotes foram completamente revestidos com solo. Os potes foram mantidos em uma estufa e regados diariamente. Para comparação, brotos de arroz expostos foram plantados em potes igualmente preparados e mantidos. /

Depois de duas semanas uma amostra das estruturas indicam a degradação parcial que foi mais pronunciada por compósitos 2 do que por compósito 3, demonstrando a possibilidade de modular a degradação pela reticulação do material.

Como podemos ver na Tabela 41, a taxa de aparecimento para as estruturas depois de quatro semanas foi menos comparado com o controle de. A amostra mostra que os compósitos completamente degradados depois deste período e alguns brotos ainda foram desenvolvidos. Este experimento demonstra que estes materiais não são fitotóxicos para os brotos de arroz.

TABELA 41

Taxas de aparecimento * para bolsas de material de compósito e controladores

de brotos expostos

Compósito 2 com Compósito 2 sem Compósito 3 com Compósito 3 sem Controle de Plantas

Solo de vaso (%) Solo de vaso (%) Solo de vaso (%) Solo de vaso (%) expostas (%)_

23_ 0_0_0_50_

taxa de aparecimento é definido como a capacidade da planta romper a estrutura (quando aplicável) e aparecer acima do nível do solo.

EXEMPLO 50 - COMPARAÇÃO DE SEMENTES ARTIFICIAIS OUE COMPREENDEM TAMPAS RAPIDAMENTE BIODEGRADÁVEIS E ESTRUTURAS NÃO DEGRADAVEIS

Os tubos de papel encerado (Colossal drinking straw, Aardvark®, Precision Product Group, Ft Modone, IN, 1,19 cm de diâmetro externo), foram cortados em 4 cm de comprimentos. Uma extremidade aberta de cada tubo foi fechado com uma película de gel de óleo de soja com espessura de 254 μιη, película fundida de compósito 2 de 680 μιη e 380 μιη de Parafilm® M pré-estirada (Exemplo 49), ou película fundida de compósito 3 com espessura de 515 μιη e 325 μιη (Exemplo 49).

A película de gel de óleo de soja foi preparada como descrita no Exemplo 26, enquanto os materiais de compósito foram preparados de acordo com um procedimento similar aqueles descritos no Exemplo 49. As películas de compósitos foram preparadas pela montagem dos tubos de papel verticalmente na largura total com revestimento/não pegajoso antes da etapa de secagem, tal que a solução foi mantida aproximadamente 1 cm (amostras mais espessas) e 0,5 cm (amostras mais finas) acima do fiando do tubos, fornecendo uma camada de película de fundição em uma extremidade dos tubos. As amostras foram removida usando uma broca de cortiça depois secados. Os recipientes dos tubos de papel Parafilm® M foram montados pela primeira escolha do fundo com um 4 cm de Parafilm® M não direcionalmente pré-estirado. Em todas as estruturas, uma camada de 1 cm de solo de vaso Tropstrato® HT autoclavado foi adicionada. Em seguida, as plantinhas de cana de açúcar, foram cultivadas por 5 semanas no meio de regeneração da plantinha e foram colocadas no topo do solo, e as folhas foram aparadas para ajustar no tubo. Em seguida, o solo adicional foi adicionado para criar um aproximadamente camada de espessura de 3 cm no tubo, e 1 ml de água foi adicionada. Finalmente, o topo de cada tubo foi revestido apenas com Parafilm® M pré-estirado. Para os tubos com tampas de Compósito 2 ou 3, um procedimento similar foi seguido, exceto começando com tubos com as películas de compósitos já fundidos no fundo e as extremidades de topo seladas com um 1 cm de seção de papel compreendido do mesmo material do fundo. Os tubos foram plantados em potes plásticos de 240 ml enchidos com solo de campo Paulínia, mantidos em uma câmara de crescimento (Instala Frio) a 28°C durante o dia e 18°C durante a noite, 70-80 % de umidade

Λ

relativa, 16 horas de fotoperíodo (190 μΕ/m ) durante o primeiro 16 dias. Depois o dia 17, as condições da câmara foram trocadas a 250C durante o dia, com 70 % de umidade relativa e um pico de temperatura de 3 O0C por 2 horas, 18°C durante a noite, mantendo a umidade relativa a 75 %, e um fotoperíodo de 14 horas (mesma intensidade de luz).

Todos os tratamentos foram irrigados a cada 2 dias usando um simulador de chuva (E.I. DuPont de Nemours, Wilmington DE 19880) fornecendo 25 mm de chuva (taxa de fluxo aproximadamente 7,5 L/min). Metade das amostras foram protegidas por uma tampa cênica de plástico durante a simulação da chuva de modo a avaliar a degradação do material na ausência do contato direto com a água.

Imediatamente depois da primeira chuva, 57 % da amostras não protegidas mais finas de compósito 2, 29 % das amostras não protegidas mais espessas de compósito 2 e 14 % das amostras não protegidas mais finas de compósito 3 que foram expostas à chuva iniciaram a ruptura, enquanto a outra amostra de compósito exposta torna-se opaca. A protegida torna-se intacta. As plantas devem apenas romper o gel de óleo de soja e amostras de Parafilm® M neste período.

Depois 33 dias, e 10 chuvas simuladas os resultados da ruptura devem ser diretamente relacionados a 2 casos diferentes: uma planta rompida a partir da estrutura ou o material rompido por si só devido à degradação causada pela água a partir da chuva simulada. Mais das amostras protegidas por compósito não degradam e a planta não deve romper estes. Os resultados dos casos de degradação são resumidos na Tabela 42. TABELA 42

Casos de degradação para tampas de topo diferentes de sementes artificiais de

tubo de papel encerado depois de 33 dias e 10 simulações de chuva

Tipo de tampa Ruptura Degradação Não Tipo de tampa Ruptura Degradação Não de amostras de planta do material rompido de amostra de planta do material rompido protegidas (%) (%) (%) não protegida (%) (%) (%) Gel de óleo de 57,1 14,3 28,6 Gel de óleo de 57,1 0,0 42,9 soja soja Compósito 2 Compósito 2 / (680 um de 0,0 0,0 100,0 (680 um de 0,0 28,6 71,4 espessura) espessura) Compósito 2 Compósito 2 (380 um de 0,0 0,0 100,0 (380 um de 14,3 85,7 0,0 espessura) espessura) Compósito 3 Compósito 3 (515 um de 0,0 0,0 100,0 (515 um de 0,0 14,3 85,7 espessura) espessura) Compósito 3 Compósito 3 (325 um de 14,3 0,0 85,7 (325 um de 28,6 57,1 14,3 espessura) espessura) Parafilm® M 42,9 0,0 57,1 Parafilm® M 42,9 0,0 57,1

A partir destes resultados podemos ver aquelas amostras de gel

de óleo de soja/Kraton® presentes na taxa de ruptura maior causada pelas plantas, que podem ser relacionadas a espessura inferior, fraqueza do material, e boas propriedades de barreira de umidade que mantém a água dentro da estrutura.

A taxa de sobrevivência das plantas para todas as estruturas de semente é mostrada na Tabela 43.

TABELA 43

Sobrevivência de sementes artificiais usando materiais de tampa de tipo

diferentes.

Amostras protegidas Número de sementes artificiais inicialmente plantadas Sobrevivência no dia 33,(%) Amostras não protegidas Número de sementes artificiais inicialmente plantadas Sobrevivência no dia 33,(%) Gel de óleo de soja 7 14,3 Gel de óleo de soja 7 28,6 Compósito 2 (680 7 o Compósito 2 (680 7 0 um de espessura) um de espessura) Compósito 2 (380 7 14,3 Compósito 2 (380 7 14,3 um de espessura) um de espessura) Compósito 3 (515 7 0 Compósito 3 (515 7 0 um de espessura) / um de espessura) Compósito 3 (325 7 0 Compósito 3 (325 7 0 um de espessura) um de espessura) Parafilm® M Pré- 7 14,3 Parafilm® M Pré- 7 28,6 estirado estirado Controles de 28 85,7 plantinha exposta

EXEMPLO 51 - MISTURAS DE POLIÍSUCCINATO DE 1,3-

PROPANODIOL) COM POLKÁCIDO LÁCTICO) Devido à rigidez e fragilidade de poli(ácido láctico), misturas com outros polímeros podem ser desejadas para melhorar as propriedades mecânicas para aplicações de semente artificial em que as sementes podem ser manuseadas por um plantador mecânico. Adicionalmente, o poli(ácido láctico) é diminuído para biodegradar em temperatura ambiente no solo (Shogren, R.L., Doane, W.M., Garlotta, D., Lawton5 J.W., Willett, J.L. Polymer Degradation and Stability, 2003, 79, 405-411). As misturas com outros polímeros podem ajudar a melhorar a dureza (Afrifah, K.UM., Matuana, L.M. Macromolecular Materials e Engineering, 2010, 802-811) e biodegradável (Shogren, R.L., Doane, W.M., Garlotta, D., Lawton, J.W., Willett, J.L. Polymer Degradation and Stability, 2003, 79, 405-411). Entretanto, as misturas de polímero, semelhantes aquelas debatidas nas referências citadas são opacas devido a incompatibilidade entre as duas fases ou mais polímeros. Para os propósitos das sementes artificiais, pode ser vantajoso possibilitar a transmissão de luz através dos materiais de semente, para acelerar o crescimento de certos tipos de tecido. Deste modo, misturas de PLA com poliéster biodegradável foram procuradas. Especificamente, as misturas de poli(ácido láctico) (PLA 4032D, NatureWorks, Minnetonka, MN) com poli(succinato de 1,3-propanodiol) (Mn = 8100 g/mol, Mw = 23000 g/mol pela cromatografia de exclusão de tamanho) foram exploradas. 1,3 g PLA 4032D e 0,2 g de poli(succinato de 1,3-propanodiol) foram pesados em um frasco de vidro de 20 ml. 8,0 g de clorofórmio foi adicionado e a solução agitada por 1 dia. A solução foi fundida em uma lâmina de poli(tetrafluoroetileno) usando uma ferramenta com lâmina com uma fenda de espessura 40 mil. Isto resultou em uma película com 13,3 % em peso de Poli(succinato de 1,3-propanodiol) com espessura 75-150 um. Um procedimento similar foi seguido para criar misturas com 22 % em peso e 50 % em peso de Poli(succinato de 1,3-propanodiol). Todas as misturas foram opticamente translúcidas a transparente (Figura 47). A calorimetria de varredura diferencial (DSC) foi usada para caracterizar as misturas. Este foi realizado em nitrogênio em uma taxa de aquecimento de IO0 C/min usando um modelo TA Instruments (New Castle5 DE) QlOO DSC. Os resultados da análise são mostrado na Tabela 44. Os resultados indicam que duas transições de vidro estão presentes nas misturas de polímero. Este indica que duas fases de polímero estão presentes, e que as misturas são amplamente imiscível. Entretanto, é observado que as temperaturas de transição de vidro mudam com composição, sugerindo alguma interação das fases, possivelmente plastificação ou compatibilidade parcial. Uma observação adicional foi uma cristalização significante encontrada para as misturas, que é ausente em PLA4032D puro, assim como um exotermia de fusão maior. Este sugere uma influência de poli(succinato de 1,3-propileno) para acelerar a cristalização, através do efeito de plastificação, ou através nucleação. Tabela 44. Transições térmicas para as misturas de poli(succinato de 1,3-

propanodiol) e poli(ácido láctico) semicristalino

Porcento em Deso de Polifácido láctico·) Porcento em peso de Polifsuccinato de 1.3-DroDanodiol) Temperaturas de transição de vidro f2 alor. 0C) Ponto de fusão f2°Calor°Q Entaloia de cristalização f2°Calor. J/e) Entalpia de fusão í2°Calor, JVgi 100 % 0% 61,7 166.9 nenhum 41 87% 13% -36.1. 52.9 167.3 20,55 34.32 50% 50% -33.7. 49.0 166.1 10.55 21.34 0% 100 % -33.4 nenhum nenhum nenhum

As medições de tensão nas misturas foram realizadas usando

um analisador de textura ta-xt2i (tecnologias de textura, scarsdale, ny). Os resultados são listados abaixo na tabela 45. As misturas de poli(succinato de 1,3-propanodiol) exibiram alongamentos mais altos, resistência inferior às tensões e menos fragilidade do que PLA4032D puro.

Tabela 45. Medições de tensão nas misturas de poli(succinato de 1,3-

propanodiol) com poli(ácido láctico). Os dados são listados são 3 cópias.

Porcento em oeso de Polifácido láctico) Porcento em Deso de Polifsuccinato de 1,3-üroDanodiol) Resistência à tensão fMPa) Alongamento (%) 100% 0% 40.5. 50.0. 50.7 13 %. 13 %. 12 % 78% 22% 30.1.33.3. 33.8 25 %. 29 %. 30 % 50% 50 % 10.3.10.9.12.0 29 %. 57 %.>74 % Sementes artificiais foram construídas embrulhando-se a película de 22 % em peso de poli(succinato de 1,3-propanodiol) em um tubo cilíndrico de camada simples com diâmetro de 1,2 cm. A borda da película ao longo o lado do tubo foi colada a quente. O tubo foi cortado em aproximadamente nas seções de 6 cm de comprimento. Uma plantinha de cana de açúcar com Metro-Mix® 360 úmido foi adicionada tal que o tubo foi aproximadamente 75 % total e as sementes foram plantadas em potes de 10 cm em Metro-Mix® 360 úmido em uma câmara de crescimento (modelo Conviron BDW-120) a 31°C durante o dia, a 22°C durante a noite, 40 % de umidade relativa, e um fotoperíodo de 13 horas (220 uE/m2). 9 sementes

artificiais foram plantadas e 4 brotaram depois 21 dias.

Degradação do solo de poli(succinato de 1,3-propanodiol) Os estudos de degradação do solo de poli(succinato de 1,3- propanodiol) (Mn = 22000, Mw = 41800 g/mol como medido pela cromatografia de exclusão por tamanho) em comparação a outros polímeros foram realizados no DuPont Stine Haskell Research Center in Newark, DE. Películas de vários poliésteres foram formadas através da pressão da fusão em temperaturas apropriadas acima do seu ponto de fusão. As películas foram de espessuras variando de aproximadamente 200 a 400 um em espessura, e foram aproximadamente 2 cm de largura por 8-12 cm de comprimento. Três amostras de película para composição foram testadas. As películas foram presas por fita aos fundos de bandejas de alumínio usando fita autoclave (VWR, Radnor, PA) tal que a maioria das películas foram expostas, e as bandejas foram enterradas horizontalmente em uma profundidade de aproximadamente 15 cm no campo. As amostras foram deixadas por um período de 27 dias, e depois exumadas. Os resultados de degradação foram julgados qualitativamente através das observações visuais. Depois da exumação, as películas foram enxaguadas com água para remover solo e observado um segundo tempo. Os resultados na Tabela 46 indicam que o poli(succinato de 1,3-propanodiol) exibiu a degradação visual similar nas condições reais do solo aos outros polímeros rapidamente degradáveis (poli(3-hidróxi butirato-co-3-hidroxivalerato)), mas depois facilmente desintegrada mecanicamente com enxague, ao passo que outros polímeros permanecem. Este sugere e vantagem para poli(succinato de 1,3-propanodiol) para desintegrar mais prontamente em um ambiente de campo. Tabela 46. Os resultados da degradação de campo de poliésteres depois de 27

dias.

Polímero Fornecedor Película espessura inicial (a) Observação visual antes de lavar Observação visual depois do enxague Poli(ácido láctico) PLA 4032D NatureWorks (Minnetonka, MN) 250 Todos intactos Todos intactos Poli(D,L-lactídeo-co- glicolida) Sigma Aldrich (St. Louis, MO) 200 2 fora de 3 quebrados Peças quebradas remanescentes Poli(succinato de 1,3- propanodiol) Sintetizado internamente a E.I. DuPont de Nemours, Wilmington, DE 400 2 fora de 3 quebrados Peças quebradas lavadas Poli(3-hidróxi butirato- co-3 -hidroxi valerato) Sigma Aldrich (St. Louis, MO) 250 1 fora de 3 quebrados Peças quebradas remanescentes

Um experimento adicional foi realizado para comparar as

taxas de degradação destes polímeros em Metro-Mix® 360. As faixas de película de tamanho similar foram criadas neste experimento em triplicatas e foram enterradas em uma orientação vertical em Metro-Mix® 360 nos vasos de plásticos de 10 CM e colocados em uma câmara de crescimento (modelo Conviron BDW-120) a 310C durante o dia, a 22°C durante a noite, 80 % de umidade relativa, e um fotoperíodo de 13 horas (220 uE/m ). Os potes foram regados periodicamente, e as películas foram exumadas depois 1 mês. A degradação das amostras foi julgada visualmente depois do enxague (Tabela 47). Foi observado que o poli(succinato de 1,3-propanodiol) significantemente degradado em Metro-Mix® 360 depois de 29 dias. TABELA 47. Os resultados da degradação de câmara de crescimento de poliésteres depois de 29 dias em Metro-Mix® 360.

Polímero Fornecedor Película espessura inicial (a) Observação visual depois do enxague Poli(ácido láctico) PLA 4032D NatureWorks (Minnetonka, MN) 250 Intacto Poli(D,L-lactídeo-co- glicolida) Sigma Aldrich (St. Louis, MO) 200 Intacto Poli(succinato de 1,3- propanodiol) Sintetizado internamente a E.I. DuPont de Nemours, Wilmington, DE 400 Degradado com fiiros Poli(3-hidróxi butirato- co-3-hidroxivalerato) Sigma Aldrich (St. Louis, MO) 250 Pesadamente degradado com furos

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As misturas adicionais de poli(succinato de 1,3-propanodiol) com poli(D,L-ácido láctico) amorfo (PLA 6361D, NatureWorks, Minnetonka, MN) foram exploradas. Estes foram criados na mesma maneira como acima e foram também uniformemente transparente a translúcido. Suas propriedades térmicas foram estudadas usando calorimetria de varredura diferencial, e os resultados são mostrados na Tabela 48.

TABELA 48. Transições térmicas para as misturas de poli(succinato de 1,3- propanodiol) e poli(D,L-ácido láctico) amorfo.

Porcento em Deso de PoliCD.L-ácido láctico) Porcento em oeso de Polifsuccinato de 1,3-DroDanodiol) Temperaturas de transição de vidro f2°Calor. 0C) Ponto de fusão Tl0Calor 0C) 100% 0% 59.8 nenhum 90% 10% 43.7 nenhum 70% 30% -37.2. 39.5 nenhum 50% 50% -32.2.43.3 nenhum 0 100% -33.4 Não determinado

15

20

EXEMPLO 52 - USO DE SEMENTES SINTÉTICAS COM PLANTAS DE CANA DE AÇÚCAR GENETICAMENTE ENGENHEIRADAS

As plantas de cana de açúcar geneticamente engenheiradas são produzidas através das tecnologias padrão (ver, por exemplo, Manickavasagam et al. (2004) Plant Cell Rep 23: 134-143; Jain et al. (2007) Plant Cell Rep 26: 581-590; Joyce et ai. (2010) Plant Cell Rep 29: 173-183). As plantas geneticamente engenheiradas contêm genes modificados ou introduzidos que conferem qualidades agronômicas alteradas (que inclui mas não são limitados a resistência aos herbicidas, resistência às pragas de inseto, resistência às doenças, rendimento melhorado e teor de açúcar melhorado). Qualquer uma semente planejada sintética descrita nesta aplicação é útil para facilitar o plantio de plantas geneticamente engenheiradas.

As plantas regeneradas geneticamente engenheiradas como descritas no Exemplo 1 ou por outros procedimentos equivalentes são inseridos em recipientes de sementes construídas como descritas nesta aplicação a partir de vários materiais (que incluem mas não são limitados a tubos ou recipientes feitos de papel encerado, ácido poli(láctico), policaprolactona, poli(3-hidróxi butirato-co-3-hidróxi valerato) polipropileno, e compósitos de celulose.) Adicionado às plantas dentro do recipiente são materiais para suportar o crescimento e saúde das plantas (que inclui mas não são limitados ao solo, MetroMix, ágar, lã de rocha, açúcar, sais inorgânicos, nutrientes MS, superabsorventes de polímero, água, fungicidas, inseticidas, herbicidas, reguladores do crescimento de planta e hormônios de planta) levando a um espaço aéreo dentro do recipiente. As extremidades do recipientes são deixadas freqüentemente ou são seladas com vários materiais (que incluem, mas não são limitados a Parafilm®, ácido poli(láctico), película alquida, película Milar®, tricopolímero de bloco LDL).

As sementes estruturas são colocadas no solo em uma câmara de crescimento, estufa ou campo, fornecido com água adequada, temperatura, fertilizante, luz, e proteção contra praga e deixado crescer por aproximadamente 4 semanas. O sucesso destas sementes é demonstrado pela sobrevivência destas plantas sob estas condições de crescimento.

A resistência ao herbicida de sementes geneticamente engenheiradas é demonstrada depois de 4 semanas de crescimento no solo. Naquele período, os recipientes de semente e materiais de tampa, ainda se presente em torno das partes aéreas das plantas, são removidas a partir das plantas. As plantas são depois tratadas com herbicidas (que incluem mas não são limitadas ao glifosato e sulfonilureia) nas taxas de uso típicos, adequados à região ou ambiente, que matam ou danificam gravemente as canas de açúcar não transgênicas e ervas daninhas alvo. Quatro semanas depois do tratamento, as plantas derivadas a partir das sementes sintéticas contendo plantas resistente ao herbicida geneticamente engenheiradas são saudáveis e crescem vigorosamente enquanto os controles de cana de açúcar não transgênicos são mortos ou gravemente danificados.

fyfmplo 53 - ttso de sementes sintéticas com plantas de γ.ανα de actvar geneticamente engenheiradas

As plantas de cana de açúcar geneticamente engenheiradas são produzidas através das tecnologias padrão (ver, por exemplo, Manickavasagam et ai (2004) Plant Cell Rep 23: 134-143; Jain et ai (2007) Plant Cell Rep 26: 581-590; Joyce et ai (2010) Plant Cell Rep 29: 173-183). As Plantas geneticamente engenheiradas contêm genes modificados ou introduzidos que conferem qualidades agronômicas alteradas (que inclui mas não são limitados a resistência ao herbicida, resistência às pragas de inseto, resistência às doenças, rendimento melhorado e teor de açúcar melhorado). Qualquer um planejamento de semente sintética descrito nesta aplicação é útil para facilitar o plantio de plantas geneticamente engenheiradas.

As plantas geneticamente engenheiradas regeneradas como descritas no Exemplo 1 ou por outros procedimentos equivalentes são inseridos nos recipientes de semente. As plantas de controle são da mesmo variedade mas não geneticamente engenheiradas. Tanto as plantas GM quanto não GM são propagadas, regeneradas, e manuseadas na mesma maneira. Além disso, as plantas cultivadas em barras GM são usadas como um outro controle. Todas as plantas, se derivadas de micropropagação ou de barras são

cultivadas nas mesmas condições.

As plantas não encapsuladas expostas são usadas como

controles. Além disso, as plantas cultivadas de barras GM também são usadas como controles.

Os tubos de papel encerado são cortados em 4 cm de comprimentos. Um extremidade aberta de cada é fechada com uma película fabricada a partir da uma mistura de gelatina e amido. A camada de película de gelatina- amido-glicerol é preparada pela evaporação de uma solução aquosa de gelatina, amido e glicerol. Nesta solução a concentração de gelatina pode ser de 0,5 % em peso a 5 % em peso. A concentração de amido pode ser de 0,1 % em peso a 2 % em peso. A concentração de glicerol pode ser de 2 % em peso a 8 % em peso. Em uma forma de realização, a solução usado para criar a película pode compreender 2,5 % em peso de Gelatina (175 Força de florescência); 1,0 % em peso amido e 5,0 % em peso glicerol. Em uma outra forma de realização, a película que forma solução pode compreender 1,25 % em peso de gelatina (Força de florescência 175) e 1,25 % em peso de gelatina (Força de florescência 300); 1,0 % em peso de amido e 5,0 % em peso de glicerol. Uma camada de 1,5 cm de solo de vaso autoclavado (Tropstrato® HT) é adicionada. As plantas são depois colocadas dentro do recipiente de papel no topo do solo com folhas aparadas para ajustar ao tubo. Em seguida, o solo adicional é adicionado para criar uma camada de aproximadamente 2 cm de espessura no tubo e água o suficiente para saturar este é adicionada. Finalmente, o topo de cada tubo é fechado usando um centrífuga de tubo de polipropileno 15 ml com um furo de 5 mm no topo, ligado ao tubo de papel usando uma peça de Parafilm(S) M. As estruturas de semente e plantas expostas são plantadas

verticalmente em potes plásticos de 470 ml enchidos com uma mistura de solo de campo (de fazenda Paulínia experimental), areia e solo de vaso (Tropstrato® HT), em uma proporção volumétrica de 1: 1: 1. As estruturas de sementes são plantadas com o nível do solo no vaso nivelado com o topo dos tubos de polipropileno e plantas expostas são plantadas de modo que o nível do solo está na junção de raízes e brotos. As barras são plantadas horizontalmente, em potes de 500 ml enchidos com a mesma mistura de solo, a 2-5 cm abaixo do nível de solo. As plantas da barra são transferidas aos potes IL depois de 3-4 semanas. Todas as plantas são irrigadas duas vezes em um dia, e mantidas dentro de uma estufa.

O desenvolvimento e sobrevivência da plantas é monitorado por até 8 semanas. A tampa cônica plástica é removida neste período, quando as plantas são bem estabelecidas no solo.

Neste período, as plantas GM e não GM produzidas a partir das construções de-semente e plantas expostas; e plantas de barras GM, todas com força equivalente e estágio fisiológico, são escolhidos para os tratamentos de herbicida como mostrado na Tabela 49. Para cada tratamento mostrado na tabela, 10 plantas são testadas.

Tabela 49

Tratamentos com Herbicidas para plantas micropropagadas GM, plantas

micropropagadas não GM, e plantas de barras GM.

Planta micropropagadas GM Exposta 1 .Controle não tratado (nenhuma aplicação ao herbicida); 2. 850 g.um.i.-ha"1 Roundup® (Glifosato); 3. 3400 g.um.i-ha"1 Roundup® (Glifosato); 4. 50 g.um.i. ha"1 Curavial® (Sulfumeturon-metil); 5. 200 g.um.i-ha"1 Curavial® (Sulfumeturon-metil). Encapsulada 6. Controle não tratado (nenhuma aplicação ao herbicida); 7. 850 g.um.i. ha"1 Roundup® (Glifosato); 8. 3400 g.um.i-ha"1 Roundup® (Glifosato); 9. 50 g.um.i. ha"1 Curavial® (Sulfumeturon-metil); 10. 200 g.um.i-ha'1 Curavial® (Sulfumeturon-metil). Planta micropropagadas não GM Exposta 11. Controle não tratado (nenhuma aplicação ao herbicida); 12. 850 g.um.i. ha"1 Roundup® (Glifosato); 13. 3400 g.um.i-ha"1 Roundup® (Glifosato); 14.50 g.um.i.ha"1 Curavial® (Sulfumeturon-metil); 15. 200 g.um.i-ha"1 Curavial® (Sulfumeturon-metil). Encapsulada 16. Controle não tratado (nenhuma aplicação ao herbicida); 17.850 g.um.i.-ha"1 Roundup® (Glifosato); 18.3400 g.um.i-ha"1 Roundup® (Glifosato); 19. 50 g.um.i. ha"1 Curavial® (Sulfiimeturon-metil); 20.200 g.um.i ha'' Curavial® (Sulfumeturon-metil). Planta de barra GM Exposta 21. Untratada control (nenhuma aplicação ao herbicida); 22. 850 g.um.i.-ha'1 Roundup® (Glifosato); 23. 3400 g.um.i-ha"1 Roundup® (Glifosato); 24. 50 g.um.i.-ha"1 Curavial® (Sulfumeturon-metil); 25. 200 g.um.i-ha"1 Curavial® (Sulfumeturon-metil).

O pulverizador de herbicida líquido é preparado em uma

garrafa de 2L pela dissolução da quantidade do herbicida em água para dar a taxa correta. As plantas são colocadas em uma bancada na estufa e a aplicação é realizada usando uma barra equipada com 110,02 bicos de jato oscilante. Os parâmetros de aplicação do pulverizador são pressão de 2,0 bars, velocidade Im-s"1, volume de pulverização 200 L ha'1, obter um fluxo de pulverizador líquido de 0,6 L min1 por bico. O pulverizador de herbicida é aplicado 50 cm acima do topo das plantas. Para todas as aplicações de sulfumeturon-metila, 0,2 % de adjuvante Agrai® (Nonilfenóxi polietóxi etanol) é adicionado no

pulverizador líquido.

A avaliação da resposta safra (% de fitotoxicidade) e planta de

altura é realizada a 7, 14, 21,30 e 45 dias depois da aplicação usando uma

avaliação visual do dano da folha, as folhas descoloridas, todas no

crescimento da planta e vigor de planta. O dano é quantificado em 5 % de

incrementos de nenhum dano (0 %) a morte (100 %). As plantas não GM,

tanto as sementes estruturas quanto plantas expostas, mostram o dano por

todos os tratamentos de herbicida dentro de 14 dias. Para as plantas GM, de

semente estruturas e plantas expostas a partir da micropropagação assim como

plantas expostas de barras, nenhum ou apenas dano mínimo (menos do que 10

%) é detectado por todos os tratamentos herbicidas.

FYKMPLO 54 -EXTRUSÀO DH TUBOS DF, POLliDX-ACIDO

T, ACTICQn)PARA SEMENTES SINTÉTICAS

Poli(D,L-ácido láctico) amorfo (6361D Resin, Natureworks, LLC., Minnetonka, MN) foi extrusado usando uma extrusora de parafuso fresca (1 1Z2" Davis Standard, Davis-Standard LLC, Fulton, NY), em tubo de diâmetro externo de 0,664" (16,86 mm) com uma espessura de parede de 0,012" (0,30 mm). O tubo foi extrusado a 13,4 ft/minuto (4,08 m/minuto) usando uma temperatura de fusão de 390° F (198,89°C), temperaturas de parafuso de 350-390°F (176,67 a 198,89°C), temperaturas de matriz de 390- 391°F (198,89 a 199,44°C), e em uma velocidade de parafuso de 14,8 RPM. O tubo extrusado foi cortado nos tubos mais curtos, 6" (15,24 cm) no

comprimento.

A semente foi montada pelo aquecimento de uma extremidade do tubo com uma pistola de calor (Master Heat Gun, Master Appliance, Racine, WI) e dobrando-o próximos com braçadeiras. Dois gramas de solo de vaso (Metro-Mix® 360) foram adicionados à extremidade aberta do tubo. Uma plantinha de cana de açúcar (Exemplo 1) foi comprimida no solo e 2 ml de água foi adicionada. O topo do tubo foi selado pelo mesmo procedimento descrito acima. As sementes foram armazenadas em temperatura ambiente, na luz, por 5 dias antes do plantio.

Antes plantio, os topos e fundos das sementes foram cortados abertos usando-se um par de tesouras. As sementes sintéticas foram plantadas em uma caixa de flores (12 cm de profundidade χ 60 cm de comprimento χ 20 cm de largura) com 50: 50 matapeake/areia do solo (uma mistura de um local de solo Delaware com areia, criando um solo de alto conteúdo de areia), tal que solo nível dentro do tubo foi alinhado com o nível de solo externo. As plantas foram cultivadas em uma câmara de crescimento (modelo Conviron BDW-120) a 31°C durante o dia, a 22°C durante a noite, 40 % de umidade relativa, e um fotoperíodo de 13 horas (220 uE/m2) e regadas IL 3 vezes na semana. As plantas de cana de açúcar em uma estrutura de semente sintética em tubo de PLA tem uma taxa de sobrevivência de 70 % no dia 14.

Claims

1. Semente artificial, caracterizada pelo fato de que compreende um ou mais tecidos vegetais regeneráveis, um recipiente que compreende uma porção degradável, um espaço aéreo não obstruído, e uma fonte de nutriente, e que compreende adicionalmente uma ou mais características selecionadas do grupo que consiste de: a) uma região penetrável ou degradável através da qual o tecido vegetal regenerável cresce, b) uma porção de monocamada solúvel em água do recipiente, c) uma região do recipiente que flui ou desliza entre cerca de 1°C e 50°C, d) um fechamento separável que é fisicamente deslocado durante o crescimento do tecido vegetal regenerável, e) uma ou mais aberturas nas laterais ou fundo do recipiente, f) uma região cônica ou afunilada que leva a uma abertura menor do que 2 cm de largura no ápice e em que o ângulo da região cônica ou afunilada é menor do que 135 graus medido a partir de lados opostos, e g) uma pluralidade de abas flexíveis através das quais o tecido regenerável cresce.

2. Semente artificial de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o recipiente ou uma região do recipiente ou um fechamento compreendem ainda um ou mais dos que seguem: poliésteres, poliamidas, poliolefinas, celulose, derivados de celulose, polissacarídeos, poliéteres, poliuretanos, policarbonatos, poli(metacrilatos de alquila), poli(acrilatos de alquila), poli(ácidos acrílicos), ácidos poli(met)acrílicos, polifosfazenos, poli-imidas, polianidridos, poliaminas, polidienos, poliacrilamidas, poli(siloxanos), poli(álcool vinílico), poli(ésteres vinílicos), poli(éteres vinílicos), polímeros naturais, copolímeros de bloco, polímeros reticulados, proteínas, ceras, óleos, plastificadores, antioxidantes, agentes de nucleação, modificadores de impacto, auxiliares de processamento, endurecedores, corantes, enchedores, estabilizantes, retardantes de chama, borracha natural, polissulfonas, ou polissulfetos; ou misturas destes; ou versões reticuladas destes.

3. Semente artificial de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o recipiente compreende ainda um componente selecionado do grupo que consiste de: a) poli(ácido D,L-láctico) amorfo, poli(ácido láctico), poli(ácido L-láctico), poli(ácido D-láctico), poli(ácido meso-láctico), poli(ácido rac-láctico), ou poli(ácido D,L-láctico), (poli(hidroxialcanoato), poli(hidroxibutirato), poli(hidroxibutirato-co-valerato), poli(caprolactona), poli(succinato de butileno), poli(succinato de etileno), poli(carbonato de etileno), poli(carbonato de propileno), amido, gelatina, amido termoplástico, poli(tereftalato adipato de butileno), poli(tereftalato succinato de propileno), poli(tereftalato adipato de propileno), poli(álcool vinílico), poli(etileno glicol), celulose, quitosano, acetato de celulose, ou butirato acetato de celulose, b) um poliéster com mais do que 5 por cento em mol de teor de monômero alifático, c) uma versão reticulada de poli(ácido D,L-láctico) amorfo, poli(ácido láctico), poli(ácido L-láctico), poli(ácido D-láctico), poli(ácido meso-láctico), poli(ácido rac-láctico), ou poli(ácido D,L-láctico), (poli(hidroxialcanoato), poli(hidroxibutirato), poli(hidroxibutirato-co- valerato), poli(caprolactona), poli(succinato de butileno), poli(succinato de etileno), poli(carbonato de etileno), poli(carbonato de propileno), amido, gelatina, amido termoplástico, poli(tereftalato adipato de butileno), poli(tereftalato succinato de propileno), poli(tereftalato adipato de propileno), poli(álcool vinílico), poli(etileno glicol), celulose, quitosano, acetato de celulose, butirato acetato de celulose, ou um poliéster com mais do que 5 por cento em mol de teor de monômero alifático, d) um plastificador, em que o plastificador está presente em menos do que 30 % em peso da composição total, e) citrato de acetil tributila, citrato de tributila, sebacato de di- n-octila, sebacato de di-2-etilexila, succinato de di-2-etilexila, adipato de di- isooctila, adipato de di-2-etilexila, glutarato de di-isooctila, glutarato de di-2-^ etilexila, poli(etileno glicol), monolaurato de poli(etileno glicol), sorbitol, glicerol, poli(propileno glicol), ou água, f) copolímeros de dois ou mais de caprolactona, ácido láctico, D-lactídeo, L-lactídeo, meso-lactídeo, D5L-Iactideo, ácido sebácico, ácido succínico, ácido adípico, ácido glicólico, ácido oxálico, etileno glicol, 1,2- propanodiol, 1,3-propanodiol, 1,3-butanodiol, 1,4-butanodiol, 1,5- pentanodiol, 2,2,4,4-tetrametil-l,3-ciclobutanodiol, 1,6-hexanodiol, ácido tereftálico, ácido isoftálico, dimetil siloxano, anidrido succínico, um di- isocianato, um reticulador, ou anidrido itálico, g) um antioxidante, um agente de nucleação, um modificador de impacto, um auxiliar de processamento, um endurecedor, um corante, um enchedor, um estabilizante, ou um retardante de chama, h) papel, papel solúvel em água, papel reciclado, papel de carta, papel kraft, papel encerado, ou papel revestido; i) uma combinação de dois ou mais dos componentes de a) até h) acima, e j) uma mistura que compreende dois ou mais dos componentes de a) até i) acima.

4. Semente artificial de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que uma região do recipiente ou fechamento compreende adicionalmente um componente selecionado do grupo que consiste de: a) copolímeros aleatórios, de bloco ou gradiente do ácido láctico com caprolactona, b) copolímeros aleatórios, de bloco ou gradiente do ácido láctico com dimetilsiloxano, c) uma resina alquídica, d) poli(álcool vinílico), amido, celulose, poli(etileno glicol), ágar, goma xantana, alginato, hidroxipropilcelulose, metilcelulose, uma proteína solúvel em água, um carboidrato solúvel em água, um polímero sintético solúvel em água, ou carboximetilcelulose, e) misturas de dois ou mais dos que seguem: poli(álcool vinílico), amido, celulose, glicerol, poli(etileno glicol), ácido cítrico, uréia, água, acetato de sódio, nitrato de potássio, nitrato de amônio, fertilizantes, ágar, goma xantana, alginato, hidroxipropilcelulose, metilcelulose, uma proteína solúvel em água, um carboidrato solúvel em água, um polímero sintético solúvel em água, um reticulador, ou carboximetilcelulose, f) um gel que compreende um copolímero de bloco e um óleo, g) carboximetilcelulose de sódio, h) papel solúvel em água impregnado com cera, i) poli(ácido D,L-láctico) amorfo, poli(ácido láctico), poli(ácido L-láctico), poli(ácido D-láctico), poli(ácido meso-láctico), poli(ácido rac-láctico), ou poli(ácido D,L-láctico), (poli(hidroxialcanoato), poli(hidroxibutirato), poli(hidroxibutirato-co-valerato), poli(caprolactona), poli(succinato de butileno), poli(succinato de etileno), poli(carbonato de etileno), poli(carbonato de propileno), amido, amido termoplástico, gelatina, poli(tereftalato adipato de butileno), poli(tereftalato succinato de propileno), poli(tereftalato adipato de propileno), poli(álcool vinílico), poli(etileno glicol), celulose, quitosano, acetato de celulose, butirato acetato de celulose; ou uma versão reticulada destes, j) um poliéster com mais do que 5 por cento em mol de teor de monômero alifático, k) uma versão reticulada de poli(ácido D,L-láctico) amorfo, poli(ácido láctico), poli(ácido L-láctico), poli(ácido D-láctico), poli(ácido meso-láctico), poli(ácido rac-láctico), ou poli(ácido D,L-láctico), poli(hidroxialcanoato), poli(hidroxibutirato), poli(hidroxibutirato-co- valerato), poli(caprolactona), poli(succinato de butileno), poli(succinato de etileno), poli(carbonato de etileno), poli(carbonato de propileno), amido, gelatina, amido termoplástico, poli(tereflalato adipato de butileno), poli(tereftalato succinato de propileno), poli(tereftalato adipato de propileno), poli(álcool vinílico), poli(etileno glicol), celulose, quitosano, acetato de celulose, butirato acetato de celulose, ou um poliéster com mais do que 5 por cento em mol de teor de monômero alifático, 1) um plastificador, em que o plastificador está presente em menos do que 30 % em peso da composição total, m) citrato de acetil tributila, citrato de tributila, sebacato de di- n-octila, sebacato de di-2-etilexila, succinato de di-2-etilexila, adipato de di- isooctila, adipato de di-2-etilexila, glutarato de di-isooctila, glutarato de di-2- etilexila, poli(etileno glicol), monolaurato de poli(etileno glicol), sorbitol, glicerol, poli(propileno glicol), ou água, n) copolímeros de dois ou mais de caprolactona, ácido láctico, D-lactídeo, L-lactídeo, meso-lactídeo, D5L-Iactideo, ácido sebácico, ácido succínico, ácido adípico, ácido glicólico, ácido oxálico, etileno glicol, 1,2- propanodiol, 1,3-propanodiol, 1,3-butanodiol, 1,4-butanodiol, 1,5- pentanodiol, 2,2,4,4-tetrametil-l,3-ciclobutanodiol, 1,6-hexanodiol, ácido tereftálico, ácido isoftálico, anidrido succínico, um di-isocianato, um reticulador, ou anidrido itálico, o) um antioxidante, um agente de nucleação, um modificador de impacto, um auxiliar de processamento, um endurecedor, um corante, um enchedor, um estabilizante, ou um retardante de chama, p) uma cera, Parafilm® ou Nescofilm®, q) papel, papel solúvel em água, papel reciclado, papel de carta, papel kraft, papel encerado, ou papel revestido; ou r) uma combinação de dois ou mais dos componentes de a) até q) acima, e s) uma mistura que compreende dois ou mais dos componentes de a) até r) acima.

5. Semente artificial de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o recipiente é expansível.

6. Semente artificial de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que a dita semente artificial é expansível através de um método selecionado do grupo que consiste de: a) encaixe telescópico de dois ou mais membros tubulares, b) desdobramento, c) inflação, d) descosturamento; e e) estiramento.

7. Semente artificial de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a fonte de nutriente compreende adicionalmente um componente selecionado do grupo que consiste de: a) solo, b) fibra de coco, c) vermiculita, d) um meio de crescimento artificial, e) ágar, f) um polímero superabsorvente, g) um regulador do crescimento de planta, h) um hormônio de planta, i) micronutrientes, j) macronutrientes, k) água, 1) um fertilizante, m) turfa, n) uma combinação de dois ou mais dos componentes de a) até m) acima, e o) uma mistura que compreende dois ou mais dos componentes de a) até n) acima.

8. Semente artificial de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o tecido vegetal regenerável é um tecido regenerável selecionado do grupo que consiste de: a) cana de açúcar, uma planta graminácea, saccharum spp, híbridos de saccharum spp, miscanthus, switchgrass, cana energética, gramas estéreis, bambu, mandioca, milho, arroz, banana, batata, batata doce, inhame, abacaxi, árvores, salgueiro, álamo, amoreira, ficus spp, dendezeiro, tamareira, poaceae, verbena, baunilha, chá, lúpulos, Erianthus spp, híbridos intergenéricos de Saccharum, Erianthus e Sorghum spp, violeta africana, maçã, tâmara, figo, goiaba, manga, bordo, ameixa, romã, mamão, abacate, amora silvestre, morango silvestre, uvas, cana, canabis, cítricos, limão, laranja, toranja, tangerina, ou lima, b) uma planta geneticamente modificada de a) acima, c) uma versão micropropagada de a) acima, e d) um versão micropropagada, geneticamente modificada de a) acima.

9. Semente artificial de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o recipiente compreende adicionalmente um componente selecionado do grupo que consiste de: a) um tubo cilíndrico com um topo cônico, b) um tubo de duas partes com uma seção de fundo porosa e uma seção de topo não porosa, c) um pacote flexível, d) um pacote semiflexível, e) uma estrutura de tubo rolado, capaz de descosturamento, f) um dispositivo de ancoramento, g) um tubo de partes múltiplas com uma borda articulada, h) um tubo de partes múltiplas mantidos juntos com adesivo, i) uma forma tubular, j) uma porção de recipiente em contato com o solo que degrada mais rápido do que a porção acima solo, k) um espaço aéreo que compreende compartimentos múltiplos, 1) uma extremidade de fundo fechada que retém umidade, m) uma tampa ligada por uma junta adesiva, n) uma tampa ligada pela inserção dentro do recipiente, e o) uma região fraca.

10. Semente artificial de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o recipiente ou fechamento compreende adicionalmente um material selecionado do grupo que consiste de: a) um material transparente, translúcido ou semitranslúcido, b) um material opaco, c) um material poroso, d) um material não poroso, e) um material permeável, f) um material impermeável; e g) qualquer um dos materiais de a) até f) acima, em que o material é biodegradável, hidrolíticamente degradável, ou compostável.

11. Semente artificial de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que uma ou mais das aberturas são presas usando um componente selecionado do grupo que consiste de: a) uma plissagem, b) uma dobra, c) um material poroso, d) malha, e) tela, f) algodão, g) gaze; e h) um grampo.

12. Semente artificial de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a semente artificial compreende adicionalmente um agente selecionado do grupo que consiste de: a) um fungicida, b) um nematicida, c) um inseticida, d) um composto antimicrobiano, e) um antibiótico, f) um biocida, g) um herbicida, h) regulador ou estimulador do crescimento de micróbio de planta, i) micróbios, j) um moluscicida, k) um pesticida para eliminação de ácaros, 1) um acaricida, m) um repelente de pássaro, n) um repelente de inseto, o) uma hormônio de planta; e p) um repelente de roedor.

13. Método de armazenar a semente artificial como definido na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende obter a semente artificial e armazenar a dita semente artificial antes do plantio em uma ou mais das condições que seguem: a) condições ambientes, b) temperatura subambiente, c) níveis de oxigênio subambientes, ou d) sob iluminação subambiente, e em que o tecido vegetal regenerável permanece viável.

14. Método de plantar da semente artificial como definido na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende obter a semente artificial e realizar uma etapa do grupo que consiste de: a) introduzir uma ou mais brechas na dita semente artificial em que as brechas facilitam o crescimento dos tecidos vegetais regeneráveis, b) expandir a semente artificial, e c) a combinação de a) e b) acima.