CN104274465A - Dpa 类似物用于保护生理活性免于功能障碍 - Google Patents

Abstract

本发明为下式DPAs类化合物或DPAs复合化合物所构成的组合物，用于抑制生物体血管或平滑肌由内皮素-1引发的收缩及内膜增生，以改善生物体的生理活性

Description

DPA 类似物用于保护生理活性免于功能障碍

技术领域

本发明为将DPAs类化合物或或DPAs复合化合物所构成的组合物，用于抑制生物体血管或平滑肌由内皮素-1引发的收缩及内膜增生，以改善生物体的生理活性。 

现有技术

以茶碱为骨架的黄嘌呤类衍生物其第七位氮基上进行修饰的DPA-1，能活化上皮以及内皮的内皮性一氧化氮合成酶(endothelium nitric oxide synthase，eNOS)，部分活化平滑肌可溶性鸟苷酸环化酶(soluble guanylyl cyclase，sGC)、磷酸二酯酶(phosphodiesterase，PDE)抑制作用。业经证实DPA-1可影响环腺苷酸(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)/蛋白激酶(protein kinase A，PKA)及环鸟苷酸(Cyclic guanosine monophosphate，cGMP)/蛋白激酶G(PKG)等路径，并且会引起气管上皮细胞一氧化氮的生成量增加，进而活化气管平滑肌细胞内sGC，DPA-1或直接活化气管平滑肌细胞内sGC，使cGMP量增加激活PKG。DPA-1也可活化腺苷酸环化酶(adenylate cyclase，AC)引起cAMP量增加而活化PKA，PKA和PKG两者皆会引起平滑肌细胞膜钾离子通道开启，最后使气管平滑肌松弛。cAMP及cGMP为细胞内二次讯传讯者，同时调节多种生理反应，包括细胞生长及分化、细胞凋亡、糖解作用及酯解作用、免疫及发炎反应等。研究报告指出DPA-1不但可诱发内生性一氧化氮释放，亦具备类似供应一氧化氮(NO donor)的药理作用。因而历年以相关活性提出发明申请096121950号的抗高血压、095112923号治疗摄护腺肥大、094129421号抗肺动脉高血压，以及美国12/878451复合盐等发明申请案。 

DPAs类化合物的哌嗪基经由化学合成方式，令矿物酸、呈现机酸 以及含呈现羧酸基团的他汀(Statin)衍生物、抗炎类药物、前列环素，抗气喘类药物制备成为DPAs复合化合物。 

发明人曾经构思以DPAs类化合物或哌嗪(piperazine)经由化学合成方式制备的DPAs复合化合物。DPAs复合化合物的合成反应，可将DPAs类化合物混合着C1-C4低醇类与水的混合溶液，与足量的矿物酸，形成四级铵盐类。另外则为DPAs类化合物的矿物酸或有机酸，混合着C1-C4低醇类与水的混合溶液，其DPAs类化合物的用量需考虑混合溶液内足以将『RX』基团的反应药物如他汀的羧酸衍生物，抗炎类药物、前列环素，以及抗气喘类药物孟鲁司特等含羧酸基团反应物溶解，随着水份的性质、反应温度，而选择C1-C4低醇类并调整混合溶液的用量。均揭示于2010年1月29日，案号为099102735号的本国专利申请案。 

因此，发明人在现有技术基础上，经过仔细研究公知终能发明出本案之「DPAs类似物的生理活性」，能够克服现有技术的不足，以下为本案的简要说明。 

发明内容

本案主要目的在于提供一种治疗生物体体内由内皮素-1所介导病症或疾病的方法，其中该方法包含对该生物体施用治疗有效量的DPAs类化合物或DPAs复合类化合物。 

本案另一目的在于提供一种治疗个生物体体内对内皮素-1受体活性有抑制作用的病症或疾病的方法，其中该方法包含对该生物体施用治疗有效量的DPAs类化合物或DPAs复合类化合物。 

于具体实施例，涉及内皮素-1激动剂(agonist)或CGRP拮抗剂(CGRP antagonist)、以改善生物体的新陈代谢，系指由内皮素-1所介导病症或疾病，抑或对内皮素-1活性有抑制作用的病症或疾病，以及混合上述相关状态的疗效。 

于具体实施例针对经由内皮素-1(endothelin-1，ET-1)之兴奋作用发挥DPA类化合物或DPAs复合类化合物其可减少生物体之血管及平滑肌的收缩，内膜增生以及与此等不正常生理变化有关的疾病。 

于具体实施例，本案尚有另一目的，在于提供式(I)所示结构的哌嗪取代类似结构(disubstituted piperazine analogs,DPAs)化合物，其中R₂与R₄可分别选自以下所组成的群组：氢基、卤素、胺基、硝基的取代基； 

碳数1-5烷基的取代基；碳数1-5烷氧基的取代基。 

式(I)

于具体实施例，本案尚有另一目的，在于提供式(II)的DPAs复合化合物(DPAs complex compound)。 

式(II) 

本案尚有另一目的，在于提供个体治疗有效量的DPAs类化合物或DPAs复合类化合物，亦或采取同步、或相继或各别的方式施用第二活性成份。 

为了让本发明之上述目的、特征、和优点能更明显易懂，下文特举优选实施例，并配合所附图式，作详细说明。 

附图说明

图1(A-E)：其是是ET-1引起肺动脉收缩张力 

(1A)内皮细胞完整肺动脉的收缩 

(1B)剥离内皮肺动脉的收缩 

(1C)施用MCT 

(1D)施用L-NAME 

(1E)肺动脉收缩变化率 

图2(A-D)：其是肺血管壁增厚、eNOS的免疫染色 

(2A)对照组 

(2B)施用MCT 

(2C)施用DPA-1 

(2D)施用MCT与西地那非 

图3(A-B)：其是肺血管壁增厚比率 

(3A)施用DPA-1与西地那非的影响(2B) 

(3B)施用药物影响平均肺动脉压(2D) 

图4(A-E)肺切片的形态学免疫染色(2C) 

(4A)对照组 

(4B)施用MCT组 

(4C)阴性对照组 

(4D)施用MCT与DPA-1 

(4E)施用MCT与西地那非 

图5(A-D)：经MCT诱导后DPA-1和西地那非对RVH的影响 

(5A)对照组 

(5B)施用MCT组 

(5C)施用MCT与DPA-1 

(5D)施用MCT与西地那非 

图6(A-B)右心室(RV）/[左心室(LV）+室中隔(S)]的比率 

(6A)相对重量比率 

(6B)相对面积比率 

图7(A-B)：其是影响内皮素-1之蛋白质表达 

(7A)内皮素-1表达比率 

(7B)ROCKII表达比率 

图8(A-C)：其是影响eNOS、sGCβ1与PKG的表达 

(8A)eNOS表达比率 

(8B)sGCβ1表达比率 

(8C)PKG表达比率 

图9(A-B)：其是影响RhoA失活 

(9A)DPA-1抑制RhoA活性 

(9B)内皮素-1诱导RhoA的激活 

图10：其是影响血浆内皮素-1的浓度 

图11(A-B)：其是血浆DPA-1浓度的改变量 

(11A)DPA-1血浆浓度 

(11B)DPA-1血浆浓度 

具体实施方式

G蛋白偶联受体（GPCRs）隶属于人类基因组中成员数庞大的膜蛋白家族，于细胞表面的7次跨膜域受体(seven-transmembrane domain receptor)膜蛋白结构，可与多数不同化学性质配体结合，获得特定的识别信号。(Ulloa-Aguirre and Conn,2009). 

GPCRs激动剂（agonist）或拮抗剂（antagonist）拥有灵活的结构组成以及难以具体评估的功能;GPCR激动剂对各自的信号途径的评估研究，颇为错综复杂。在血管平滑肌的ET-1、凝血酶、血管收缩素II(Angiotensin II,Ang II)、溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid,LPA)和儿茶酚胺(catecholamine)，已知是其中具代表性GPCRs激动剂。另外肾上腺素阻断剂的α1B次型受体可导致广泛的低血压症，5-HT2B激动剂可呈现潜在地肺高血压。 

在一些药物设计中以GPCRs做为共同的标靶，但很少研究宣称GPCRs拮抗剂或激动剂与一氧化氮(NO)的释放有关。惊奇地，Hodges RR等人于2005年发现α1肾上腺素受体激动剂去氧肾上腺素(phenylephrine)可增加一氧化氮的生成且激活p42/p44MAPK(参考Invest Ophthalmol Vis Sci.46(8):2781-9)。而Funaki C.等人于2007年发现，增加cAMP可抑制p44/p42MAPK活性(参考Am J Physiol Cell  Physiol.293(5):C1551-60)。本发明所示GPCRs受体可视为内皮素-1/5-羟色受体之同属性受体。因此，以药物拮抗同属性内皮素-1/5-羟色受体，即所谓CPCRs拮抗剂(GPCRs antagonists)，可运用于生物体活性功能障碍的调控及治疗。 

发明人多年之研究，发现DPA-1经由激活内皮细胞的「非典型」5HT-2B感受器官，和增加cGMP，可抑制多样化的GPCRs受体。 

虽然TW200736612号已经揭示使用G蛋白-偶合受体(G protein-coupled receptor;GPCR)以筛检一或多种作为受检者的身体质量调节剂或肥胖症调节剂或体脂肪百分比调节剂或作为用于肥胖及其相关症状之医药剂的候选化合物的方法。而TW200804812号业已揭示关于使用G蛋白偶合受体鉴别候选化合物是否为动脉粥样化的调节物的方法。本发明也建议DPA-1是减轻体重的理想GPCR抑制剂，不具芬氟拉明引生肺动脉高压(pulmonary artery hypertension，PAH)的风险。 

临床生理活性的功能障碍，包括平均肺动脉压(MPAP)、平均血压(MABP)和体量的下降，肺动脉(pulmonary artery，PA)收缩张力之减缩，甚至于血管平滑肌收缩张力的减缩。肺动脉收缩张力的减缩，将足以导致缺氧、低氧血症，而合并着血管平滑肌收缩张力的减缩，将导致形成血栓。男性摄护腺收缩不良，内膜增生形成导致摄护腺肥大，排尿作用难以顺畅。阴茎海绵体收缩张力不良，难以让阴茎的勃起顺畅。阴茎血管闭塞，可诱发阴茎癌。血管内膜增生，伴随着钙化可诱发动脉粥样硬化。 

平均肺动脉压(MPAP)、平均血压(MABP)和体量 

如表1所示，正常对照(CTL)大鼠(第1组)的平均肺动脉压(mean pulmonary arterial pressure，MPAP)为12.9±0.9毫米汞柱(n=6)。野百合碱(monocrotaline，MCT)前处理大鼠(第2组)，平均肺动脉压则急剧移动到30.9±2.9毫米汞柱(n=6)。长期MCT处理大鼠，经舌下给药DPA-1(2.5毫克/千克/天)或口服西地那非(2.5毫克/千克/天)治疗21天，如表1所示肺动脉高压(pulmonary artery hypertension，PAH)显著衰减分别为16.9±0.1(第3组)和19.8±0.9毫米汞柱(第4 组)(n=6）。施用DPA-1或西地那非治疗后，平均血压(mean artery blood pressure，MABP)和心跳速率均无显著变化。施用DPA-1或西地那非治疗后动物体重(Body weight，BW)呈现增加，与未治疗大鼠(第1组)373±5.4g相比较，第2组为310±5.6g，第3组为334±4.5g和第4组为328.6±8.3g。 

表1 

肺动脉(pulmonary artery，PA)收缩张力 

如图1A所示，DPA-1(0.1～100μM）随浓度增加能抑制ET-1(0.01μM)-诱导内皮细胞完整PA的收缩。剥离内皮的肺动脉，如图1B所示，抑制ET-1诱导对剥离内皮PA的收缩，在施用100μM DPA-1呈现大幅降低。如图1C与1D所示对内皮细胞完整PA的收缩，施用MCT或以N'-硝基-L-精氨酸甲酯盐酸盐(L-NG-Nitroarginine Methyl Ester,Hydrochloride，L-NAME)预处理，可减少其收缩，显示一氧化氮(NO)自血管内皮释出。MCT处理大鼠PA(第2组)，可减少DPA-1诱导的松弛，与无MCT对照组(第1组)相比较，显示MCT(图1C）能造成血管内皮功能的障碍。图1E显示，上述4种方法足以造成PA收缩的变化。 

表2DPA-1抑制动脉血管及其它平滑肌收缩的IC₅₀浓度 

肺血管壁增厚、eNOS的免疫染色和PAH 

在0天起始到21天后测量右肺和心脏切片(图2），经由心脏重量比与心脏截面积比表示MCT处理大鼠的PA壁厚度(WT%)。 

如图2所示苏木和曙红(hematoxylin and eosin，HE staining，HE)染色的切片比较，与仅给予生理食盐水(第2组)对照组，表示MCT前处理大鼠给予DPA-1(第3组)或西地那非(第4组)，末端肺动脉呈现显著偏低。生理食盐水对照组对于MCT前处理组，所显示MCT的重量比增加和截面积比增加状态，分别为27.5%对于40.9%，以及15.7%对于35.2%。以DPA-1治疗大鼠，很明显对肺小动脉形态呈现高度地改善(图3)。 

第2组肺切片的形态学免疫染色，在PA内皮细胞eNOS显著减少，表明与厚度有关。以DPA-1或西地那非治疗恢复eNOS的免疫染色。阴性对照组无法呈现内皮细胞的棕色色泽(图4C)。如表1和图3B所示，施用药物DPA-1比西地那非更有效地抑制MCT诱导平均肺动脉压(MPAP）。 

肺动脉高压(PAH)与右心室肥大(right ventricular hypertrophy，RVH)的关联 

如图5所示，MCT注射后可增加MPAP，分别由舌下给药西地那非和DPA-1治疗呈现抑制，与MCT相比较治疗组p<0.05有意义地差异。如图6所示，MCT注射可增加大鼠右心室(RV）/[左心室(LV）+室中隔(S)]的相对比率，亦即第2组右心室指数到40.9±4.5%，与第1组正常大鼠相比。第3组DPA-1降低右心室指数至30.6±1.8%与MCT相比较P<0.05。第4组西地那非降低右心室指数到31.1±2.7%与MCT相比较P<0.05(图6A）。经由RV/LV+S面积比的测量，DPA-1和西地那非显著减少的比率值分别到26±2.6%和28±4.5%，(图6B）与MCT相比较P<0.05。 

内皮素-1、ROCKII、eNOS、sGCβ1和PKG.变化影响内皮素-1的表达 

内皮素-1、ROCKII、eNOS、sGCβ1和PKG.变化影响内皮素-1的 表达，如图7A所示。MCT比CTL组，能显著地诱导肺实质组织的ET-1表达比率。MCT诱导的ET-1表达，均能被DPA-1和西地那非所降低。经MCT前处理大鼠21天后，ROCKII的表达能增加到354.3±80.1%。在此期间施用DPA-1和西地那非治疗，ROCKII表达增加量分别仅至150.2±29.5%和97.1±28.8%(图7B)。而DPA-1比西地那非，降低ROCKII的表达更有效。 

如图8所示，MCT前处理大鼠肺组织中印迹试验分析，第3组施用DPA-1表明eNOS(图8A)和sGCβ1(图8B)增加量分别到315.5±67.3%和203.4±36.7%。第4组施用西地那非，该二者增加量分别为180.35±37.4%和109.2±22.2%。显示DPA-1比西地那非，对于eNOS表达的增加量更佳，但sGCβ1表达的增加量，则以西地那非较强。此外与第2组未治疗大鼠比较如图8C所示，第3组DPA-1增加PKG到140.3±20.8%，比第4组西地那非的76.6±13.8%更多。 

RhoA失活 

如图9A显示DPA-1随浓度的增加，而对于肺动脉RhoA活性呈现抑制作用。将全细胞裂解蛋白制成西方免疫印迹，经由量测GTP结合RhoA(激活RhoA)以获知RhoA活性。输入的RhoA作为内参照(loading control)。因此，肺动脉接受24小时的DPA-1治疗组，呈现直接抑制RhoA活性。 

内皮素-1诱导RhoA的激活 

如图9B显示体外培养的肺动脉平滑肌细胞(PA smooth muscle cells，PASMCs)，0.01μM的ET-1可诱导RhoA的活化。ET-1刺激30分钟，与对照细胞相比较，RhoA开始被激活(P<0.05)。以0.1，1.0，10mM的DPA-1预处理肺动脉细胞24小时，随浓度的增加，而抑制内皮素-1诱导RhoA的激活。10　μM的DPA-1可完全抑制。 

影响血浆内皮素-1的浓度 

施用MCT和DPA-1如图10所示，足以影响血浆内皮素-1的浓度。第3组施用[MCT+DPA-1]组显示，降低ET-1的浓度为0.05±0.02ng/mL，比较第1组CTL组为0.007±0.002ng/mL和第2组MCT前处理 组的0.16±0.06ng/mL。 

血浆DPA-1浓度的改变量 

DPA-1的血浆浓度改变量如图11A和图11B所示，单位为ng/mL，检品浓度低于检测的下限(below lower limit of quantification，blq)低于0.1ng/mL。检测6小时内的浓度，0.25小时为最高，而DPA-1的浓度可维持24小时。 

从上述慢性大鼠模型，证实在慢性大鼠模型腹腔注射MCT(60mg/kg)21天，能诱发PAH、增加肺动脉(PA)的内膜厚度以及右心室/左心室+室中隔(RV/LV+S)的重量比值。以舌下给药DPA-1(2.5毫克/千克/天)治疗21天，在肺组织中血管eNOS的免疫染色能预防其更改并恢复。蛋白质印迹分析显示舌下给药DPA-1能增强eNOS，可溶性鸟苷酸环化酶(sGC)和蛋白激酶G(PKG)并减少内皮素1(ET-1)表达及Rho激酶II(ROCKII)激活MCT前处理大鼠肺组织的长期调理。 

在培养中的肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)，投以DPA-1(0.1～10μM)24小时后，可分别抑制RhoA和内皮素-1诱导RhoA的激活。DPA-1可通过增强eNOS和抑制ET-1/ROCKII的表达，阻止MCT诱导的PAH，PA壁的增厚和右心室肥大(RVH)。在体外，DPA-1抑制内皮素-1诱导PA的收缩和ET-1-依赖/无依赖RhoA肺动脉平滑肌细胞的激活。总之，DPA-1抑制内皮素-1诱导/ET-1-介导的PA收缩，有益于治疗MCT经由内皮素-1造成的PAH。 

根据本发明的构想，而于适当实施例，有效量主成分可选自如式(I)的DPAs类化合物(DPAs derivative compound)，或式(II)的DPAs复合化合物(DPAs complex compound)，于添加适量赋形剂，运用制剂方式处理所制备的食品或药品组合物，经由适宜方式施用动物体内的各种剂型，均可呈现上述生理活性。 

式(I)的哌嗪取代类似结构(disubstituted piperazine analogs,DPAs)以DPAs类化合物称之，其中R₂与R₄可分别选自以下所组成的群组：氢基、卤素、胺基、硝基的取代基； 

碳数1-5烷基的取代基；碳数1-5烷氧基的取代基。 

式(I) 

而于适当实施例，DPAs类化合物为DPA-1、DPA-2、DPA-3及DPA-4类。分别为(7-2-4-(2-氯苯)哌嗪基〕乙基〕-1,3-二甲基黄嘌呤(7-[2-[4-(2-chloro-phenyl)piperazinyl]-ethyl]-1,3-dimethylxan thine,DPA-1)，DPA-2为7-2-4-(2-甲氧基苯)哌嗪基〕乙基〕-1,3-二甲基黄嘌呤(7-[2-[4-(2-methoxybenzene)-piperazinyl]ethyl]-1,3-dimethylxanthine)，DPA-3为7-2-4-(4-硝基苯)哌嗪基〕乙基〕-1,3-二甲基黄嘌呤(7-[2-[4-(4-nitrobenzene)piperazinyl]ethyl]-1,3-dimethyl-xanthine)，而DPA-4为7-2-4-(2-硝基苯)哌嗪基〕乙基〕-1,3-二甲基黄嘌呤(7-[2-[4-(2-nitrobenzene)piperazinyl]-ethyl]-1,3-dimethylxanthine)。 

式(II)的DPAs复合化合物(DPAs complex compound)，可经由化学合成方式由DPAs类化合物与他汀类药物、羧甲基纤维素钠、高分子聚合物或聚谷氨酸基团衍生物等含有羧酸基团结构的化合物制备。 

式(II) 

其中R₂与R₄可分别选自以下所组成的群组： 

氢基、卤素、胺基、硝基的取代基； 

碳数1-5烷基的取代基； 

碳数1-5烷氧基的取代基； 

RX其选自以下所组成含羧酸基团群组之一： 

他汀类药物、羧甲基纤维素钠(sodium CMC)、高分子聚合物或聚谷氨酸基团衍生物药物；以及 

RX^-可为上述基团带负电的阴离子。 

烷基为单价的饱和烃基(hydrocarbon radical)，以单链连接碳原子，该碳氢化合物可形成直链(straight-chain)、支链(branched)或环状(cyclic)。"碳数C1-C5烷基"为指含1到5个碳原子的烷基基团，优选的碳数C1-C5烷基为甲基(methyl)、乙基(ethyl)、正丙基(n-propyl)、异丙基(isopropyl)、正丁基(n-butyl)、异丁基(iso-butyl)、仲丁基(sec-butyl)、叔丁基(tert-butyl)、正戊基(n-pentyl)、异戊基(iso-pentyl)、叔戊基(tert-pentyl)、新戊基(neo-pentyl)。. 

烷氧基(alkoxy)为一种烃基团，以单个氧原子取代烷基之一碳原子。碳数C1-C5烷氧基，优选为甲氧基(methoxyl)、乙氧基(ethoxyl)、正丙氧基(n-propoxyl)、异丙氧基(isopropoxyl)。正丁氧基(n-butoxyl)、异丁氧基(iso-butoxyl)、仲丁氧基(sec-butoxyl)、叔丁氧基(tert-butoxyl)、正戊氧基(n-pentoxyl)、异戊氧基(iso-pentoxyl)、叔戊氧基(tert-pentoxyl)。 

而于适当实施例，含羧酸基团的他汀类药物，必要时为指结构上含羧酸基团的市售他汀(Statin)类药物，包括阿托伐他汀(Atorvastatin)、西立伐他汀(Cerivastatin)、氟伐他汀(Fluvastatin)、罗瓦斯达汀(Lovastatin)、美伐他汀(Mevastatin)、普伐他汀(Pravastatin)、瑞舒伐它汀(Rosuvastatin)、辛伐他汀(Simvastatin)及其混合物。 

高分子聚合物(Co-polymers)，必要时为指结构上含羧酸基团的高分子量聚合分子，包括透明质酸(hyaluronic acid)、聚丙烯酸(polyacrylic acid)、聚甲基丙烯酸脂(polymethacrylates)、尤特奇(Eudragit)、硫酸葡聚醣(dextran sulfate)、硫酸乙酰肝素(heparan  sulfate)、聚乳酸(polylactic acid或称为polylactide,PLA)、聚羟基乙酸(polyglycolic acid,PGA)、聚乳酸钠(polylactic acid sodium,PLA sodium)、聚乙醇酸钠(polyglycolic acid sodium,PGA sodium)及其混合物。透明质酸亦称醣醛酸，为指含D-葡萄糖醛酸(D-glucuronic acid)及N-乙酰葡糖胺(N-Acetyl-D-Glucosamine,NAG)单元组成的高分子聚合物。聚甲基丙烯酸脂(polymethacrylates,PMMA)为甲基丙烯酸的高分子聚合物，而尤特奇(Eudragit)为一种聚甲基丙烯酸脂的产物。硫酸葡聚醣与硫酸乙酰肝素，为由硫酸基团聚合的多醣分子及其混合物。 

而于适当实施例，含羧酸基团的聚谷氨酸(poly-γ-polyglutamic acid,γ-PGA)基团衍生物，必要时指结构上含羧酸基团的海藻酸钠(alginate sodium)、聚谷氨酸(poly-γ-polyglutamic acid,γ-PGA)、聚谷氨酸钠(poly-γ-polyglutamic acid sodium,γ-PGA sodium)或是聚赖氨酸与海藻酸钠交联的聚海藻酸钠(alginate-poly-lysine-alginate,APA)、聚乳酸钠(polylactic acid sodium;PLA sodium)、聚乙醇酸钠(polyglycolic acid sodium;PGA sodium)及其混合物。 

根据上述构想，式(II)DPAs复合化合物的合成，其间DPAs类化合物与所添加反应的RX基团为一单位摩尔量以合成复合化合物，为DPAs类与单量体羧酸基团合成的化合物。而基于反应酸的用量以及立体结合的因素，施用参与反应的RX量充足的状态下，可为二单位摩尔量以上，则可呈现双量体羧酸基团的复合化合物。 

不论单量体或双量体的DPAs复合化合物于添加适量赋形剂均可成为一种食品或药品组合物，运用制剂方式处理成适宜施用哺乳类动物体内各种剂型，而呈现上述生理活性。 

将2-氯乙基茶碱(2-chloroethyl theophylline)、2-氯苯基哌嗪(2-chlorophenyl piperazine)依分子量的百分比溶解于含水乙醇(hydrous ethanol)的碱性溶液加热并回流3小时。静置过夜冷却后倒出上清液，经减压浓缩除去溶媒，再溶于1倍体积的乙醇及其3倍体积 的2N盐酸(HCl)，置于50至60℃水浴形成pH1.2的饱和溶液。经活性炭脱色、过滤、静置过夜、过滤，获得DPA-1HCl的白色结晶。 

2-氯苯基哌嗪 

将2-氯乙基茶碱及4-硝基苯基哌嗪依分子量的百分比溶解于含水乙醇溶液中加热并回流3小时。隔夜冷却后倒出上清液，经减压浓缩干固，再加入1倍体积的乙醇及其3倍体积的2N盐酸于50至60℃下水浴溶解成pH1.2的饱和溶液。以活性炭脱色、过滤、放置隔夜、过滤，即可获得DPA-3HCl的黄色结晶。 

将2-氯乙基茶碱(2-chloroethyl theophylline)、2-甲氧基苯基哌嗪(2-methoxybenzene piperazine)依分子量的百分比溶解于含水乙醇(hydrous ethanol)的碱性溶液溶液中加热并回流3小时。静置过夜冷却后倒出上清液，经减压浓缩除去溶媒，再溶于1倍体积的乙醇及其3倍体积的2N盐酸(HCl)，置于50至60℃水浴形成pH1.2的饱和溶液。经活性炭脱色、过滤、静置过夜、过滤，获得DPA-2HCl的白色结晶。 

羧甲基纤维素钠(sodium carboxyl methyl cellulose;sodium CMC)或高分子聚合物、聚谷氨酸基团的盐类溶于碱性溶液，添加DPA类或其盐酸盐置于50至70℃水浴反应后，室温下添加乙醇放置过夜进行结晶，过滤获得DPA类-羧甲基纤维素DPAs复合化合物、DPA类-高分子聚合物或DPA类-聚谷氨酸基团复合物。上述碱性溶液选自添加氢氧化钠(NaOH)或碳酸氢钠(NaHCO₃)所形成的溶液。 

根据上述构想本发明DPAs类化合物所合成式(I)或式(II)的DPAs 复合化合物，为选择他汀类药物、羧甲基纤维素钠、高分子聚合物或聚谷氨酸基团衍生物等含有羧酸基团结构的药物，适宜运用于医疗或保健功能。 

具体而言指DPA-1-阿托伐他汀复合化合物、DPA-2-阿托伐他汀复合化合物、DPA-3-阿托伐他汀复合化合物、DPA-4-阿托伐他汀复合化合物;DPA-1-西立伐他汀复合化合物、DPA-2-西立伐他汀复合化合物、DPA-3-西立伐他汀复合化合物、DPA-4-西立伐他汀复合化合物;DPA-1-氟伐他汀复合化合物、DPA-2-氟伐他汀复合化合物、DPA-3-氟伐他汀复合化合物、DPA-4-氟伐他汀复合化合物;DPA-1-罗瓦斯达汀复合化合物、DPA-2-罗瓦斯达汀复合化合物、DPA-3-罗瓦斯达汀复合化合物、DPA-4-罗瓦斯达汀复合化合物;DPA-1-美伐他汀复合化合物、DPA-2-美伐他汀复合化合物、DPA-3-美伐他汀复合化合物、DPA-4-美伐他汀复合化合物;DPA-1-普伐他汀复合化合物、DPA-2-普伐他汀复合化合物、DPA-3-普伐他汀复合化合物、DPA-4-普伐他汀复合化合物;DPA-1-瑞舒伐它汀复合化合物、DPA-2-瑞舒伐它汀复合化合物、DPA-3-瑞舒伐它汀复合化合物、DPA-4-瑞舒伐它汀复合化合物;DPA-1-辛伐他汀复合化合物、DPA-2-辛伐他汀复合化合物、DPA-3-辛伐他汀复合化合物、DPA-4-辛伐他汀复合化合物;DPA-1-羧甲基纤维素复合化合物、DPA-2-羧甲基纤维素复合化合物、DPA-3-羧甲基纤维素复合化合物、DPA-4-羧甲基纤维素复合化合物;DPA-1-透明质酸复合化合物、DPA-2-透明质酸复合化合物、DPA-3-透明质酸复合化合物、DPA-4-透明质酸复合化合物;DPA-1-聚丙烯酸复合化合物、DPA-2-聚丙烯酸复合化合物、DPA-3-聚丙烯酸复合化合物、DPA-4-聚丙烯酸复合化合物;DPA-1-聚甲基丙烯酸脂复合化合物、DPA-2-聚甲基丙烯酸脂复合化合物、DPA-3-聚甲基丙烯酸脂复合化合物、DPA-4-聚甲基丙烯酸脂复合化合物;DPA-1-尤特奇复合化合物、DPA-2-尤特奇复合化合物、DPA-3-尤特奇复合化合物、DPA-4-尤特奇复合化合物;DPA-1-聚乳酸复合化合物、DPA-2-聚乳酸复合化合物、DPA-3-聚乳酸复合化合物、DPA-4-聚乳酸复合化合物;DPA-1-聚羟基乙酸复合化合物、DPA-2-聚羟基乙酸复合化合物、DPA-3-聚羟基乙酸复合化合物、 DPA-4-聚羟基乙酸复合化合物;DPA-1-硫酸葡聚醣复合化合物、DPA-2-硫酸葡聚醣复合化合物、DPA-3-硫酸葡聚醣复合化合物、DPA-4-硫酸葡聚醣复合化合物;DPA-1-硫酸乙酰肝素复合化合物、DPA-2-硫酸乙酰肝素复合化合物、DPA-3-硫酸乙酰肝素复合化合物、DPA-4-硫酸乙酰肝素复合化合物;DPA-1-海藻酸钠复合化合物、DPA-2-海藻酸钠复合化合物、DPA-3-海藻酸钠复合化合物、DPA-4-海藻酸钠复合化合物;DPA-1-聚谷氨酸复合化合物、DPA-2-聚谷氨酸复合化合物、DPA-3-聚谷氨酸复合化合物、DPA-4-聚谷氨酸复合化合物;DPA-1-聚谷氨酸钠复合化合物、DPA-2-聚谷氨酸钠复合化合物、DPA-3-聚谷氨酸钠复合化合物、DPA-4-聚谷氨酸钠复合化合物;DPA-1-聚海藻酸钠复合化合物、DPA-2-聚海藻酸钠复合化合物、DPA-3-聚海藻酸钠复合化合物、DPA-4-聚海藻酸钠复合化合物等等。 

于单一医药制剂提供个体治疗有效量的第一活性成份DPAs类化合物或DPAs复合类化合物，亦或采取同步、或相继或各别的方式施用施用第二活性成份。其中施用第二活性成份的方式，可将第二活性成份依照医药制剂的方式形成医药组合物，亦可运用公知食品组合物的制造技术，将第二活性成份成为食品。而在相关技术上第一活性成份DPAs类化合物或DPAs复合类化合物亦可运用公知食品组合物的制造技术，成为食品。 

上述同步是将第二活性与第一活性成份混合于同一医药制剂或食品，或放置于相同吸入器的分别舱室。相继将第二活性与第一活性成份以任何顺序一种紧接着另一种给药或服用。 

上述赋形剂或称为『药学上可接受之载体或赋形剂』、『生物可利用之载体或赋形剂』，系包括溶媒、分散剂、包衣、抗菌或抗真菌剂，保存或延缓吸收剂等任何公知用于制备成剂型之适当化合物。通常此类载体或赋形剂，本身不具备治疗疾病的活性，且将本技术所揭示的衍生物，搭配药学上可接受的载体或赋形剂，制备的各剂型，施用动物或人类不致于造成不良反应、过敏或其它不适当反应。因而本技术所揭示的衍生物，搭配药学上可接受的载体或赋形剂，适用于临床及人类。”有 效地剂量”系代表足以改善或防止医学症状或生物体状态的剂量。有效地剂量亦说明施用化合物的剂量足供用于诊断之剂量。除非说明书另有叙述，否则『活性化合物』以及『医药活性化合物』于此均可替换使用，指具有制药学、药理学或治疗效果之物质。 

运用本化合物之剂型经由静脉、口服、吸入或经由鼻、直肠、阴道等局部或舌下等方式给药，可达到治疗效果。对于不同病症之患者，约每日施用0.1mg至100mg的活性成份。 

该载体随各剂型而不同，无菌注射的组成物可将溶液或悬浮于无毒的静脉注射稀释液或溶剂中，此类溶剂如1,3－丁二醇。其间可接受的载体可为甘露醇(Mannitol)或水。此外固定油或以合成的单或双甘油酯悬浮介质，系一般习用的溶剂。脂肪酸，如油酸(Oleic acid)、橄榄油或蓖麻油等与其甘油酯衍生物，尤其经多氧乙基化的型态皆可作为制备注射剂并为天然医药可接受的油类。此等油类溶液或悬浮液可包含长链酒精稀释液或分散剂、羧甲基纤维素或类似的分散剂。其它一般使用的接口活性剂如Tween、Spans或其它相似的乳化剂或是一般医药制造业所使用于医药可接受的固态、液态或其它可用于剂型开发的生物可利用增强剂。 

用于口服给药的组合物则系采用任何一种口服可接受的剂型，其型式包括胶囊、锭剂、片剂、乳化剂、液状悬浮液、分散剂、溶剂。口服剂型一般所使用的载体，以锭剂为例可为乳糖、玉米淀粉、润滑剂，如硬脂酸镁为基本添加物。而胶囊使用的稀释液包括乳糖与干燥玉米淀粉。制成液状悬浮液或乳化剂剂型，是将活性物质悬浮或溶解于结合乳化剂或悬浮剂的油状接口，视需要添加适度的甜味剂，风味剂或是色素。 

鼻用气化喷雾剂或吸入剂组成物，可根据已知的制剂技术进行制备。例如，将组成物溶于生理食盐水中，添加苯甲醇或其它适合的防腐剂，或促吸收剂以增强生物可利用性。本技术所揭示化合物的组合物亦可制成栓剂，进行经直肠或阴道的给药方式。 

本技术所揭示化合物亦可运用『静脉给药』，其是包括经由皮下、腹腔、静脉、肌肉，或关节腔内、颅内、关节液内、脊髓内注射，主动 脉注射，胸腔注射，疾病部位内注射，或其它适合的给药技术。 

兔子离体海绵体实验 

取重2.0～3.0公斤的兔子，以40mg/kg苯巴比妥钠(pentobarbital sodium)耳静脉注射麻醉，接着立即剪下阴茎海绵体，置于室温(20～25℃)已通有混合气(95%O₂+5%CO₂)的Kreb's溶液中，将旁边的组织除去，再将海绵体剪成约5mm长，两端以蛙心夹夹住，一端固定于底部，置入20毫升Krebs溶液的组织浴器中，温度维持在37.0℃，另一端则连接力传感器(force transducer)，经由记录器(COULBOURN AT-High-Speed Videograph)记录等长收缩张力，标本给予2.0克的张力，待平衡后进行以下实验： 

(a)累积浓度反应曲线(cumulative concentration-response curves)的完成： 

为评估化合物对海绵体的活性作用大小，每一段海绵体于60分钟后平衡，加入药物使浓度由10^-9M累积至10^-4M。观察不同浓度化合物对离体海绵体的松弛作用，以此作为对照组，接着进行以下的实验。 

(b)海绵体松弛作用机转的探讨： 

同大鼠及兔子的肺动脉实验方法。 

肺动脉实验 

重200-250g成年雄性大鼠单次皮下注射60mg/kg野百合(monocrotaline,MCT)21天诱发PAH或生理食盐水。DPA-1(2.5毫克/千克/天/25μL PG)以微吸管(micropipette)滴在舌下腔进行舌下给药。1分钟内以微吸管施用DPA-1，不需止痛。大鼠分为4个实验组：正常对照组(第1组）、MCT前处理组(第2组）、MCT前处理大鼠长期施用DPA-1(第3组)和MCT前处理大鼠长期施用西地那非(第4组)。 

平均肺动脉压和平均血压的血流动力学 

10周龄雄性大鼠经1.25g/kg聚氨酯(urethane)腹腔注射麻醉，进行平均肺动脉压(MPAP)、心跳与平均血压(MABP)的测量。从股动脉纪录平均血压(MABP)和心跳。开胸鼠以压力感应器(Gould,Model P50,U.S.A.）连接着压力处理器放大器(Gould,Model13-4615-52,U.S.A.） 纪录肺动脉的平均肺动脉压(MPAP)。插管于股静脉，分别以肝素混合生理盐水、DPA-1和西地那非进行静脉注射。动物体温维持在37℃，维持自发性呼吸。 

肺动脉的等长收缩力(Isometric force of PAs)。 

根据British Journal of Pharmacology160:971　986,2010所叙述方法剥离肺动脉(PA)，测量大鼠的等长收缩力。简单地说，在开胸手术前将大鼠以过量的戊巴比妥钠(60毫克/公斤)腹腔注射进行安乐死。将主要肺动脉切成2-3毫米环，在等长收缩力的条件下悬浮肺动脉，并连接到先前所述的力传感器(force transducer,Ugo Basile,Model7004Comerio VA，Italy），量测内皮素-1(0.01μM)所造成的收缩。 

对照组以生理食盐水处理内皮细胞完整的PA环(+E)、剥离内皮细胞的PA环(-E)，以MCT和施用100μM的L-NAME预处理组拉伸到1g基本张力，并且均衡60～90分钟。均衡后，施用乙酰胆碱1μM至少达80%的松弛响应，经ET-1收缩PA环以恢复组织和量测内皮细胞的功能。 

器官槽内以ET-1预培养15分钟，当ET-1获得稳定的收缩反应，持续添加0.1-100μM的DPA-1.在ET-1预培养前，先以氧化氮合酶抑制剂L-NAME(100μM)预培养20分钟，探讨DPA-1对NOS的影响。在某些实验，以镊子插入腔和PA环，来回五次先剥离内皮，制备剥离内皮的PA环(-E)，作为于内皮细胞完整PA环(+E)施用ET-1作用的比较组。 

松弛的百分比估算公式：松弛(%)=(最大收缩-松弛级别）/(最大收缩基本量）x100.以内皮素-1诱导对PA环获得最大收缩反应，评估DPA-1对于MCT前处理血管内皮的机制，分别以无MCT处理的对照组(第1组)，以L-NAME预处理组和MCT处理组比较其PA环的张力。 

蛋白印迹分析 

量测蛋白质表达量，依照Chung HH等人所述方式进行其总蛋白提取以及蛋白印迹分析(参考British Journal of Pharmacology160:971　986,2010）。肺组织经施用DPA-1和西地那非，以4实验组的大鼠 量测eNOS、sGCα、ROCKII和ET-1的表达。印迹分析中使用大鼠或兔的单株抗体eNOS(Upstate,NY,U.S.A.)、ROCKII(Upstate,NY,U.S.A.）、RhoA(Santa Cruze,CA,U.S.A.）和载入对照β-肌动蛋白蛋白(β-actin，Sigma-Adrich,MO)。实验大鼠的整个右肺组织切成小片，依照前述方法剥离和提取蛋白质。 

蛋白提取物，以5:1检品缓冲液煮过。检品缓冲液以甘油20%、4%十二烷基硫酸钠(Sodium dodecyl sulfate,SDS)、100mM的三羟甲基氨基甲烷(Tris(hydroxymethyl)aminomethane,Tris,pH6.8)和0.2%溴酚蓝(bromophenol blue)组成。以100V，40mA条件，进执10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-polyacrylamide gel)电泳2小时，每条蛋白印迹20μg。 

已剥离的蛋白质转移到聚氟化二乙烯(polyvinylidene difluoride,PVDF)膜，经5%的脱脂奶粉处理，以阻断非特异性IgGs(90分钟，100V)，特定抗体培养1小时。印迹再以碱性磷酸酶标记的抗鼠或抗-山羊IgG抗体(1:1000)培养1小时。经辣根过氧化物酶共轭二级抗体，随后以ECL检测(Amersham Pharmacia,USA)观察得知呈现免疫阳性反应。 

肺动脉的制备 

经MCT前处理或未处理的大鼠，以60mg/kg戊巴比妥钠(pentobarbital sodium)进行安乐死。依照Gao等人(参考Lung Cell Molecular Physiology292:L678-684,2007)所建立肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)的培养方法，先轻轻地分开PA环下方的结缔组织，然后切碎、放入培养皿以Dulbecco's改良的鹰培养基(Dulbecco's modified Eagle's medium,DMEM)在5%二氧化碳/95%空气的37℃环境培养。该培养基含有10%胎牛血清、0.244%碳酸氢钠(NaHCO₃)和1%青霉素/链霉素(penicillin/streptomycin)。培养基每隔3天更新一次，细胞进行传代培养(subculture)直到融合(confluence)。于2-4传代(passage)的原代培养(Primary cultures)进行实验，经β-肌动蛋白(Sigma-Adrich,MO)的免疫荧光染色，以确认肺动脉的纯度。平滑肌细 胞组成，应含有超过95%的细胞。 

肺动脉的RhoA活性 

亲和免疫沉淀法检测(affinity precipitation assay)仅与激活GTP的Rho结合，以确认Rho A的活性。简单地说，肺动脉平滑肌细胞培养到次融汇(sub-confluent)约85-90%融合状态，以0.1、1、10μM的DPA-1施用24小时，在37℃以0.01μM的ET-1与10%胎牛血清施用30分钟后，在4℃添加裂解缓冲液反应15分钟。 

裂解缓冲液的组成，含有25mM N-(2-羟乙基)呱嗪-N'-2-乙烷磺酸(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethane-sulfonic acid，HEPES，pH值7.5)、150mM氯化钠，1%(辛基苯氧基)聚乙氧基乙醇(po1yoxyethylene alkyl phonol，Igepal CA-630)、10mM氯化镁、1mM乙二胺四乙酸(Ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA)、10%甘油、1Ag/ml抑肽酶(aprotinin)、10Ag/ml亮抑酶肽(leupeptin)和1mmol/l钒酸钠(Na₃VO₄)。 

细胞裂解后，在4℃以13000g离心10分钟。4℃下以裂解缓冲液等体积的Rho检测试剂琼脂糖凝胶共轭(agarose conjugated rhotekin-RBD)进行培养45分钟，再以裂解缓冲液洗涤三次。以十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)检品缓冲液煮沸琼脂糖凝胶，释出激活Rho A和检品，呈现于12%聚丙烯酰胺凝胶经抗Rho A的免疫印迹法分析(clone55）。 

组织学检查 

切碎大鼠右肺叶和从各组获得的六个大鼠心脏，浸泡在福尔马林，以梯度酒精脱水且埋入石蜡。用福尔马林固定的肺组织检品埋入石蜡，切成4μm厚片并经苏木曙红(hematoxylin-eosin，H&E)染色，以光学显微镜检查，进行肺内小动脉内壁增厚的组织病理学评估。石蜡包埋的心脏组织，切成4μm厚片。组织部分浸没在二甲苯(xylene)且依照前述方法脱水(8，9)。切片以苏木曙红染色，轻轻地以水冲洗后，每一切片经梯度酒精脱水，最后以二甲苯浸泡两次。以尼康(Eclipse TE2000-S)显微镜，拍摄显微照片。 

形态学和免疫组织化学 

大鼠右肺和六个心脏检品，以光学显微镜检查形态学。以福尔马林固定的检品，埋入石蜡后，制作成4μm切片安置于免疫载玻片(Superfrost)上。右肺和心脏部分，经苏木曙红染色以评估血管和心脏的形态。使用尼康显微镜(Eclipse TE2000-S）耦合到尼康彩色视频摄像机量测各组检品，内壁厚度(μm）和内壁区域的肺动脉肌肉层，其内壁区域为计算内壁弹力膜(internal elastic lamina)和血管外膜厚度的区域)。 

在右心室(RV）的相对权重/[左心室(LV）+室中隔(S)]的比率，亦即右心室指数(heart index)。经苏木曙红染色(H&E)染色，医萃多软件(Histolab software)量测右心室/左心室+室中隔(RV/LV+S)。每一动物平均采取六个肺动脉检品，eNOS抗体(1:100)进行右肺的测量。 

内皮素-1的血浆浓度 

按照制造商的说明(Biomedica Group,Wien,Austria）以酵素免疫法试剂盒(enzyme immunoassay kit，EIA kit)，量测血浆内皮素-1.以19号针(19G)进行心脏采血的穿刺，取样后离心，以剥离血浆。血浆检品(0.8　1.0毫升)以与0.6%三氟乙酸(trifluoroacetic acid)酸化后，2000g，48C离心15分钟。 

DPA-1的血浆浓度 

以LCpMS/MS方法控制微量吸管(micropipette)，经舌下施用大鼠。3.6毫克/公斤剂量DPA-1·HCl溶于25μl丙二醇(propylene glycol），给药后DPA-1的血浆浓度从0.1～20ng/ml到更高的10～5000ng/ml。 

高效液相色谱(high performance liquid chromatography，HPLC)的条件，流动相:23%乙腈(CH₃CN)+1.0%甲酸，管柱：Luna C18，2.0毫米x50毫米、5毫米费诺美(Phenomenex)公司制品，流速0.2毫升/分钟以质谱仪(Quattro Ultima,Micromass LtD.,Manchester)，自动取样机(autosamper)(Waters Alliance2790LC,Waters,MA,USA） 与数据处理器进行联机管控。分别在0分钟、2分钟、5分钟、10分钟、0.25小时、0.5小时、1小时、1.5小时、2小时、4小时、6小时、9小时和24小时量测血浆浓度。 

统计分析 

所有实验数据的结果，皆由平均值加减偏差呈现(Mean±S.E.M.)。利用Dunnett’s test统计差异性，当p值小于0.05时，表示统计学上有显著差异。 

实施例： 

实施例一制备DPA-1盐酸盐(7-[2-[4-(2-chlorobenzene)piperazinyl]ethyl]-1,3-dimethyl xanthine HCl) 

取DPA-1(8.3g)溶于混合着乙醇(10mL)与1N盐酸(60mL)的溶液，于50℃下反应20分钟，室温下添加乙醇(20mL)放置过夜进行结晶，过滤获得DPA-1盐酸盐(6.4g)。 

实施例二制备DPA-3盐酸盐(7-[2-[4-(4-nitrobenzene)piperazinyl]ethyl]-1,3-dimethyl xanthine HCl) 

取DPA-1(8.3g)溶于混合着乙醇(10mL)与1N盐酸(60mL)的溶液，于50℃下反应20分钟，室温下添加乙醇(20mL)放置过夜进行结晶，过滤获得DPA-3盐酸盐(6.6g)。 

实施例三制备DPA-2-聚丙烯酸复合物 

取DPA-2(8g)溶于混合着乙醇(10mL)与聚丙烯酸(2.5g)的溶液，于50℃下反应10分钟，室温下添加乙醇(20mL)放置过夜进行结晶，过滤获得DPA-1-烟碱酸复合物(7.4g)。 

实施例四制备DPA-3-聚海藻酸钠复合物 

取12.5g聚海藻酸钠(APA)溶于40ml氢氧化钠(5%)的水溶液，加入8.3g的DPA-3HCl置于50℃下反应10分钟，室温下添加乙醇(20mL)放置过夜进行结晶，过滤获得DPA-3-聚海藻酸钠复合物(31.4g)。 

实施例五制备DPA-1-聚谷氨酸复合物 

取DPA-1(7.9g)溶于混合着乙醇(10mL)与3.8g聚谷氨酸的溶液，于50℃下反应10分钟，室温下添加乙醇(20mL)放置过夜进行结晶，过滤获得DPA-1-聚谷氨酸复合物(10.4g)。 

实施例六制备DPA-1-羧甲基纤维素DPAs复合化合物复合物 

取20g的羧甲基纤维素钠(sodium CMC)溶于40ml氢氧化钠(5%)的水溶液，加入16g的DPA-1HCl置于50℃下反应10分钟，室温下添加乙醇(20mL)放置过夜进行结晶，过滤获得DPA-1-羧甲基纤维素DPAs复合化合物复合物(31.4g)。 

实施例七制备DPA-2-透明质酸复合物 

取DPA-2(8g)溶于混合着乙醇(10mL)与透明质酸(2.5g)的溶液，于50℃下反应10分钟，室温下添加乙醇(20mL)放置过夜进行结晶，过滤获得DPA-2-透明质酸复合物(9.4g)。 

实施例八制备DPA-4-硫酸乙酰肝素复合物 

取DPA-4(8.3g)溶于混合着乙醇(10mL)与硫酸乙酰肝素(8.5g)的溶液，于50℃下反应10分钟，室温下添加乙醇(20mL)放置过夜进行结晶，过滤获得DPA-4-硫酸乙酰肝素复合物(9.2g)。 

实施例九制备DPA-1-硫酸葡聚醣复合物 

取DPA-1(8g)溶于混合着乙醇(10mL)与硫酸葡聚醣(3.5g)的溶液，于50℃下反应10分钟，室温下添加乙醇(20mL)放置过夜进行结晶，过滤获得DPA-1-硫酸葡聚醣复合物(10.6g)。 

实施例十    制备锭剂的组合物 

分别依量秤取下列各成分，混和后充填于打锭机，制备成锭剂 

DPA-1-透明质酸   140mg 

乳糖             qs 

玉米粉           qs 

实施例十一   制备锭剂的组合物 

分别依量秤取下列各成分，混和后充填于打锭机，制备成锭剂 

DPA-1-羧甲基纤维素  160mg 

乳糖                qs 

玉米粉              qs 

在新药物研究领域，抗肥胖药物有发生肺动脉高压(PAH)的风险。芬氟拉明和它的类似物是已知的著名抑制肥胖药物。芬氟拉明的抑制肥胖处方，规定可单独或与芬特明合并使用。而具有中枢神经作用可引起幻觉的Locaserin，在2012年由美国FDA核准成为一种新的减少体重药物。Locaserin属于5-HT2C和5-HT2A感受器次型的5-羟色胺感受器激动剂。而5-HT2C可在肺动脉表达。Locaserin对于平滑肌5-HT2C感受器，比之于对于平滑肌5-HT2B，呈现高达100倍的选择性。但不如内皮的非典型(atypical)5HT2B次型感受器官的激活，其可结合血管内皮一氧化氮合酶(eNOS)的活化，而释出一氧化氮。 

经由GPCR拮抗剂可拮抗由5HT2A/5HT2B/5HT2C、Ang II、ET-1和儿茶酚胺等感受器官受刺激所造成的肺动脉平滑肌收缩，而产生肺动脉高压(PAH)。在人类许多血管壁、血管平滑肌和血管内皮细胞的5-HT2B感受器。Chung HH等人于2010年发现，激活血管内皮的5HT-2B感受器，可释出松弛血管之一氧化氮，以保护肺动脉避免高血压(参考Vascul Pharmacol53,239-49.)。经由该活性机制，以5-HT2B抑制剂对抗在心脏、平滑肌和中缝背核神经元(dorsal raphe nucleus)由5-HT2B感受器引起的活化。芬氟拉明在肺动脉平滑肌虽可启动5-HT2B，但无一氧化氮从内皮细胞释出。相对地DPA-1，除在内皮细胞启动5-HT2B，且伴随着一氧化氮的释出活性，因而可抑制5-HT导致肺动脉的收缩，意味着可作为5HT在肺动脉平滑肌的5HT2A/5HT2B/5HT2C感受器的多样化拮抗剂，可归属于GPCR的拮抗剂。依此原理，DPA类GPCR拮抗剂能抑制由多种5HT感受器、Ang II、ET-1和儿茶酚胺感受器引起的肺动脉收缩。 

施用GPCRs拮抗剂，可经由抑制ET-1刺激所呈现的GPCRs多样化(diversity GPCRs)作用所导致的立体结构变化，即造成所谓的allosteric inhibition。亦即依据Conn PM等人在2010年发表的文献以及多位学者的研究(参考Trends Endocrinol Metab.2010 Mar;21(3):190-7)，可抑制ET-1-以及5HT所导致的肺动脉收缩。PAH的调控亦可针对多样化GPCRs进行标靶治疗。DPA-1即呈现此抑制多样化GPCRs的作用。在RhoA/Rho激酶(ROCK)激活PAH的作用中，ET-1即介入该一途径。依此原理，DPA-1可抑制血管紧缩素II(Ang II)　所诱发Ca²⁺的内流，肺血管平滑肌的收缩和经由5-羟色胺(5-HT)的不同受器而抑制PAH。因此，Katritch V等人于2012年所报导ET-1、Ang II，儿茶酚胺和5-HT皆可能凭借着的抑制多样化的GPCRs，而调控肺动脉RhoA/ROCK的活化作用(参考Trends Parmacol Sci33,17-27,2013)。迄今，在临床上，bosentan虽然因抑制ET-1的调控反应，成为有力的PAH治疗药物。然而bosentan，无法完全有效地以竞争作用抑制由其它原因引起的PAH。所以除包括介入ET-1的感受器，另经由增强NO/eNOS活性及非特定GPCRs的拮抗作用，或可成为bosentan、sildenafil及其组合的竞争对手药物，用于抑制PAH。 

ET-1从内皮释出，可导致PA血管收缩和细胞增生，并介入内皮细胞的机能不良病症。活化内皮eNOS而释出一氧化氮(NO)的松弛平滑肌作用，及抑制PAH，系经由cGMP依赖性途径(cGMP-dependent pathway)。其中包括共存的ROCK(co-localized ROCK)、eNOS、sGC和PKG在PA的表现。sildenafil和DPA-1皆能经由抑制磷酸二酯酶5A(PDE-5A)，而增强cGMP依赖性蛋白激酶(PKG)的活化作用，且分别抑制RhoA活化作用和细胞增生。此外，sildenafil对于儿童PAH的疗效较差。抑制ET-1/Ang II/5-HT的启动GPCRs，同时能增强NO/eNOS，将成为颇有潜力抑制PAH的药物。Manxiang Li等人于2012年所报导(参考Pharmacological Research59,312　318.)并用bosentan和sildenafil，而能抑制5-HT和ET-1，则能充分抑制PAH。综上所述，DPA-1因为具备有效的抑制GPCRs，且拥有类似bosentan抑制ET-1感受器的活性。在PAH的治疗上，并用DPA-1与bosentan，将超出与并用sildenafil所呈现的效益。 

综上所述，本发明运用DPAs类化合物或或DPAs复合化合物所构成的组合物，于大鼠证实可抑制ET-1，以改善生物体的新陈代谢恒定。 显示本发明的化合物可用于产业产品，确实具有进步性与新颖性。 

因此，即使本案已由上述的实施例所详细叙述而可由本领域技术人员任意修饰，而不脱离本发明的保护范围。 

其它实施例 

1.一种治疗个体体内由内皮素-1所介导病症或疾病的方法，其中该方法包含对该个体施用治疗有效量的DPAs类化合物。 

2.如实施例1的方法，其中DPAs类化合物选自7-2-4-(2-氯苯)哌嗪基〕乙基〕-1,3-二甲基黄嘌呤(7-[2-[4-(2-chlorophenyl)piperazinyl]ethyl]-1,3-dimethyl-xanthine,DPA-1)； 

7-2-4-(2-甲氧基苯)哌嗪基〕乙基〕-1,3-二甲基黄嘌呤(7-[2-[4-(2-methoxybenzene)-piperazinyl]ethyl]-1,3-dimethylxanthine,DPA-2)； 

7-2-4-(4-硝基苯)哌嗪基〕乙基〕-1,3-二甲基黄嘌呤(7-[2-[4-(4-nitrobenzene)piperazinyl]ethyl]-1,3-dimethylxanthine,DPA-3);以及 

7-2-4-(2-硝基苯)哌嗪基〕乙基〕-1,3-二甲基黄嘌呤(7-[2-[4-(2-nitrobenzene)piperazinyl]ethyl]-1,3-dimethylxanthine,DPA-4)等DPAs类化合物。 

3.如实施例1的方法，其中该病症或疾病经由减少血管的收缩、气管的收缩。 

4.一种治疗个体体内对ET-1活性有反应的病症或疾病的方法，其中该方法包含对该个体施用治疗有效量的DPAs类化合物。 

5.如实施例4的方法，其中DPAs类化合物选自7-2-4-(2-氯苯)哌嗪基〕乙基〕-1,3-二甲基黄嘌呤(7-[2-[4-(2-chlorophenyl)piperazinyl]ethyl]-1,3-dimethyl-xanthine,DPA-1)； 

7-2-4-(2-甲氧基苯)哌嗪基〕乙基〕-1,3-二甲基黄嘌呤(7-[2-[4-(2-methoxybenzene)-piperazinyl]ethyl]-1,3- dimethylxanthine,DPA-2)； 

7-2-4-(4-硝基苯)哌嗪基〕乙基〕-1,3-二甲基黄嘌呤(7-[2-[4-(4-nitrobenzene)piperazinyl]ethyl]-1,3-dimethylxanthine,DPA-3);以及 

7-2-4-(2-硝基苯)哌嗪基〕乙基〕-1,3-二甲基黄嘌呤(7-[2-[4-(2-nitrobenzene)piperazinyl]ethyl]-1,3-dimethylxanthine,DPA-4)等DPAs类化合物。 

6.如实施例4的方法，其中该病症或疾病系选自减少肥胖的脂肪组织含量、血管的收缩、气管的收缩。 

7.一种治疗个体体内由ET-1和广泛的5-羟色胺所介导病症或疾病的方法，其中该方法包含对该个体施用治疗有效量的DPAs复合类化合物。 

8.如实施例7所述的方法，其中DPAs复合化合物为DPAs类化合物与选自以下含有羧酸基团结构化合物所合成的DPAs复合化合物： 

他汀类药物、羧甲基纤维素钠(sodium CMC)、高分子聚合物、聚谷氨酸基团衍生物及其混合物。 

9.如实施例8所述的医药组合物，其中高分子聚合物选自透明质酸(hyaluronic acid)、聚丙烯酸(polyacrylic acid)、聚甲基丙烯酸脂(Polymethacrylates)、尤特奇(Eudragit)、硫酸葡聚醣(dextran sulfate)、硫酸乙酰肝素(heparan sulfate)、聚乳酸(polylactic acid或称为polylactide,PLA)、聚羟基乙酸(polyglycolic acid,PGA)、聚乳酸钠(polylactic acid sodium,PLA sodium)、聚乙醇酸钠(polyglycolic acid sodium,PGA sodium)及其混合物。 

10.如实施例8所述的组合物，其中聚谷氨酸基团衍生物选自海藻酸钠(alginate sodium)、聚谷氨酸(γ-PGA)、聚谷氨酸钠(γ-PGA sodium)或聚海藻酸钠(APA)及其混合物。 

11.如实施例8所述的组合物，其中他汀类药物选自阿托伐他汀(Atorvastatin)、西立伐他汀(Cerivastatin)、氟伐他汀(Fluvastatin)、罗瓦斯达汀(Lovastatin)、美伐他汀(Mevastatin)、 普伐他汀(Pravastatin)、瑞舒伐它汀(Rosuvastatin)、辛伐他汀(Simvastatin)及其混合物。 

12.一种治疗个体体内对G蛋白偶联受体(GPCR)活性抑制有反应的病症或疾病的方法，其中该方法包含对该个体施用治疗有效量的DPAs复合类化合物。 

13.一种治疗个体体内对ET-1和广泛的5-羟色胺活性抑制有反应的病症或疾病的方法，其中该方法包含对该个体施用治疗有效量的DPAs复合类化合物，或同步、或相继或各别的方式施用第二活性成份。 

14.一种治疗个体体内由ET-1和广泛的5-羟色胺所介导病症或疾病的方法，其中该方法包含对该个体施用治疗有效量的DPAs复合类化合物，或同步、或相继或分别的方式地施用第二活性成份。 

15.一种治疗个体体内对ET-1和广泛的5-羟色胺活性抑制有反应的病症或疾病的方法，其中该方法包含对该个体施用治疗有效量的DPAs复合类化合物，或同步、或相继或分别地经由各别的医药制剂施用第二活性成份。 

16.一种治疗个体体内由ET-1和广泛的5-羟色胺所介导病症或疾病的方法，其中该方法包含对该个体施用治疗有效量的DPAs复合类化合物，或同步、或相继或分别地经由各别的医药制剂施用第二活性成份。 

Claims (10)

1.一种组合物的用途，其是其用于制备改善个体内由内皮素-1所介导病症或疾病的药剂，该组合物包含DPAs类化合物与DPAs复合类化合物之一。

2.如权利要求1的用途，其中DPAs类化合物选自7-2-4-(2-氯苯)哌嗪基〕乙基〕-1,3-二甲基黄嘌呤(7-[2-[4-(2-chlorophenyl)piperazinyl]ethyl]-1,3-dimethyl-xanthine,DPA-1)；

7-2-4-(2-甲氧基苯)哌嗪基〕乙基〕-1,3-二甲基黄嘌呤(7-[2-[4-(2-methoxybenzene)-piperazinyl]ethyl]-1,3-dimethylxanthine,DPA-2)；

7-2-4-(4-硝基苯)哌嗪基〕乙基〕-1,3-二甲基黄嘌呤(7-[2-[4-(4-nitrobenzene)piperazinyl]ethyl]-1,3-dimethylxanthine,DPA-3);

7-2-4-(2-硝基苯)哌嗪基〕乙基〕-1,3-二甲基黄嘌呤(7-[2-[4-(2-nitrobenzene)piperazinyl]ethyl]-1,3-dimethylxanthine,DPA-4)等DPAs类化合物之一;

其中DPAs复合化合物为DPAs类化合物与选自以下含有羧酸基团结构化合物所合成的DPAs复合化合物：

他汀类药物、羧甲基纤维素钠、高分子聚合物、聚谷氨酸基团衍生物及其混合物。

3.如权利要求1的用途，其中该病症或疾病涉及血管的收缩、气管的收缩、摄护腺过度收缩以及阴茎海绵体收缩。

4.一种组合物的用途，其是其用于制备影响个体内的内皮素-1活性的病症或疾病的药剂，其中该组合物包含DPAs类化合物与DPAs复合类化合物之一。

5.如权利要求4的用途，其中该病症或疾病涉及血管的收缩、气管的收缩、摄护腺过度收缩以及阴茎海绵体收缩，或血管内膜增生。

6.一种组合物的用途，其是其用于制备影响个体内对广泛的5-羟色胺活性病症或疾病的药剂，其中该该组合物包含DPAs类化合物与DPAs复合类化合物之一。

7.一种组合物的用途，其是其用于制备改善个体内由广泛的5-羟色胺所介导病症或疾病的药剂，其中该该组合物包含DPAs类化合物与DPAs复合类化合物之一。

8.如权利要求6或7所述的用途，其中DPAs类化合物选自7-2-4-(2-氯苯)哌嗪基〕乙基〕-1,3-二甲基黄嘌呤(7-[2-[4-(2-chlorophenyl)piperazinyl]ethyl]-1,3-dimethyl-xanthine,DPA-1)；

7-2-4-(2-甲氧基苯)哌嗪基〕乙基〕-1,3-二甲基黄嘌呤(7-[2-[4-(2-methoxybenzene)-piperazinyl]ethyl]-1,3-dimethylxanthine,DPA-2)；

7-2-4-(4-硝基苯)哌嗪基〕乙基〕-1,3-二甲基黄嘌呤(7-[2-[4-(4-nitrobenzene)piperazinyl]ethyl]-1,3-dimethylxanthine,DPA-3);

7-2-4-(2-硝基苯)哌嗪基〕乙基〕-1,3-二甲基黄嘌呤(7-[2-[4-(2-nitrobenzene)piperazinyl]ethyl]-1,3-dimethylxanthine,DPA-4)等DPAs类化合物之一;

DPAs复合化合物为DPAs类化合物与选自以下含有羧酸基团结构化合物所合成的DPAs复合化合物：

他汀类药物、羧甲基纤维素钠、高分子聚合物、聚谷氨酸基团衍生物及其混合物。

9.如权利要求8所述的医药组合物，其中高分子聚合物选自透明质酸(hyaluronic acid)、聚丙烯酸(polyacrylic acid)、聚甲基丙烯酸脂(Polymethacrylates)、尤特奇(Eudragit)、硫酸葡聚醣(dextransulfate)、硫酸乙酰肝素(heparan sulfate)、聚乳酸(polylactic acid或称为polylactide,PLA)、聚羟基乙酸(polyglycolic acid,PGA)、聚乳酸钠(polylactic acid sodium,PLA sodium)、聚乙醇酸钠(polyglycolic acid sodium,PGA sodium)及其混合物。

10.如权利要求8所述的组合物，其中聚谷氨酸基团衍生物选自海藻酸钠(alginate sodium)、聚谷氨酸(γ-PGA)、聚谷氨酸钠(γ-PGAsodium)或聚海藻酸钠(APA)及其混合物。