CN104274441B

CN104274441B - 一种卷柏生物碱在制备治疗血栓性疾病药物中的应用

Info

Publication number: CN104274441B
Application number: CN201410583544.5A
Authority: CN
Inventors: 孔毅; 苏杏丽; 王跃虎; 牛红梅
Original assignee: China Pharmaceutical University
Current assignee: China Pharmaceutical University
Priority date: 2014-10-27
Filing date: 2014-10-27
Publication date: 2017-01-11
Anticipated expiration: 2034-10-27
Also published as: CN104274441A

Abstract

本发明公开了具备以下结构的卷柏生物碱(Psm2)及其药学上可成的盐在制备治疗血栓性疾病药物中的应用，

Description

一种卷柏生物碱在制备治疗血栓性疾病药物中的应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种卷柏生物碱(3aS,8aR)-3a-[(E)-3-羧基丁-2-乙烯)-N1,N8,N8-三甲基-1,2,3,3a,8,8a-六氢吡咯并[2,3-b]吲哚(pyrrolidinoindolinealkaloid，Psm2)在制备抗血栓药物中的应用。

背景技术

目前，心血管性疾病，特别是动脉血栓性疾病已成为引起全球性人类死亡及残疾的首要原因，而血小板与血管的相互作用在血栓形成中起重要作用。通过在血管上的聚集，血小板能维持血管的完整性、控制出血，但是其也会引起动脉粥样硬化及动脉血栓的形成。非正常的血小板聚集将会导致动脉血栓的形成，进而引起威胁人类健康的疾病。所以，抗血小板制剂即使具有治疗窗狭窄及出血副作用等不足，但仍然是治疗和预防心血管疾病的重要工具。最常见的抗血小板制剂包括阿司匹林(环氧化物酶抑制剂)，氯吡格雷(ADP受体拮抗剂)和依替巴肽(αIIbβ3受体拮抗剂)等。

虽然这些药物能够有效的减少心肌梗死，中风，静脉血栓栓塞等等临床发病率和死亡率，但是他们还存在一些问题，包括较弱的血小板功能抑制作用(例如阿司匹林)，起效慢(例如氯吡格雷)，由于一些患者血小板抑制作用差，不同患者的反应也会有所差异(例如氯吡格雷)，整合素αIIbβ3拮抗剂只能静脉注射而不能口服治疗，不能将减少血栓的形成与增加出血的风险完全分开等。其中最主要的共同缺陷就是在抗血小板聚集的同时对止血系统有不利影响，带来出血副作用，导致出血并发症。这些不足大大地限制了他们在临床上的应用，所以目前仍有需要研究、开发新的抗血小板药物。化学药物的开发费用昂贵、毒副作用大，所以人们把目光转向存在于具有抗血小板、抗血栓或与心血管性疾病相关的食用或药用植物中的天然化合物的研发上，试图从天然成分中寻找毒副作用小，抗血栓活性高、作用机制独特的抗血栓药物。

江南卷柏(Selaginella moellendorfii Hieron.)，是一种多年生常绿草本植物，为我国常用的中草药。其性平，味微甘，能清热利尿，活血消肿。现代药理研究表明其有广泛的药理活性，例如抗肿瘤活性，抗菌活性，抗病毒及免疫调节活性，被用于治疗急性传染性肝炎、胸胁腰部挫伤、全身浮肿等疾病。研究报道其主要化学成分有木脂素、生物碱、香豆素、黄酮苷和具有细胞毒性或抗氧化作用的双黄酮等。

(3aS,8aR)-3a-[(E)-3-羧基丁-2-乙烯)-N1,N8,N8-三甲基-1,2,3,3a,8,8a-六氢吡咯并[2,3-b]吲哚，((3aS,8aR)-3a-[(2E)-3-carboxybut-2-enyl]-N1,N8,N8-trimethyl-1,2,3,3a,8,8a-hexahydropyrrolo[2,3-b]indole，pyrrolidinoindoline alkaloid)是一种从江南卷柏的整体植物中分离得到的卷柏生物碱。现有文献Yue-Hu Wang,Chun-Lin Long,Fu-Mei Yang,Xi Wang,Qian-Yun Sun,Hong-Sheng Wang,Ya-Na Shi,and Gui-Hua Tang.Pyrrolidinoindoline Alkaloidsfrom Selaginella moellendorfii，Journal of Natural Products,2009,Vol.72,No.6，1151–1154.对其抗菌、抗氧化及细胞毒性进行了研究，结果显示该化合物不具有以上活性。

发明内容

本发明对卷柏生物碱(3aS,8aR)-3a-[(E)-3-羧基丁-2-乙烯)-N1,N8,N8-三甲基-1,2,3,3a,8,8a-六氢吡咯并[2,3-b]吲哚的药理作用进行了研究，提供了(3aS,8aR)-3a-[(E)-3-羧基丁-2-乙烯)-N1,N8,N8-三甲基-1,2,3,3a,8,8a-六氢吡咯并[2,3-b]吲哚的新的药物用途。

本发明具体技术方案如下：

具有以下结构的卷柏生物碱或其药学上可成的盐在制备治疗血栓性疾病药物中的应用，

上述卷柏生物碱pyrrolidinoindoline alkaloid化学名为(3aS,8aR)-3a-[(E)-3-羧基丁-2-乙烯)-N1,N8,N8-三甲基-1,2,3,3a,8,8a-六氢吡咯并[2,3-b]吲哚，英文名为(3aS,8aR)-3a-[(2E)-3-carboxybut-2-enyl]-N1,N8,N8-trimethyl-1,2,3,3a,8,8a-hexahydropyrrolo[2,3-b]indole。

上述卷柏生物碱可以是游离碱，也可以与酸成盐，如无机酸盐可以为：盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、硝酸盐、磷酸盐或磷酸氢盐；有机酸盐可以为：甲酸盐、乙酸盐、苯甲酸盐、丁二酸盐、富马酸盐、马来酸盐、乳酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、琥珀酸盐、葡糖酸盐、甲磺酸盐、苯磺酸盐或对甲苯磺酸盐等。

本发明所述应用中，所述血栓性疾病是由血小板聚集引起的动脉血栓性疾病。

本发明化合物可按参考文献Yue-Hu Wang,Chun-Lin Long,Fu-Mei Yang,Xi Wang,Qian-Yun Sun,Hong-Sheng Wang,Ya-Na Shi,and Gui-Hua Tang.Pyrrolidinoindoline Alkaloidsfrom Selaginella moellendorfii，Journal of Natural Products,2009,Vol.72,No.6，1151–1154.中公开的方法制备得到。

药理药效实验证实，本发明所述卷柏生物碱pyrrolidinoindoline alkaloid能有效、剂量依赖性地抑制体内外血小板聚集，降低小鼠急性肺血栓的死亡率及大鼠动静脉旁路血栓的重量，并且表现出较低的出血风险，能制备为抗血栓药物，特别是抗血小板聚集引起的动脉血栓药物。

卷柏生物碱pyrrolidinoindoline alkaloid作为天然中药材提取物的主要成分，其来源丰富、价格低廉，具有高抗血栓活性、低出血风险等优点，可广泛用于动脉粥样硬化、心肌梗死等动脉心血管性疾病，其体内抗血小板及抗血栓活性优于治疗血栓的药物—阿司匹林，而出血风险却低于阿司匹林。

本发明的卷柏生物碱pyrrolidinoindoline alkaloid或其可药用盐可以单独使用或以药物组合物的形式使用。药物组合物包括作为活性成分的本发明的化合物或其可药用盐及可药用载体。较佳的，本发明的药物组合物有0.1-99.9％重量百分比的作为活性成分的本发明的化合物或其可药用盐。“可药用载体”不会破坏本发明的化合物或其可药用盐的药学活性，同时其有效用量，即能够起药物载体作用时的用量对人体无毒。

“可药用载体”包括但不限于：离子交换材料、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、自乳化药物传递系统(SEDDS)如d-维生素E聚乙二醇1000琥珀酸酯、吐温或其他类似聚合介质等药物制剂用的表面活性剂、血清蛋白如人血清白蛋白、缓冲物质如磷酸盐、氨基乙酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸部分甘油酯混合、水、盐、电解质如硫酸盐精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、硅胶、硅酸镁等。聚乙烯吡咯酮、纤维素物质、聚乙烯醇、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸酯、乙烯-聚氧乙烯-嵌段聚合物和羊毛脂、环糊精如α-、β-、γ-环糊精或其经化学修饰的衍生物如2-和3-羟丙基-β-环糊精等羟烷基环糊精或其他可溶性衍生物等均可用于促进本发明的化合物、其药用盐或前药的药物传递。

其他可药用辅料如填充剂(如无水乳糖、淀粉、乳糖珠粒和葡萄糖)、粘合剂(如微晶纤维素)、崩解剂(如交联羧甲基淀粉钠、交联羧甲基纤维素钠、低取代羟丙基纤维素和交联PVP)、润滑剂(如硬脂酸镁)、吸收促进剂、香味剂、甜味剂、稀释剂、赋形剂、润湿剂、溶剂、增溶剂和着色剂等也可加入本发明的药物组合物中。

上述本发明的化合物或其可药用盐以及药物组合物可通过肠道或者非肠道途径给药。非肠道给药制剂包括注射剂、霜剂、软膏剂、贴剂、喷雾剂等。给药途径包括皮下、皮内、动脉内、静脉内、肌内、关节内、滑液内、胸骨内、鞘内、病灶内、颅内注射或输注，或者，口服、局部、直肠、经鼻、经颊、阴道、舌下、皮内、粘膜、气管、尿道给药，或者通过吸入气雾或植入蓄积或者针刺方式给药。

上述本发明的化合物或其可药用盐以及药物组合物的治疗有效量为0.001-100mg/kg/d之间，可用于相关疾病的单一用药或联合用药治疗，为本领域技术人员能够理解的范围。

附图说明

图1是本发明所述卷柏生物碱体外抗血小板聚集实验结果的分析图。

图2是本发明所述卷柏生物碱体内抗血小板聚集实验结果的分析图。

图3是本发明所述卷柏生物碱对出血时间及出血体积影响的实验结果分析图。

具体实施方式

以下通过实施例说明本发明的具体步骤，但不受实施例限制。

在本发明中所使用的术语，除非另有说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

下面结合具体实施例并参照数据进一步详细描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

在以下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。

实施例1卷柏生物碱(3aS,8aR)-3a-[(E)-3-羧基丁-2-乙烯)-N1,N8,N8-三甲基-1,2,3,3a,8,8a-六氢吡咯并[2,3-b]吲哚(Psm2)的制备江南卷柏(6公斤)用甲醇回流提取3次，得浸膏780克。硅胶(80～100目)柱层析，分别用氯仿、丙酮、甲醇洗脱，得甲醇洗脱部分350克。将甲醇洗脱部分用D101大孔树脂进行层析处理，分别用水与甲醇洗脱。甲醇洗脱部分71克，用C-18反相硅胶层析处理，甲醇-水梯度洗脱，20％洗脱部分(2克)用硅胶(400目)柱层析(氯仿-甲醇-二乙胺，90:30:1)及LH-20凝胶柱层析(甲醇)得到本发明所述卷柏生物碱200毫克。

实施例2卷柏生物碱(3aS,8aR)-3a-[(E)-3-羧基丁-2-乙烯)-N1,N8,N8-三甲基-1,2,3,3a,8,8a-六氢吡咯并[2,3-b]吲哚(Psm2)对体外血小板聚集的影响

1.实验操作

兔颈动脉取血，置于含有1ml 3.8％枸橼酸钠的15ml离心管中(每管最终的体积约为10ml，保证兔血和抗凝剂体积比为9:1)；1000r/min离心5min，取上层液即富血小板血浆(plateletrich plasma,PRP)，余下血样以3000r/min离心10-15min,得到贫血小板血浆(platelet poorplasma,PPP)。用PPP调整血小板浓度至(250～300)×10⁹个/L；每次测试吸取300μl PPP置于血小板聚集仪测试区调零，再吸取270μl PRP置于预热槽中，分别加入不同浓度的受试样品和测试珠；37℃条件下，预热5min后置于测试区；最后加入10μl相关诱导剂如ADP(法国Hyphen Biomed公司，终浓度10μM)、凝血酶(法国Hyphen Biomed公司，终浓度1U/ml)、I-型胶原(美国Sigma-Aldrich公司，终浓度2μg/ml)或U46619(美国Sigma-Aldrich公司，终浓度3μM)；在LBY-NJ4血小板凝集仪(北京普利生)上测定5min内血小板的最大聚集率(RPA)；其中，空白对照为生理盐水，实验重复三次，同时通过以下公式计算血小板聚集抑制率：[(X-Y)/X]×100％。X代表生理盐水组血小板最大聚集率；Y代表各组血小板最大聚集率。并用GraphpadPrism6计算各个诱导剂作用下的IC₅₀值。结果显示，随Psm2浓度的增加，最大血小板聚集率逐渐减小，其抑制作用呈现浓度依赖性；其中Psm2对ADP，U46619，凝血酶及胶原诱导的血小板聚集的IC₅₀分别约为138.0μM，139.6μM，930.2μM及125.6μM(如图1所示)。

实施例3卷柏生物碱(3aS,8aR)-3a-[(E)-3-羧基丁-2-乙烯)-N1,N8,N8-三甲基-1,2,3,3a,8,8a-六氢吡咯并[2,3-b]吲哚(Psm2)对体内血小板聚集的影响

(1)实验动物：SD大鼠(180-240g)40只(雌雄各半)，购自江苏省南京市青龙山动物中心；

(2)实验过程:将大鼠随机分为5组，每组8只，分别为空白对照组(给予等体积的生理盐水)，阳性药阿司匹林组(阿司匹林50mg/kg)，低、中、高剂量样品组(1、3、10mg/kg)，给药体积为5ml/kg。给药30min后，颈动脉取血至15ml的离心管中，3.8％枸橼酸钠溶液抗凝，如上述制备PRP、PPP及测定不同处理组的血小板最大聚集率。结果显示：Psm2能剂量依赖性地降低血小板最大聚集率(如图2所示)。

实施例4卷柏生物碱(3aS,8aR)-3a-[(E)-3-羧基丁-2-乙烯)-N1,N8,N8-三甲基-1,2,3,3a,8,8a-六氢吡咯并[2,3-b]吲哚(Psm2)对小鼠急性肺血栓的影响

(1)实验动物：ICR小鼠(18-22g)60只，雌雄各半，购自江苏省南京市青龙山动物中心；

(2)实验过程：将小鼠分为5组，每组10只，分别为阴性对照组(生理盐水代替样品及诱导剂)；模型对照组(生理盐水代替样品)；阳性对照组(给予等体积的阿司匹林)；低、中、高剂量样品组(1、3、10mg/kg)。给药体积为5ml/kg。给药30min后，尾静脉注射ADP(300mg/kg)，使小鼠形成急性肺血栓栓塞，记录注射诱导剂后15min内各组死亡小鼠的数量。计算出每组的死亡率并通过以下公式计算抗栓活性物急性肺血栓栓塞的保护率：[1-(X/Y)]×100％。X代表各组死亡小鼠的数量；Y代表各组的小鼠总数量。结果显示：Psm2对小鼠表现出剂量依赖性的保护作用，并且活性高于阿司匹林。

表1对小鼠急性肺血栓的影响(n＝10)

组别	剂量/(mg/kg)	死亡数/总数	保护率(％)
				阴性组		0/10	100
模型组		10/10##	0##
				阿司匹林	50	2/10**	80**
Psm2	10	2/10**	80**
					3	5/10**	50**
	1	8/11*	27*

##与阴性对照组比较P<0.01；与模型组比较*P<0.05，P<0.01**。

实施例5卷柏生物碱(3aS,8aR)-3a-[(E)-3-羧基丁-2-乙烯)-N1,N8,N8-三甲基-1,2,3,3a,8,8a-六氢吡咯并[2,3-b]吲哚(Psm2)对大鼠动静脉旁路血栓形成的影响

(1)实验动物SD大鼠(180-240g)30只(雌雄各半)，购自江苏省南京市青龙山动物中心；

(2)实验过程:将大鼠随机分为5组，每组6只，如上述体内血小板聚集实验处理动物。手术前，取两根4cm长PE-50作为套管两端，一根12cm长PE-60内置10cm长棉线(手术刀片刮擦，以便血栓的形成)作为中间套管，中间套管注入生理盐水，两端套管注入50IU/ml肝素。给药30min后，腹腔注射水合氯醛(10％水合氯醛，3ml/kg)麻醉，颈部中线位置切口，分离出右侧颈动脉和左侧颈静脉，两根4cm的PE管分别插入右侧颈动脉和左侧颈静脉后连接套管，然后松开动脉夹，体外血液循环15min后停止，立刻取出丝线，用滤纸吸取血栓表面的血液，精密称量湿重，60℃干燥15min后(室温干燥6小时)称量干重，总湿重减去丝线湿重即为血栓湿重；总干重减去丝线干重即为血栓干重，同时计算血栓抑制率。

血栓抑制率(％)＝(W₀-W)/W₀×100％其中W₀是阴性组的血栓重，W是实验组的血栓重。

结果发现，阳性药阿司匹林组、高、中剂量组都能使血栓重量显著下降，与阴性组有显著性差异(P<0.05，P<0.01)。

表2对大鼠动静脉旁路血栓形成的影响(n＝6)

与阴性组相比，*P<0.5,**P<0.01。

实施例6卷柏生物碱(3aS,8aR)-3a-[(E)-3-羧基丁-2-乙烯)-N1,N8,N8-三甲基-1,2,3,3a,8,8a-六氢吡咯并[2,3-b]吲哚(Psm2)对小鼠断尾出血的影响

(1)实验动物：ICR小鼠(18-22g)50只，雌雄各半，购自江苏省南京市青龙山动物中心；

(2)实验过程：按照上述急性肺血栓实验对小鼠进行分组，分别尾静脉注射阿司匹林(50mg/kg),Psm2(3、10、30mg/kg)或等体积的生理盐水。给药体积为5ml/kg。给药30min后，水合氯醛(5％，6ml/kg)麻醉小鼠，称量小鼠的体重记为W₁,然后将小鼠放置于固定器中，将其尾部垂直，用尺子测量，并在距尾尖3-5mm处作标记，然后用手术剪在鼠尾标记处剪断，并将其尾尖浸入37℃生理盐水(40ml)中，剪断尾尖开始计时至出血停止并记录剪断尾尖后的出血时间t(另取一个秒表只记录累积的血流时间即为出血时间t)，如果出血时间t大于30min则记为30min，计时结束后称量小鼠及尾尖的重量记为W₂，出血前后小鼠重量的变化△W＝W₁-W₂即为出血体积v，t即为出血时间。

实验结果表明，Psm2在有效剂量3和10mg/kg没有出血副作用；而阿司匹林在50mg/kg时，虽然与10mg/kg的Psm2表现相当的活性，但却明显的延长了出血时间、增加了小鼠的出血体积(如图3所示)。

综上所述，本发明的卷柏生物碱(3aS,8aR)-3a-[(E)-3-羧基丁-2-乙烯)-N1,N8,N8-三甲基-1,2,3,3a,8,8a-六氢吡咯并[2,3-b]吲哚(Psm2)对体内外血小板聚集都有显著的抑制作用，能明显的降低小鼠急性肺血栓的死亡率及大鼠动静脉旁路血拴的重量，却对小鼠断尾出血没有明显的影响，可用于制备抗血栓，特别是血小板聚集引起的动脉血栓的药物。

Claims

1.具有以下结构的卷柏生物碱或其药学上可成的盐在制备治疗血栓性疾病药物中的应用，

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述血栓性疾病是由血小板聚集引起的血栓性疾病。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述药物含卷柏生物碱以及药学上可以接受的载体。