CN104266987A

CN104266987A - 一种磷酸替米考星中磷酸根的检测方法

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Publication number: CN104266987A
Application number: CN201410435947.5A
Authority: CN
Inventors: 任勇; 张金霞; 包洁华; 李晓萍
Original assignee: Ningxia Tairui Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Ningxia Tairui Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2014-08-29
Filing date: 2014-08-29
Publication date: 2015-01-07

Abstract

本发明涉及一种磷酸替米考星中磷酸根的检测方法，本发明通过对样品处理的优选及供试品、对照品制备方法的试验，建立了磷酸替米考星中磷酸根（PO₄ ^-3）的分析方法；通过对样品处理和试剂配制的优化，建立了兽药磷酸替米考星中磷酸根（PO₄ ^-3）检测方法；通过方法学验证试验研究表明：准确度试验的平均回收率为：100.6%，相对标准偏差RSD:1.5%；精密度试验的RSD为2.4%；线性关系良好Y=10.696X+0.0297，相关系数γ=0.9996 ；从而充分说明，本发明所建立的方法准确度高、专属性强、重现性良好，通过对兽药磷酸替米考星中磷酸根（PO₄ ^-3）量的控制，确保其安全性，从而更有效的防治牛、山羊、绵羊、奶牛、猪、鸡等动物感染性疾病。

Description

一种磷酸替米考星中磷酸根的检测方法

技术领域

本发明涉及制药技术领域，特别是涉及一种磷酸替米考星中磷酸根(PO₄ ^-3)的检测方法。

背景技术

替米考星为最新型大环内酯类抗生素，主要抗革兰氏阳性菌如金葡萄菌、肺炎球菌、链球菌等，对部分革兰氏阴性菌如流感嗜血杆菌、巴氏杆菌及家禽支原体的活性比泰乐菌素强。内附吸收快，组织穿透力强，分布容积广，半衰期可达1～2天，体内维持时间长。临床主要用于牛、猪、鸡、绵羊、山羊、兔等感染性疾病，特别是用于畜禽呼吸道疾病，并取得显著疗效。该药具有抗菌活性强、药代动力学特征优良、用量少、毒性小等特点。临床应用表明：替米考星是一种安全有效的新型兽药，具有广阔的应用前景。

替米考星具有同泰乐菌素相似的广谱抗菌活性，对革兰氏阳性菌和某些革兰氏阴性菌、霉形体、螺旋体等均有抑制作用，对胸膜肺炎放线杆菌、巴氏杆菌及霉形体具有比泰乐菌素更强的抗菌活性。Inamoto等报道，替米考星(TMS)、金霉素(CTC)、甲砜霉素(TP)和泰乐菌素(TS)对日本1980～1989年间从猪肺炎损害部位分离出的61株多杀性巴氏杆菌和35株胸膜肺炎放线杆菌的抗菌作用，大多数菌株对TMS、CTC、TP敏感。CTC和TP分别在3.13μg/ml和0.78μg/ml时对51株(83.6％)和46株(75.4％)多杀性巴氏杆菌有抑制作用。TS对几乎所有菌株的抗菌活性较低，MIC≥6.25μg/ml。TMS对23株(37.7％)多杀性巴氏杆菌的MIC≥1.56μg/ml，但在3.13μg/ml时，TP和TMS分别能抑制32株(91.4％)和33株(94.3％)放线杆菌，可见作为同一大环内酯类药物，泰乐菌素对两种细菌的抗菌活性均不及替米考星。Salmon SA等用从美国、加拿大分离到的515株致病菌对头孢噻呋、恩诺沙星、红霉素、磺胺二甲嘧啶、壮观霉素、林可霉素、磺胺嘧啶/TMP、氨苄青霉素和替米考星等9种药物的敏感性进行测定。结果发现，抗菌作用最强的是恩诺沙星和头孢噻呋，替米考星对巴氏杆菌和胸膜肺炎放线杆菌活性中等。替米考星对鸡霉形体表现出较强的体外抗菌活性。Jordan等报道了替米考星和泰乐菌素对家禽6株鸡败血霉形体和3株滑液霉形体的体外MIC值。替米考星对6株鸡败血霉形体的MIC值分别为：＜0.0125、0.0025、0.0025，＞12.5、0.004、0.1、0.0125、0.006和0.025μg/ml；而泰乐菌素的MIC值则分别为：＜0.0125、0.02、0.02、3.2、0.016、0.8、0.0125、0.025和0.025μg/ml。Ziv等应用替米考星对从奶牛乳房炎分离的112株金黄色葡萄球菌和其它致病菌进行MIC-90测定。结果替米考星对乳房炎金黄色葡萄球菌和链球菌均很敏感，其中对化脓性链球菌活性最强(MIC-90为0.04μg/ml)。替米考星在小于3.12μg/ml时能抑制90.8％的其它革兰氏阳性乳房炎致病菌。

综上所述，磷酸替米考星作为一种较新的大环内酯类抗生素，其较强的抗菌活性和优越的药物动力学特征，使它在畜禽敏感菌引起的肺炎、巴氏杆菌病以及乳房炎等疾病的防治方面发挥着重要作用。因此，建立磷酸替米考星的质量控制体系，保证其产品质量就具有非常实际的意义。

磷酸替米考星的合成过程中，成盐结晶步骤会带入大量的游离磷酸，这些磷酸的遗留不仅降低产品的稳定性，同时会对药品的安全性带来影响。因此，确立磷酸替米考星中磷酸根的检测指标，对于确保磷酸替米考星的安全性具有非常重要的意义。

发明内容

本发明的目的就在于提供一种磷酸替米考星中磷酸根(PO₄ ^-3)的检测方法。

本发明采用下述技术方案实现：

一种磷酸替米考星中磷酸根的检测方法，其特征在于采用显色法将供试品溶液在紫外分光光度计上于650nm处测吸光度，查标准曲线计算，其中

供样品溶液的制备：精密称取样品2g，于250ml容量瓶中，加纯化水稀释至刻度，充分摇匀，精密吸取试验溶液5ml于100ml的容量瓶中，加10％三氯乙酸溶液10ml，用水稀释至刻度，后精密吸取滤液2ml于50ml容量瓶中，加纯化水5ml，钼酸铵溶液、米吐尔溶液各2ml，于沸水浴中加热35min，放冷，用水稀释至刻度，摇匀即可。

所述标准曲线采用如下方法制备：配制浓度依次为0.613μg/ml、0.9198μg/ml、1.2264μg/ml、1.5330μg/ml、1.8396μg/ml、2.1462μg/ml、2.4528μg/ml、2.7594μg/ml的PO₄ ^-3溶液，以空白为参比，用紫外分光光度计于650nm处测吸光度，以已知PO₄ ^-3浓度为纵坐标，以测得的吸光度为横坐标，绘制标准曲线，相关系数R＞0.999。

所述钼酸铵溶液的制备方法为：精密称取钼酸铵溶液5g，加水50ml，微热使溶解后，倒入加有75ml浓硫酸和50ml水的冷混液的棕色试剂瓶中，于冰箱中保存。

所述米吐尔溶液的制备方法为：精密称取对甲基对甲氨基酚硫酸盐0.2g，和亚硫酸钠1g，加水10ml溶解与44g亚硫酸氢钠溶于190ml水所成的溶液，混合均匀过滤，盛入棕色瓶中，冰箱保存。

试验过程发现：采用GB/T5009.87-2003《食品中磷的测定》进行样品处理，步骤繁琐，消化时间长，并且由于磷酸替米考星具有良好的水溶性导致显色不稳定，为此，本发明通过对样品处理的优选及供试品、对照品制备方法的试验，建立了磷酸替米考星中磷酸根(PO₄ ^-3)的分析方法；通过对样品处理和试剂配制的优化，建立了兽药磷酸替米考星中磷酸根(PO₄ ^-3)检测方法；通过方法学验证试验研究表明：准确度试验的平均回收率为：100.6％，相对标准偏差RSD:1.5％；精密度试验的RSD为2.4％；线性关系良好Y＝10.696X+0.0297，相关系数γ＝0.9996；从而充分说明，本发明所建立的方法准确度高、专属性强、重现性良好，通过对兽药磷酸替米考星中磷酸根(PO₄ ^-3)量的控制，确保其安全性，从而更有效的防治牛、山羊、绵羊、奶牛、猪、鸡等动物感染性疾病。

附图说明

图1为磷酸根(PO₄ ^-3)标准曲线图。

具体实施方式

采用显色法将供试品溶液在紫外分光光度计上于650nm处测吸光度，查标准曲线计算所得。

样品名称：磷酸替米考星，(来源：宁夏泰瑞制药股份有限公司)。

仪器：水浴锅

标准曲线的绘制：配制浓度依次为0.613μg/ml、0.9198μg/ml、1.2264μg/ml、1.5330μg/ml、1.8396μg/ml、2.1462μg/ml、2.4528μg/ml、2.7594μg/ml的PO₄ ^-3溶液，以空白为参比。用紫外分光光度计于650nm处测吸光度，以已知PO₄ ^-3浓度为纵坐标，以测得的吸光度为横坐标，绘制标准曲线(相关系数R＞0.999)。

钼酸铵溶液(A液)的制备：精密称取钼酸铵溶液5g，加水50ml，微热使溶解后，倒入加有75ml浓硫酸和50ml水的冷混液的棕色试剂瓶中，于冰箱中保存(保存期2周)。

米吐尔溶液(B液)的制备：精密称取米吐尔(硫酸对甲氨基酚)0.2g，和亚硫酸钠1g，加水10ml溶解与44g亚硫酸氢钠溶于190ml水所成的溶液，混合均匀过滤，盛入棕色瓶中，冰箱保存(保存期为2周)。

10％三氯乙酸溶液的制备：称取固体三氯醋酸10.0g，加水100ml溶解，摇匀后转移至棕色试剂瓶中待用。

供试品溶液的制备方法：精密称取磷酸替米考星样品2g，于250ml容量瓶中，加纯化水稀释至刻度，充分摇匀，精密吸取试验溶液5ml于100ml的容量瓶中，加10％三氯乙酸溶液10ml，用水稀释至刻度，精密吸取滤液2ml于50ml容量瓶中，加纯化水5ml，A液、B液各2ml，于沸水浴中加热35min，放冷，用水稀释至刻度，摇匀，(若有沉淀物则用无磷滤纸过滤)。

P = \frac{r \times 125000}{W}

P：样品含PO₄ ^-3量(μg/g)；

W：样品的质量(g)；

r：由吸光度值查曲线得PO₄ ^-3的含量(μg/ml)。

精密度：制备供试品溶液5份，测定磷酸根(PO₄ ^-3)结果RSD为2.4％，重复性良好(见表1)。

表1 磷酸根(PO₄ ^-3)精密度试验结果表

线性试验：精密称取105℃干燥至恒重的磷酸二氢钾0.4394g于1000ml容量瓶中，加适量纯化水使溶解，用水稀释至刻度(此时溶液含PO₄ ^-3为306.6μg/ml)，再精密吸取此溶液10ml于100ml容量瓶中，加0.05mol/L硫酸2ml，用水稀释至刻度(含磷30.66μg/ml)。

分别吸取稀释液0.0、1.0ml、1.5ml、2.0ml、2.5ml、3.0ml、3.5ml、4.0ml、4.5ml于50ml容量瓶中(取5ml水加入空白样品)，分别加A液(钼酸铵溶液)、B液(米吐尔溶液)各2ml，然后用水稀释至14ml(依次吸取水为9.0ml、8.5ml、8.0ml、7.5ml、7.0ml、6.5ml、6.0ml、5.5ml，空白加水5ml)于沸水浴中加热35min，冷却，用水稀释至刻度，摇匀。则其相应的浓度依次为0.613μg/ml、0.9198μg/ml、1.2264μg/ml、1.5330μg/ml、1.8396μg/ml、2.1462μg/ml、2.4528μg/ml、2.7594μg/ml，以空白为参比。用紫外分光光度计于650nm处测吸光度，以已知PO₄ ^-3浓度为纵坐标，以测得的吸光度为横坐标，绘制标准曲线，试验结果表明，PO₄ ^-3在0.6130～2.7594μg/ml范围内，呈良好的线性关系。测定结果见表2，线性关系曲线图见图1。表2 PO₄ ^-3浓度测定线性范围

回收率试验：分别按照所确定限度的相对浓度80％，100％，120％加入含磷30.66μg/ml对照品溶液0.8ml、1.0ml、1.2ml，照测定法项下的提取方法及测定法提取并测定，结果平均回收率为：100.6％，RSD:1.5％(见表3)。

表3：PO₄ ^-3准确度试验结果

Claims

1.一种磷酸替米考星中磷酸根的检测方法，其特征在于采用显色法将供试品溶液在紫外分光光度计上于650nm处测吸光度，查标准曲线计算，其中

供样品溶液的制备：精密称取样品2g，于250ml容量瓶中，加纯化水稀释至刻度，充分摇匀，精密吸取试验溶液5ml于100ml的容量瓶中，加10%三氯乙酸溶液10ml，用水稀释至刻度，后精密吸取滤液2ml于50ml容量瓶中，加纯化水5ml，钼酸铵溶液、米吐尔溶液各2ml，于沸水浴中加热35min，放冷，用水稀释至刻度，摇匀即可。

2.按照权利要求1所述的磷酸替米考星中磷酸根的检测方法，其特征在于所述标准曲线采用如下方法制备：配制浓度依次为0.613μg/ml、0.9198μg/ml、1.2264μg/ml、1.5330μg/ml、1.8396μg/ml、2.1462μg/ml、2.4528μg/ml、2.7594μg/ml的PO₄ ^-3溶液，以空白为参比，用紫外分光光度计于650nm处测吸光度，以已知PO₄ ^-3浓度为纵坐标，以测得的吸光度为横坐标，绘制标准曲线，相关系数R＞0.999。

3.按照权利要求1所述的磷酸替米考星中磷酸根的检测方法，其特征在于所述钼酸铵溶液的制备方法为：精密称取钼酸铵溶液5g，加水50ml，微热使溶解后，倒入加有75ml浓硫酸和50ml水的冷混液的棕色试剂瓶中，于冰箱中保存。

4.按照权利要求1所述的磷酸替米考星中磷酸根的检测方法，其特征在于所述米吐尔溶液的制备方法为：精密称取对甲基对甲氨基酚硫酸盐0.2g，和亚硫酸钠1g，加水10ml溶解与44g亚硫酸氢钠溶于190ml水所成的溶液，混合均匀过滤，盛入棕色瓶中，冰箱保存。