CN104263640A - 将引物或引物、探针固定于固相载具用于pcr的方法 - Google Patents

将引物或引物、探针固定于固相载具用于pcr的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及PCR反应（聚合酶链式反应）实验技术领域，尤其是一种将引物或引物、探针固定于固相载具用于PCR的方法。将引物或引物、探针按相关主题，溶解好以后，按一定的比例，在无菌实验室里加入到固相载具的PCR反应管（孔）内，然后放入烘箱中，将加入的液体水分蒸干，同时保留并贴壁固定引物或引物、探针，即形成固化的引物或引物、探针反应层，最后用膜将固相载具密闭，4℃保存，以待备用。本发明的固相载具带有引物层或引物、探针混合层，使用时只需加入酶混合液、灭菌水和模板，不需再加入PCR引物和探针，降低了加孔出错率；能很快完成实验操作，缩短检测周期；PCR反应的引物、探针已固定在PCR管内，运输与储存非常方便。

Description

将引物或引物、探针固定于固相载具用于PCR的方法
技术领域
本发明涉及PCR反应（Polymerase Chain Reaction,聚合酶链式反应，一种用于体外扩增核酸片段的技术）实验技术领域，尤其是一种将引物或引物、探针固定于固相载具用于PCR的方法。
背景技术
PCR板是普通PCR试验或荧光定量PCR试验中常用的分子生物学耗材，分为48孔PCR板、96孔PCR板、384孔PCR板、8联管和单孔PCR反应管。PCR板的使用方法是通过加入PCR反应引物、探针、酶混液（DNA聚合酶与缓冲液的混合液或DNA聚合酶、逆转录酶与缓冲液的混合液）、水和模板核酸（DNA、RNA）,混合后放入PCR仪或实时荧光定量PCR仪上进行PCR反应。这种方法的不足之处在于：1、检测或扩增同一个基因、进行多个PCR反应时，需要向多个PCR反应管（孔）内重复加入相同的引物和探针；2、检测或扩增不同的基因、进行多个PCR反应时，需要向不同的PCR反应管（孔）内加入不同的引物和探针。这样，既耗费实验人员时间，工作量大，工作效率低，又容易出错，引物或探针加错孔位，从而直接影响实验结果的及时性、准确性和重复性。例如：1、检测60份标本中的乙肝病毒基因，就需要重复60次向60个PCR反应管（孔）内加入乙肝病毒基因的引物和探针，工作量大，耗时长，工作效率低，实验人员也很辛苦；2、同时检测30份标本中的乙肝病毒基因和丙肝病毒基因，就需要重复30次向30个PCR反应管（孔）内加入乙肝病毒基因的引物和探针，再重复30次向30个PCR反应管（孔）内加入丙肝病毒基因的引物和探针，不仅工作量大，耗时长，还有可能加错管（孔）位，得出错误的结果。
发明内容
为了克服现有的技术的不足，本发明提供了一种将引物或引物、探针固定于固相载具用于PCR的方法。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种将引物或引物、探针固定于固相载具用于PCR的方法，其方法如下：
步骤一、引物或引物、探针按相关主题溶解：引物、探针合成后，按引物、探针终浓度100uM 的需要量，加入缓冲液，短暂离心使加入的缓冲液全部沉积到PCR管或孔底部，保证引物、探针充分溶解到缓冲液中，室温放置1h，形成母液；
步骤二、在无菌实验室里，将上下游引物、探针分别从步骤一的100uM母液中取出10ul分装，再加入10-90ul 缓冲液稀释到10-50uM，形成使用液，4℃保存备用。根据进行的单重或者多重PCR反应需要，将该使用液加入固相载具的PCR反应管或孔中；
步骤三、将已加入引物或引物、探针的固相载具放入烘箱中，直至将加入的液体水分蒸干，加入的引物或引物、探针即被贴壁固定，此时即形成固化的引物层或引物、探针层；
步骤四、将带有固化的引物层或引物、探针层的固相载具用封板膜封板，4℃保存，以待备用。
本方案可将引物层或引物、探针层很好地固定于固相载具上，解决现有技术的工作量大、工作效率低、实验时间长、容易出现加孔错位等问题。其中，固定的引物或引物、探针可以是1对引物，多对引物，1对引物探针，或多对引物探针等，此处不应当受到限制。
根据本发明的另一个实施例，进一步包括，所述步骤三中将已加入引物或引物、探针的固相载具放入烘箱中，该烘箱为普通烘箱或其它形式的加热烘干器具。本方案中使用的烘箱应当不受限制，其目的是为将引物或引物、探针烘干固化。
根据本发明的另一个实施例，进一步包括，所述步骤三中将已加入引物或引物、探针的固相载具放入烘箱中，烘干温度在35℃至95℃温度范围内，烘干时间为5分钟至3小时（固相载具可用的温度所对应的烘干时间如下表）。其中，优选的烘干温度为50℃，烘干时间为2小时。
温度（℃） 35 50 70 95
时间（小时） 3 2 0.5 5分钟
根据本发明的另一个实施例，进一步包括，所述固相载具为48孔PCR板、96孔PCR板、384孔PCR板、8联管或单个PCR反应管。此处，所述的固相载具是指装载有PCR反应管（孔）的固相载体。
根据本发明的另一个实施例，进一步包括，所述固相载具的各个PCR反应孔内可以添加不同或相同的引物层或引物、探针层。
本发明还包含一种固相载具，包括使用上述方法所制造的带有固化的引物层或引物、探针层的固相载具。
本发明的有益效果是，
（1）本发明的固相载具将引物或引物、探针预先固定在相应PCR管中，使用时只需加入酶混合液（DNA聚合酶与缓冲液的混合液或DNA聚合酶、逆转录酶与缓冲液的混合液）、灭菌水和模板，能大大减轻实验者的劳动负担，减少其工作量，并显著降低实验者将引物、探针加错PCR管位的几率；
（2）本发明的固相载具将引物或引物、探针已固定在相应的PCR管中，使用时不需再向PCR反应孔内加入引物和探针，大大缩短了实验时间和检测周期，能显著提升实验者的工作效率；
        （3）本发明的固相载具将引物或引物、探针已固定在相应PCR管内，引物、探针不再以液体形式存在，在运输与储存过程中不用担心液体溢出，运输与储存非常方便。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。
图1是本发明的固相载具装载多个PCR反应管（孔）结构示意图。
图2是本发明多管固相载具上单个PCR反应管（孔）的切面示意图。
图3是本发明固相载具装载单个PCR反应管结构示意图。
图4是本发明单管固相载具装载的单个PCR反应管切面示意图。
图5（a）、5（b）、5（c）是按本发明实施例方法实验组的单一病毒感染的扩增效果图，实验组举例一组。
图6（a）、6（b）、6（c）是常规定量PCR方法对照组的单一病毒感染的扩增效果图，对照组举例一组。
图中，1、96孔PCR板，2、PCR反应管（孔），3、引物层或引物、探针反应层。
具体说明如下：
1）图5（a）扩增曲线CT=25.31～27.56，为固相载具组的1～14号病例样本检测的呼吸道合胞病毒单次实验的结果图片；
2）图5（b）扩增曲线CT=25.07～28.35，为固相载具组的15～21号病例样本检测的甲型流感病毒单次实验的结果图片；
3）图5（c）扩增曲线CT=25.52～28.15，为固相载具组的22～31号病例样本检测的乙型流感病毒单次实验的结果图片；
6）图6（a）扩增曲线CT=25.08～27.72，为现有定量PCR组的1～14号病例样本检测的呼吸道合胞病毒单次实验的结果图片；
7）图6（b）扩增曲线CT=25.00～28.11，为现有定量PCR组的15～21号病例样本检测的甲型流感病毒单次实验的结果图片；
8）图6（c）扩增曲线CT=25.39～27.99，为现有定量PCR组的22～31号病例样本检测的乙型流感病毒单次实验的结果图片。
具体实施方式
      如图1、2所示，为本发明的一种固相载具结构图，其为96孔（管）PCR反应板，相应的反应管内有按本发明方法固定制成的引物层或引物、探针混合层。图3、图4为本发明另一固相载具单个PCR反应管结构示意图。
      在实验人员需要使用时，将已固定好引物或引物、探针的主题96孔（管）PCR固相载具取出，不需加入PCR引物和探针，只需将酶混合液（DNA聚合酶与缓冲液的混合液或DNA聚合酶、逆转录酶与缓冲液的混合液）、灭菌水和模板（样本DNA或RNA、阴性对照、阳性对照）按比例混匀后，加入至每个PCR管中即可进行PCR反应，使用与操作非常简便。
       下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明。
       实施例：以固定有引物、探针层的96孔PCR固相载具为反应板，以呼吸道病原体检测为例。实验操作流程如下：
一、固相载具的制作：
取普通96孔PCR板，将三种呼吸道感染常见病原体呼吸道合胞病毒（RSV）、甲型流感病毒(FluA)、乙型流感病毒(FluB)的特异性引物和探针（稀释到浓度10-20uM）分别取0.4-1ul加入到相应的PCR管中，每个PCR管加入一种病原体的特异性引物和探针（检测一种病原体。也可在一个PCR管内加入多种引物和探针，在一个PCR管内检测多种病原体，即多重PCR检测。为便于说明本发明的使用和优点，此处单个PCR管只设计检测一种病原体。）。将上述已加入引物和探针的PCR板放入烘箱中，50℃烘干2小时（35℃～95℃均能实现烘干，随温度的变化时间会相应的反向变化），此时，引物和探针会被交联固定在PCR管底部内壁。将上述固定有引物探针的固相载具（PCR板）用膜封闭，4℃保存，备用。该固相载具三种病原体引物探针分布图示如下：
图1  固相载具各管三种病原体特异性引物探针分布图
　 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A RSV FluA FluB RSV FluA FluB RSV FluA FluB RSV FluA FluB
B RSV FluA FluB RSV FluA FluB RSV FluA FluB RSV FluA FluB
C RSV FluA FluB RSV FluA FluB RSV FluA FluB RSV FluA FluB
D RSV FluA FluB RSV FluA FluB RSV FluA FluB RSV FluA FluB
E RSV FluA FluB RSV FluA FluB RSV FluA FluB RSV FluA FluB
F RSV FluA FluB RSV FluA FluB RSV FluA FluB RSV FluA FluB
G RSV FluA FluB RSV FluA FluB RSV FluA FluB RSV FluA FluB
H RSV FluA FluB RSV FluA FluB RSV FluA FluB RSV FluA FluB
二、固相载具定量PCR与目前通用定量PCR方法对三种病原体检测结果比较
1、待检标本：收集31例呼吸道感染病人咽拭子标本（已被临床证明为呼吸道感染病人，具体感染情况见表1），放入约 1ml 生理盐水中，充分洗涤，5000rpm离心6分钟。收集细胞沉淀，提取总RNA，待检。
表1：31例呼吸道感染病人病原体感染情况
样本编号 呼吸道合胞病毒 甲型流感病毒 乙型流感病毒
1-14 阳性 阴性 阴性
15-21 阴性 阳性 阴性
22-31 阴性 阴性 阳性
2、采用本发明制备的固相载具对31例病人核酸标本进行定量PCR检测
A.PCR反应液的配制与加样：将PCR反应酶混液（热启动酶、反转录酶、Mgcl2、dNTP、缓冲液）与每例待检样本核酸按比例混合，灭菌水补足至75ul，制成PCR反应液，吸取25ul加入固相载具上的PCR反应管（孔）内。这样，每例标本共占用三个PCR反应管（孔），检测三种病原体，检测病原体的顺序见上图1，待检标本PCR管分布见下图2。注意：与目前所用的定量PCR方法相比，本环节省去了引物和探针配制环节、引物和探针加样环节，其余步骤与目前所用的定量PCR方法相同。这样，即减少了工作量，又缩短了实验时间，提高了工作效率，并且降低了引物和探针因工作繁忙加错PCR孔位引起的实验出错风险。
图2  96孔固相载具上病例样本和阴性对照摆放位置分布图
  1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A S1 S1 S1 S2 S2 S2 S3 S3 S3 S4 S4 S4
B S5 S5 S5 S6 S6 S6 S7 S7 S7 S8 S8 S8
C S9 S9 S9 S10 S10 S10 S11 S11 S11 S12 S12 S12
D S13 S13 S13 S14 S14 S14 S15 S15 S15 S16 S16 S16
E S17 S17 S17 S18 S18 S18 S19 S19 S19 S20 S20 S20
F S21 S21 S21 S22 S22 S22 S23 S23 S23 S24 S24 S24
G S25 S25 S25 S26 S26 S26 S27 S27 S27 S28 S28 S28
H S29 S29 S29 S30 S30 S30 S31 S31 S31 nc nc nc
上述分布表中，S为sample样本的缩写,S1为1号样本，S2为2号样本，以此类推。检测的3个病原体，检测顺序为：A1，呼吸道合胞病毒；A2，甲型流感病毒；A3，乙型流感病毒。A4～A6孔位为2号样本检测的3个病原体,检测顺序同1号样本。其它，以此类推。H7～H9孔位为阴性对照 (negative control,nc)，检测标本为生理盐水。同上，H7为呼吸道合胞病毒，H8为甲型流感病毒，H9为乙型流感病毒。
B.上机操作：上述实验步骤完成后，将固相载具封好热封膜并置于实时荧光定量PCR仪中，在仪器上调试参数，记录样品摆放顺序，设定反应程序。此步同目前所用的定量PCR。
3、现有通用定量PCR方法对31例病人核酸标本进行检测
A.引物和探针的配制:
1）将合成好的病原体呼吸道合胞病毒（RSV）、甲型流感病毒(FluA)、乙型流感病毒(FluB)的特异性引物和探针，分别离心1000rpm/min，离心2分钟。
2）引物、探针离心后，按引物、探针终浓度100uM 的需要量，分别加入缓冲液，短暂离心使加入的缓冲液全部沉积到PCR管底部，保证引物、探针充分溶解到缓冲液中，室温放置1h，形成母液；
3）分别取呼吸道合胞病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒的上下游引物，从步骤二制备好的100uM母液中各取10ul，再加入10-90ul 缓冲液稀释到10-20uM，形成使用液；
4）分别取呼吸道合胞病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒的特异性探针，从步骤二制备好的100uM母液中各取10ul，再加入10-90ul 缓冲液稀释到10-20uM，形成使用液；
5）取3支1.5ml的离心管，做好标记。计算检测31例样本所需的每种病原体引物和探针的用量，分别向标记好的离心管内加入呼吸道合胞病毒、甲型流感病毒和乙型流感病毒的引物使用液，再分别向三支离心管内加入三种病原体的探针使用液，震荡混匀，形成引物探针混合液。
B．按顺序吸取上述已制备好的三种病原体的引物探针混合液，按上图1中所示的病原体顺序，将之分别加入到96孔PCR板的每个PCR管（孔）中。
C.PCR反应液的配制与加样：将PCR反应酶混液（热启动酶、反转录酶、Mgcl2、dNTP、缓冲液）与每例待检样本核酸按比例混合，灭菌水补足至75ul，制成PCR反应液，吸取25ul加入已分装好三种病原体引物和探针液体的96孔PCR反应管（孔）内。待检标本PCR反应液加入顺序见上图2。
D.上机操作：上述A-C实验步骤完成后，将96孔PCR反应板封好热封膜并置于实时荧光定量PCR仪中，在仪器上调试参数，记录样品摆放顺序，设定反应程序。
4、结果比较
利用本发明制备的固相载具以及现有通用定量PCR方法，按照步骤2、3的方法分别进行三次重复实验。得到的数据结果显示，31例样本检测的3种呼吸道病原体中，待测样本 1～14号感染呼吸道合胞病毒样本的CT值在25.08～28.19之间，15～21号感染甲型流感病毒的样本CT值在25.00～28.89之间，22～31号感染乙型流感病毒的样本CT值在25.37～28.15之间。详细数据见下表2、3、4。
表2 呼吸道合胞病毒阳性样本固相载具与常规定量PCR实验三次重复实验数据
表3 甲型流感病毒阳性样本固相载具与常规定量PCR实验三次重复实验数据
表4 乙型流感病毒阳性样本固相载具与常规定量PCR实验三次重复实验数据
本实施例从以下三个方面分析实验数据：
A.重复性分析：呼吸道合胞病毒病例样本检测中，固相载具三次独立重复实验Ct值标准差为26.31±0.78，常规定量PCR三次独立重复实验Ct值标准差为26.32±0.81；甲型流感病毒病例样本检测中，固相载具三次独立重复实验Ct值标准差为26.79±0.98，常规定量PCR三次独立重复实验Ct值标准差为26.84±1.02；乙型流感病毒病例样本检测中，固相载具三次独立重复实验Ct值标准差为26.57±0.90，常规定量PCR三次独立重复实验Ct值标准差为26.55±0.91。通过标准差分析表明使用固相载具与常规定量PCR方法相比，重复性无明显差别, 使用固相载具的结果重复性似乎略优于常规定量PCR方法。
显著性分析：对每个样本每种病原体三次重复检测得出的Ct值求平均值，这样，每组样本每种病原体均得出一组Ct值的平均值。 用t检验对
固相载具三次独立重复实验得出的一组Ct值的平均值和常规定量PCR方法三次独立重复实验得出的Ct值的平均值进行统计学分析，结果显示呼吸道合胞病毒组P值为0.9，甲型流感病毒组P值为0.58，乙型流感病毒组P值为0.65，P值均大于0.05，表明使用本发明固相载具检测方法与现有定量PCR方法检测效果相同，无显著性差异，固相载具检测方法实验结果同样准确可靠。
C.与常规PCR方法相比，使用固相载具具有非常显著的优点:
1、降低劳动负荷，减少工作量：因为固相载具已将引物探针提前交联固定在PCR孔/管底部，因此省去了实验人员实验前配置引物溶液、探针溶液，制备引物、探针混合液，将引物、探针混合液加入96孔PCR板中的操作。在本实施例中，省去的实验步骤如下：
A.引物和探针的配制:
1）将合成好的病原体呼吸道合胞病毒（RSV）、甲型流感病毒(FluA)、乙型流感病毒(FluB)的特异性引物和探针，分别离心1000rpm/min，离心2分钟。
2）引物、探针离心后，按引物、探针终浓度100uM 的需要量，分别加入缓冲液，短暂离心使加入的缓冲液全部沉积到PCR管底部，保证引物、探针充分溶解到缓冲液中，室温放置1h，形成母液（首次配制引物、探针液，需放置1小时以使之溶解，后续使用不需再放置1小时）；
3）分别取呼吸道合胞病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒的上下游引物，从步骤二制备好的100uM母液中各取10ul，再加入10-90ul 缓冲液稀释到10-20uM，形成使用液；
4）分别取呼吸道合胞病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒的特异性探针，从步骤二制备好的100uM母液中各取10ul，再加入10-90ul 缓冲液稀释到10-20uM，形成使用液；
5）取3支1.5ml的离心管，做好标记。计算检测31例样本所需的每种病原体引物和探针的用量，分别向标记好的离心管内加入呼吸道合胞病毒、甲型流感病毒和乙型流感病毒的引物使用液，再分别向三支离心管内加入三种病原体的探针使用液，震荡混匀，形成引物探针混合液。
B．按顺序吸取上述已制备好的三种病原体的引物探针混合液，按上图1中所示的病原体顺序，将之分别加入到96孔PCR板的每个PCR管（孔）中。
2、缩短实验时间，提高工作效率：以本实施例来说明，常规PCR反应离心引物探针需2分钟；检测3个病原体，需稀释3条探针与6条引物（上游引物、下游引物），约需时间5分钟；取三支离心管做标记，需要2分钟；计算引物、探针用量，配制三种病原体引物、探针混合液约需10分钟；将引物、探针混合液加入相应的孔位，每个孔位需8秒，加完96孔PCR板所需时间约 13分钟。这样，完成一个96孔PCR板引物、探针的稀释、配制和加入约需30多分钟。使用本发明制备的固相载具，在实验时尤其是临床检验时就可以节约30多分钟。对一个三甲医院来说，一天检测的标本往往上百个，检测的病原体多达10余种，就可以节约很多时间。特别地，由于省了很多工作，减少了实验时间，实验人员不用太过匆忙，实验操作会较为从容，这样，实验结果也会更为准确。
3、降低实验出错的几率：针对多病原体、多样本检测时，实验人员往往由于时间和其他方面的原因，实验操作匆忙，导致加样出错率大大增加。如本发明实施例，采用现有的定量PCR方法用一个96孔PCR板对31例病人核酸标本进行检测，相同的样本检测三个病原体，还需要做三次独立的重复试验，那么一个病原体的引物与探针的混合物加入一个96孔PCR板需要重复加入31次，三个96孔PCR板，需要重复加入93次。三个病原体都需要重复加样93次，加样出错率就会大大增加，如把乙型流感病毒的引物和探针错加入甲型流感病毒的检测管内。本发明的固相载具引物、探针已预先固定在PCR管内，能够有效避免因加错孔位而导致数据不真实的几率。
综上所述，本发明方法制备的固定有引物层或引物、探针层的固相载具使用方便、重复性好、实验结果准确可靠。同时，大大减少了实验人员的工作量、缩短了检测周期、降低了实验出错率、提高了工作效率。
上述实施例采用的96孔PCR固相载具，但其它能进行PCR反应的固相载具也能使用，如48孔PCR板、384孔PCR板、8联管或单个PCR管等，此处不应当受到限制。
上述实施例以呼吸道病原体检测为例，但也可以是其它疾病的相关检测如糖尿病、癌症、其它病原体感染检测等，耐药性基因检测如KRAS、EGFR等，重大传染性疾病相关检测如艾滋病、乙肝丙肝、肺结核和手足口病、呼吸道多重病原体检测等，应用范围不应当受到限制。
凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本专利的保护范围之内。
本发明的固定有引物层或引物、探针层的固相载具通量较高、适用检测范围广、检测时间短、重复性好、操作简便，具有良好的应用前景。

Claims (7)

1.一种将引物或引物、探针固定于固相载具用于PCR的方法，其方法如下：
步骤一、引物或引物、探针按相关主题溶解：引物、探针合成后，按引物、探针终浓度100uM 的需要量，加入缓冲液，短暂离心使加入的缓冲液全部沉积到PCR管（孔）底部，保证引物、探针充分溶解到缓冲液中，室温放置1h，形成母液；
步骤二、在无菌实验室里，将上下游引物分别从步骤一的100uM母液中取出10ul分装，再加入10-90ul 缓冲液稀释到10-50uM，形成使用液，4℃保存备用，根据进行的单重或者多重PCR反应需要，将该使用液加入固相载具的PCR反应管（孔）中；
其特征是：
步骤三、将已加入引物或引物、探针的固相载具放入烘箱中，直至将加入的液体水分蒸干，加入的引物或引物、探针即被贴壁固定，此时即形成固化的引物层或引物、探针层；
步骤四、将带有固化的引物层或引物、探针层的固相载具用膜封板，4℃保存，以待备用。
2. 根据权利要求1所述的将引物或引物、探针固定于固相载具用于PCR的方法，其特征是，所述步骤三中将已加入引物或引物、探针的固相载具放入烘箱中，该烘箱为普通烘箱或其它形式的加热烘干器具。
3. 根据权利要求1所述的将引物或引物、探针固定于固相载具用于PCR的方法，其特征是，所述步骤三中将已加入引物或引物、探针的固相载具放入烘箱中，烘干温度在35℃至95℃温度范围内，烘干时间为5分钟至3小时。
4. 根据权利要求3所述的将引物或引物、探针固定于固相载具用于PCR的方法，其特征是，所述烘干温度优选为50℃，烘干时间优选为2小时。
5.根据权利要求1所述的将引物或引物、探针固定于固相载具用于PCR的方法，其特征是，所述固相载具为48孔PCR板、96孔PCR板、384孔PCR板、8联管或单个PCR反应管。
6.根据权利要求1所述的将引物或引物、探针固定于固相载具用于PCR的方法，其特征是，所述固相载具的各个PCR反应管（孔）内可以添加不同或相同的引物层或引物、探针层。
7.一种固相载具，其特征是，使用上述权利要求1所制造的带有固化的引物层或引物、探针层的固相载具。
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