CN104258474A - 一种含有离子交换功能基团的栓塞微球 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种含有离子交换功能基团的栓塞微球的制备,将2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸(AMPS)制备成轻度交联预聚物,然后与海藻酸钠(SA)共混,将PAMPS与SA共混聚合物溶液加入到液体石蜡中,通过反相悬浮交联法制备而成的互穿网络聚合物微球,微球呈现规整球形,粒径集中分布在300微米到700微米之间,微球的载药量可达25%~45%,高温灭菌密封后性能稳定,具有抗肿瘤栓塞化疗的应用前景。
Description
技术领域
本发明公开了一种含有离子交换功能基团的栓塞微球的制备,属于医用材料制备领域。
背景技术
海藻酸钠(SA)是由D-苷露糖醛酸和D-古洛糖醛酸组成的天然多糖,具有生物相容性好,无毒性,可降解等特点。其中古洛糖醛酸极易与Ca2+、Ba2+等金属二价离子形成静电作用,交联得到海藻酸钠微球。基于以上特点海藻酸钠被广泛应用于食品与医药行业中。
传统经动脉化疗栓塞治疗中晚期肝癌的疗效已经得到公认。栓塞剂经导管注射进入肝动脉后会堵塞癌细胞周围的毛细血管,阻断血液中的养分供应,从而导致肿瘤坏死。众所周知,阿霉素是目前肿瘤化疗中最常用的抗癌药物,但其在给药量较高时,会表现出严重的副作用。
传统的血管栓塞剂多数不能负载化疗药物,只能起到物理栓塞的目的,在临床应用中有一定的局限性,近年来虽然国内外文献相继报道了一些载药微球,但是大部分都通过物理包埋负载药物,存在载药量少,制备工艺繁琐等弊端,目前在美国,唯一市售的载药洗脱微球是不可生物降解的DC bead,由PVA水凝胶组成。另一个不可降解药物洗脱微球名为Quadrasphere,在欧洲和日本有售。因此研发生物降解的药物洗脱微球,提高药物的负载率和载药速度,减少药物在输送过程中的泄露,对于提高栓塞效果非常重要。
发明内容
本发明以海藻酸钠(SA)和2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸(AMPS)为原料,用戊二醛和聚乙二醇双甲基丙烯酸酯分别对SA和聚(2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸)进行交联,采用悬浮交联的方法制备了栓塞微球,微球粒径分布在100μm和900μm之间,集中分布在300~700μm。对栓塞微球的功能基团进行活化,通过微球中(-COOH)和(-SO3H)的氢质子与盐酸阿霉素的氨基发生离子交换作用来负载药物,提高了微球的载药率,可达到25%~45%,共聚焦显微镜显示阿霉素主要集中在微球外部表层20±5μm。本发明微球可以用于血管栓塞剂,具有生物相容性好,载药量较大,生物可降解性等优点;微球在121℃高温灭菌15分钟后密封放置12个月后仍能保持外观圆整,分散性好,彼此间无粘连的特点,微球制备容易工业生产,可以应用到抗肿瘤栓塞化疗领域。
本发明的有益效果:
(1)提供一种新型可降解性含离子交换功能基团的栓塞微球的制备方法。通过微球中具有离子交换功能基团的-SO3H和-COOH的离子交换作用负载阿霉素药物,使药物快速负载到微球上,可以达到较高的载药量,并有良好的稳定性。
(2)通过分步交联法合成了含有离子交换功能基团的栓塞微球,简化了微球的制备方法,便于工业生产。
(3)合成的微球干燥后不会塌陷,解决了一般文献中SA微球干燥后容易塌陷变形的问题,且高温灭菌后容易密封保存,具有良好的稳定性。
(4)微球生物相容性好,在药物释放过程中具有缓释效果。
附图说明
图1含离子交换功能基团的栓塞微球的粒径分布;
图2微球在不同介质中的溶胀率;a、pH=7.4的PBS缓冲溶液;b、0.9%的NaCl溶液;c、pH=5.0的缓冲溶液;d、5%的CaCl2溶液;e、超纯水;
图3含离子交换功能基团的栓塞微球的载药动力学曲线;a、b、c、d分别表示粒径在100~300、300~500、500~700、700~900(μm)区间的样品载药动力学曲线;
图4a、b、c、d分别为微球121℃高温灭菌15分钟后密封放置3、6、9、12个月后微球的形态;
具体实施方式
实施例1:含有离子交换功能基团的栓塞微球的制备
(1)合成聚2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸预聚物,将0.5g的AMPS溶于去离子水中形成0.5w%的水溶液,添加聚乙二醇双甲基丙烯酸酯(0.065w%)作为轻度交联试剂,过硫酸钾(0.020w%)为引发剂,搅拌溶解并混合均匀,水浴加热升温到70℃,反应5小时,形成粘流状预聚物,将该预聚物溶液滴入到乙醚溶液中沉淀,经过反复三次溶解-重沉淀,最后真空干燥得到纯净聚合物PAMPS;
(2)制备共混聚合物溶液,将海藻酸钠溶解在去离子水中形成1.5w%的溶液,将纯净聚合物PAMPS加入到去离子水中形成2w%的溶液,按照PAMPS与SA质量比为1:1~1:8将两组分混合,加热到50℃搅拌数小时,使组分充分混合均匀;
(3)制备互穿网络聚合物微球,将PAMPS与SA共混聚合物溶液加入到液体石蜡中,共混聚合物溶液与液体石蜡油的体积比为1:5,加入2w%司班80为乳化剂,高速搅拌3小时形成微悬浮体系,然后以2:1体积比的去离子水和乙醇为溶剂配制10w%的戊二醛溶液,缓慢滴加到反应体系中,恒温25℃搅拌,交联反应3~5小时,微球初步形成,再将反应体系升温到80℃,同时减压抽除乙醇和部分水分,熟化反应2小时,再经过破乳、抽滤、洗涤、液氮冷冻再抽真空干燥制得栓塞微球。
实施例2:栓塞微球离子交换基团的活化
将实施例1制备得到的栓塞微球干燥后,重新浸泡在8~10w%的盐酸溶液中搅拌半小时,将微球过滤,用去离子水反复浸泡、洗涤除尽残留盐酸,真空干燥制得最终产品。
实施例3:微球的光学显微镜图片和粒径分布
取干燥后的含有离子交换功能基团的栓塞微球于载玻片上,调节光学显微镜的放大倍数,使得一个视野中有尽可能多的微球,对微球的表面形貌进行观察,进一步准确测量微球的粒径大小,观察其分布趋势。
实施例4:微球的扫描电镜分析
微球的SEM分析将微球用超薄切片沿中心切开,切面部位向上粘在附有两面胶的样品台上,对样品表面进行喷金处理,扫描电镜加速电压调至1kV,高真空条件下观察微球的表观形貌和切面结构。
实施例5:微球的溶胀性能测试
称取过筛干燥后的微球5份,分别加入到等体积的5种介质(pH=7.4的PBS溶液、pH=5.0的PBS溶液、0.9%的生理盐水、5%的CaCl2溶液、超纯水),置于恒温水浴振荡器中,保持温度在37±0.5℃。每次取样前用滤纸吸干微球表面的缓冲液,在2h内,每隔10min称量样品的质量,计算样品的溶胀率,
实施例6:不同粒径微球载药动力学曲线
称取粒径在100~300μm、300~500、500~700μm、700~900μm区间内的微球各10mg,分别置于4份含有5ml浓度为2mg/ml的阿霉素溶液中,超声振荡;分别在1min、5min、10min、20min、30min、1h、4h、8h、12h、24h、48h后测定样品在483nm处的吸光度,计算微球的载药量。
实施例7:微球对不同类型药物的载药动力学研究
称取粒径在300~500μm的微球各20mg,分别放入浓度(2mg/ml)与体积(6mL)相同的阿霉素溶液和姜黄素乙醇溶液中,分别在1min、5min、10min、20min、30min、1h、4h、8h、12h、24h、48h后测定样品的吸光度,计算微球的载药量。
实施例8:微球在不同浓度的盐酸阿霉素溶液中的载药率和包封率
称取干燥的10mg互穿网络聚合物微球6份,另取相同份数相同质量的湿态的互穿网络聚合物微球(高温灭菌后密封保存在5%的CaCl2水溶液中),分别置于浓度为0.1mg/ml、0.25mg/ml、0.5mg/ml、0.75mg/ml、1mg/ml、2mg/ml的阿霉素水溶液中。磁力搅拌,测定样品在483nm处的吸光度,计算微球的载药率和包封率。
实施例9:微球内部阿霉素的分布
取若干个载药微球于乙醇浸泡过的载玻片上,滴加少量清水使微球均匀分散开,盖玻片周围密封,使用德国徕卡公司的TCS SP8型激光共聚焦显微镜,氩离子光源,激发波长为488nm,对微球表层部分由外向内每隔10μm逐层拍照,观察荧光强度与药物分布。
实施例10:微球的稳定性测试
称取一定质量的微球置于装有5%的CaCl2溶液的样品瓶中,121℃高温灭菌后密封保存,分别在不同时间点用超景深三维光学显微镜对微球灭菌前后的形态进行观察记录。
实施例11:微球的降解性能分析
选取实验制的微球的几个,加入到pH=7.4的PBS溶液中,置于恒温水浴振荡器中,保持温度在37±0.5℃,选取不同时间点分别对微球的降解情况进行跟踪记录。
实施例12:微球的细胞毒性测定
将1克微球用10毫升0.9%氯化钠生理盐水浸泡24小时,分离滤液做细胞毒性分析。用10%的MCDB细胞培养液将细胞配成浓度为6×103个/mL的细胞悬浮液,每孔150μL接种于3个96孔培养板,置于37℃、5%CO2培养箱中培养24h。吸出每孔中的原培养液,每孔加入150μL的阴性对照液(10%MCDB培养基)、阳性对照液(0.64%苯酚培养基)、样品溶液,置于37℃、5%CO2培养箱中培养,3块板分别培养1天、2天、3天,每组设6个平行孔。取出培养板通过倒置显微镜观察、评价细胞生长状况。倒出培养液,每孔加入200μL10%TCA固定液,在4℃固定40min。弃固定液,去离子水洗涤,晾干。每孔加入100μL0.4%SRB染色液,37℃染色30min。弃染色液,去离子水洗涤,晾干。每孔加入150μL10mmol/LTris,于酶标仪上540nm处震荡,测定每孔的吸光度OD值。计算细胞相对增值率,评价样品毒性等级,细胞毒性为零级。
Claims (5)
1.一种含有离子交换功能基团的聚合物栓塞微球,其特征是由轻度交联的聚2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸(PAMPS)与海藻酸钠(SA)为成分形成的聚合物共混体系、通过反相悬浮交联法制备而成的互穿网络聚合物微球,外观呈白色,彼此之间无粘连,微球呈现规整球形,粒径集中分布在300~700(微米)之间,PAMPS与SA质量比为1:1~1:8,离子交换功能基团磺酸基和羧基的总含量为4.2~5.0毫摩尔/克。
2.权利要求1所述的一种含有离子交换功能基团的聚合物栓塞微球的制备方法,其特征是制备分三步进行:
(1)合成轻度交联的聚2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸预聚物,将AMPS溶于去离子水中形成0.25w%~0.5w%的水溶液,添加聚乙二醇双甲基丙烯酸酯(0.04~0.065w%)作为轻度交联试剂,过硫酸钾(0.010~0.020w%)为引发剂,搅拌溶解并混合均匀,水浴加热升温到70℃,反应5小时,形成粘流状预聚物,将该预聚物溶液滴入到乙醚溶液中沉淀,经过反复三次溶解-重沉淀,最后真空干燥得到纯净聚合物PAMPS;
(2)制备共混聚合物溶液,将海藻酸钠溶解在去离子水中形成1.5w%的溶液,将纯净聚合物PAMPS加入到去离子水中形成2w%的溶液,按照PAMPS与SA质量比为1:1~1:8将两组分混合,加热到50℃搅拌数小时,使组分充分混合均匀;
(3)制备互穿网络聚合物微球,将PAMPS与SA共混聚合物溶液加入到液体石蜡中,共混聚合物溶液与液体石蜡油的体积比为1:4~1:7,加入2w%司班80为乳化剂,高速搅拌3小时形成微悬浮体系,然后以2:1体积比的去离子水和乙醇为溶剂配制10w%的戊二醛溶液,缓慢滴加到反应体系中,恒温25℃搅拌,交联反应3~5小时后微球初步形成,再将反应体系升温到80℃,同时减压抽除乙醇和部分水分,熟化反应2小时,再经过破乳、抽滤、洗涤、液氮冷冻再抽真空干燥制得栓塞微球。
3.一种提高栓塞微球离子交换容量的方法,其特征是按照权利要求2所述的方法制备得到栓塞微球后,将干燥后的栓塞微球重新浸泡在8~10w%的盐酸溶液中搅拌半小时,活化离子交换功能基团,将微球过滤,用去离子水反复洗涤除尽残留盐酸,真空干燥制得最终产品。
4.权利要求1所述的含有离子交换功能基团的栓塞微球对于含有正电荷药物的负载方法,其特征是将该干燥的栓塞微球浸泡在浓度为1.5~2毫克/毫升、温度为37℃的盐酸阿霉素水溶液中,间歇超声振荡,通过微球中具有离子交换功能基团的-SO3H和-COOH与盐酸阿霉素的离子交换作用,使药物快速负载到微球上,微球的载药量可达25%~45%。
5.权利要求1所述的一种含有离子交换功能基团的栓塞微球作为抗肿瘤栓塞剂的应用,其特征在于微球的生物相容性好、无细胞毒性、121℃高温灭菌15分钟后密封放置12个月后 仍能保持外观圆整,分散性好,彼此间无粘连的特点,微球制备容易工业生产,可以应用到抗肿瘤栓塞化疗领域。
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