CN104256403A - 一种富含维生素k2(mk-7)淡豆豉制作方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种富含维生素K2（MK-7）淡豆豉制作方法，采用大豆为原料，在传统淡豆豉工艺的环节中，大豆用自来水浸泡改为营养液浸泡，发酵利用自然菌种改为添加淡豆豉粉，再接种纳豆芽孢杆菌及枯草杆菌种子液，按传统自然发酵工艺制得淡豆豉。采用烃和脂肪酸酯的各至少一种组成混合溶剂先提取；其滤渣再采用醇与醚的各至少一种组成混合溶剂提取；继而采用烃和脂肪酸酯的各至少一种组成混合溶剂纯化；醇及醚的各至少一种组成混合溶剂进行结晶，能有效地得到高纯度的维生素K2（MK-7），纯度≥97%。以淡豆豉（干物）计，每千克淡豆豉中维生素K2（MK-7）收率在41~44.78mg之间，比传统淡豆豉中维生素K2（MK-7）高约8倍，具有较好的应用前景及商业价值。

Description

一种富含维生素K2(MK-7)淡豆豉制作方法
技术领域
本发明涉及一种富含维生素K2（MK-7）淡豆豉制作方法，具体为通过传统淡豆豉工艺改进制得富含维生素K2（MK-7）的淡豆豉，并能从中提取，纯化，结晶得到高纯维生素K2（MK-7），属食品发酵及生物提取技术领域。
背景技术
维生素K2（又称MK-7）是β-甲萘醌第3碳位带上有7个异戊二烯基团的脂溶性，黄色结晶性粉末。其结构如下：
研究显示，动物体内具有生物活性的维生素K2，而维生素K1、维生素K3都需要转化为维生素K2才起作用。维生素K2具有多种生理功能，如预防肝硬化进展为肝癌；促进凝血酶原形成，促进凝血；防治骨质疏松症；降低血压等多种医疗保健价值。
维生素K2家族根据萘醌的第3碳位上侧链异戊二烯个数不同分为14个类型。而具有7个异戊二烯侧链的甲萘醌维生素K2（35）又称MK-7是生理活性较高，使用较广的一种。而维生素K2（MK-7）其侧链含有7个异戊二烯，若用天然原料合成复杂，步骤多，难度较大，且异构体较多。侧链再与甲萘醌进一步合成维生素K2（MK-7）成本较高，使其广泛使用受到限制。有证据不断证明维生素K2（MK-7）大量存在于纳豆中，而纳豆中维生素K2（MK-7）是人体需要的全反式结构，不存在异构体物质，具有良好的安全性。
日本使用纳豆最早，纳豆也是日本的传统食品。据文献报道，日本纳豆，每100g含4700μg维生素K2（MK-7）。有的文献报出，每100g纳豆中含维生素K2（MK-7）高达8700μg
豆豉是我国的传统食品，已有2000多年的悠久历史。我国豆豉唐代传入日本，今天日本的纳豆与我国豆豉同属姐妹，但我国豆豉是在大豆经发酵成淡豆豉后，加入食盐，高盐豆豉，限制了食用量，也限制了豆豉中的重要的生理物质——维生素K2（MK-7）的摄入。豆豉仅仅起到了调味及少量的营养作用。
虽然近年来我国在豆豉的功能研究上取得了一定的进展，如张健华，李里特等提取的“豆豉水解物对α-葡萄糖甘酶有较好的抑制活性”；邹磊，汪立君等“豆豉提取物对乙酰胆碱酯酶有的抑制能力”；阚建全，陈宗道等“豆豉的非透析类黑精抗氧化和抑制亚硝胺的合成研究”；张炳文，蔺新英等“细菌性豆豉提取物抗凝血作用的初步研究”等。上述文献提及的从豆豉中提取的具有生理作用的物质仅属于混合物类，距离国外，尤其是日本，提纯到具有明确的分子结构及功能作用的单体或化合物还有较大差距。在这方面日本已将纳豆中的纳豆激酶，纳豆纤溶酶，维生素K2等提纯到单体化合物，并进入动物、临床试验，以至作为医药保健原料。在我国以淡豆豉提取维生素K2，尚未见报道。制备富含维生素K2（MK-7）的淡豆豉，并从中提取得到具有商业价值的高品质维生素K2（MK-7），至今国内外也尚未见文献报道。
我国传统淡豆豉，其制作工艺，在大豆浸泡步骤一般采用饮用水浸泡，缺乏足够的微生物发酵所需的营养物。菌种靠空气中的自然菌（霉菌及酵母等菌）不加入专一的发酵菌种。虽然采取自然发酵这一较好的发酵方式，但维生素K2（MK-7）产率较低。据玉溪健坤生物药业有限公司实验室对当地传统市售的豆豉检测，结果表明维生素K2（MK-7）5mg/kg左右，不具备商业提取价值。
发明内容
本发明目的是提供一种富含维生素K2（MK-7）淡豆豉制作方法，并从中提取，纯化，结晶得到高纯度（≥97%）的维生素K2（MK-7）产品，以作为医药及保健原料。
本发明更进一步提供维生素K2（MK-7）晶体，性状为淡黄色，纯度≥97%。进一步提供维生素K2（MK-7）检测方法，以确保所得产品的质量。
本发明一种富含维生素K2（MK-7）淡豆豉制作方法，其特征是该方法包含使用营养液浸泡大豆；用淡豆豉粉、纳豆芽孢杆菌种子液、枯草杆菌种子液接种，经自然发酵得到富含维生素K2（MK-7）的淡豆豉。
浸泡大豆的营养液制备包含选择含维生素K1的新鲜蔬菜至少一种，取汁，计重，分别加入多元醇至少一种，钠盐至少一种，糖至少一种混溶，用水稀释至20~50%浓度。
其中多元醇，钠盐和糖与蔬菜汁的重量比分别为2~5%、0.1~0.4%、1~4%。
其中大豆为破碎、脱壳的大豆，营养液浸泡量为脱壳大豆重量的3倍，常温浸泡24小时。
用于接种的淡豆豉粉是选用淡豆豉至少一种，自然风干，粉碎过程是在避光的状况下进行。
其中淡豆豉粉碎前水分≤5%，粉碎后装袋，封口，0℃保存备用。
其中纳豆芽孢杆菌种子液，枯草杆菌种子液包含种子液培养基配方组成及制备。
纳豆芽孢杆菌种子液配方组成：牛肉膏5g，蛋白栋5g，葡萄糖5g，氯化钠2g，蔗糖8g，磷酸二氢钾1g，蒸馏水1000ml，PH为7.0；枯草杆菌种子培养液配方组成：牛肉膏5g，蛋白栋6g，葡萄糖5g，氯化钠3g，蔗糖8g，磷酸二氢钾 1.5g，硫酸锰6mg，蒸馏水1000ml，PH为7.0。
纳豆芽孢杆菌种子液，枯草杆菌种子液制备过程是将上述两种配方分别混溶，分别在110~120℃，消毒1小时，放冷至25℃，分别接种活化的纳豆芽孢杆菌，活化的枯草杆菌，然后，分别在30℃、37℃，厌氧发酵24小时，0℃保存。
根据权利要求9的方法，其特征是活化的纳豆芽孢杆菌，活化的枯草杆菌是将纳豆芽孢杆菌菌种、枯草杆菌菌种按菌种提供者分别给定的固体活化培养基及培养条件制得。
其中使用的纳豆芽孢杆菌、枯草杆菌各至少一种作为菌种。
接种发酵包含：在破碎脱壳大豆，经营养液浸泡24小时，再在90~100℃蒸煮30~40分钟，放冷至约30℃时，接种淡豆豉粉、纳豆芽孢杆菌种子液、枯草杆菌种子液。接种量以破碎脱壳大豆重量计，每100g加入2~5g淡豆豉粉，10g纳豆芽孢杆菌种子液，10g枯草杆菌种子液，装笼，约30℃保温，自然发酵72~96小时，放冷至常温，得富含维生素K2（MK-7）的淡豆豉。
其中将制得的富含维生素K2（MK-7）的淡豆豉，避光，自然风干，控制水分不高于12%，在0℃保存，一部分用于制备含维生素K2（MK-7）的淡豆豉粉，其余作为提取维生素K2（MK-7）的原料。
本发明从富含淡豆豉中提取、纯化和结晶得到维生素K2（MK-7）方法，其特征是以富含淡豆豉为原料，包括提取使用烃及脂肪酸酯各至少一种作为混合溶剂先提取，再使用醇和醚的各至少一种组合成混合溶剂再提取，继而使用烃及脂肪酸酯的各至少一种作为纯化混合溶剂进行纯化，再使用醇和醚至少一种作为混合溶剂进行结晶，上述混合溶剂能有效地提取、纯化、结晶得到高纯度维生素K2（MK-7）。
上述先后两次用于提取富含维生素K2（MK-7）的淡豆豉中维生素K2（MK-7）的混合溶剂量均是淡豆豉的7~8倍。
提取使用的烃与脂肪酸酯的各至少一种组成混合液的重量比是10∶1~3；使用的醇与醚的各至少一种组成混合液的重量比是10∶2~4，先后使用混合溶剂液分别提取次数为3~4次。
提取是采用超声振荡30分钟，经离心分离，提取液分别经减压浓缩，挥去溶剂后合并提取浓缩物，称重，以此用于纯化时硅胶的计重。
纯化包含选自烃和脂肪酸酯各至少一种组成混合溶剂，借助硅胶柱层析纯化提取的维生素K2（MK-7），其硅胶的用量是提取浓缩物重量的4~4.5倍（其中3倍量用于分离，1~1.5倍量用于拌样）。
其中纯化混合溶剂所用烃和脂肪酸酯的重量比是100∶1，借助TLC检测控制维生素K2（MK-7）质量。
其中TLC是2×5cm G硅胶板，用于TLC跑板的一种烃与一种脂肪酸酯的混合溶剂体积比是100∶2~10，借助碘显色。
其中收集含维生素K2（MK-7）的柱层析洗脱液，减压浓缩。浓缩温度控制在60~80℃之间，所得含维生素K2（MK-7）的纯化物应避光，25℃保存。
所述结晶方法包含使用选自醇和醚的各至少一种组成混合溶剂，使维生素K2（MK-7）从纯化物中结晶或重结晶，其使用的混合溶剂量是含维生素K2（MK-7）纯化物重量的8~10倍。
其中使用醇和醚中的各至少一种组合成混合溶剂时，醇与醚的组合重量比为10∶1~3。
其中杂质被消除在母液中，杂质为除维生素K2（MK-7）外的物质。
其中维生素K2（MK-7）的结晶是按照冷却结晶的方式进行。
其中结晶步骤中的冷却温度不高于25℃，结晶是在静态完成的。
其中结晶浓度以结晶完成时，维生素K2（MK-7）的重量与结晶溶剂的重量比不高于20%。
其中得到维生素K2（MK-7）结晶，其纯度≥97%。
该发明方法包含使用浸泡大豆的营养液制备；淡豆豉粉制备；纳豆芽孢杆菌种子液制备、枯草杆菌种子液制备。其过程是将破碎脱壳大豆，经营养液浸泡，蒸煮，接种，自然发酵制得富含维生素K2（MK-7）的淡豆豉。
该方法包括使用烃和脂肪酸酯各至少一种组成混合溶剂先提取；在选用醇及醚的各至少一种组成混合溶剂再提取；使用烃及脂肪酸酯各至少一种组成混合溶剂进行纯化；使用醇及醚各至少一种组成混合溶剂进行结晶得到维生素K2（MK-7）。
本发明的一种富含维生素K2（MK-7）淡豆豉制作方法，制作简便，提取成本低，所得维生素K2（MK-7）纯度高，具有较好的商业利用前景及价值。
具体实施方式
发明人对具有重要生理功能的维生素K2（MK-7）进行了广泛研究，结果发现，当将传统淡豆豉制作，用水浸泡环节改为用营养液浸泡时，维生素K2（MK-7）产率有明显增加；将传统淡豆豉发酵时不接种菌种改为使用营养液浸泡，再接种淡豆豉粉、纳豆芽孢杆菌和枯草杆菌菌种子液，经自然发酵得到淡豆豉。将所得的淡豆豉再用不同混合溶剂提纯，结晶后，得到高纯度的维生素K2（MK-7）。欣喜发现，维生素K2（MK-7）产率显著增加，具有巨大的商业价值及应用前景，基于此发现完成了此发明。
下面详细描述本发明。
一、富含维生素K 2 （MK-7）的淡豆豉制备
富含维生素K2（MK-7）的淡豆豉是本发明获得具有商业价值的高纯维生素K2（MK-7）的原料。本发明与传统淡豆豉制作工艺不同之处是用营养液浸泡大豆替代传统淡豆豉用水浸泡；经蒸煮后，接种淡豆豉粉（种曲），再接种纳豆芽孢杆菌、枯草杆菌种子液，这与传统淡豆豉靠自然菌相比所得淡豆豉含维生素K2（MK-7）显著提高。
（1）、用于浸泡大豆的营养液制备
作为浸泡是将精选的经过破碎脱壳大豆，称重。用此（脱壳大豆）重量3倍量20~50%浓度的营养液在常温下浸泡24小时。
作为营养液制备是先选择食用含维生素K1的蔬菜中的至少一种掏碎，过滤，取汁，称重。按每100g计分别加入2~5%的至少一种多元醇，0.1~0.4%的至少一种钠盐和1~4%的至少一种糖混溶后，加水按百分浓度配成。20~50%浓度的营养液。
作为营养液成分之一的蔬菜汁是选择含维生素K1的新鲜蔬菜，其品种是没有限制的。作为选择可提到的蔬菜中品种有瓜类，如：冬瓜、西葫芦、南瓜、苦瓜、绿茄子、番茄、青椒、龙辣椒、甜椒；有茎类，如：莴笋茎、芹菜、绿色芹菜等；有根类：如，萝卜、胡萝卜；有花类，如，白兰花、油菜花、西兰花等；有豆类，如：白芸豆、黄豆芽、绿豆芽、黑豆芽、豌豆、雪豆、龙芸豆、豇豆等；有蒜类，如：洋葱、蒜苔、韭菜茎、嫩葱、大蒜苗；有菜叶类，如：中国大白菜、中国小白菜、卷心菜、茼蒿、茴香、生菜、油菜、莴笋叶、萝卜缨（萝卜叶）、菠菜、生菜、韭葱、香菜、绿色芹菜叶等；有野生蔬菜，如菊苣、蒲公英、荠菜等。优选花类、瓜类和菜叶类，更优选花类和菜叶类。
作为实例选择，优选的是西兰花、莴笋叶、萝卜缨（萝卜叶）、菊苣、菠菜、生菜、韭葱、黑豆芽、香菜、绿色芹菜叶、蒲公英、荠菜，更优选的是西兰花、莴笋叶、绿色芹菜叶、蒲公英、波菜。
作为营养液组成的另一成分之一是加入多元醇中的至少一种，其选择是没有限制的，可以提到的如1,2-乙二醇，1,2丙二醇，1,3-丙二醇，1,2-丁二醇，1,3-丁二醇，1,2,3-丙三醇（甘油）木糖醇、山梨醇、甘露醇。
作为优选使用可提到的如：1,2丙二醇，1,2,3-丙三醇，木糖醇，甘露醇，山梨醇。更为优选使用，1,2,3-丙三醇（甘油）在营养液中的加入量，在特定实例中是以蔬菜汁重量计重，每100g汁中加入2~5g。
作为营养液组成的又一成份之一是加入至少一种钠盐。
作为钠盐选择是没有限制的，可提到的钠盐，如：氢化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、食品酸式焦磷酸钠、食品级三聚磷酸钠、食品焦磷酸钠、食品级磷酸钠、食品级六偏磷酸钠等。
作为优选使用可提到的，如：磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、食品焦磷酸钠。
更为优选使用磷酸氢二钠，作为钠盐中的至少一种加入量是以蔬菜汁计重，每100g蔬菜汁中加入0.1~0.4g。
作为营养液的另一成份之一的是加入至少一种糖，其选择是没有限制的。作为选择的糖可提到的，如：蔗糖、甜菜糖、麦芽糖、低聚果糖、甜叶菊糖、低聚木糖，低聚甘露糖、低聚半乳糖、低聚乳果糖、大豆低聚糖、低聚纤维糖、低聚异麦芽酮糖、葡萄糖等。
作为特定实例中可优选使用的糖，如：蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、甜菜糖。
更优选使用，蔗糖，葡萄糖
作为糖的至少一种在营养液中的加入量在特定实例中是以蔬菜汁，计重，每100g蔬菜汁中加入1~4g。
（2）、使用淡豆豉粉作为种曲接种
用于接种的淡豆豉粉，其原料淡豆豉是没有限制的。作为选择使用可以提到的，如易门淡豆豉、通海淡豆豉、澄江淡豆豉及本发明制作的富含维生素K2（MK-7）的淡豆豉等。
优选使用易门淡豆豉、通海淡豆豉和本发明制作的富含维生素K2（MK-7）的淡豆豉。
更优选使用本发明制作的富含维生素K2（MK-7）淡豆豉。
淡豆豉粉制备是将淡豆豉在阴暗处避光环境下，自然风干至水分≤5%时，进行粉碎，粉碎目数没有限制。将粉碎的淡豆豉粉用铝塑复膜袋装袋，封口，在0℃保存备用。整个过程应避光操作。
淡豆豉粉接种量是以破碎脱壳大豆重量计，每100g破碎脱壳大豆加入2~5g淡豆豉粉。
（3）、使用纳豆芽孢杆菌及枯草杆菌种子液接种
作为用于接种的纳豆芽孢杆菌种子液、枯草杆菌种子液是用纳豆芽孢杆菌及枯草杆菌，经过种子培养而得到的，而纳豆芽孢杆菌和枯草杆菌，其选择是没有限制的，可以自己选育，也可从其它渠道或从中国工业微生物菌种保藏管理中心（China Center of Industrial Culture Collection, CICC）购买。
作为购买使用选择可提到的，如：10023纳豆芽孢杆菌，10260纳豆芽孢杆菌，10261纳豆芽孢杆菌，10262纳豆芽孢杆菌，10263纳豆芽孢杆菌，20132纳豆芽孢杆菌，20443纳豆芽孢杆菌，20444纳豆芽孢杆菌，20637纳豆芽孢杆菌，10446枯草杆菌，10455枯草杆菌，10454枯草杆菌，10455枯草杆菌，10456枯草杆菌，10457枯草杆菌，10458枯草杆菌10459枯草杆菌，10460枯草杆菌，10461枯草杆菌等。
作为使用可优选的，纳豆芽孢杆菌、枯草杆菌，如1023纳豆芽孢杆菌、10260纳豆芽孢杆菌、10457枯草杆菌、10453枯草杆菌。
更优选使用的是10260纳豆芽孢杆菌、10453枯草杆菌作为菌种。
作为特定实例，本发明所用的纳豆芽孢杆菌种子液培养基配方组成和制备是牛肉膏5g，蛋白栋5g，葡萄糖5g，氯化钠2g，蔗糖8g，磷酸二氢钾1g，蒸馏水1000ml。将上述配方物料装入三角烧瓶混溶后，密封，经120℃ 1小时灭菌消毒，放冷至25℃，在无菌操作环境下接种纳豆芽孢杆菌（CICC编号：10260），固体活化菌种在30℃，静置培养24小时后，0℃冰箱保存。
纳豆芽孢杆菌（CICC编号：10260）菌种，购买时CICC提供的固体活化培养为CMO336豆芽汁蔗糖培养基，其配方是豆芽汁100.0ml，蔗糖5.0g，琼脂1.5~2.0g，自然PH。[注] 豆芽汁的制作：大豆芽500g（用芽即可），加水2500ml，煮沸浓缩至约1000ml时，过滤待用。
培养温度：30℃，培养时间1~2天。
作为本发明的枯草杆菌种子液培养基配方组成和制备是：牛肉膏5g，蛋白栋6g，葡萄糖5g，氯化钠3g，蔗糖8g，磷酸二氢钾1.5g，硫酸锰6mg，蒸馏水1000ml，pH为7.0。将上述配方物料装入三角烧瓶混溶，密封，经120℃ 1小时灭菌消毒，放冷至25℃，在无菌操作环境下接种枯草杆菌（CICC编号：10453），固体活化菌种培养在37℃，静置培养24小时后，存放于0℃冰箱保存。
枯草杆菌固体活化培养基购买菌时，CICC提供的培养基为CM0002营养肉汁琼脂，配方为蛋白栋5.0g，牛肉浸取物3.0g，氯化钠5.0g，琼脂15.0g，蒸馏水1000mL，pH7.0，培养温度37℃，培养时间1~2天。
（4）、富含维生素K 2 （MK-7）淡豆豉的制备操作
作为富含维生素K2（MK-7）的淡豆豉发酵是将精选的大豆，经过破碎成瓣，脱壳后，称重。用3倍大豆重量的20~50%浓度的营养液在室温下，浸泡24小时，滤除浸泡液，在经90~100℃蒸煮40分钟，放冷至约30℃。以脱壳大豆重量计，每100g加入2~5%的淡豆豉粉（曲种）、10g纳豆芽孢杆菌种子液、10g枯草杆菌种子液拌匀，然后装入竹箩框，密封，约30℃保温，自然发酵72~96小时，所得淡豆豉，放冷至室温，避光，风干至水分小于12%，0℃以下保存作为提取维生素K2（MK-7）或制作淡豆豉粉的原料。
二、从淡豆豉中提取，纯化及结晶维生素K 2 （MK-7）
维生素K2（MK-7）为脂溶性。通过发酵所得淡豆豉中含有复杂而丰富的成分，如纳豆激酶、纤维素溶酶、α-糖酶、维生素K2（MK-7）、维生素K2（MK-4）等。而维生素K2（MK-7）一般很少处于游离状态，其往往与大分子的糖蛋白、酶类、酮类和苷类物质结合具有一定的亲水性。为从淡豆豉中最大限度地有效提取，纯化，结晶得到维生素K2（MK-7），且其过程不受氧化的影响。本发明首次发现使用单一溶剂，单一方法不能有效提取，纯化，结晶得到维生素K2（MK-7），并保护其不受空气氧化的破坏，从而得到高纯度的维生素K2（MK-7）。而采用烃和脂肪酸酯的各至少一种组成混合溶剂提取，再使用醇和醚的各至少一种组成混合溶剂再提取，将两次提取物除去溶剂后，合并浓缩物，进一步用烃和脂肪酸酯的各至少一种组成混合溶剂，借助硅胶进行纯化，尔后再用醇和醚的各至少一种组成混合溶剂结晶或重结晶，从而得到高纯度的维生素K2（MK-7）。
）、从淡豆豉中提取，纯化及结晶维生素K 2 （MK-7）使用溶剂选择
作为从淡豆豉中提取及纯化提取浓缩物[含维生素K2（MK-7）]时，使用的烃是没有特别限制的，可以提到的脂肪烃、芳香烃，卤代烃等，优选脂肪烃、芳香烃，更优选脂肪烃。
脂肪烃是没有特别限制的，可以是环状的或无环的，一般含有3~20个碳原子，优选5~12个碳原子的。
关于特定实例，可提到的，如：丙烷、丁烷、异丁烷、戊烷、正己烷、庚烷、葵烷、辛烷、壬烷、环戊烷、环已烷、甲基环戊烷、2,3-二甲基丁烷、甲基环戊烷、2,3-二甲基戊烷、甲基环已烷等。其中优选使用丙烷、戊烷、2,3-二甲基戊烷、正己烷、庚烷、辛烷。更优选，庚烷、正己烷。
芳香烃是没有特别限制的，一般含有6~20个碳原子，优选7~10个碳原子。作为特定实例，如可以提到苯、甲苯、二甲苯、邻二甲苯、间二甲苯、对二甲苯、丁基苯、二乙基苯、戊基苯等。优选甲苯、二甲苯、邻二甲苯、间二甲苯、二乙基苯。更优选甲苯。
作为卤代烃是没有限制的，可以是环状或无环，饱和或不饱和的，优选无环状的。
特定实例可提到的，如：二氯甲烷、三氯甲烷、四氯化碳、1,1-二氯乙烷、1,2-二氯乙烷、1,1,1-氯乙烷、1,1,2-二氯乙烷、五氯乙烷、六氯乙烷。
优选二氯甲烷、三氯甲烷、四氯化碳、1,1-二氯甲烷。更优选二氯甲烷、三氯甲烷。
作为从淡豆豉中再次提取及结晶纯化物[含维生素K2（MK-7）]时，使用的醇是没有限制的，可以是环状的或无环状的，饱和或不饱和的。饱和者是优选的含1~12个碳原子，更优选1~6个碳原子。
在特定实例中可提到的，如：甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇、1-丁醇、2-丁醇、异丁醇、正丁醇、1-戊醇、2-戊醇、3-戊醇、2-甲基-1-丁醇、异-2-戊醇、2-乙基-1-丁醇、3-甲基-2-丁醇、1-已醇、2-乙基-1-丁醇、1-庚醇、2-庚醇、3-庚醇、1-辛醇、2-辛醇、1-壬醇、1-葵醇、1-十一碳醇、1-十二碳醇、烯丙醇、苯甲醇、环已醇、1,2-乙二醇、1，2-丙醇、1,3-丙二醇、1,2-丁二醇、1,3丁二醇。
优选甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇、1-丁醇、2-丁醇、异丁醇、1-戊醇、异丁醇、1-戊醇、2-戊醇、3-戊醇、异戊醇。更优选甲醇、乙醇、1-丙醇、异戊醇。
作为从淡豆豉中用于提取和纯化提取浓缩物[含维生素K2（MK-7）]时，使用的脂肪酸酯是没有限制的，可以提到的，如：丙酸酯、乙酸酯、甲酸酯等。优选乙酸酯和甲酸酯。更优选乙酸酯。
关于丙酸酯例如可以提到的，丙酸甲酯、乙酸乙酯、丙酸乙酯、丙酸丁酯、丙酸异戊酯等。优选丙酸乙酯。
关于乙酸乙酯、例如可以提到的，乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸、丙酯、乙酸仲乙酯、乙酸辛酯等。优选乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸丁酯、乙酸异丁酯、乙酸戊酯、乙酸异戊酯。更优选乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸丙酯，乙酸异丁酯。
作为从淡豆豉中再次提取及结晶纯化物[含维生素K2（MK-7）]时，使用的醚是没有特别限制的，可以是环状的或无环的，饱和的或不饱和的，优选使用饱和的。
关于特定实例，如：可提到的乙醚、甲基叔丁基醚、二丙醚、二异丙醚、二丁醚、二已醚、乙基乙烯基醚、丁基乙烯基醚、茴香醚、苯乙醚、丁基苯基醚、甲氯基甲苯、呋喃、2-甲基呋喃、四氢呋喃、二甲醚等。
优选使用乙醚、甲苯、四氢呋喃;
更优选使用乙醚、甲基叔丁基醚;
作为两次提取，纯化，结晶所提到的上述溶剂，选择使用时，优先考虑沸点、熔点和粘度等性质，例如，溶剂应当具有下述沸点、熔点及较低粘度（在20℃下不高于约5mpa·S）。所述沸点允许为增加溶解度而适当加热，有利于从两次提取、纯化和结晶母液中回收溶剂（30~150℃）。从生产操作看，在常温下几乎不挥发的溶剂是优选的，例如沸点低于约80℃者是优选的，沸点低于96者更是优选的。所述熔点允许在室温下处理时以及冷却至室温或以下后（不高于约20℃，优选不高于约10℃，更优选不高于10℃。进而更优选不高于约0℃）几乎不发生固化。
淡豆豉中的维生素K2（MK-7）当处于溶解状态时，随着浓度增加趋于变得更加耐受氧化作用。在这方面，上述溶剂除能高效提取，纯化，结晶维生素K2（MK-7）外，还有利于维生素K2（MK-7）的防氧化。
）、从淡豆豉中提取维生素K 2 （MK-7）的描述
作为提取程序
研究发现，烃与脂肪酸酯的各至少一种组成的混合溶剂先提取。提取后的渣再用醇与醚的各至少一种组成混合溶剂再提取，每次提取过程是超声振荡30分钟，然后离心分离，能高效提取并保护维生素K2（MK-7）。
作为烃与脂肪酸酯各至少一种组成混合溶剂作为提取时，溶剂组成的重量比是10∶1~3，优选10∶2，更优选10∶3。
作为醇与醚的各至少一种组成的混合溶剂作为再提取时，溶剂组成时的重量比是10∶2~4，优选10∶3，更优选10∶4。
作为提取过程是借助超声振荡30分钟，经离心分离。分离是采用框式离心机，在离心机内壁套上布袋，通过离心，使渣及含维生素K2（MK-7）的提取溶剂分离。通过上述两次不同溶剂提取，使维生素K2（MK-7）分布在提取溶剂中。
淡豆豉中的维生素K2（MK-7）当处于溶解状态时，作为两次提取溶剂的使用量均是淡豆豉重量的7~8倍，优选7倍量的溶剂是可行的。更优选8倍的溶剂，提取次数为3~4次，优选提取次数为3次，更优选提取次数为4次。
作为溶剂的循环使用，从节约考虑提取维生素K2（MK-7）后的混合溶剂，分别减压浓缩，分别收集回收，可循环再用。将分别浓缩所得的含维生素K2（MK-7）的浓缩物（含有杂质）进一步进行柱层析纯化。
）、含维生素K 2 （MK-7）提取浓缩物的纯化描述
维生素K2（MK-7）的纯化，是将从淡豆豉中经两次混合溶剂提取，除去溶剂所得的含维生素K2（MK-7）的浓缩物，通过常规的柱层析来完成的。使用带塞或不带塞的玻璃柱，在柱中装入硅胶用本发明所述的用于纯化的混合溶剂密实2~4时，再将所要分离的含维生素K2（MK-7）的提取浓缩物用硅胶拌样上柱，再用上述纯化溶剂洗脱，收集含维生素K2（MK-7）的洗脱液部分。减压浓缩即得含维生素K2（MK-7）的纯化物。
作为纯化提取含维生素K2（MK-7）的浓缩物是以层析硅胶为载体。使用100 ~300目层析硅胶，优选使用200目层析硅胶，更优选使用300目层析硅胶。
作为层析纯化，装柱拌样及洗脱所使用的混合溶剂是选择烃及脂肪酸酯的各至少一种组成混合溶剂，其烃与脂肪酸酯的重量比是100∶1。
作为提取含维生素K2（MK-7）的浓缩物纯化时，其硅胶用量是4~4.5倍，其中用于装柱的硅胶量是浓缩物的3倍。 
用于浓缩物拌样的硅胶量是浓缩物的1~1.5倍，优选1倍，更优选1.5倍进行拌样。
作为柱层析洗脱速度是没有特别限制的，可根据TLC检测控制流速（薄板：2×5cm硅胶G薄板）并与维生素K2（MK-7）对照品[进口维生素K2（MK-7）标准品]薄层点板并展开。展开剂为烃与脂肪酸酯，其重量比为10∶3。再经碘显色，使杂质留在硅胶层析柱上。
收集含维生素K2（MK-7）的洗脱液减压浓缩回收溶剂，将所得的维生素K2（MK-7）纯化产物进一步结晶或重结晶。
）、含维生素K 2 （MK-7）纯化产物的结晶描述
所要进行结晶的含维生素K2（MK-7）纯化物可以按照不同方式得到，如：合成，发酵纳豆及淡豆豉中提取纯化所得的纯化物，优选从淡豆豉，纳豆中提取纯化得到的纯化物，更优选按照本发明富含维生素K2（MK-7）的淡豆豉中提取纯化所得纯化物。
本发明的结晶方法特别适用于从富含维生素K2（MK-7）的淡豆豉用本发明所述的混合溶剂，经两次分别提取，再用本发明所述纯化方法得到的纯化产物进行结晶，从而得到高纯度维生素K2（MK-7）。
结晶的方法是没有限制的，结晶可以利用常规的结晶方法进行，如：冷却结晶，浓缩结晶，溶剂置换结晶和其它方法中的至少一种，特别是冷却结晶或者冷却结晶与某种其它结晶方法的组合是优选的。
结晶步骤中的冷却温度是重要的因素，温度一般不高于25℃，优选不高于15℃，更优选不高于10℃。下限就是系统的固化温度。
作为固化温度，-30℃~10℃，优选-20~10℃，更优选-10℃~10℃，能有利于结晶的进行。
在结晶过程中，控制结晶速率也尤为重要，也就是控制在一定的温度下，每小时单位时间结晶出来的晶体重量。以最小程度减少各种杂质混入所得的维生素K2（MK-7）中。优选25℃时，每小时的结晶速率不超过40%。更优选10℃时，每小时，不超过20%。作为结晶或重结晶时，使用醇与醚组成的混合溶剂的重量是纯化产物重量的8~10倍。优选使用8倍量，更优选使用9倍量，特别优选使用10倍量。
结晶浓度也是重要的因素，在以结晶完成时维生素K2（MK-7）的重量相对于结晶溶剂的重量不高于20%，优选不高于15%，更优选不高于10%，通过上述浓度的保持，有可能更适于工业规模生产的结晶。结晶可在搅拌情况下进行，但为防止流动状态下，维生素K2（MK-7）更易发生氧化。结晶优选在静置状态下进行。
按照本发明使用醇与醚的各至少一种组合成混合溶剂作为结晶溶剂时，能有效地解决维生素K2（MK-7）溶解度以及结晶浓度、收率、结晶特征。而醇与醚的各至少一种作为结晶混合溶剂，其重量比一般不高于10∶3，优选不高于10∶2，更优选不高于10∶1。
经结晶得到的维生素K2（MK-7）晶体可借助固液分离技术，如：离心或真空过滤，必要时再洗涤滤饼。
也可将所得湿产物装入真空干燥器在减压，避光下进行真空干燥，得干燥产物。
按照本发明能够方便有效地制得富含维生素K2（MK-7）的原料淡豆豉，并使用发明中所述溶剂及方法提取，纯化，结晶得到高纯度的维生素K2（MK-7），含量≥97%。
下列实例及对比实例能进一步详细阐述本发明，不过，这些实例侧重不限于本发明的范围。实施例中，维生素K2（MK-7）的纯度（含量）是借助下述HPLC（高压液相色谱）分析方法测定的。
HPLC条件：色谱柱：不锈钢十八烷键合硅胶柱（150mm×?4.6mm,5μm）；流动相：甲醇；检测波长：254nm；柱温：40℃；流速：1ml/min。
实施例1：称取精选大豆1200g（水分含量为5%），粉碎机破碎（控制避免过度粉碎）成瓣，脱壳，得1100g(91.6%收率)豆瓣。
用新鲜西兰花榨汁，取过滤的汁660g，然后分别加入甘露醇13.2g（2.0%）、磷酸氢二钠0.66g（0.1%）、蔗糖6.6g（1.0%）搅拌溶解，再加入2619.54g水稀释，制得3300g浓度约为20.6%的营养液。
在常温下，将豆瓣用所制得的营养液浸泡24h后，滤除多余营养液，在95℃温度下，茏蒸30分钟，放冷至30℃，加入22g淡豆豉粉（玉溪易门淡豆豉风干制得），再分别接种110g纳豆芽孢杆菌种子液及枯草杆菌种子液，拌匀，装入竹箩框中，用聚乙烯膜密封，约30℃温度下自然发酵72小时。发酵完成后，放冷至室温，避光风干，检测水分为10%，得淡豆豉1155g，装袋，置于冰箱中，在0℃条件下保存备用。
实施例2：取实施例1所得淡豆豉250g（水分含量为10%）避光再自然风干，测水分得4.5%，用粉碎机粉将其粉碎成粉（50~100目，占80%，其余目数占20%）。除去损耗30g，得淡豆豉粉220g，用铝塑复膜袋密封包装，置于冰箱中，在0℃条件下保存备用（用于作为种曲）。
实施例3：称取精选大豆1200g（水分含量为5%）用粉碎机破碎（控制避免过度粉碎）成瓣，脱壳得1150g（95.8%收率）豆瓣。
用新鲜波菜榨汁，取过滤的汁1035g，然后分别加入木糖醇31.05（3%）、磷酸二氢钠2.07g（0.2%）、葡萄糖20.7g(2%)搅拌溶解，再加入2361g水稀释，制得3450g浓度约为31.6%的营养液。
在常温下，将豆瓣用所制得的营养液浸泡24小时后，滤除多余营养液，然后在95℃的温度下，茏蒸40分钟，放冷至约30℃，随后加入34.5g实例2所制的淡豆豉粉（曲种），再分别接种115g纳豆芽孢杆菌种子液和枯草杆菌种子液，搅拌均匀，最后装入竹制箩框中，用聚乙烯膜密封，在约30℃条件下，自然发酵96h。发酵完成后，在避光的环境下，放冷至室温，自然风干，测水分为11%，得淡豆豉1213g，装袋，置于冰箱中，在0℃温度下保存备用。
实施例4：称取精选大豆1200g（水分含量5%）用粉碎机破碎（控制避免过度粉碎）成瓣，脱壳，得1140g（95.0%收率）豆瓣。
用新鲜莴笋叶榨汁，取过虑的汁1368g，然后分别加入山梨醇54.32g（4.0%）、食品磷酸钠4.1g（0.3%）、麦芽糖41g(3.0%)搅拌溶解，再加入1952.58g水稀释，制得3420g浓度为42.9%的营养液。
在常温下，将豆瓣用所制得的营养液浸泡24小时后，滤除多余营养液，然后在95℃的温度下，茏蒸40分钟，放冷至约30℃，随后加入54.72g实例2所制的淡豆豉粉，再分别加入114g纳豆芽孢杆菌种子液和枯草杆菌种子液，拌匀后，装入竹箩框中，用聚乙烯膜密闭，在约30℃的条件下，自然发酵96小时。发酵完成后，在避光的环境下，放冷至室温，自然风干，测得水分为12%，得淡豆豉1219.8g，装袋，置于冰箱中，在0℃温度下保存备用。
实施例5：称取精选大豆1200g（水分含量5%）用粉碎机破碎（控制避免过度粉碎）成瓣，脱壳，得1145g（95.4%收率）豆瓣。
取用新鲜绿色芹菜叶榨汁，过虑制得的汁1718g，然后分别加入甘油85.9g（5.0%）、磷酸氢二钠6.87g（0.4%）、蔗糖68.7g(4.0%)搅拌溶解，再加入1879.43g水稀释，制得3758.9g浓度为50.0%的营养液。
在常温下，将豆瓣用所制得的营养液浸泡24小时后，滤除多余营养液，然后在95℃的温度下，茏蒸40分钟，放冷至约30℃，随后加入57.25g实例2所制的淡豆豉粉，再分别加入115g纳豆芽孢杆菌种子液和枯草杆菌种子液，拌匀后，装入竹箩框中，用聚乙烯膜密闭，在约30℃的条件下，自然发酵96小时。发酵完成后，在避光的环境下，放冷至室温，自然风干，测得水分为11%，得淡豆豉1208g，装袋，置于冰箱中，在0℃温度下保存备用。
对比实例1（传统淡豆速递的制作方法）
称取按实施例5粉碎方法所得的同批脱壳豆瓣1145g（水分含量为5%），用水浸泡24小时后，滤除多余的水，然后在95℃的温度下，蒸40分钟，放冷至约30℃，装入竹箩框中，用聚乙烯膜密闭，在约30℃的条件下，自然发酵96小时。发酵完成后，在避光的环境下，放冷至室温，自然风干，测得水分为11%，得淡豆豉1208g，装袋，置于冰箱中，在0℃温度下保存备用。
对比实例2（用营养液浸泡，不接种菌种）
称取按实施例5粉碎方法所得的同批脱壳豆瓣1145g（水分含量为5%），用实例5所制营养液浸泡24小时后，滤除多余营养液，然后在95℃的温度下，蒸40分钟，放冷至约30℃，装入竹箩框中，用聚乙烯膜密闭，在约30℃的条件下，自然发酵96小时。发酵完成后，在避光的环境下，放冷至室温，自然风干，测得水分为10%，得淡豆豉1202g，装袋，置于冰箱中，在0℃温度下保存备用。
对比实例3（不用营养液浸泡，接种菌种）
称取按实施例5粉碎方法所得的同批脱壳豆瓣1145g（水分含量为5%），用水浸泡24小时后，滤去多余的水，然后在95℃的温度下，蒸40分钟，放冷至约30℃，随后加入57.25g实例2所制的淡豆豉粉，再分别加入115g纳豆芽孢杆菌种子液和枯草杆菌种子液，拌匀后，装入竹箩框中，用聚乙烯膜密闭，在约30℃的条件下，自然发酵96小时。发酵完成后，在避光的环境下，放冷至室温，自然风干，测得水分为10%，得淡豆豉1203g，装袋，置于冰箱中，在0℃温度下保存备用。
实施例6：称取实施例1所得淡豆豉900g（水分含量为10%），用5727.3g甲苯和572.7g乙酸丙酯混合均匀，得到6300g（7倍量）混合溶剂，在常温，每次超声振荡30分钟，分3次提取，用框式离心机离心分离，合并提取及离心液。滤渣再用5727.3g甲醇和572.7g二丙醚混匀制得的6300g(7倍量)混合溶剂，再在常温下，每次超声振荡30分钟，再分3次提取后，离心，弃渣，合并提取液。
将先后两次混合溶剂提取液分别减压浓缩，回收溶剂。合并浓缩物，称重，得150g提取浓缩物。
用450g层析硅胶进行装柱，再用甲苯与乙酸丙酯(100:1，V/V)配制的洗脱溶剂密实柱子2~4小时。密实柱子完成后，用150g层析硅胶与所得150g提取浓缩物混合拌样，上柱，然后用上述洗脱溶剂进行洗脱，并用TLC检测（硅胶G板）控制流速及洗脱质量，收集含维生素K2（MK-7）洗脱液。将收集的含维生素K2（MK-7）的洗脱液减压浓缩，回收溶剂，称重，得到含维生素K2（MK-7）的纯化物80g。
避光操作。将所得80g含维生素K2（MK-7）的纯化物加入由492g异丙醇和148g四氢呋喃组成的640g(8倍量)混合溶剂中，在40℃加热溶解后，在10℃的温度下，进行静态结晶。结晶完成后，真空抽滤。收集所得晶体，将其转入真空干燥器中，在避光环境下，干燥48小时。干燥完成后，称重，得到35mg含量为97.1%的维生素K2（MK-7）。维生素K2（MK-7）质量收率为41.96mg/kg干淡豆豉。
实施例7：称取实施例3所得淡豆豉1000g（水分含量为11%），用5833g二氯甲烷和1167g乙酸甲酯混合均匀，得到7000g（7倍量）混合溶剂，在常温，每次超声振荡30分钟，分别3次提取，用框式离心机离心分离，合并提取及离心液。滤渣再用5833g异丙醇和1167g四氢呋喃混匀制得的7000g(7倍量)混合溶剂，在常温下，每次超声振荡30分钟，再分3次提取后，离心，弃渣，合并提取液。
将先后两次混合溶剂提取液分别减压浓缩，回收溶剂。合并浓缩物，称重，得210g提取浓缩物。
用630g层析硅胶进行装柱，再用二氯甲烷与乙酸甲酯(100:1，V/V)配制的洗脱溶剂密实柱子2~4小时。密实柱子完成后，用210g层析硅胶与所得210g提取浓缩物混合拌样，上柱，然后用上述洗脱溶剂进行洗脱，并用TLC检测（硅胶G板）控制流速及洗脱质量，收集含维生素K2（MK-7）洗脱液。将收集的含维生素K2（MK-7）的洗脱液减压浓缩，回收溶剂，称重，得到含维生素K2（MK-7）的纯化物96.8g。
避光操作。将所得96.8g含维生素K2（MK-7）的纯化物加入由645g异丙醇和129g甲基叔丁基醚组成的774g(约8倍量)混合溶剂中，在40℃加热后，在10℃的温度下，进行静态结晶。结晶完成后，真空抽滤。收集所得晶体，将其转入真空干燥器中，在避光环境下，干燥48小时。干燥完成后，称重，得到39mg含量为97.5%的维生素K2（MK-7）。维生素K2（MK-7）质量收率为42.72mg/kg干淡豆豉。
实施例8：称取实施例4所得淡豆豉1000g（水分含量为12%），用6154g乙烷和1846g乙酸乙酯混合均匀，得到8000g（8倍量）混合溶剂，在常温，每次超声振荡30分钟，提取分4次进行后，用框式离心机离心分离，合并提取及离心液。滤渣再用6154g异戊醇与1846g甲基叔丁基醚混匀制得的8000g(8倍量)混合溶剂，在常温下，每次超声振荡30分钟，再分4次提取后，离心，弃渣，合并提取液。
将先后两次混合溶剂提取液分别减压浓缩，回收溶剂。合并浓缩物，称重，得215g提取浓缩物。
用645g层析硅胶进行装柱，再用乙烷与乙酸乙酯(100:1，V/V)配制的洗脱溶剂密实柱子2~4小时。密实柱子完成后，用322.5g层析硅胶与所得215g提取浓缩物混合拌样，上柱，然后用上述洗脱溶剂进行洗脱，并用TLC检测（硅胶G板）控制流速及洗脱质量，收集含维生素K2（MK-7）洗脱液。将收集的含维生素K2（MK-7）的洗脱液减压浓缩，回收溶剂，称重，得到含维生素K2（MK-7）的纯化物95g。
避光操作。将所得95g含维生素K2（MK-7）的纯化物加入由777g乙醇和78g二丙醚组成的855g(9倍量)混合溶剂中，在40℃加热后，在15℃的温度下，进行静态结晶。结晶完成后，用布氏漏斗工，真空抽滤。收集所得晶体，将其转入真空干燥器中，在避光环境下，干燥48小时。干燥完成后，称重，得到40.5mg含量为97.3%的维生素K2（MK-7）。维生素K2（MK-7）质量收率为44.78mg/kg干淡豆豉。
实施例9：称取实施例5所得淡豆豉1000g（水分含量为11%），用6154g庚烷和1846g丙酸乙酯混合均匀，得到8000g（8倍量）混合溶剂，在常温，每次超声振荡30分钟，提取分4次进行后，用框式离心机离心分离，合并提取及离心液。滤渣再用6154g乙醇与1846g乙醚混匀制得的8000g(8倍量)混合溶剂，在常温下，每次超声振荡30分钟，再分4次提取后，离心，弃渣，合并提取液。
将先后两次混合溶剂提取液分别减压浓缩，回收溶剂。合并浓缩物，称重，得221g提取浓缩物。
用663g层析硅胶进行装柱，再用庚烷与丙酸乙酯(100:1，V/V)配制的洗脱溶剂密实柱子2~4小时。密实柱子完成后，用331.5g层析硅胶与所得221g提取浓缩物混合拌样，上柱，然后用上述洗脱溶剂进行洗脱，并用TLC检测（硅胶G板）控制流速及洗脱质量，收集含维生素K2（MK-7）洗脱液。将收集的含维生素K2（MK-7）的洗脱液减压浓缩，回收溶剂，称重，得到含维生素K2（MK-7）的纯化物99g。
避光操作。将所得99g含维生素K2（MK-7）的纯化物加入由900g乙醇和90g二丙醚组成的990g(10倍量)混合溶剂中，在40℃加热后，在25℃的温度下，进行静态结晶。结晶完成后，真空抽滤。收集所得晶体，将其转入真空干燥器中，在避光环境下，干燥48小时。干燥完成后，称重，得到40.54mg含量为97.2%的维生素K2（MK-7）。维生素K2（MK-7）质量收率为44.28mg/kg干淡豆豉。
对比实例4
将对比实施例1、2、3所得的淡豆豉分别称取1000g分别按实施例6、7、8所述方法进行提取，纯化，结晶，所得维生素K2（MK-7）分别称重，检测其纯度，结果见下表。

Claims (13)

1.一种富含维生素K2（MK-7）淡豆豉制作方法，其特征是该方法包含使用营养液浸泡大豆；用淡豆豉粉、纳豆芽孢杆菌种子液、枯草杆菌种子液接种，经自然发酵得到富含维生素K2（MK-7）的淡豆豉。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是浸泡大豆的营养液制备包含选择含维生素K1的新鲜蔬菜至少一种，取汁，计重，分别加入多元醇至少一种，钠盐至少一种，糖至少一种混溶，用水稀释至20~50%浓度。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征是其中多元醇，钠盐和糖与蔬菜汁的重量比分别为2~5%、0.1~0.4%、1~4%。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征是其中大豆为破碎、脱壳的大豆，营养液浸泡量为脱壳大豆重量的3倍，常温浸泡24小时。
5.根据权利要求1的方法，其特征是用于接种的淡豆豉粉是选用淡豆豉至少一种，自然风干，粉碎过程是在避光的状况下进行。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征是其中淡豆豉粉碎前水分≤5%，粉碎后装袋，封口，0℃保存备用。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征是其中纳豆芽孢杆菌种子液，枯草杆菌种子液包含种子液培养基配方组成及制备。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征是纳豆芽孢杆菌种子液配方组成：牛肉膏5g，蛋白栋5g，葡萄糖5g，氯化钠2g，蔗糖8g，磷酸二氢钾1g，蒸馏水1000ml，PH为7.0；枯草杆菌种子培养液配方组成：牛肉膏5g，蛋白栋6g，葡萄糖5g，氯化钠3g，蔗糖8g，磷酸二氢钾1.5g，硫酸锰6mg，蒸馏水1000ml，PH为7.0。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征是纳豆芽孢杆菌种子液，枯草杆菌种子液制备过程是将上述两种配方分别混溶，分别在110~120℃，消毒1小时，放冷至25℃，分别接种活化的纳豆芽孢杆菌，活化的枯草杆菌，然后，分别在30℃、37℃，厌氧发酵24小时，0℃保存。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征是活化的纳豆芽孢杆菌，活化的枯草杆菌是将纳豆芽孢杆菌菌种、枯草杆菌菌种按菌种提供者分别给定的固体活化培养基及培养条件制得。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征是其中使用的纳豆芽孢杆菌、枯草杆菌各至少一种作为菌种。
12.根据权利要求1 所述的方法，其特征是接种发酵包含：在破碎脱壳大豆，经营养液浸泡24小时，再在90~100℃蒸煮30~40分钟，放冷至约30℃时，接种淡豆豉粉、纳豆芽孢杆菌种子液、枯草杆菌种子液,接种量以破碎脱壳大豆重量计，每100g加入2~5g淡豆豉粉，10g纳豆芽孢杆菌种子液，10g枯草杆菌种子液，装笼，约30℃保温，自然发酵72~96小时，放冷至常温，得富含维生素K2（MK-7）的淡豆豉。
13.根据权利要求5或6所述的方法，其特征是其中将制得的富含维生素K2（MK-7）的淡豆豉，避光，自然风干，控制水分不高于12%，在0℃保存，一部分用于制备含维生素K2（MK-7）的淡豆豉粉，其余作为提取维生素K2（MK-7）的原料。
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