CN104255448B - 一种岗松初代培养芽诱导方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种岗松初代培养芽诱导方法,采用岗松嫩枝为外植体,通过对外植体无菌消毒处理后,将外植体接种于初代培养芽诱导培养基上,置于适宜的温度、湿度和光照强度条件下进行培养,诱导芽的萌发。本发明克服了岗松芽诱导过程中外植体的褐变,外植体存活率较好,芽诱导萌发快,萌发时间为10天左右,诱导率较高,岗松芽苗生长旺盛,可满足下一步的增殖培养的需要,加快岗松组织培养快速繁殖体系的建立,具有较好的经济效益、社会效益和生态效益。
Description
技术领域
本发明涉及岗松无性繁殖技术,具体涉及一种岗松初代培养芽诱导方法。
背景技术
岗松(Baeckeafrutescens)属桃金娘科的一种灌木,是我国南方常用的野生民间草药,全株入药,有祛风除湿、解毒利尿、杀虫止痒的功能;另外枝叶可编扫帚、做藤编,也可提取芳香油及制栲胶;燃烧值高,是农村群众喜刈的薪材。随着社会经济的快速发展和人民生活水平的不断提高,当前以岗松油为原料生产的纯天然、安全、保健的日用品和医药用品需求量极大,而大量的采伐势必造成野生岗松资源的日益枯竭。因此,推进人工繁殖育苗的规模化、产业化进程,缩短育苗周期,对满足制药行业的需求,实现资源可持续发展有着积极的意义。
岗松的繁殖方法主要为种子直播的有性繁殖和扦插育苗的无性繁殖。由于岗松的种子非常微小,肉眼几乎看不见,采集非常困难,岗松的有性繁殖具有难度。扦插育苗时扦插苗成活率受季节的影响又比较大。而组织培养作为一种快速无性繁殖方法,利用嫩枝作为材料,在实验室内繁殖苗木,不受季节限制,既可以满足生产上的数量需求,又可保持母本性状。组织培养过程中,初代培养是制约组织培养顺利进行的关键步骤,其中涉及了外植体的获取、外植体的消毒、培养基选择以及培养体褐变等问题。因此,总结出一种有效的岗松初代培养诱导方法非常重要。
发明内容
本发明为了克服现有技术的不足,提供一种能克服芽诱导过程中外植体褐变,提高岗松芽诱导率的岗松初代培养芽诱导方法,为下一步的增殖培养提供量足、质优的无菌材料,促进岗松组织培养快速繁殖体系的建立。
为了实现上述发明目的,本发明的技术方案如下:
一种岗松初代培养芽诱导方法,其特征在于:采用岗松嫩枝为外植体,通过对外植体无菌消毒处理后,将外植体接种于初代培养芽诱导培养基上,置于适宜的温度、湿度和光照强度条件下进行培养,诱导芽的萌发;其操作步骤为:
(1)外植体获取:选择在晴天上午采集到的岗松嫩枝作为外植体;
(2)外植体消毒:对外植体进行洗涤预处理后,再用化学试剂进行消毒处理,最后剪切成茎段接入芽诱导培养基中;
(3)外植体接种:将消毒后的外植体用无菌吸水纸吸干表面水分,然后剪成长1.5-2.0cm 的茎段接种于初代芽诱导培养基中,每瓶接种2-3个茎段;
(4)芽诱导培养:将接种后的外植体置于适宜室内条件下培养。
以上步骤(1)所述的岗松嫩枝是长5-10cm的半木质化粗壮岗松嫩枝。
以上步骤(2)中所述的预处理的方法是将采集到的岗松嫩枝放入封口袋,立即带回室内,剪去岗松嫩枝上的针叶,然后用自来水对除去针叶后的外植体冲洗3-4遍,再用脱脂棉蘸低浓度的洗洁精溶液擦拭,最后将外植体装入纱布袋内并置于流水中冲洗20-25min。
以上所述的低浓度的洗洁精溶液是体积浓度为1.0-3.0%的洗洁精水溶液。
以上步骤(2)中所述的消毒处理的方法是将预处理后的外植体置于干净烧杯,用无菌水清洗2-3次,然后将外植体转到超净工作台上,置入灭菌过的广口三角瓶,迅速向瓶内倒入体积浓度为2%的次氯酸钠灭菌液进行灭菌消毒,充分浸没外植体后加盖好瓶口,轻轻晃动三角瓶6-8min,然后将灭菌液倒净后立即将外植体倒入无菌水轻搅漂洗5次,每次不少于2min。
以上步骤(3)中所述的初代芽诱导培养基是以MS为基本培养基,还包括6-BA,NAA,维生素C,琼脂和蔗糖;其中6-BA的含量为1.5-2.0 mg/L,NAA的含量为0.05mg/L,维生素C的含量为10mg/L,琼脂的含量为0.6%以及蔗糖的含量为3%。
以上所述步骤(4)中的适宜室内条件为白天温度27 ±2℃,夜间温度 22 ±2 ℃,采用日光灯培养,光照强度1800-2000lx,光照时数10h•d- 1。
与现有技术相比,本发明具有以下的优点和积极效果:
1、本发明的一种岗松初代培养芽诱导方法,外植体接种于优质的初代芽诱导培养基中,所用的芽诱导培养基材料均是根据岗松自身的特点所制备的,有效克服了岗松芽诱导过程中外植体的褐变,使得岗松芽苗生长旺盛。
2、本发明的一种岗松初代培养芽诱导方法,通过对外植体进行预处理和消毒灭菌后,接种于优质的初代芽诱导培养基中,外植体存活率较好,芽诱导萌发快,萌发时间为10天左右,诱导率较高,可满足下一步的增殖培养的需要,加快岗松组织培养快速繁殖体系的建立,具有较好的经济效益、社会效益和生态效益。
3、本发明的一种岗松初代培养芽诱导方法,以长5-10cm的半木质化粗壮岗松嫩枝作为外植体,保证了外植体较强的分生能力,促进芽的诱导。
4、本发明的一种岗松初代培养芽诱导方法,材料易得,成本低,操作简单方便。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1:
一种岗松初代培养芽诱导方法,在晴天上午采集长5cm的半木质化粗壮岗松嫩枝作为外植体。将采集到的岗松嫩枝放入封口袋,立即带回室内,剪去岗松嫩枝上的针叶,然后用自来水对除去针叶后的外植体冲洗3-4遍,再用脱脂棉蘸体积浓度为1.0%的洗洁精水溶液擦拭,最后将外植体装入纱布袋内并置于流水中冲洗20min,即对外植体进行洗涤预处理。将预处理后的外植体置于干净烧杯,用无菌水清洗2次,然后将外植体转到超净工作台上,置入灭菌过的广口三角瓶,迅速向瓶内倒入体积浓度为2%的次氯酸钠灭菌液进行灭菌消毒,充分浸没外植体后加盖好瓶口,轻轻晃动三角瓶6min,然后将灭菌液倒净后立即将外植体倒入无菌水轻搅漂洗5次,每次2min。将消毒后的外植体用无菌吸水纸吸干表面水分,然后剪成长1.5cm 的茎段接种于初代芽诱导培养基中,每瓶接种3个茎段。所述的初代芽诱导培养基是以MS为基本培养基,还包括6-BA,NAA,维生素C,琼脂和蔗糖;其中6-BA的含量为1.5 mg/L,NAA的含量为0.05mg/L,维生素C的含量为10mg/L,琼脂的含量为0.6%以及蔗糖的含量为3%。将接种后的外植体置于白天温度为27 ±2℃,夜间温度为 22 ±2 ℃,采用日光灯培养,光照强度1800-2000lx,光照时数10h•d- 1的适宜室内条件下培养。45d后调查,外植体存活率为87.6%,芽诱导率为80.4%,极少数外植体发生褐变,芽苗生长正常。
实施例2:
一种岗松初代培养芽诱导方法,在晴天上午采集长8cm的半木质化粗壮岗松嫩枝作为外植体。将采集到的岗松嫩枝放入封口袋,立即带回室内,剪去岗松嫩枝上的针叶,然后用自来水对除去针叶后的外植体冲洗3-4遍,再用脱脂棉蘸体积浓度为2.0%的洗洁精水溶液擦拭,最后将外植体装入纱布袋内并置于流水中冲洗20min,即对外植体进行洗涤预处理。将预处理后的外植体置于干净烧杯,用无菌水清洗2次,然后将外植体转到超净工作台上,置入灭菌过的广口三角瓶,迅速向瓶内倒入体积浓度为2%的次氯酸钠灭菌液进行灭菌消毒,充分浸没外植体后加盖好瓶口,轻轻晃动三角瓶7min,然后将灭菌液倒净后立即将外植体倒入无菌水轻搅漂洗5次,每次5min。将消毒后的外植体用无菌吸水纸吸干表面水分,然后剪成长1.5cm 的茎段接种于初代芽诱导培养基中,每瓶接种3个茎段。所述的初代芽诱导培养基是以MS为基本培养基,还包括6-BA,NAA,维生素C,琼脂和蔗糖;其中6-BA的含量为1.5 mg/L,NAA的含量为0.05mg/L,维生素C的含量为10mg/L,琼脂的含量为0.6%以及蔗糖的含量为3%。将接种后的外植体置于白天温度为27 ±2℃,夜间温度为 22 ±2 ℃,采用日光灯培养,光照强度1800-2000lx,光照时数10h•d- 1的适宜室内条件下培养。45d后调查,外植体存活率为92.7%,芽诱导率为82.5%,极少数外植体发生褐变,芽苗生长正常。
实施例3:
一种岗松初代培养芽诱导方法,在晴天上午采集长8cm的半木质化粗壮岗松嫩枝作为外植体。将采集到的岗松嫩枝放入封口袋,立即带回室内,剪去岗松嫩枝上的针叶,然后用自来水对除去针叶后的外植体冲洗3-4遍,再用脱脂棉蘸体积浓度为3.0%的洗洁精水溶液擦拭,最后将外植体装入纱布袋内并置于流水中冲洗25min,即对外植体进行洗涤预处理。将预处理后的外植体置于干净烧杯,用无菌水清洗3次,然后将外植体转到超净工作台上,置入灭菌过的广口三角瓶,迅速向瓶内倒入体积浓度为2%的次氯酸钠灭菌液进行灭菌消毒,充分浸没外植体后加盖好瓶口,轻轻晃动三角瓶8min,然后将灭菌液倒净后立即将外植体倒入无菌水轻搅漂洗5次,每次5min。将消毒后的外植体用无菌吸水纸吸干表面水分,然后剪成长2.0cm 的茎段接种于初代芽诱导培养基中,每瓶接种2个茎段。所述的初代芽诱导培养基是以MS为基本培养基,还包括6-BA,NAA,维生素C,琼脂和蔗糖;其中6-BA的含量为2.0 mg/L,NAA的含量为0.05mg/L,维生素C的含量为10mg/L,琼脂的含量为0.6%以及蔗糖的含量为3%。将接种后的外植体置于白天温度为27 ±2℃,夜间温度为 22 ±2 ℃,采用日光灯培养,光照强度1800-2000lx,光照时数10h•d- 1的适宜室内条件下培养。45d后调查,外植体存活率为95.2%,芽诱导率为86.6%,极少数外植体发生褐变,芽苗生长正常。
实施例4:
一种岗松初代培养芽诱导方法,在晴天上午采集长10cm的半木质化粗壮岗松嫩枝作为外植体。将采集到的岗松嫩枝放入封口袋,立即带回室内,剪去岗松嫩枝上的针叶,然后用自来水对除去针叶后的外植体冲洗3-4遍,再用脱脂棉蘸体积浓度为3.0%的洗洁精水溶液擦拭,最后将外植体装入纱布袋内并置于流水中冲洗25min,即对外植体进行洗涤预处理。将预处理后的外植体置于干净烧杯,用无菌水清洗3次,然后将外植体转到超净工作台上,置入灭菌过的广口三角瓶,迅速向瓶内倒入体积浓度为2%的次氯酸钠灭菌液进行灭菌消毒,充分浸没外植体后加盖好瓶口,轻轻晃动三角瓶8min,然后将灭菌液倒净后立即将外植体倒入无菌水轻搅漂洗5次,每次8min。将消毒后的外植体用无菌吸水纸吸干表面水分,然后剪成长2.0cm 的茎段接种于初代芽诱导培养基中,每瓶接种2个茎段。所述的初代芽诱导培养基是以MS为基本培养基,还包括6-BA,NAA,维生素C,琼脂和蔗糖;其中6-BA的含量为2.0 mg/L,NAA的含量为0.05mg/L,维生素C的含量为10mg/L,琼脂的含量为0.6%以及蔗糖的含量为3%。将接种后的外植体置于白天温度为27 ±2℃,夜间温度为 22 ±2 ℃,采用日光灯培养,光照强度1800-2000lx,光照时数10h•d- 1的适宜室内条件下培养。45d后调查,外植体存活率为91.8%,芽诱导率为81.6%,极少数外植体发生褐变,芽苗生长正常。
Claims (1)
1.一种岗松初代培养芽诱导方法,其特征在于:采用岗松嫩枝为外植体,通过对外植体无菌消毒处理后,将外植体接种于初代培养芽诱导培养基上,置于适宜的温度、湿度和光照强度条件下进行培养,诱导芽的萌发;其操作步骤为:
(1)外植体获取:选择在晴天上午采集到的长5-10cm的半木质化粗壮岗松嫩枝作为外植体;
(2)外植体消毒:对外植体进行洗涤预处理后,再用化学试剂进行消毒处理,最后剪切成茎段接入芽诱导培养基中;
所述的预处理的方法是将采集到的岗松嫩枝放入封口袋,立即带回室内,剪去岗松嫩枝上的针叶,然后用自来水对除去针叶后的外植体冲洗3-4遍,再用脱脂棉蘸体积浓度为1.0-3.0%的洗洁精溶液擦拭,最后将外植体装入纱布袋内并置于流水中冲洗20-25min;
所述的消毒处理的方法是将预处理后的外植体置于干净烧杯,用无菌水清洗2-3次,然后将外植体转到超净工作台上,置入灭菌过的广口三角瓶,迅速向瓶内倒入体积浓度为2%的次氯酸钠灭菌液进行灭菌消毒,充分浸没外植体后加盖好瓶口,轻轻晃动三角瓶6-8min,然后将灭菌液倒净后立即将外植体倒入无菌水轻搅漂洗5次,每次不少于2min;
(3)外植体接种:将消毒后的外植体用无菌吸水纸吸干表面水分,然后剪成长1.5-2.0cm 的茎段接种于初代芽诱导培养基中,每瓶接种2-3个茎段;
所述的初代芽诱导培养基是以MS为基本培养基,还包括6-BA,NAA,维生素C,琼脂和蔗糖;其中6-BA的含量为1.5-2.0 mg/L,NAA的含量为0.05mg/L,维生素C的含量为10mg/L,琼脂的含量为0.6%以及蔗糖的含量为3%;
(4)芽诱导培养:将接种后的外植体置于适宜室内条件下培养;
所述的适宜室内条件为白天温度27 ±2℃,夜间温度 22 ±2 ℃,采用日光灯培养,光照强度1800-2000lx,光照时数10hd- 1。
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