CN104244957A

CN104244957A - 用于治疗分娩停止的方法

Info

Publication number: CN104244957A
Application number: CN201380016529.6A
Authority: CN
Inventors: G·埃克曼-奥德贝格; A·马尔姆斯特伦
Original assignee: Di Lefang LLC
Current assignee: Di Lefang LLC; Dilafor AB
Priority date: 2012-03-26
Filing date: 2013-03-25
Publication date: 2014-12-24
Anticipated expiration: 2033-03-25
Also published as: MY185108A; MX2014011451A; HK1203370A1; CN104244957B; ZA201406567B; SG11201406118QA; EP2830634A1; US20150057226A1; RU2014143008A; EP2830634A4; WO2013147690A1; CA2868479A1; NZ631279A; JP2015514705A; AU2013240598A1; UA117907C2

Abstract

本发明涉及某些硫酸化的葡糖胺聚糖用于治疗分娩停止的用途。硫酸化的葡糖胺聚糖具有减弱的抗凝血活性，其与能够促进子宫的子宫肌层收缩的试剂联合施用，由此重新建立有效的分娩。

Description

用于治疗分娩停止的方法

技术领域

本发明涉及某些硫酸化的葡糖胺聚糖通过使在分娩过程中进入分娩停止(laborarrest)的妇女重新建立有效的分娩而用于治疗分娩停止的用途。

背景技术

产科学中常见的临床问题是滞产或某些方面的功能障碍性分娩。据证明所有分娩中，例如在欧洲和美国，约40％-60％的分娩产程进展缓慢或停止。在发展中国家，由伴有产后大出血的分娩停止是孕产妇死亡的最常见原因。

子宫由两个部分组成，子宫体和子宫颈，其在怀孕和分娩期间具有不同的功能。子宫体主要由平滑肌肌束(smooth muscle bundles)，包埋在细胞外基质(ECM)的子宫肌层组成，而子宫颈主要由ECM组成。ECM的主导组分是胶原Ⅰ和Ⅲ，但也有少量的蛋白聚糖。蛋白聚糖由连接有一至一百条多糖链(葡糖胺聚糖)的蛋白核心构成。子宫的收缩和软化(the softening)，或者换句话说成熟(ripening)，以及子宫颈的扩张之间的协调对于正常分娩是至关重要的。这些过程之间的不协调导致异常分娩。

在Acta Obstetricia et Gynecologica.2010；89:147–150中报道了已经发现达肝素(dalteparin)，一种低分子量肝素(LMWH)促进分娩过程，因此缩短了分娩时间，据其建议达肝素在分娩中增加诱导子宫平滑肌收缩的催产素并且还刺激宫颈细胞中细胞因子的释放。即使达肝素通常看来对分娩过程带来积极作用，但是由于其抗凝作用导致失血的危险因而在临床上是不可行的。

WO 03055499教导了硫酸化的葡糖胺聚糖，例如肝素，具有100BP单位/mg或更低的抗凝血活性，通常能够有效预防性启动或治愈性治疗宫颈和子宫平滑肌用于在妇女中建立有效的分娩。该文献建议硫酸化的葡糖胺聚糖可以和催产素联合用于低内源性催产素水平情况下子宫平滑肌的启动。然而，该文献没有建议当并发症出现要求直接治疗功效时，硫酸化的葡糖胺聚糖可用于直接介入治疗。

如今，对经历分娩停止的妇女越来越多地施用催产素直到重新建立有效的分娩。由于施用高剂量的催产素来重新建立有效的宫缩，存在这样的高风险，即太频繁的宫缩导致胎盘中较低的血流量，危及胎儿并常常导致胎儿窒息。

尽管在分娩过程中进入分娩停止对于妇女是极大的全球问题，但是很少有针对加速分娩而开发新药的努力。本发明通过向分娩停止的妇女施用有效量的某些硫酸化的葡糖胺聚糖以重新建立有效的分娩而解决了该问题。

发明内容

具有10IU/mg以下的抗因子IIa活性和10IU/mg以下的抗因子Xa活性的化学修饰的肝素或硫酸乙酰肝素与能够促进子宫的子宫肌层收缩的试剂联合施用，由此重新建立有效的分娩并治疗分娩停止。通过根据本发明的方法和用途可以治疗初级和二级分娩停止。

附图说明

图1是显示妇女分娩时间的图，该妇女已接受催产素并已用根据本发明的化学修饰的肝素或硫酸乙酰肝素(DF01)治疗或已接受安慰剂。

图2A-2D显示了当使用催产素和根据本发明的化学修饰的肝素或硫酸乙酰肝素(DF01)联合治疗时在子宫肌细胞中的钙离子流入量。

具体实施方式

在描述本发明之间，还应了解本文所用的术语仅为了描述特定实施方案的目的而使用，并不旨在限定，因为本发明的范围仅由所附权利要求书及其等同方案加以限定。

必须指出的是，如在本说明书和所附权利要求书中使用的，单数形式“一”、“该”和“所述”包括复数指代，除非上下文另有明确规定。

此外，在适用的情况下，术语“约”用于表示一个给定值的+/-2％的偏差，优选数值的+/-5％的偏差，最优选数值的+/-10％的偏差。

在本发明上下文中使用的术语“分娩停止”是指在从孕妇一经有重复性的宫缩开始的所有分娩阶段中分娩的不正常的情况。分娩的正常过程被定义为有规律子宫的子宫肌层收缩，导致至少每小时约1厘米的子宫颈扩张直到10cm的扩张。在本发明的上下文中，正常分娩过程也被定义为有效分娩。

分娩停止是指不同的情况，从比正常过程慢的情况(亦即，在1小时过程中、在1-2小时过程中或在至少2小时过程中子宫颈扩张小于约1cm)，到子宫颈成熟以及子宫的子宫肌层收缩的过程的完全缺乏的情况。分娩停止在未经产的妇女中比在经产的妇女中更为常见。根据目前的实践，在确定了该妇女比正常过程慢之后，在多等额外的一小时以判断该妇女是否可以进入正常的过程而不用治疗后，通常才开始用催产素治疗。

妇女可以在分娩的不同阶段产生分娩停止。早期分娩停止(有时称为“初级停止”)经常是由于受损的子宫颈扩张，在分娩末期(亦即，当妇女扩张≥5-6cm，并且最初cm为正常过程时，称为“二级停止”)是由于受损或者不足的子宫的子宫肌层收缩。本文中分娩停止的含义延伸到了如下的临床常见术语，例如难产、缓慢的分娩过程、分娩停止、生产完全中断(complete cessation of progress)，功能障碍性分娩失败(dysfunctional labor failure)和已经经历了重复性宫缩后的头盆不称(cephalopelvic disproportion)。在停止之前，分娩的启动可以是自发的或是通过常规的方法或治疗启动。与自发启动分娩的妇女相比，在已经通过药物或者物理手段诱发分娩的妇女中妇女经历分娩停止的频率更高。

在本发明的上下文中，术语“分娩停止的治疗”涉及疗法，其中从施用中要求直接应答效应。在分娩情况下，要求该施用直接导致子宫的子宫肌层收缩的促进或刺激。换言之，本发明不涉及预防性疗法，其中在进入分娩之前，妇女可以接受疗法以预防或抵消延迟的分娩。

术语“联合(in combination)”是指用本发明中所述的化学修饰的肝素或者硫酸乙酰肝素与另一有效促进或刺激子宫的子宫肌层收缩的试剂联合治疗。“联合”具有广泛的含义，其包括辅助地、同时地、顺序地或者平行地进行治疗的情况中的任意种。其还可以指本发明所述的化学修饰的肝素或硫酸乙酰肝素被施用作对另一用于促进或刺激子宫的子宫肌层收缩的试剂的追加治疗。在追加治疗的情况下，本发明所述的化学修饰的肝素或硫酸乙酰肝素被施用于已经用能够促进子宫的子宫肌层收缩的试剂治疗的妇女。

本发明公开了用于对遭受分娩停止的妇女重新建立有效分娩的具有低抗凝作用(例如抗因子Xa活性200IU/mg以下)的硫酸化葡糖胺聚糖。所述硫酸化葡糖胺聚糖与能够促进子宫的子宫肌层收缩的试剂联合施用治疗分娩停止。

葡糖胺聚糖为硫酸化的葡糖胺聚糖，其选自硫酸乙酰肝素、解聚的硫酸乙酰肝素、肝素、解聚的肝素(例如低分子量肝素)硫酸皮肤素、硫酸皮肤素、硫酸软骨素和解聚的硫酸软骨素。

硫酸化葡糖胺聚糖是硫酸乙酰肝素，硫酸皮肤素和硫酸软骨素，其由交替的己糖胺和糖醛酸残基构成。D-葡糖醛酸(GlcA)和其C-5差向异构体L-艾杜糖醛酸(IdoA)的存在和己糖胺和糖醛酸(uronosyl)残基的特异性硫酸化赋予了聚合物极大的结构差异。此结构由重复的二糖构建，所述二糖包含从无或极少至接近100％的含艾杜糖醛酸的二糖。含GlcA-和IdoA-N-己糖胺的二糖结构可以从长嵌段至交替的二糖模式变化。硫酸化的变化和艾杜糖醛酸硫酸盐的程度产生众多生物活性。有不同的定义明确的硫酸皮肤素、硫酸软骨素、硫酸乙酰肝素、肝素和肝素的多糖。

硫酸乙酰肝素，具有葡糖胺和糖醛酸作为重复二糖，且由主要以分隔方式排列的N-乙酰化和N-硫酸化二糖组成，其在细胞表面和细胞外基质中具有广泛分布。其与肝素相比通常较少硫酸化且具有较低的艾杜糖醛酸含量并且具有更加多变的结构。硫酸乙酰肝素和蛋白质之间的相互作用牵涉多种生理过程，例如细胞粘附、细胞增殖、酶调节、细胞因子作用、病毒入侵和抗凝血特性。硫酸乙酰肝素具有依赖于特定抗凝血五糖存在的抗凝血活性，然而明显不如肝素。硫酸乙酰肝素是线性多糖，其可以如Fransson等人，Structural studies on heparan sulphates，Eur.J.Biochem.106，59-69(1980)所述，从猪的肠粘膜或从牛肺，使用氯化十六烷基吡啶部分和随后的盐提取物从肝素支链部分制备。

硫酸软骨素是硫酸化线性多糖，其由交替的葡糖醛酸和N-乙酰-半乳糖胺残基组成，后者在4或6位被硫酸化。它们可以由牛气管软骨或鼻软骨制备。硫酸软骨素对于细胞外基质的组建很重要，其产生间质的膨胀压力并参与中性粒细胞的募集。

硫酸皮肤素是硫酸化线性多糖，其由交替的糖醛酸和N-乙酰-半乳糖胺残基组成。糖醛酸是D-GlcA或L-IdoA并且所述二糖可以分别在半乳糖胺和IdoA的4和6和2位上被硫酸化。硫酸皮肤素可以从猪皮肤、肠粘膜和牛肺制备。其具有生物学活性，例如细胞外基质的组建、与细胞因子相互作用、抗凝血活性和中性粒细胞的募集。

肝素是天然存在的葡糖胺聚糖，其由肥大细胞合成并存储在肥大细胞的细胞内。肝素，工业上是通过猪的肠道粘膜制备，是一种有效的抗凝血剂，并已经作为优选的预防和治疗血栓栓塞性疾病的药物用于临床60余年。肝素治疗的主要潜在副作用是由其抗凝血特性和低生物利用率引起的出血并发症。肝素是高度多分散性的并由分子量范围在5至40kDa(平均大约在15至18kDa)的多糖异质群体组成。

低分子量肝素或肝素是线性寡糖，主要由交替的N-硫酸化葡糖胺和IdoA残基组成，并且常包含抗凝血五糖。它们可以通过特异性化学裂解或酶裂解由肝素制备。它们的主要临床功能是通过凝血因子Xa的抗凝血酶增强抑制作用，从而产生抗血栓形成作用。已提出其具有抗转移(antimetastatic)性质。(Pfizer,美国)是通过受控的肝素获得的低分子量肝素的例子，其由于因子Xa的抑制而具有抗血栓形成作用。具有选择性抗凝血活性的肝素片段及其制备方法描述于美国专利号4,303,651中。根据欧洲药典(Pharm Eur)，肝素如果被称为低分子量肝素(低分子质量肝素)应当具有不在70IU(国际单位)/mg以下的抗因子Xa活性并且M_w在8 000Da以下。肝素、低分子量肝素和其它肝素衍生物的抗凝血活性通常以它们通过抗凝血酶增强凝血因子Xa和因子IIa的抑制的能力被测量。测量抗因子Xa-和抗因子IIa活性的方法对技术人员而言是已知的，还描述于药典，例如欧洲药典(Pharm Eur)和美国药典(USP)中。通过例如选择性高碘酸盐氧化(见例如Fransson LA和Lewis W,Relationship between anticoagulant activity of heparin andsusceptibility,to periodate oxidation,FEBS Lett.1979,97:119-23；Lindahl等人,ProcNatl Acad Sci USA,1980；77(11):6551-6555)和技术人员已知的其它手段可以去除抗凝血活性。

低分子量肝素或解聚肝素是线性寡糖的混合物，主要由交替的N-硫酸化葡糖胺和IdoA残基组成，并且常包含抗凝血五糖。它们可以通过特异性化学裂解由肝素制备。它们的主要临床功能是凝血因子Xa，从而产生抗血栓形成作用。已提出其具有抗转移性质。(Pfizer,美国)是通过受控的肝素获得的低分子量肝素的例子，其由于因子Xa的抑制而具有抗血栓形成作用。具有选择性抗凝血活性的肝素片段及其制备方法描述于美国专利号4,303,651中。

本发明涉及治疗已经经历过重复性宫缩后进入分娩停止的妇女的分娩停止的方法。通过向处于分娩停止的孕妇施用有效量的具有10IU/mg以下的抗因子IIa活性和10IU/mg以下的抗因子Xa活性的至少一种化学修饰的肝素或硫酸乙酰肝素联合能够促进子宫的子宫肌层收缩的试剂，重新建立有效的分娩，由此治疗分娩停止。对于经历初级分娩停止的妇女而言，治疗分娩停止意味着恢复重复性的子宫的子宫肌层收缩，提高频率，持续时间以及强度来引起正常过程的子宫颈扩张；对于经历二级分娩停止的妇女而言，重新建立有效的分娩以及治疗分娩停止意味着恢复周期性的子宫的子宫肌层收缩，进而引起新生儿的排出。根据本发明的治疗分娩停止应当作为直接介入施用疗法而进行，该疗法在施用后直接启动一个直接或者间接导致重新建立有效分娩和治疗分娩停止的过程。

分娩停止与低子宫浓度和明显减少的硫酸乙酰肝素基因表达均有关(HjelmCluff A,B,Klimaviciute A,Dahlqvist C,Cebers G,A andEkman-Ordeberg G:Prolonged labour associated with lower expression of syndecan 3and connexin 43in human uterine tissue.Reproductive Biology and Endocrinology2006,4:24)。据本发明人所知，根据本发明方法施用化学修饰的肝素或硫酸乙酰肝素，子宫平滑肌中硫酸乙酰肝素的浓度可以恢复，因此可以用来治疗分娩停止，进而重建有效的收缩。分娩停止的治疗减少了分娩时间，进而减少了并发症，亦即，产后出血和母亲的子宫内膜炎，以及胎儿宫内窒息和与延长分娩时间相关的感染的增加风险。重要的是，其还降低了对母亲和胎儿均有风险的外科手术剖腹产(caesarian sections)的数量。剖腹产也是昂贵的，因此，本发明也有经济上的优势。

分娩停止可以与低子宫颈成熟度或低频率，和无效收缩或两者有关。根据本发明待施用的化学修饰的肝素或硫酸乙酰肝素可以在子宫颈以及子宫上均发挥效力。关于宫颈成熟，就本发明人所知，根据本发明方法待施用的化学修饰的肝素或硫酸乙酰肝素还可能存在与前列腺素E2(prostaglandinE2)的协同效果。关于子宫收缩，就本发明人所知，根据本发明方法待施用的化学修饰的肝素或硫酸乙酰肝素将用所述化学修饰的肝素或硫酸乙酰肝素补充子宫肌层组织水平，使得例如催产素(经常用于引发分娩的试剂)可以在子宫肌层上发挥其收缩作用。一个效果是施用的催产素的量可以降低，进而可避免其消极的副作用。

一方面，根据本发明施用的化学修饰的肝素或硫酸乙酰肝素具有30000Da或更小的重均分子量(Mw)。另一方面，根据本发明施用的化学修饰的肝素或硫酸乙酰肝素的重均分子量(Mw)在20000Da以下。另一方面，根据本发明施用的化学修饰的肝素或硫酸乙酰肝素的重均分子量(Mw)为10000Da或更小。另一方面，根据本发明施用的化学修饰的肝素或硫酸乙酰肝素的重均分子量(Mw)不高于8000Da。在另一方面，根据本发明施用的化学修饰的肝素或硫酸乙酰肝素的重均分子量(Mw)不高于7000Da。

一方面，本发明涉及一种方法，其中向遭受分娩停止的妇女施用化学修饰的肝素，该化学修饰的肝素属于由平均分子量在20 000Da以下的肝素构成的组。另一方面，解聚的肝素具有10 000Da以下的平均分子量。另一方面，解聚的肝素平均分子量不高于8000Da，再一方面，解聚的肝素平均分子量不高于7000Da。

如上面提到的，一些硫酸化葡糖胺聚糖具有抗凝血特性。但是，对于例如在分娩过程中通过重新建立有效分娩来治疗分娩停止所使用的制剂而言，抗凝血作用通常是不希望的。

因此，对于不希望抗凝血作用的应用而言，在本发明的方法中使用的化学修饰的肝素或者硫酸乙酰肝素具有30IU/mg或更低的抗因子Xa活性，以及30IU/mg或更低的抗因子IIa活性。另一方面，在本发明的方法中使用的化学修饰的肝素或者硫酸乙酰肝素具有10IU/mg或更低的抗因子Xa活性，以及10IU/mg或更低的抗因子IIa活性。

肝素、低分子量肝素和其他肝素衍生物的抗凝血活性通常根据它们增强抗凝血酶抑制凝血因子Xa和凝血因子IIa的能力加以测量。测量抗因子Xa-和抗因子IIa活性的方法是本领域技术人员公知的，且也记载在药典中，例如欧洲药典(PharmEur)，以及美国药典(USP)中。

抗凝血活性可以通过例如选择性的高碘酸盐氧化作用去除(参见例如，Fransson LA,and Lewis W,Relationship between anticoagulant activity of heparin andsusceptibility,to periodate oxidation,FEBS Lett.1979,97:119-23；Lindahl et al.,ProcNatl Acad Sci USA,1980；77(11):6551-6555)，但是也可以通过其他本领域技术人员已知的其他手段去除。

在一方面，在本发明的方法中使用的化学修饰的肝素或者硫酸乙酰肝素具有10IU/mg或更低的抗因子Xa活性，以及10IU/mg或更低的抗因子IIa活性。

另一方面，化学修饰的肝素或者硫酸乙酰肝素的二糖结构基本上没有非硫酸化葡糖醛酸和艾杜糖醛单元，且具有10IU/mg或更低的抗因子Xa活性，以及10IU/mg或更低的抗因子IIa活性。

在另一方面，化学修饰的肝素是低抗凝性的肝素，其具有10IU/mg或更低的抗因子Xa活性，以及平均分子量不高于8000Da或不高于7000Da。

在一方面，本发明涉及化学修饰的肝素的用途；其中肝素的抗凝作用通过用高碘酸盐处理以消除抗凝血酶的结合亲和力来消除的。获得这样的化学修饰的肝素的一个非限制性方式是进行高碘酸盐氧化，接着进行产物的碱性β-消除。这个过程导致抗凝血活性的消除。美国专利4,990,502(Lormeau等人)中公开的方法阐明了一种处理天然肝素的方式，以选择性裂解负责抗凝血作用的五糖序列和随后的解聚，其得到平均分子量5.8至7.0kDa的低抗凝血肝素。

在一方面，在本发明的方法中使用的化学修饰的肝素具有的平均分子量(Mw)为约4.6到6.9kDa。

在一方面，本发明方法涉及化学修饰的肝素用于治疗分娩停止的用途，所述化学修饰的肝素包含

(i)基本上不含调节抗凝血作用的化学完整的糖序列的多糖链；以及

(ii)对应于1.2至12kDa的分子量的多糖链，所述多糖链具有根据(式I)的主要出现的二糖，

其中，

n为2到20的整数。

在本文中，包含基本上不含调节抗凝血作用的化学完整的糖序列的多糖链的化学修饰的肝素或硫酸乙酰肝素，意味着多糖链已经经过化学处理以基本上修饰全部通过抗凝血酶(AT)特异性调节抗凝血作用的五糖。

这样的化学修饰的肝素的主要出现的多糖链具有分子量为3.6-7.2kDa的6到12个二糖单位，而至少70％的多糖链的分子量为至少3kDa以上。多糖分布及其对应的以重量累积％表示的分子质量可以是根据下表：

此外，多糖包含糖链，所述糖链具有如式I所示的还原末端残基并且基本上不含有完整的非硫酸化的艾杜糖醛酸和/或葡萄糖醛酸。

在一方面，该化学修饰的肝素包含修饰的葡糖胺，其信号存在于¹H-NMR波谱的5.0至6.5ppm之间，其强度(比例％)相比于来自于天然肝素的5.42ppm处的信号在4％以下。这些葡糖胺信号可以存在于5.95ppm和6.15ppm处。在一方面，葡糖胺总量的1％以下被修饰。

在本文中，“修饰的葡糖胺”是指具有残基结构的葡糖胺，所述残基结构不预期出现在肝素产品或低分子量肝素产品(解聚的肝素)的¹H-NMR波谱中。修饰的葡糖胺的出现可以归因于用于氧化非硫酸化的艾杜糖醛酸和/或葡萄糖醛酸以基本上消除抗凝血作用的化学修饰过程。合意的是使修饰的葡糖胺的存在最小化，因为它们可以代表化学修饰的肝素产品的不可预测的性质，例如非特异性解聚。

在一方面，化学修饰的肝素包含在非还原性末端具有不饱和键的修饰的葡糖胺。这类修饰的葡糖胺信号存在于¹H-NMR波谱中的5.95ppm和6.15ppm处。

本发明的方法也可以用于治疗分娩停止，不论启动时诱发的还是自发的。在本发明的上下文本中，“引产”通常定义为一种干预，其直接或间接启动足够有效的分娩从子宫的子宫肌层收缩至导致分娩和孩子诞生过程的完成。

可以多种方式引产，均是本领域技术人员公知的。引产方法的非限制性例子为物理刺激方法，施用催产素，前列腺素E或其衍生物，例如米索前列醇和地诺前列素；破裂羊膜囊(rupturing the amniotic sac)，扩张子宫颈，以及施用子宫颈内气圈(intracervical ballon)。也可以使用这些引产方法的组合。

本发明涉及与能够促进或刺激施用于孕妇的子宫的子宫肌层收缩的试剂的联合治疗不充分的分娩过程。这类试剂的非限制性实例有催产素和前列腺素类如PGE1(米索前列醇)和PGE2。在本发明的一方面，能够促进或者刺激子宫的子宫肌层收缩的的试剂是催产素。因此，当化学修饰的肝素或者硫酸乙酰肝素作为催产素的辅助制剂施用时，其促进了催产素诱发的子宫的子宫肌层收缩。本领域技术人员将制定治疗方案，优选制定为与催产素的临床例行程序相适应，因为化学修饰的肝素或硫酸乙酰肝素将与催产素平行施用。在本发明该方面的非限制性例子中，至少每24小时施用化学修饰的肝素或硫酸乙酰肝素一次，并且辅助催产素的治疗直至约36小时。在另一方面，施用化学修饰的肝素或硫酸乙酰肝素1-24次/24小时。在另一方面，施用化学修饰的肝素或硫酸乙酰肝素6次/24小时。可以静脉内和/或皮下进行施用。在一方面，通过持续输注施用化学修饰的肝素或硫酸乙酰肝素。在目前临床实践中，静脉内施用催产素。

在所述方法的一方面，妇女每24小时接受直至1.5g化学修饰的肝素或硫酸乙酰肝素。在另一方面，妇女每24小时接受直至1.2g化学修饰的肝素或硫酸乙酰肝素，并且作为非限制性例子，1.2g/24小时以200mg剂量施用6次。在所述方法的一方面，妇女经受重复性子宫肌层收缩但是已经进入分娩停止。在该方面，所述方法包括施用化学修饰的肝素或硫酸乙酰肝素，其能辅以能够促进或刺激子宫收缩的试剂，例如催产素，从而恢复子宫肌层收缩。

在一方面，用于本发明的化学修饰的肝素或硫酸乙酰肝素可以与有效量的促进子宫的子宫肌层收缩的试剂配制在一起，并因此通过前面建议的施用途径在一个组合物中一起施用(共施用)。

在一方面，用于本发明的化学修饰的肝素或硫酸乙酰肝素的组合物与能够促进子宫的子宫肌层收缩的试剂的至少一种组合物被包含在试剂盒中。依据不同临床情况，可以单剂量形式或多剂量形式提供组合物。剂型可以适合于施用工具，所述施用工具也可以是试剂盒的一部分。为此目的，所述试剂盒可以进一步包含显示如何和何时施用被包含的组合物的临床说明书。

根据目前的实践，促进子宫肌层收缩的试剂的浓度被滴定以达到合意的效果，并且不施用超过妇女必需的所述试剂。滴定通常开始于低剂量，其被增加直至已经确定了合意的效果(即子宫的子宫肌层收缩)。在一方面，化学修饰的肝素或硫酸乙酰肝素的组合物与至少一种组合物的多剂量形式一起包含在试剂盒中，所述组合物包含适合于数个剂量施用的能够促进子宫的子宫肌层收缩的试剂。在一个例子中，所述试剂盒包含多剂量形式的催产素，并且所述化学修饰的肝素或硫酸乙酰肝素与初始低剂量或标准剂量的催产素联合施用。如果患者停留在分娩停止中，可以来自多剂量形式的受控的剂量施用催产素一次或数次直至分娩过程被重新确立。

所述方法可以包括施用具有如本说明书任何在先部分中所定义的特性的化学修饰的肝素或硫酸乙酰肝素。

催产素经常施用于孕妇以引发分娩或者治疗分娩停止。经常地，催产素的效果是削弱的，可能是由于缺少硫酸乙酰肝素导致超剂量的催产素，这可带来严重的副作用例如过高收缩性。综合使用本发明方法和施用化学修饰的肝素或硫酸乙酰肝素可以逆转削弱的催产素的效果，从而诱发催产素节约效应(sparing effect)，避免高收缩性和胎儿并发症的风险。据本发明人所知，这可以通过以下方式表达：除非硫酸乙酰肝素的水平恢复到必须/充足的水平，否则催产素不能发挥其收缩效果。因此，根据本发明的方法和用途引起催产素施用量的降低。

采用本发明的介入治疗，通过重新建立有效的分娩来治疗分娩停止，可以显著减少缩短的分娩时间和分娩并发症的数量，例如剖腹产手术。滞产还与其它母婴并发症相关，例如产后出血、器械分娩和子宫内膜炎以及胎儿窒息和感染的增加风险。催产素对子宫收缩没起作用导致频繁的剖腹产手术，包括紧急情况下进行的剖腹产手术。

用于本发明方法的化学修饰的肝素或硫酸乙酰肝素可以作为药物组合物通过胃肠外施用而系统地施用，例如通过皮下或静脉内注射。对于胃肠外施用，活性化合物可以合并入溶液或混悬剂，所述溶液或混悬剂还含有一种或多种佐剂，例如无菌稀释剂如注射用水、生理盐水、固定油、聚乙二醇、丙三醇、丙二醇或其它合成溶剂、抗菌剂、抗氧化剂、螯合剂、缓冲剂和调节渗透度的试剂。可以在安瓶、小瓶、一次性注射器中或作为输液装置递送胃肠外制剂，还可以用于自我给药。

用于本发明方法的化学修饰的肝素或硫酸乙酰肝素可以通过皮下施用，并因此采用合适的自施用工具如注射器进行施用。

此外，用于本发明方法中的化学修饰的肝素或硫酸乙酰肝素适合于局部施用，包括粘膜渗透，例如，但不限于阴道，直肠，子宫内，以及鼻腔黏膜施用。

在本发明的一方面中，也涉及具有10IU/mg以下的抗因子IIa活性和10IU/mg以下的抗因子Xa活性的化学修饰的肝素或硫酸乙酰肝素，与能够促进子宫的子宫肌层收缩的试剂联合用于治疗分娩停止。上述公开的所有涉及本发明方法和化学修饰的肝素或硫酸乙酰肝素的特征也应用于本发明的这一方面。

在本发明的再一方面，涉及具有10IU/mg以下的抗因子IIa活性和10IU/mg以下的抗因子Xa活性的化学修饰的肝素或硫酸乙酰肝素，与能够促进子宫的子宫肌层收缩的试剂联合用于制备用于治疗分娩停止的药物的用途。所有以上公开的关于本发明方法和化学修饰的肝素或硫酸乙酰肝素的特征也应用于本发明的这一方面。

本发明还涉及在分娩过程中减少催产素施用量的方法，该方法包括如下步骤：对在分娩中遭受分娩停止的孕妇施用有效量的至少一种具有10IU/mg以下的抗因子IIa活性和10IU/mg以下的抗因子Xa活性的化学修饰的肝素或硫酸乙酰肝素。所有以上公开的关于本发明方法和化学修饰的肝素或硫酸乙酰肝素的特征也应用于本发明的这一方面。

本发明包含在本发明中公开的实施方案和各个方面的任意组合。

在以下非限制性实施例中进一步公开本发明。

实施例

根据本发明的化学修饰的肝素的制备方法的详细说明

以下实施例1至9作为例子说明如何生产根据本发明用途的化学修饰的肝素或硫酸乙酰肝素。

从肝素钠制备物质。所述制备涉及用高碘酸盐选择性氧化在肝素中的非硫酸化的糖醛酸残基，包括结合于AT的五糖序列中的葡萄糖醛酸部分。破坏该残基的结构毁坏了与AT的高亲合性相互作用，并且因此基本上消除抗凝血作用(以a-FXa或a-FIIa测定)。随后的碱处理，β消除反应导致聚合物在已经被高碘酸盐氧化的非硫酸化糖醛酸位点上裂解。同时，这些操作处理导致抗凝血活性的丧失和肝素链的充分解聚。

另外，用NaBH₄还原所得到的裂解位点处的还原末端端子，其将末端醛转化为相应的更稳定的二醇。然后，通过用乙醇的反复沉淀、过滤和离心除去添加剂、杂质和副产物。然后通过真空和加热干燥获得粉末形式的物质。将药物物质溶解于无菌水性缓冲液中以得到药物产品，其旨在用于静脉内或皮下施用。

目前为止描述的方法通常包括氧化、聚合物裂解(碱水解)和还原步骤。开发根据本发明的方法以抵消或消除肝素链的任何类型的非特异性解聚。在这种情况下，非特异性解聚通常指与特异性碱性β消除反应无关的解聚。非特异性解聚导致产物的结构不稳定，其可能产生纯化的产品在储存期间进一步的解聚和变色。另外，其可能有助于平常在肝素中没有发现的，在NMR波谱中出现的，非典型物种的出现。

在以下段落中描述和列举的方法包括抵消或消除非特异性解聚的不同方面。

实施例1：

非硫酸化葡萄糖醛酸和艾杜糖醛酸(残基)的氧化，结合AT的五糖和抗凝血活性的删除

将约3000克肝素溶解于净化水中以得到10-20％w/v的溶液。将该溶液的pH调节至4.5-5.5。然后，将偏高碘酸钠(NaIO₄)加入到生产溶液中；高碘酸盐的量为肝素重量的15-25％。再次将pH调节至4.5-5.5。避光进行反应。在保持13-17℃的温度下，在连续搅拌下，使生产溶液反应18-24小时，其中在最后的两个小时中将温度降至5℃。

氧化反应的终止和含碘化合物的除去

于5-25℃的温度，伴随着温和的搅拌，将乙醇(95-99.5％)经0.5-1小时添加入反应混合物中。添加的乙醇的体积在1-2体积乙醇/生产溶液体积的范围内。然后使氧化的肝素沉淀并沉积15-20小时，然后倾倒出并弃除母液。

然后，将沉积物溶解于净化水中以获得15-30％w/v生产溶液。加入NaCl以获得生产溶液中0.15-0.30mol/升的浓度。在保持5-25℃的温度同时继续搅拌另外的0.5-1小时。然后在搅拌下，将1.0-2.0体积乙醇(95-99.5％)/生产溶液体积经0.5-1小时加入到该溶液中。从该溶液中沉淀出产物。

通过碱性β消除过程的多糖链的解聚

倾倒出并弃除母液后，将沉积物于约7升的水中搅拌直至完全溶解，溶液的浓度现在为15-30％。在保持5-25℃的温度同时缓慢加入4M NaOH溶液直至获得10.5-12的pH。引发并进行反应15-95分钟。此时，记录溶液的pH并缓慢添加4MHCl直至获得5.5-7的pH。

还原性末端端子的还原

在保持13-17℃的温度同时，将溶液的pH调节至5.5-6.5。然后将130-150克硼氢化钠加入至溶液中，此时pH将升至10-11，继续反应14-20小时。这段反应时间后，缓慢加入稀酸以调节pH值至4，这降解剩余的硼氢化钠。维持4的pH值45-60分钟后，使用稀的NaOH溶液将溶液的pH调节至7。

根据实施例5继续纯化。

实施例2

葡萄糖醛酸和艾杜糖醛酸(残基)的氧化，抗凝血活性的删除

将约3000克肝素溶解于净化水中以得到10-20％w/v的溶液。将该溶液的pH调节至4.5-5.5。然后，将偏高碘酸钠(NaIO₄)加入到生产溶液中；高碘酸盐的量为肝素重量的15-25％。再次将pH调节至4.5-5.5。避光进行反应。在保持13-17℃的温度下，在连续搅拌下，使生产溶液反应22-26小时，其中在最后的两个小时中将温度降至5℃。反应期结束时测定并记录pH。

氧化反应的终止和含碘化合物的除去

通过碱性β消除过程的多糖链的解聚

倾倒出并弃除母液后，将沉积物于约7升的水中搅拌直至其外表显示完全溶解。在保持20-25℃的温度同时缓慢加入4M NaOH直至获得10.5-12的pH，因此允许引发的反应进行15-95分钟。此时，记录溶液的pH并缓慢添加4M HCl直至获得5.5-7的pH。

还原性末端端子的还原

倾倒出并弃除母液后，通过添加净化水溶解沉积物直至获得15-30％w/v的生产溶液浓度。在保持13-17℃的温度同时，将溶液的pH调节至5.5-6.5。然后将130-150克硼氢化钠加入至溶液中并使其溶解，pH立即升至pH 10-11，继续反应14-20小时。记录该反应时间段之前和之后的溶液的pH。这段反应时间后，缓慢加入稀酸以调节pH值至4，这降解剩余的硼氢化钠。维持4的pH值45-60分钟后，使用稀的NaOH溶液将溶液的pH调节至7。

根据实施例5继续纯化。

实施例3

葡萄糖醛酸和艾杜糖醛酸(残基)的氧化，抗凝血活性的删除

通过碱性β消除过程的多糖链的解聚

在保持5-25℃的温度同时，缓慢加入4M NaOH溶液直至获得10.5-12的pH。引发并进行反应15-95分钟。此时，记录溶液的pH并缓慢添加4M HCl直至获得5.5-7的pH。

还原性末端端子的还原

在保持13-17℃的温度同时，将溶液的pH调节至5.5-6.5。然后将130-200克硼氢化钠加入至溶液中，此时pH将升至10-11，继续反应14-20小时。这段反应时间后，缓慢加入稀酸以调节pH值至4，这降解剩余的硼氢化钠。维持4的pH值45-60分钟后，使用稀的NaOH溶液将溶液的pH调节至7。

还原的产物的沉淀和含碘化合物的初始去除

于5-25℃的温度，在温和搅拌下，将乙醇(95-99.5％)经过0.5-1小时加入反应混合物中。添加的乙醇的体积在1-2体积乙醇/生产溶液体积的范围内。然后使得氧化的肝素沉淀并沉积15-20小时，然后倾倒出并弃除母液。

然后，将沉积物溶解于净化水中以获得15-30％w/v的生产溶液。加入NaCl以获得生产溶液中0.15-0.30mol/升的浓度。

根据实施例5继续纯化。

实施例4

葡萄糖醛酸和艾杜糖醛酸(残基)的氧化，抗凝血活性的删除

将约3000克肝素溶解于净化水中以得到10-20％w/v的溶液。将该溶液的pH调节至4.5-5.5。然后，将偏高碘酸钠(NaIO₄)加入到生产溶液中；高碘酸盐的量为肝素重量的15-25％。再次将pH调节至4.5-5.5。反应器避光。在保持13-17℃的温度下，在连续搅拌下，使生产溶液反应18-24小时，其中在最后的两个小时中将温度降至5℃。然后，加入丙三醇以淬灭反应，即，将残余高碘酸盐转化为碘酸盐，加入150-200ml 85％的丙三醇溶液并搅拌下反应30-60分钟。

沉淀产物，除去含碘化合物和淬灭/反应产物

然后，将沉积物溶解于净化水中以获得15-30％w/v的生产溶液。加入NaCl以获得生产溶液中0.15-0.30mol/升的浓度。在保持5-25℃的温度同时继续搅拌0.5-1小时。然后，搅拌下，经0.5-1小时，向该溶液加入1.0-2.0体积乙醇(95-99.5％)/生产溶液体积。从该溶液中沉淀出产物。

通过碱性β消除过程的多糖链的解聚

倾倒出并弃除母液后，在约7升的水中搅拌沉积物直至其外观显示完全溶解。在保持5-25℃的温度同时，缓慢加入4M NaOH直至获得10.5-12的pH，允许由此引发的反应进行60-95分钟。此时，记录溶液的pH并缓慢添加4M HCl直至获得5.5-7的pH。

还原性末端端子的还原

倾倒出并弃除母液后，通过添加净化水溶解沉积物直至获得15-30％的生产溶液浓度。在保持13-17℃的温度同时，将溶液的pH调节至5.5-6.5。然后将130-150克硼氢化钠加入至溶液中并使其溶解，pH立即升至pH 10-11，继续反应14-20小时。记录该反应时间段之前和之后的pH。这段反应时间后，缓慢加入稀酸以调节pH值至4，这降解剩余的硼氢化钠。维持4的pH值45-60分钟后，使用稀的NaOH溶液将溶液的pH调节至7。

根据实施例5继续纯化。

实施例5

产物的纯化

过程添加剂和杂质的去除，反离子的添加和过滤

根据如下概括的方法处理来自于由硼氢化物还原末端端子的最终化学修饰步骤的根据实施例1-4的生产溶液。

然后，将一体积的生产溶液添加入1.5-2.5体积的乙醇(95-99.5％)，然后于＜20℃，于＞2000G离心20-30分钟，随后倾倒出并弃除上清液。

然后将离心获得的产物糊状物溶解于净化水中以获得10-20％w/v的产物浓度。然后加入NaCl以获得0.20-0.35mol/升的浓度。然后，每体积生产溶液添加1.5-2.5体积的乙醇(95-99.5％)，其从溶液中沉淀出产物。接着如上所述离心。

然后，向剩余的糊状物中添加净化水以溶解。现在的产物浓度在10-20％w/v的范围内。然后将产物溶液的pH调节至6.5-7.5。然后过滤溶液以除去任何微粒。然后，向一体积的生产溶液中添加1.5-2.5体积的乙醇(95-99.5％)。然后于＜20℃，于＞2000G，进行离心20-30分钟，然后倾倒出并弃除上清液。

沉淀糊状物的脱水和粒径的降低

向反应器中填充入乙醇约2升体积。在搅拌乙醇下，同时加入沉淀糊状物。机械搅拌固化糊状物并用乙醇替换存在的水得到同质颗粒混悬液。1-2小时后停止搅拌，然后使颗粒沉积。移除过量的液体后，使颗粒过筛或研磨以获得较小的且均匀大小的颗粒。

产物的干燥

将产物均匀地分布于托盘上，并置于真空箱中。施用真空并于35-40℃进行加热。此时，在保持干燥器内低压同时，氮气蒸汽通过干燥器。当产物获得稳定的重量时，即没有发现进一步的蒸发，视为完成干燥。包装产品并防湿保存。

实施例6

葡萄糖醛酸和艾杜糖醛酸(残基)的氧化，抗凝血活性的删除

通过碱性β消除过程的多糖链的解聚

在保持5-25℃的温度同时，缓慢加入4M NaOH直至获得10.5-12的pH，允许由此引发的反应进行15-95分钟。此时，记录溶液的pH并缓慢添加4M HCl直至获得5.5-7的pH。

还原性末端端子的还原

倾倒出并弃除母液后，通过添加净化水溶解沉积物直至获得15-30％w/v的生产溶液浓度。在保持13-17℃的温度同时，将溶液的pH调节至5.5-6.5。然后将130-200克硼氢化钠加入至溶液中并使其溶解，pH立即升至pH 10-11，继续反应14-20小时。记录该反应时间段之前和之后的pH。这段反应时间后，缓慢加入稀酸以调节pH值至4，这降解剩余的硼氢化钠。维持4的pH值45-60分钟后，使用稀的NaOH溶液将溶液的pH调节至7。然后向溶液中加入净化水直至获得15-20mS/cm的反应溶液导电性。

通过离子交换色谱法纯化产物

将直径500mm的色谱柱用介质、DEAE-Sepharose或QAE-Sepharose填装至对应于10-15cm床高的25-30升体积。进行色谱法3-4轮以纯化所有的产物。

然后制备缓冲液，

平衡缓冲液，缓冲液A，15mM磷酸盐，150mM NaCl

洗脱缓冲液，缓冲液B，2M NaCl溶液

装备缓冲液，0.5M NaOH

于15-25℃，以≤200cm/小时或约350升/小时的流速，进行该色谱法步骤。

将柱用平衡缓冲液平衡直至洗脱液具有15-20mS/cm的导电性。然后将氧化肝素溶液泵入柱内。应用的粗产物的量相当于＜40g/升的色谱法介质。

平衡缓冲液后进行等度(isocratic)冲洗，并当UV 210-254nm达到基线时停止冲洗。典型地，需要5床体积的缓冲液来达到基线。除去添加入过程中的化学品和这些化学品形成的产物。

然后，通过进行梯度洗脱，应用于柱上的缓冲液的离子强度线性增加。缓冲液A从100％降至0％，而被超过5床体积的100％缓冲液B替换。当UV吸收为＞0.1AU时收集产物(洗脱物)，并且当信号＜0.1AU时停止收集。然后进行柱的保洁，随后再次准备色谱柱以用于下一轮色谱法。合并所有轮次的洗脱物并保存于15-25℃。

产物的脱盐

于15-25℃，连续搅拌下，向一体积上述步骤中获得的合并的洗脱物添加3体积的95-99.5％乙醇。从该溶液中沉淀出产物。允许产物沉积＞3小时。然后，将沉积物溶解于净化水中达到15-25％的浓度。然后将溶液加入95-99.5％的冷乙醇(＜-5℃)，典型地消耗5体积乙醇/一体积产物溶液。然后，于＞2000G，以连续模式离心，然后收集并制得产物糊状物以干燥。

产物的干燥

将产物均匀地分布于托盘上，并置于真空箱中。应用真空并于35-40℃进行加热。此时，在保持干燥器内低压同时，氮气蒸汽通过干燥器。当产物获得稳定的重量时，即没有发现进一步的蒸发，视为完成干燥。粉碎产物并得到同质性，然后包装产品并防湿保存。

实施例8

使根据实施例1和3制备的低抗凝血肝素经历1H-NMR分析并与天然肝素的波谱比较。

表II阐明了产生于非还原性末端不饱和葡糖胺的不存在于天然肝素中的5.00ppm至6.50ppm之间的信号。表II的结果显示能够从天然肝素降低这样的不被预测存在于波谱中的化合物的存在至一个很低的水平。作为对比，对于5.70-8.00ppm区域内的任何信号，目前适用于肝素质量控制的限制(EDQM的专题7)为与5.42ppm的信号相比＜4％。

表II、关于异常信号的低抗凝血肝素的定量结果。1H-NMR波谱中信号6.15和5.95ppm的信号强度

另外，通过联合1H-NMR和13C-NMR波谱评估(HSQC)还定量了非还原性末端不饱和葡糖胺的存在，并以mol％的总葡糖胺证明(见表III)。

另外，通过以下的NMR二维(2D)方法分析样品，所述NMR二维方法涉及如前所述的质子和碳NMR波谱(HSQC)的联合应用(参见Guerrini M.,Naggi A.,Guglieri S,Santarsiero R,Torri G.Anal Biochem 2005；337,35-47)。

表III阐明了与低抗凝血肝素的葡糖胺的总量相比的修饰的葡糖胺的部分(％)，其以¹H-NMR波谱中的5.95ppm和6.15ppm处的信号存在。

表III：总葡糖胺的异常信号5.95ppm、6.15ppm的定量测定结果

实施例9

可以通过常规的无菌工艺将根据上述任何一个实施例生产的产品制成药物产品，例如pH 6-8的含有150mg/mL的活性产物和15mM磷酸钠的溶液。如此获得的药物产品主要旨在用于皮下施用，但也适用于静脉内施用。

得到的产品是具有设计的4.6-6.9kDa平均分子量并基本上无抗凝血活性的肝素的解聚形式。

所述产品具有对应于1.2-15kDa的分子量n为2-20范围内的多糖聚合物的粒径分布。主要的大小是对应于3.6-9.6kDa分子量的6-16个二糖单元。

通过用TSK 2000和TSK 3000SW串联柱进行的GPC-HPLC测定分子量。使用折射率来评估。对于LMWH使用第一国际校准物。

下面呈现分子质量分布和总重量累积百分比的对应部分。

表IV、几个批次的多糖分布及以重量累积％表示的其对应的分子质量

重均平均分子量的对应值，Mw落入4.6-6.9kDa的范围内。

实施例10

于环境温度，研究了根据实施例1至3制备的和根据实施例9配制的化学修饰的肝素的药物物质(粉末)和溶解于磷酸盐水性缓冲溶液中的药物产品的稳定性达36个月。初始产品为纯白色至浅黄色溶液，在400nm(10％w/v溶液)具有0.14吸光度，pH为7.0和渗透度为658mOsm/kg，平均分子量为5.6kDa且浓度为150mg/ml。

36个月之后，药物产品具有相同的视觉外观，在400nm(10％w/v溶液)具有0.13吸光度，pH为7.1和渗透度为657mOsm/kg，平均分子量为5.4kDa且浓度为153mg/ml。

实施例11

皮下施用

用氚标记通过实施例1公开的方法制备的化学修饰的肝素，并向SD大鼠和狗施用。

结果：

对于大鼠以2、8和24mg肝素/kg/天以及对于狗以3、15和45mg肝素/kg/天皮下施用后，迅速吸收并且在大鼠和狗中一般分别在0.5和1.5小时内达到最大血浆浓度。在大鼠和狗中皮下生物利用度约为90％。有趣的是，肝素的对应的生物利用度约为10％。

实施例12在晚期妊娠采用DF01治疗

研究设计

这是随机、双盲、安慰剂对照、多中心研究以评价在晚期妊娠采用DF01预处理减少分娩时间的安全性和疗效。瑞典的十八个研究中心参与了本研究。

DF01为根据本发明的化学修饰的肝素，其是低抗凝血肝素，依据实施例1和9，通过来自猪的肠粘膜的肝素的高碘酸盐氧化和然后进行产物的β消除而产生。

方案规定每名受试者进入日常门诊，从孕龄38+0周达到40+0周开始治疗直到分娩，接受皮下注射研究的医药产品。对每名受试者参与本研究的预期持续时间为1-28天(+筛选时间和后继时间)。所有妇女必须最迟在妊娠42+0周引产。给予最长28天的治疗[最多28个剂量的研究的医药产品(IMP)]。分娩之后8-16周进行随访。

治疗

DF01为解聚的肝素，其基本上失去了其抗凝血活性(<10IU/mg依据药典的抗因子Xa-和抗因子IIa试验)。重均分子量Mw为5000-7000。

DF01和匹配的安慰剂提供为用于皮下注射的溶液。

DF01的药物制剂为用于皮下注射的溶液，8mL分散于橡皮塞密封的和用剥除型铝盖覆盖的玻璃小瓶中。

每mL的DF01溶液包含下列成分：

□DF01，150mg

□磷酸盐缓冲液，0.015M

□苄醇，14mg。

用苄醇保藏的无菌生理学氯化钠溶液用作安慰剂。以如药物产品相同的方式在小瓶中提供八(8)mL安慰剂。

每mL的安慰剂溶液包含下列成分：

□氯化钠，9mg

□苄醇，14mg。

受试者接受60mg/天的DF01(0.4mL)(对应于1.00mg/kg/天，60kg受试者)或安慰剂(0.4mL)。

通过每天皮下注射施用所述产品，治疗开始于孕龄38+0周至40+0周，且治疗持续直至分娩。如果在42+0周仍然没有分娩，则进行引产。治疗最长持续时间为28天。日常注射之间允许的时间间隔为24+/-6小时，即18-30小时。如果时间限制偶尔没有满足或者剂量错过，治疗仍然可以继续。

结果

总共有149名非剖腹产分娩，其中妇女接受了催产素(DF01组83名，安慰剂组66名)。时序检验显示了对于分娩时间在治疗组之间具有显著性差异，p值为0.0158。图1中给出了产品限定的出生曲线并解释如下。当分娩持续到约6-8小时，大部分病例的妇女将不会接受催产素，DF01单独地看起来具有很小的作用(两条曲线彼此紧密)。但是，当分娩延长超过6-8小时，一般会给予妇女催产素，额外施用DF01看起来增强了催产素的效果，促进缩短分娩时间。

催产素无法发挥其作用可能是由于缺乏硫酸乙酰肝素，在许多病例中，其导致了催产素的过量，这可能导致严重的副作用，如高收缩性。联合使用DF01可以诱发催产素节约效应，避免高收缩性和胎儿并发症的风险。

实施例11

人子宫平滑肌细胞于培养中形成。已经确定用于细胞的采用钙指示剂染料Fluo-4测量细胞内Ca²⁺的方法和采用共聚焦显微镜使肝细胞成像的方法。采用催产素处理细胞，并且证明向细胞溶质的Ca²⁺流入(图2B)。

效应是剂量依赖性的，最大效应已在0.05IU/ml催产素处。使用如实施例1描述的DF01用于实验。

图2A显示单独的DF01不影响Ca²⁺浓度。然而，当DF01与催产素一起施用时，相比于单独的催产素，获得了增加的和持续的Ca²⁺水平(图2B和C)。剂量响应通路(见图2D)显示Ca²⁺峰的数量与DF01的浓度相关。该结果证明了DF01如何通过促进和维持催产素的作用而发挥子宫收缩的作用的机理。

通过采用10μM维拉帕米预孵育子宫平滑肌细胞30分钟进一步研究所述机理。维拉帕米不影响由催产素或由催产素和DF01联合诱导的Ca²⁺流入。因此可以推断不涉及L通道。

进一步研究主要的肌醇-3磷酸盐(IP3)的运输机理是否刺激内质网的Ca²⁺运输。为了研究该通路，在与100μM浓度孵育30分钟之后，测试2-氨基乙氧二苯基硼酸酯(2-APB)对Ca²⁺的作用。该抑制剂强烈减少催产素和催产素/DF01刺激的Ca²⁺运输。

为了进一步表征催产素和DF01之间的相互作用，使用催产素受体抑制剂阿托西班的作用，并且经受DF01的细胞增强了催产素对Ca²⁺运输的作用。10^-6M浓度的阿托西班明显抑制催产素以及催产素/DF01的联合的作用。

这些结果表明DF01本身不影响Ca²⁺运输。然而，当与催产素联合时，注意到明显的剂量响应增强的Ca²⁺运输的刺激。DF01稳定了催产素的作用，导致更长时间的刺激。该作用不涉及L通道，但是涉及在催产素信号中刺激Ca²⁺流入的IP3。催产素拮抗剂的作用提示对于DF01的作用在催产素受体水平起作用。

结论是根据本发明的DF01和化学修饰的肝素是有用的试剂，其施用以改善子宫肌层收缩并且治疗与不充分或缺乏子宫肌层收缩相关的并发症。总之，DF01和类似的化学修饰的肝素和硫酸肝素被认为在重新确定有效的分娩所需要的干预治疗中是直接有效的。

尽管本文详细描述了特别的实施方案，其是以实施例的形式完成的，仅用于阐述目的，并且其并不意味着限制了附上的权利要求的范围。特别地，发明人预期可以对本发明作出各种替换、变化、和修饰而不偏离由权利要求书所限定的本发明的精神和范围。

Claims

1.一种化学修饰的肝素或硫酸乙酰肝素，其具有10IU/mg以下的抗因子IIa活性和10IU/mg以下的抗因子Xa活性，其包含：

其中，

n是2到20的整数，

其具有与能够促进子宫的子宫肌层收缩的试剂联合用于治疗分娩停止的用途。

2.根据权利要求1所述的用途的化学修饰的肝素或硫酸乙酰肝素，其中所述分娩停止是初级分娩停止。

3.根据权利要求1所述的用途的化学修饰的肝素或硫酸乙酰肝素，其中所述分娩停止是二级分娩停止。

4.根据权利要求3所述的用途的化学修饰的肝素或硫酸乙酰肝素，其中所述二级分娩停止是不充分的生产或完全中断的生产。

5.根据权利要求3所述的用途的化学修饰的肝素或硫酸乙酰肝素，其中所述二级分娩停止是由于头盆不称引起的。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的用途的化学修饰的肝素或硫酸乙酰肝素，其中所述娩停止发生于已经诱发进入分娩的妇女。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的用途的化学修饰的肝素或硫酸乙酰肝素，其中所述分娩停止发生于未经产的妇女。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的用途的化学修饰的肝素或硫酸乙酰肝素，其中能够促进子宫的子宫肌层收缩的试剂是催产素。

9.根据权利要求1-8中任一项所述的用途的化学修饰的肝素或硫酸乙酰肝素，其中所述化学修饰的肝素或硫酸乙酰肝素具有的平均分子量(Mw)为约4.6到6.9kDa。

10.根据权利要求1-9中任一项所述的用途的化学修饰的肝素或硫酸乙酰肝素，其中主要出现的多糖链具有6到12个二糖单元，分子量为3.6到7.2kDa。

11.根据权利要求1-10中任一项所述的用途的化学修饰的肝素或硫酸乙酰肝素，其中至少70％的多糖链的分子量至少为3kDa以上。

12.根据权利要求1-11中任一项所述的用途的化学修饰的肝素或硫酸乙酰肝素，其具有根据下表的多糖分布及其相应的以重量累计％表示的分子质量：

13.根据权利要求1-12中任一项所述的用途的化学修饰的肝素或硫酸乙酰肝素，其中所述多糖包含具有如式I所示的还原末端残基的糖链。

14.根据权利要求1-13中任一项所述的用途的化学修饰的肝素或硫酸乙酰肝素，其包含非还原性末端不饱和的葡糖胺，所述葡糖胺信号存在于¹H-NMR波谱5.0至6.5ppm之间，其强度(比例％)相比于来自天然肝素的5.42ppm处的信号在4％以下。

15.根据权利要求14所述的用途的化学修饰的肝素或硫酸乙酰肝素，其中所述葡糖胺信号存在于5.95ppm和6.15ppm处。

16.根据权利要求1-15中任一项所述的用途的化学修饰的肝素或硫酸乙酰肝素，其中葡糖胺总量的1％以下被修饰。

17.根据权利要求15-16中任一项所述的用途的化学修饰的肝素或硫酸乙酰肝素，其中所述葡糖胺包含非还原性末端不饱和的葡糖胺。

18.根据权利要求15-17中任一项所述的用途的化学修饰的肝素或硫酸乙酰肝素，其中所述葡糖胺信号存在于¹H-NMR波谱5.95ppm和6.15ppm处。

19.根据权利要求1-18中任一项所述的用途的化学修饰的肝素或硫酸乙酰肝素，其中所述化学修饰的肝素或硫酸乙酰肝素基本上不含有完整的非硫酸化的艾杜糖醛酸和/或葡萄糖醛酸。

20.根据权利要求1-19中任一项所述的用途的化学修饰的肝素或硫酸乙酰肝素，其中至少一种化学修饰的肝素或硫酸乙酰肝素在局部药物制剂中局部施用。

21.根据权利要求1-19中任一项所述的用途的化学修饰的肝素或硫酸乙酰肝素，其中至少一种化学修饰的肝素或硫酸乙酰肝素在肠道外药物制剂中施用。

22.根据权利要求21所述的用途的化学修饰的肝素或硫酸乙酰肝素，其中所述化学修饰的肝素或硫酸乙酰肝素每1-4小时静脉内施用，联合催产素的治疗直到36小时。

23.一种治疗分娩停止的方法，其包括给怀孕妇女施用具有10IU/mg以下的抗因子IIa活性和10IU/mg以下的抗因子Xa活性的化学修饰的肝素或硫酸乙酰肝素，并且联合能够促进子宫的子宫肌层收缩的试剂，其中所述化学修饰的肝素或硫酸乙酰肝素包含：

其中，

n是2到20的整数。

24.根据权利要求23所述的方法，其中所述分娩停止是初级分娩停止。

25.根据权利要求23所述的方法，其中所述分娩停止是二级分娩停止。

26.根据权利要求25所述的方法，其中所述二级分娩停止是完全中断的生产。

27.根据权利要求25所述的方法，其中所述二级分娩停止是由于头盆不称引起的。

28.根据权利要求23-27中任一项所述的方法，其中所述娩停止发生于已经诱发进入分娩的妇女。

29.根据权利要求23-28中任一项所述的方法，其中所述分娩停止发生于未经产的妇女。

30.根据权利要求23-29中任一项所述的方法，其中能够促进子宫的子宫肌层收缩的试剂是催产素。

31.一种具有10IU/mg以下的抗因子IIa活性和10IU/mg以下的抗因子Xa活性的化学修饰的肝素或硫酸乙酰肝素与能够促进子宫的子宫肌层收缩的试剂联合用于制造治疗分娩停止的药物的用途，所述化学修饰的肝素或硫酸乙酰肝素包含：

其中,

n是2到20的整数。