CN104232792A

CN104232792A - 检测口蹄疫病毒、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的基因芯片以及试剂盒

Info

Publication number: CN104232792A
Application number: CN201410455941.4A
Authority: CN
Inventors: 文心田; 李金海; 李兴玉; 黄小波; 曹三杰; 文翼平; 伍锐
Original assignee: Sichuan Agricultural University
Current assignee: Sichuan Agricultural University
Priority date: 2014-09-09
Filing date: 2014-09-09
Publication date: 2014-12-24
Anticipated expiration: 2034-09-09
Also published as: CN104232792B

Abstract

本发明公开了一种检测口蹄疫病毒、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的基因芯片和试剂盒。本发明基因芯片和检测试剂盒和检测方法可以准确、有效的检测口蹄疫病毒、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒，且特异性强、灵敏度高、耗时短，检测快速，应用前景良好。

Description

检测口蹄疫病毒、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的基因芯片以及试剂盒

技术领域

本发明涉及一种检测口蹄疫病毒、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的基因芯片以及检测方法。

背景技术

口蹄疫(foot-and-mouth disease，FMD)是由口蹄疫病毒(FMDV)引起的偶蹄动物的一种急性，热性，高度传染性疫病，主要特征是在口腔粘膜、蹄部、乳房、皮肤出现水疱，继而发生溃疡的一类传播速度极快的传染病。该病严重危害畜牧业生产，影响国际贸易和国家声誉，受到了各国政府的普遍关注，被国际兽疫局列为法定通报的动物传染病，我国将其列为一类重大动物疫病之首。FMD易感动物包括牛、绵羊、山羊、骆驼和猪等70多种家养和野生偶蹄类动物。该病曾在全球范围广泛流行，给世界养殖业造成巨大的经济损失。近年来，我国曾发生过O型、A型、Asia1型3个血清型的FMD疫情：2005年～2007年发生多起Asia1型口蹄疫疫情；2009年武汉、上海和北京发生A型FMD疫情；2009年和2010年在中国台湾与香港自治区相继发生O型FMD疫情，在2010年广东省广州市的白云区发生O型FMD疫情，至2010年末我国大陆的9个省的18个地方发生O型FMD疫情。此外，在健康牛群中发现有带毒情况。我国周边的印度、越南、阿富汗等国家FMD流行情况比较复杂，国外毒株多次传入我国，对我国FMD的防控造成巨大的威胁。FMD传染性强，危害巨大，快速、准确的诊断对FMD的防控具有重要意义。

猪瘟(Classical Swine Fever，CSF)是由猪瘟病毒(CSFV)引起的一种急性、热性、高度接触性传染病，可表现为急性、慢性、非典型或母猪繁殖障碍的病程，被世界动物卫生组织(OIE)列为须申报的动物疫病，我国将其列为一类传染病。近年来，一些已宣布消灭猪瘟的欧洲国家出现了猪瘟疫情的复发，2005年～2012年期间，共有46个国家和地区发生了猪瘟。总体上，猪瘟在我国得到了有效的控制，但该病在我国很多地方仍然广泛存在，其流行形式也以非典型CSF为主，此外，由于多种因素的影响，猪瘟疫苗免疫失败的现象较为普遍。对猪瘟的防控仍然是猪群疫病防控的重点之一。

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome，PRRS)又称猪蓝耳病，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine Reproductiveand Respiratory Syndrome，PRRSV)，引起猪的高度接触性传染病。按临床表现的不同可分为经典猪蓝耳病和高致病性猪蓝耳病。经典猪蓝耳病以母猪繁殖障碍、早产、流产、死胎、木乃伊胎和仔猪呼吸综合征为特征；高致病性猪蓝耳病以高度接触性传播、全身出血、肺部实变和母猪繁殖障碍为特征，仔猪、育肥猪和成年猪均可发病和死亡，其中仔猪发病率可达100％，死亡率可达50％以上，母猪流产率可达30％以上。我国2008年新修订的《一、二、三类动物疫病病种名录》将高致病性猪蓝耳病列为一类动物疫病。目前，该病已广泛流行于世界上所有养猪的国家和地区，是危害养猪业最严重的疾病。PRRSV自上世纪90年代传入我国以来，给养猪业造成了巨大的损失，特别是2006年下半年爆发的高致病性猪蓝耳病(HPRRSV)疫情，造成了巨大的经济损失。目前，我国PRRSV流行毒株主要为美洲型，经典株和高致病性变异株均在猪群中广泛存在。

口蹄疫(FMD)、猪瘟(CSF)和猪蓝耳病(猪繁殖与呼吸综合征，PRRS)可造成巨大的经济损失，对这3个病的防控是猪群疫病防控的重点和首要任务。对发病畜禽进行及时准确地诊断，大量开展动物疫病主动监测，掌握畜禽疫病的感染情况，是采取科学防控措施的前提和基础，也是提高动物疫病科学防控水平的必然要求；同时，通过监测，对病原学阳性动物进行净化，可有效降低野毒污染，促进畜禽健康。目前针对FMDV、CSFV和PRRSV的病原学检测方法已有很多报道，对每个病单独检测，费事、耗力，增加了检测成本。生产中迫切需要敏感性高、特异性强的高通量联合检测技术，以提高检测效率，有效降低劳动强度，节约检测成本。

目前，公告号为CN1274849C的专利公开了同时检测口蹄疫病毒、猪瘟病毒、伪狂犬病病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的基因芯片，但是该文件中没有芯片的特异性和灵敏度试验，不能说明其可以特异且灵敏地同时检出口蹄疫病毒、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种特异性强、灵敏度高、可同时检测口蹄疫病毒、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的基因芯片和试剂盒。

本发明检测口蹄疫病毒、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的基因芯片，它包括固相载体以及固定在固相载体上的探针；所述探针包括SEQ IDNO：7～9所示任意一个或者任意多个基因片段，SEQ ID NO：10～13所示任意一个或者任意多个基因片段，以及SEQ ID NO：14～16所示任意一个或者任意多个基因片段。

基因芯片，是指指通过不同方法将生物分子(寡核苷酸、cDNA、genomicDNA、多肽、抗体、抗原等)固着于硅片、玻璃片(珠)、塑料片(珠)、凝胶、尼龙膜等固相递质上形成的生物分子点阵，其突出的特点是微型化、集成化、平行化和高通量。

其中，它还包括阳性对照探针、阴性对照探针和/或定位探针，其中，阳性对照探针是SEQ ID NO：18所示的基因片段，阴性对照探针是SEQ ID NO：17所示的基因片段，定位探针是标记了荧光染料的SEQ ID NO：20所示的基因片段。

所述荧光染料是cy3荧光染料或cy5荧光染料。

所述固相载体为醛基化玻片。

所述口蹄疫病毒是A型、O型或Asia1型口蹄疫病毒。

所述猪瘟病毒是野毒株或疫苗弱毒C株猪瘟病毒。

所述猪繁殖与呼吸综合征病毒是美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒。

所述美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒是美洲型高致病性猪蓝耳病病毒或美洲型猪蓝耳病经典毒株。

本发明检测口蹄疫病毒、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的试剂盒，其特征在于：它包括前述的基因芯片与扩增口蹄疫病毒、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的基因的试剂；其中，扩增试剂包括SEQ ID NO：1～2、SEQ ID NO：3～4和SEQ ID NO：5～6所示引物对。

所述引物对中，SEQ ID NO：1、3、5所示上游引物与SEQ ID NO：2、4、6所示下游引物的摩尔比为1:10。

所述SEQ ID NO：2、4、6所示下游引物上标记有荧光染料。

所述荧光染料是cy3荧光染料或cy5荧光染料。

所述口蹄疫病毒是A型、O型或Asia1型口蹄疫病毒。

所述猪瘟病毒是野毒株或疫苗弱毒C株猪瘟病毒。

所述猪繁殖与呼吸综合征病毒是美洲型猪蓝耳病病毒。

所述美洲型猪蓝耳病病毒是美洲型高致病性猪蓝耳病病毒或美洲型猪蓝耳病经典毒株。

本发明还提供了SEQ ID NO：3～4所示引物对以及SEQ ID NO：7～16所示基因片段。

本发明还提供了SEQ ID NO：1～2、SEQ ID NO：3～4和SEQ ID NO：5～6所示引物对在制备同时扩增口蹄疫病毒、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒基因的试剂中的用途。

本发明还提供了SEQ ID NO：7～9所示任意一个或者任意多个基因片段，SEQ ID NO：10～13所示任意一个或者任意多个基因片段，以及SEQ ID NO：14～16所示任意一个或者任意多个基因片段在制备检测口蹄疫病毒、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的基因芯片中的用途。。

其中，所述基因芯片还包括阳性对照探针、阴性对照探针和/或定位探针，其中，阳性对照探针是序列如SEQ ID NO：18所示的基因片段，阴性对照探针是SEQ ID NO：17所示的基因片段，定位探针是标记了荧光染料的SEQ IDNO：20所示的基因片段。

本发明还提供了SEQ ID NO：1～2、SEQ ID NO：3～4和SEQ ID NO：5～6所示引物对，与SEQ ID NO：7～9所示任意一个或者任意多个基因片段，SEQID NO：10～13所示任意一个或者任意多个基因片段，以及SEQ ID NO：14～16所示任意一个或者任意多个基因片段在制备检测口蹄疫病毒、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的试剂盒中的用途；

其中，3对引物对为扩增试剂，SEQ ID NO：7～16所示基因片段为检测探针。

述引物对中，SEQ ID NO：1、3、5所示上游引物与SEQ ID NO：2、4、6所示下游引物的摩尔比为1:10。

所述SEQ ID NO：2、4、6所示下游引物上标记有荧光染料。

所述荧光染料是cy3荧光染料或cy5荧光染料。

所述口蹄疫病毒是A型、O型或Asia1型口蹄疫病毒。

所述猪瘟病毒是野毒株或疫苗弱毒C株猪瘟病毒。

所述猪繁殖与呼吸综合征病毒是美洲型猪蓝耳病病毒。

本发明基因芯片和试剂盒可以同时检测口蹄疫病毒、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒，特异性强，灵敏度高，各病毒最低检出浓度的数量级为10²copies/μL，耗时短，检测快速，可以迅速掌握畜禽疫病的感染情况，有效防控口蹄疫、猪瘟和猪蓝耳病的发生，临床应用前景良好。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例。凡基于本发明权利要求书记载的内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1寡聚核苷酸芯片探针点样示意图；

图2定位探针和阴阳性对照探针浓度筛选芯片点样示意图；

图3FMDV检测探针浓度筛选芯片点样分布图；

图4M1:分子量Marker DL1000；M2:分子量Marker DL2000；1-3：A、O、Asia1FMDV RNA扩增产物；4：pMD20-T对照；5：PMD3D扩增产物；

图5克隆基因片段的测序结果；

图6RT-PCR扩增产物电泳结果。M：100bp的分子量Marker；1、2：Shimen株和C株RNA扩增结果；3阴性对照；4、5：质粒PMD-W和PMD-C扩增结果；6：pMD-20T对照；

图7克隆基因片段序列。短线(-)表示缺失的碱基；

图8RT-PCR扩增产物电泳结果。M：100bp的分子量Marker；1、2：CH1-R株和JXA1-R株RNA扩增结果；3：阴性对照；4、5：质粒PMDP和PMDHP扩增结果；6:pMD-20T载体对照；

图9克隆基因片段序列；

图10阳性对照标记物靶基因(PC2)和探针(PC1)的结果；

图11阳性对照标记物(PC2)浓度和探针(PC1)浓度对杂交信号的影响；

图12单重和三重RT-PCR扩增产物电泳结果。M：100bp的分子量Marker；1,3,5,7,9:单重RT-PCR扩增结果；2,4,6,8,10：多重RT-PCR扩增结果；1、2：FMDV；3、4:Shimen；5、6:CSFV C株；7、8:CH1-R；9、10:JXA1-R；

图13三重不对称RT-PCR标记产物杂交结果。1：FMDV；2:Shimen；3：CSFV C株；4:CH1-R；5:JXA1-R；6：FMDV+Shimen；7：Shimen+JXA1-R；8：Shimen+CH1-R；

图14FMDV 3D片段标记物与检测探针在不同温度下的杂交结果；

图15猪瘟野毒标记物在不同温度下的杂交结果；

图16猪瘟疫苗株标记物在不同温度下的杂交结果；

图17猪蓝耳病经典株(CH1-R)标记物在不同温度下的杂交结果；

图18高致病性猪蓝耳病变异株(JXA1-R)标记物在不同温度下的杂交结果；

图19特异性实验结果；

图20不同稀释度质粒PMD3D(FMDV)的基因芯片检测结果。1#～10#:10×稀释的质粒PMD3D，浓度分别为8.34×10⁹～8.34×10⁰copies/μL；

图21不同稀释度质粒PMD-W(CSFV野毒株)的基因芯片检测结果。1#～10#:10×稀释的质粒PMD-W，浓度分别为1.06×10⁹～1.06×10⁰copies/μL；

图22不同稀释度质粒PMD-C(C株)的基因芯片检测结果。1#～10#:10×稀释的质粒PMD-C，浓度分别为9.02×10⁹～9.02×10⁰copies/μL；

图23不同稀释度质粒PMDP(PRRSV)的基因芯片检测结果。1#～10#:10×稀释的质粒PMDP，浓度分别为3.76×10⁹～3.76×10⁰copies/μL；

图24不同稀释度质粒PMDHP(HPRRSV)的基因芯片检测结果。1#～10#:10×稀释的质粒PMDHP，浓度分别为3.65×10⁹～3.65×10⁰copies/μL。

具体实施方式

一、实验材料和仪器

材料准备

1.1毒株

A型、O型、Asia1型FMDV标准抗原：中国农业科学院兰州兽医研究所生产的口蹄疫抗体液相阻断ELISA试剂盒；猪瘟弱毒(CSFV，C株)、美洲型高致病性猪蓝耳病病毒(HPRRSV，JXA1-R株)、美洲型猪蓝耳病经典毒株(PRRSV，CH1-R株)、猪伪狂犬病毒(PRV)：来自商品弱毒疫苗；猪圆环病毒(PCV-2)、猪细小病毒(PPV)、猪乙型脑炎病毒(JEV)、猪瘟病毒(Shimen株)、牛病毒性腹泻/黏膜病病毒(BVDV)：四川农业大学保存；20份临床不稳定猪群组织样品，四川省动物疫病预防控制中心保存。

1.2主要试剂

RT-PCR一步法扩增试剂盒PrimeScript one step RT-PCR kit、载体pMD-20T购自TaKaRa公司；琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，质粒提取试剂盒TIAN pure Midi Plasmid Kit，感受态细胞DH5α购自天根公司；RNA、DNA柱式提取试剂盒购自北京世纪元亨。

Baio醛基载玻片、Baio2×点样缓冲液、Baio杂交缓冲液，均购自上海百傲科技有限公司；洗涤液Ⅰ(2×SSC，0.1％SDS)、洗涤液Ⅱ(0.2×SSC，0.1％SDS)、洗涤液Ⅲ(0.2×SSC)、0.5％NaBH40.1mol/L磷酸盐缓冲液等。

1.3主要仪器

基因芯片点样仪(Microgrid Ⅱ Compact，BioRobotics，UK)；基因芯片扫描仪(GenePix Personal 4100A，Axon Instruments Inc.，USA)；紫外交联仪(CL-508，Uvitec，UK)；高速冷冻离心机(Sigma，Germany)；普通梯度PCR仪(BIO-RAD，USA)；震荡培养箱(THZ-92C，上海博讯实业有限公司)；核酸蛋白质检测仪(Ependorf Biophotometer，德国)；隔水式恒温培养箱(上海齐欣科学仪器有限公司)。

实施例1本发明检测方法

1、材料和仪器

同前述实验材料和仪器。

2、实验方法

2.1PCR引物、检测探针的设计与合成

登录GenBank获取FMDV、CSFV、PRRSV主要基因型(血清型)代表毒株的基因序列，利用DNAStar软件的MegAlign模块分别进行同源性分析，选取保守基因作为检测靶区，根据经验，用Oligo7.0软件设计扩增引物和寡核苷酸探针。在标记样品时，下游引物选用5`端Cy3修饰的引物；寡核苷酸探针5`端添加Poly T15连接臂并氨基化。引物序列见表1，寡核苷酸探针见表2，经Blast比对后送上海生工合成。

表1：引物序列和位置

表2：寡聚核苷酸探针序列

1.2核酸提取

使用北京世纪元亨公司RNA柱式提取试剂盒和DNA柱式提取试剂盒提取相应病毒的核酸。

2.3标准质粒的构建

分别以O型FMDV，CSFV Shimen株和疫苗C株，PRRSV病毒CH1-R株和JXA1-R株核酸为模板，用Primescript one step RT-PCR kit ver.2试剂盒和相应的引物进行RT-PCR扩增，将扩增产物纯化、克隆到pMD-20T载体，用PCR扩增和测序鉴定阳性质粒。并将阳性质粒分别命名为PMD3D、PMD-W、PMD-C、PMDP和PMDHP。

2.4芯片制备

用点样液将寡核苷酸检测探针和定位探针稀释成一定的浓度，取8μL按芯片设计阵列加入384孔板，芯片点样仪采用实心点样针将探针点制于醛基化玻片，每条探针点4点，各样点中心距离为1100μm，点样时湿度保持在70％，点制好的芯片室温干燥过夜。芯片42℃湿盒中水合1h，42℃干燥20min。将芯片置于含0.5％NaBH40.1mol/L磷酸盐缓冲液中孵育10min，以封闭未与探针结合的醛基，用0.2％SDS溶液洗涤3次，蒸馏水洗涤2次，每次洗涤2min，800r/min离心3min甩干，将处理好的芯片4℃保存备用。

芯片设计为8×8的微阵列(见图1)，包括6个部分：DW为定位探针；“空白”为不点样对照；“点样液”为点样液对照；NC为阴性对照探针；PC1为阳性对照探针；其它位点为检测探针。

2.4.1定位探针点样浓度的优化

将定位探针DW 2×倍比稀释，再与Baio2×点样缓冲液等量混合，使DW探针终浓度分别为50μM、25μM、12.5μM、6.25μM、3.125μM和1.5625μM，按照图2所示的布局，点样于醛基化玻片，制备芯片。

2.4.2阳性对照探针杂交动力学研究

将阳性对照探针PC1倍比稀释，再与Baio2×点样缓冲液等量混合，将PC1探针稀释成50μM、25μM、12.5μM和6.25μM，按照图2所示的布局，点样于醛基化玻片，制备相应芯片，用将20μM的相应阳性标记物(PC2)作2×倍比稀释，取4μL，加10μLDEPC水和14μL杂交液混合后，与芯片在44℃杂交3h，洗涤后，检测分析杂交信号。

2.4.3检测探针浓度筛选

以FMDV检测探针为例，将TF1、TF2和TF3倍比稀释，再与Baio2×点样缓冲液等量混合，将FMDV探针最终稀释成50μM、25μM、12.5μM、6.25μM，按照图3所示的布局，点样于醛基化玻片，制备相应芯片。以PMD3D为模板(8.34X106copies/μL)，采用不对称RT-PCR扩增标记，标记样品与芯片44℃杂交3h，检测分析杂交信号。

2.5目的片段标记

2.5.1不对称PCR引物最适比例的确定

以FMDV为例，采用不对称RT-PCR技术标记目的基因片段。以TaKaRa生产的One Step PrimeScriptTM RT-PCR Kit(考虑到最终要用一步法对样品进行扩增，故选用一步法RT-PCR试剂盒为基础)，对标记下游引物和上游引物的比例进行优化。反应体系为：BufferⅢ(2x)12.5μL、Enzyme Mix 1μL、Cy3标记下游引物1μL(10μM)，上游引物(0.5μM)分别加4μL/2μL/1μL/0.5μL/0.25μL，模板2μL(8.34X106copies/μL)，补DEPC水至25μL。循环参数为：50℃，30min，94℃2min，1个循环；94℃25s，58℃25s，72℃25s，40个循环；72℃5min。将扩增产物与芯片在44℃杂交3h，检测分析杂交信号。

2.5.2多重RT-PCR扩增

提取FMDV(O型)、CSFV(Shimen株和C株)、PRRSV(CH1-R株和JXA1-R株)核酸，分别用相应的单重RT-PCR和多重RT-PCR扩增，观察扩增产物电泳条带的亮度是否有明显差异，以此判断引物间是否有干扰。反应体系为：用One Step PrimeScriptTM RT-PCR Kit扩增试剂盒，BufferⅢ(2x)12.5μL、Enzyme Mix 1μL、未标记的引物F1(1μM)和F2(10μM)1μL、HC1(1μM)和HC2(10μM)1μL、P1(1μM)和P2(10μM)1μL、模板2.5μL，补DEPC水至25μL；单重RT-PCR只加相应的引物，其余成分不变。循环参数为：50℃，30min，94℃2min，1个循环；94℃25s，58℃25s，72℃25s，40个循环；72℃延伸5min。扩增完成后，取10μL产物，以2％琼脂糖凝胶电泳分析。

2.5.3多重不对称RT-PCR标记样品

提取FMDV(O型)、CSFV(Shimen株和C株)、PRRSV(CH1-R株和JXA1-R株)核酸，用多重不对称RT-PCR扩增所提的核酸样品，标记下游引物与上游引物的比例均为10:1，反应体系其余成分见2.5.1和2.5.2，分别对单种模板和混合模板进行扩增标记。

2.6芯片杂交

将5μL Cy3标记的产物、2μL PC2(0.625μM)、7μLDEPC水和14μL Baio杂交缓冲液(2×)混匀，95℃，变性5min，迅速冰浴10min，滴加到芯片点样区域，盖上盖玻片，置湿盒中在一定温度条件下杂交。杂交后的芯片依次用42℃预热的洗涤液Ⅰ(2×SSC，0.1％SDS)、洗涤液Ⅱ(0.2×SSC，0.1％SDS)、洗涤液Ⅲ(0.2×SSC)和蒸馏水洗涤3min，最后800r/min离心3min甩干。

2.6.1杂交时间的选择

按照图1所示，制备基因芯片。以FMDV检测探针为例，用不对称RT-PCR方法标记样品，模板为8.34×106copies/μL的PMD3D质粒，在44℃条件下与芯片杂交，杂交时间分别为1h、2h、3h、4h、5h和6h。杂交后洗涤，检测分析杂交信号。

2.6.2杂交温度优化

按照图1所示，制备基因芯片，检测探针和阴阳性对照探针浓度为25μM，定位探针浓度为6.25μM。用不对称RT-PCR方法标记样品，模板分别为PMD3D、PMD-W、PMD-C、PMDP、PMDHP质粒。标记样品分别在40℃、44℃、48℃和52℃温度条件下进行杂交，检测分析杂交信号。

2.7信号检测

用Genpix4100A芯片扫描仪，以激发双波长532nm和635nm扫描采集信息；PMT为700，扫描分辨率为10μm；以16位TIF格式和JPG格式保存图像。

2.8数据分析

用GenePixPr05.0软件分析扫描结果，以600nm作为直径获取样点信号，采取自动方式找点，获取芯片各点的杂交信号，总信号强度(TotalIntensity)、信号强度中位值(Median)、信号强度平均值(Mean)等信息，以*.txt文件格式保存输出数据。经比较分析，本试验采用4个点信号中位置和背景信号平均值的比值(SNRm)，并结合扫描图像杂交斑点清晰度来评价杂交结果。当信号强度中位值≥1000、SNRm值≥2，扫描图像杂交斑点清晰，三者结果一致为杂交阳性。当DW和PC1位点荧光信号阳性，空白、点样液和NC位点杂交信号阴性时，芯片检测结果有效。

3、实验结果

3.1目的片段扩增及重组质粒的构建

用RT-PCR扩增A型、O型、Asia1型FMDV的3D基因部分片段，均扩增出约107bp的特异性片段。克隆构建含O型FMDV 3D基因片段的重组质粒，对重组质粒进行PCR鉴定，条带大小与预期结果相符(图4)；对质粒的测序结果也证实(图5),107bp目的片段成功克隆到pMD-20T载体中，将其命名为PMD3D。

分别以Shimen株和C株的RNA为模板，用RT-PCR均扩增出约117bp左右的特异性片段。用PCR对克隆的质粒进行鉴定，扩增条带大小与预期相符(图6)；对质粒的测序结果也证实(图7)，目的片段成功克隆到pMD-20T载体中，将其分别命名为PMD-W和PMD-C。

以C-NA-PRRSV(CH1-R)和H-NA-PRRSV(JXA1-R)RNA为模板，用RT-PCR均扩增出约135bp左右的特异性片段。用PCR对克隆的质粒进行鉴定，扩增条带大小与预期相符；对质粒的测序结果也证实，目的片段成功克隆到pMD-20T载体中，将其分别命名为PMDP和PMDHP(图8、图9)。

3.2探针点样浓度优化结果

3.2.1定位探针点样浓度的优化

按照图2的布局制备芯片，将14μL DEPC水和14μL杂交液混合后，加到芯片点样区，44℃杂交3h，按芯片杂交程序洗涤后扫描检测，检测结果表明：各浓度的定位探针荧光信号中位值在5650～65535(饱和)之间，SNRm值在11.42～119.59之间。

实验结果说明，本发明方法中，定位探针的点样浓度可以为1.56～25μM，优选为6.25μM。

3.2.2阳性对照探针杂交结果

按照图2所示制备基因芯片，不同稀释度的阳性标记物(PC2)的杂交结果见图10，图11。从杂交结果来看，杂交信号随着标记物浓度的增加而增加(信号呈饱和状态时，杂交点为白色，信号值为65535)。标记物的浓度与杂交信号之间并不呈线性关系，当标记物的浓度低于1.25×2^-6μM时，杂交信号随着浓度增加的幅度较小；浓度在1.25×2^-6μM～1.25×2^-1μM之间时，杂交信号随着浓度增加的幅度较大，当浓度高于1.25时，杂交信号基本上都呈饱和状态。

探针浓度不同，其杂交信号强度也有一定的差异，综合检测的灵敏度、芯片制作成本等因素，探针的点样浓度定为25μM。当标记物的浓度为1.25×2^-9μM时，杂交信号的中位值为1358，SNRm为3.03，芯片扫描图出现肉眼可见的斑点，可判为阳性，故其检测极限为1.25×2^-9μM。本试验中，在进行其它标记样品的检测时，阳性对照加2μL，浓度为0.625μM，其杂交信号值刚好呈饱和状态。

因此，本发明方法中，阳性对照探针浓度为25μM，标记物为0.625μM。

3.2.3检测探针浓度筛选结果

按照图3的布局制备基因芯片，用标记的PMD3D基因片段在44℃，杂交3h，洗涤后，扫描分析杂交信号，结果如下表3所示。

表3 不同浓度的FMDV检测探针杂交结果

杂交结果表明，探针浓度在25μM和12.5μM时，具有较强的杂交信号，不同的探针最适点样浓度略有差异，不同的探针最适点样浓度略有差异，在12.5μM～25μM总体上均能取得较好的杂交效果，最优浓度为25μM。

3.3样品标记优化结果

3.3.1不对称RT-PCR引物比例优化结果

以FMDV目的片段的标记为例，在25μL反应体系中，Cy3标记的反向引物(10μM)加1μL，非标记的上游引物(0.5μM)加2μL时，与芯片的杂交信号最强，即标记下游引物与上游引物的比例为10:1时，标记产物与芯片的杂交信号最强。

分别以重组质粒PMD-W、PMD-C、PMDP、PMDHP为模板，按照标记下游引物与上游引物的比例为10:1时，标记的目的片段与基因芯片均有很强的杂交信号。

因此，本发明方法中，标记下游引物与上游引物的比例为10:1。

3.3.2多重RT-PCR方法引物评价

单重和多重RT-PCR分别对FMDV(O型)、CSFV(Shimen株和C株)、PRRSV(CH1-R株和JXA1-R株)的RNA进行扩增，扩增产物电泳结果见图12。

检测结果表明，多重RT-PCR可以对O型FMDV，猪瘟Shimen株和C株，PRRSV(CH1-R)，HPRRS(JXA1-R)的RNA进行有效扩增，其产物的亮度与相应的单重RT-PCR无明显差异。

实验结果说明，本发明3对引物之间不会相互干扰，可以同时有效扩增 3种病毒的基因。

3.3.3不对称多重RT-PCR方法标记结果

用多重不对称RT-PCR标记RNA样品，标记产物杂交结果见图13。

多重不对称RT-PCR标记单重模板和混合模板，标记产物与芯片上相应的探针杂交斑点明显，杂交结果阳性，每种模板都只与对应的探针特异结合。

实验结果说明，本发明芯片可以同时准确检测不同的病毒。

3.4芯片杂交参数确定

3.4.1杂交时间对杂交信号的影响

用不对称RT-PCR方法标记PMD3D(8.34X10⁶copies/μL)，在44℃条件下与芯片杂交1h、2h、3h、4h、5h、6h，杂交结果见表4。

表4 杂交时间对杂交信号的影响

由表4可以看出，杂交时间1～6小时均可检测到杂交，3条探针杂交信号中位值有随杂交时有间缓慢增加的趋势，但变化不明显。芯片杂交既要有充分的时间，又要防止时间过长，杂交液蒸发过多，背景值增高，本研究将杂交时间定位3h。

实验结果说明，本发明方法中，杂交时间可以为1～6h。优选为3h。

3.4.2目的基因在不同温度下的杂交结果

按照图1所示，制备基因芯片，检测探针和阴阳性对照探针浓度为25μM，定位探针浓度为6.25μM。用优化后的不对称RT-PCR方法标记样品，模板分别约为10⁶拷贝/μL的PMD3D、PMD-W、PMD-C、PMDP、PMDHP质粒。将标记样品分别在40℃、44℃、48℃、52℃温度下进行杂交3h，检测分析杂交信号。

标记的FMDV 3D基因片段与基因芯片的杂交结果见图14：

3D基因片段与对应检测探针TF1杂交信号Median值(中位值)在826～5975之间，SNRm值在2.16～15.15之间；与TF2杂交信号Median值在7469～23305之间，SNRm值在19.60～57.12之间；与TF3杂交信号Median值在13019～57739之间，SNRm值在34.04～130.04之间；其它检测探针信号Median值均在800以下，SNRm值均小于2。阴阳性对照成立，3D基因标记物只与相应的TF1、TF2和TF3探针有阳性杂交反应，而与其他检测探针无交叉反应；随着温度升高，杂交信号减弱，在40～48℃时杂交信号明显，在40～44℃时，杂交信号较强，在44℃时，杂交信号最强。

标记的CSFV(Shimen)5`-UTR基因片段与基因芯片的杂交结果见图15：目的基因片段与对应检测探针TH1杂交信号Median值在4992～35182之间，SNRm值在12.67～87.19之间；与TH2杂交信号Median值在2837～24772之间，SNRm值在6.42～61.62之间；与TH3杂交信号Median值在1363～5506之间，SNRm值在2.91～13.63之间；与TH4杂交信号Median值在5351～33512之间，SNRm值在13.69～80.90之间；其它检测探针信号Median均在800以下，SNRm值均小于2。检测结果表明，阴阳性对照成立，目的基因片段标记物只与相应的TH1、TH2、TH3和TH4探针有阳性杂交反应，而与其他检测探针无交叉反应；随着温度升高，杂交信号先增加后减弱，在40～52℃时杂交信号都很明显，在44～48℃时，杂交信号较强，在44℃时，杂交信号最强；TH2的杂交信号明显高于TH3。

标记的CSFV(C株)5`-UTR基因片段与基因芯片的杂交结果见图16。目的基因片段与对应检测探针TH1杂交信号Median值(中位值)在9277～48912之间，SNRm值在20.86～100.90之间；与TH2杂交信号Median值1394～3978之间，SNRm值在2.64～8.36之间；与TH3杂交信号Median值在5908～25601之间，SNRm值11.23～53.17之间；与TH4杂交信号Median值在8947～38110之间，SNRm值在17.24～79.94之间；其它检测探针信号Median均在800以下，SNRm值均小于1.5。检测结果表明，阴阳性对照成立，目的基因片段标记物只与相应的TH1、TH2、TH3和TH4探针有阳性杂交反应，而与其他检测探针无交叉反应；随着温度升高，杂交信号先增加后减弱，在40～52℃时杂交信号都很明显，在44～48℃时，杂交信号较强，在44℃时，杂交信号最强；TH3的杂交信号明显高于TH2。

标记的PRRSV(CH1-R)Nsp3基因片段与基因芯片的杂交结果见图17。目的基因片段与检测探针TP1杂交信号Median值(中位值)在1245～5926之间，SNRm值在2.77～12.54之间；与TP2杂交信号Median值3632～42061之间，SNRm值在8.03～74.94之间；与TP3杂交信号Median值在765～897之间，SNRm值1.54～1.80之间；与其它检测探针信号Median均在1000以下，SNRm值均小于2。检测结果表明，阴阳性对照成立，目的基因片段标记物只与相应的TP1和T P2探针有阳性杂交反应，而与其他检测探针无交叉反应。随着温度升高，杂交信号先增加后减弱，在40～52℃时杂交信号都很明显，在44～48℃时，杂交信号较强，在44℃时，杂交信号最强。

标记的HPRRSV(JXA1-R)Nsp3基因片段与基因芯片的杂交结果见图18。目的基因片段与检测探针TP3杂交信号Median值(中位值)在7007～12872之间，SNRm值在12.83～23.58之间；TP1、TP2和其他检测探针的杂交信号Median值均在1000以下，SNRm值均小于2。检测结果表明，阴阳性对照成立，目的基因片段标记物只与TP3探针有阳性杂交反应，而与其他检测探针无交叉反应。随着温度升高，杂交信号先增加后减弱，在40～52℃时杂交信号都很明显，在44～48℃时，杂交信号较强，在44℃时，杂交信号最强。

因此，采用本发明方法进行检测，温度可以为40～48℃，优选为44℃。

同时，由图14可以看出，TF1～TF3均可以检出FMDV基因片段，说明TF1、TF2、TF3中任意一个探针均能有效检测口蹄疫病毒。

根据图15和图16还可以看出，TH1～TH4均可以检出CSFV(Shimen)和CSFV(C株)的基因片段，说明TH1、TH2、TH3、TH4中任意一个探针均能有效检测猪瘟病毒。

根据图17和图18还可以看出，探针TP1、TP2可以检出美洲型猪蓝耳病经典毒株PRRSV(CH1-R)，但不能检出美洲型高致病性猪蓝耳病病毒HPRRSV(JXA1-R)，探针TP3可以有效检出HPRRSV(JXA1-R)，但不能检出PRRSV(CH1-R)。因此，若仅需检测美洲型猪蓝耳病经典毒株时，基因芯片上固定TP1或/和TP2探针均可，若仅需检测美洲型高致病性猪蓝耳病病毒时，基因芯片只需固定TP3即可，若需同时检测多种美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒时，需要固定TP1或/和TP2探针，以及TP3探针。

综上，本发明方法采用三对引物通过多重RT-PCR方法同时扩增口蹄疫病毒、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的基因，将扩增得到的基因片段用本发明检测探针进行检测，可以准确检测待检样品中是否有口蹄疫病毒、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒。

实施例2特异性试验

一、试验方法

用多重不对称RT-PCR对猪圆环病毒(PCV-2)、猪细小病毒(PPV)、伪狂犬病毒(PRV)、猪乙型脑炎病毒(JEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、牛病毒性腹泻/黏膜病病毒(BVDV)核酸模板扩增标记，扩增产物分别用实施例1制备的基因芯片检测，以评价其特异性。

多重RT-PCR扩增的方法如下：

提取待检样品核酸(使用北京世纪元亨公司RNA柱式提取试剂盒和DNA柱式提取试剂盒提取相应病毒的核酸)，多重RT-PCR扩增，反应体系为：用One Step PrimeScriptTM RT-PCR Kit扩增试剂盒，BufferⅢ(2x)12.5μL、Enzyme Mix 1μL、未标记的引物F1(1μM)和F2(10μM)1μL、HC1(1μM)和HC2(10μM)1μL、P1(1μM)和P2(10μM)1μL、模板2.5μL，补DEPC水至25μL；单重RT-PCR只加相应的引物，其余成分不变。循环参数为：50℃，30min，94℃2min，1个循环；94℃25s，58℃25s，72℃25s，40个循环；72℃延伸5min。扩增完成后，取10μL产物，用于芯片检测。

基因芯片检测：

将5μL前述产物、2μL PC2(0.625μM)、7μLDEPC水和14μL Baio杂交缓冲液(2×)混匀，95℃，变性5min，迅速冰浴10min，滴加到芯片点样区域，盖上盖玻片，置湿盒中杂交，杂交时间为3h，杂交温度为44℃。杂交后的芯片依次用42℃预热的洗涤液Ⅰ(2×SSC，0.1％SDS)、洗涤液Ⅱ(0.2×SSC，0.1％SDS)、洗涤液Ⅲ(0.2×SSC)和蒸馏水洗涤3min，最后800r/min离心3min甩干。

二、结果

实验结果如图19所示，采用本发明方法检测，猪圆环病毒(PCV-2)、猪细小病毒(PPV)、伪狂犬病毒(PRV)、猪乙型脑炎病毒(JEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、牛病毒性腹泻/黏膜病病毒(BVDV)核酸检测结果均阴性，说明本发明基因芯片和试剂盒的特异性强。

实施例3灵敏度试验

一、试验方法

按照实施例1的方法，将重组质粒PMD3D(8.34×10⁹copies/μL)、PMD-W(1.06×10⁹copies/μL)、PMD-C(9.02×10⁹copies/μL)、PMDP(3.76×10⁹copies/μL)、PMDHP(3.65×10⁹copies/μL)分别作10×倍比稀释，用多重不对称RT-PCR扩增，扩增产物用基因芯片检测，以评价检测基因芯片系统的灵敏性。

多重RT-PCR扩增的方法和基因芯片检测方法同实施例2。

二、结果

采用本发明方法检测质粒PMD3D，最低检测浓度可达8.34×10²copies/μL，检测结果见图20。

采用本发明方法检测质粒PMD-W，最低检测浓度可达1.06×10²copies/μL，检测结果见图21。

采用本发明方法检测质粒PMD-C，最低检测浓度可达9.02×10²copies/μL，检测结果见图22。

采用本发明方法检测质粒PMDP，最低检测浓度可达3.76×10²copies/μL，检测结果见图23。

采用本发明方法检测质粒PMDHP，最低检测浓度可达3.65×10²copies/μL，检测结果见图24。

采用本发明方法进行检测时，各病毒样品的最低检测浓度的数量级为10²copies/μL，说明本发明基因芯片和试剂盒的检测灵敏度高。

实施例4重复性试验

一、实验方法

选用构建的同一批基因芯片，用FMDV 3D标记物进行重复性试验，评价其稳定性。

多重RT-PCR扩增的方法和基因芯片检测方法同实施例2。

二、实验结果

用PMD3D不对称RT-PCR的标记产物，与同批次基因芯片10张杂交，杂交结果见表5。

表5 同批次芯片重复性检测

TF1探针杂交信号Median为2612.9±101.44，变异系数为3.88％，SNR值为7.00±0.22，变异系数为3.88％；TF2探针杂交信号Median为19672.6±1705.30，变异系数为8.67％，SNR值为52.39±3.01，变异系数为5.74％；TF3探针杂交信号Median为22694.7±1321.55，变异系数为5.82％；SNR值为60.20±3.19，变异系数为5.30％；阴性对照探针杂交信号Median为551.6±36.11，变异系数为6.55％，SNR值为1.51±0.10，变异系数为6.51％。

检测结果表明，基因芯片检测信号稳定，一致性好。

实施例5临床样品检测

一、实验方法

用本发明实施例1的方法对20份临床不稳定猪群样品进行检测。

多重RT-PCR扩增的方法和基因芯片检测方法同实施例2。

二、结果

用建立的芯片检测技术对20份临床样品进行了检测，CSFV阳性6份，PRRSV阳性7份，HPRRSV阳性5份，未检测到FMDV。其中CSFV+PRRSV阳性2份，PRRSV+HPRRSV阳性1份。

实验结果说明，本发明基因芯片和试剂盒可以有效检测样品中的口蹄疫病毒、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒。

综上，本发明基因芯片和试剂盒可以有效检测口蹄疫病毒、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒，特异性强、敏感性高、耗时短，检测快速，具有良好的应用前景。

Claims

1.一种检测口蹄疫病毒、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的基因芯片，其特征在于：它包括固相载体以及固定在固相载体上的探针；所述探针包括SEQ ID NO：7～9所示任意一个或者任意多个基因片段，SEQ ID NO：10～13所示任意一个或者任意多个基因片段，以及SEQ ID NO：14～16所示任意一个或者任意多个基因片段。

2.根据权利要求1所述的基因芯片，其特征在于：它还包括阳性对照探针、阴性对照探针和/或定位探针，其中，阳性对照探针是SEQ ID NO：18所示的基因片段，阴性对照探针是SEQ ID NO：17所示的基因片段，定位探针是标记了荧光染料的SEQ ID NO：20所示的基因片段。

3.一种检测口蹄疫病毒、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的试剂盒，其特征在于：它包括权利要求1或2所述的基因芯片以及扩增口蹄疫病毒、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的基因的试剂；其中，扩增试剂包括SEQ ID NO：1～2、SEQ ID NO：3～4和SEQ ID NO：5～6所示引物对。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述引物对中，SEQ IDNO：1、3、5所示上游引物与SEQ ID NO：2、4、6所示下游引物的摩尔比为1:10。

5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述SEQ ID NO：2、4、6所示下游引物标记有荧光染料。

6.SEQ ID NO：3～4所示引物对以及SEQ ID NO：7～16所示基因片段。

7.SEQ ID NO：7～9所示任意一个或者任意多个基因片段、SEQ ID NO：10～13所示任意一个或者任意多个基因片段以及SEQ ID NO：14～16所示任意一个或者任意多个基因片段在制备检测口蹄疫病毒、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的基因芯片中的用途。

8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于：所述基因芯片还包括阳性对照探针、阴性对照探针和/或定位探针，其中，阳性对照探针是SEQ ID NO：18所示的基因片段，阴性对照探针是SEQ ID NO：17所示的基因片段，定位探针是标记了荧光染料的SEQ ID NO：20所示的基因片段。

9.SEQ ID NO：1～2、SEQ ID NO：3～4和SEQ ID NO：5～6所示引物对在制备同时扩增口蹄疫病毒、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒基因的试剂中的用途。

10.SEQ ID NO：1～2、SEQ ID NO：3～4和SEQ ID NO：5～6所示引物对，与SEQ ID NO：7～9所示任意一个或者任意多个基因片段、SEQ ID NO：10～13所示任意一个或者任意多个基因片段以及SEQ ID NO：14～16所示任意一个或者任意多个基因片段在制备检测口蹄疫病毒、猪瘟病毒和繁殖与呼吸综合征病毒的试剂盒中的用途；其中，三对引物对为扩增试剂，SEQ ID NO：7～16所示基因片段为检测探针。