CN104232656A - 用于提高农作物抗逆特性的逆境调控基因HsCBL8及其克隆方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于提高农作物抗逆特性的逆境调控基因HsCBL8，具有序列表SEQ IDNo.1所示的序列。相应的，本发明公开了所述基因的克隆方法。本发明公开的逆境调控基因HsCBL8是多种农作物的生物和非生物胁迫响应途径的上游基因，能调控多种逆境的应激反应，显著有益于作物的抗逆境育种研究。

Description

用于提高农作物抗逆特性的逆境调控基因HsCBL8及其克隆方法

技术领域

本发明涉及一种能够提高作物抗逆特性的调控基因，属于生物育种与分子生物学领域。 

背景技术

复杂多样的自然环境，一直是影响农作物产量和品质的重要外界因素，诸如干旱、冻害、盐渍、酸性土壤等是植物在自然界遭受的主要环境胁迫因子，严重影响作物的生长与产量，尤其近些年频发的灾害天气严重影响作物的产量。 

针对上述问题，主要的解决方案主要有两种，一种是下大力度改善自然生长条件，例如改善土壤品质、提高森林密度防止极端天气的发生等，但此种方法多缓不济急，需要多年长期投资才能实现，只具有宏观意义，对于具体的农作物种植收效不大；另一种方法是提高农作物自身的抗性，也就是通过自然杂交、人工杂交、突变筛选、基因工程等方法获得具有抗逆特性的植物品种。 

目前，作物的非生物逆境抗性/耐性育种主要集中在以下几个方面：1.栽培作物与近缘野生抗逆物种杂交获得抗逆境特性；2.采用筛选突变体的方式(X-射线、化学和物理致突机制)获得抗逆境特性；3.把模式植物(如拟南芥和水稻等)中的已知有抗逆境功能的基因导入作物获得抗逆境特性；4.从作物野生资源中克隆抗逆基因，而后把该基因导入作物中获得抗逆境特性。其中，从野生资源中克隆抗逆途径中的基因来进行作物的抗逆境育种是最有效的育种途径，已有的研究都是致力于研究逆境响应途径的下游基因，如甜菜碱合成酶(Waditee et al.2005)、液泡逆向转运体(Na⁺/H⁺antiporter)(Shi et al.2000)和低亲和Na⁺转运体HKT1(Uozumi et al.2000；Rus et al.2001)等。 

已有的基因工程实践证明，采用下游基因很难解决逆境抗性分子育种的难题(Bhatnagar-Mathur et al.2008)，即使经过了基因改造，栽培水稻、小麦、玉米等作物在逆境(干旱、水涝、盐碱等)下减产、绝收等情况时有出现，这些在很大程度上影响了作物的产量，甚至有些地区不能种植粮食作物。 

因此，本领域急切需要找到有效的技术方法，提高作物的抗/耐逆境特性，从而进一步改良作物，实现作物在逆境条件下的产量和品质的提高，应对当前多变的气候和环境灾害。 

发明内容

申请人仔细研究了多种已知植物对外界恶劣环境的胁迫响应，发现类钙调磷酸酶B蛋白(calcineurin B-like protein(CBL)是多种生物和非生物胁迫响应途径 的上游基因，能调控多种逆境的应激反应，尤其是干旱、盐、冷等胁迫。因此，申请人通过现代基因工程的方法从在恶劣环境中生存的野生大麦中克隆了HsCBL8基因，具有逆境抗性响应特性，在高盐、低温和高酸胁迫具有功能，从而为作物的抗逆育种提供最有效的育种途径。 

为实现上述目的，本发明是通过下述技术方案实现的： 

用于提高农作物抗逆特性的逆境调控基因HsCBL8，具有序列表SEQ ID No.1所示的编码序列，其具有序列表SEQ ID No.2所示的编码区域，并表达序列表SEQ ID No.3所示的氨基酸序列。 

上述基因是以高盐、酸性、低温环境下生存的野大麦幼苗的生物基因组为基础，并通过已知的水稻、拟南芥、高粱、小麦等植物的同源性CBL基因序列设计的引物进行扩增的，从而可确定其也具有显著的抗逆特性。 

在上述基础上，申请人对逆境下生长的野生小麦的cDNA进行了深入研究，从而得到了其编码区域两端的非翻译区(UTR)和相连接的启动子区域，具有序列表SEQ ID No.4、SEQ ID No.5所示的3’UTR区、5’UTR区和启动子区，该序列含有与逆境、激素等信号互作的功能区域。 

相应的，本发明还公开了所述逆境调控基因HsCBL8的克隆方法，是以在3种逆境胁迫下生长的野生大麦为材料，通过简并引物PCR、普通PCR和3’-RACE获得该基因的部分cDNA以及相应的在逆境胁迫中起到关键的调控作用的编码区基因组DNA；并在此基础上通过反向巢式PCR获得该基因的5’UTR区和启动子区。所得到的HsCBL8在高盐、低温和高酸胁迫下具有功能，是重要的逆境响应调控因子。 

本发明的基因不仅可以通过克隆方法得到，也可以通过基因组测序或通过cDNA库测序获得该基因，本发明所提供的方法是申请人得到该基因序列的方法。 

具体的，逆境调控基因HsCBL8的克隆方法包括下述步骤： 

1)从野生大麦中获得全基因组RNA，并通过反转录酶得到cDNA； 

2)利用简并引物HsCBLS、HsCBLA，采用PCR方法扩增步骤1)的cDNA； 

3)利用引物HsCBL8S、HsCBL8A，采用PCR方法扩增步骤2)所得序列从而获得逆境调控基因HsCBL8的编码序列。 

在上述方法中，简并引物PCR是根据与目标物种具有同源性的基因保守区域设计引物，进行PCR扩增获得目的片段。 

其中，所用的简并引物序列为 

HsCBLS：5'－GMGACWGYBTTSAGYGTDAGTGAA－3'、 

HsCBLA：5'－GHTYYRYRTCWGCKTCCTCAAA－3'； 

其中，M＝A/C；R＝A/G；W＝A/T；S＝G/C；Y＝C/T；K＝G/T；V＝A/G/C；H＝A/C/T；D＝A/G/T；B＝G/C/T；N＝A/G/C/T。 

上述的含义是对应字母位置可以采用所给定的碱基中的一种，例如字母A位置的碱基可以是A或C。 

步骤3)采用的是常规PCR方法，采用的PCR引物序列如下所示： 

HsCBL8S：5'－ATCTAGA(Xba I)CTTTTCCCTCGTCATTACCATGT－3'、 

HsCBL8A：5'－TGGTACC(KpN I)ATAGGGATGGGAAAATCTGCCTAG－3'。 

在上述基础上，该克隆方法还包括下述步骤： 

通过3’-RACE获得cDNA的3’UTR区，通过反向巢式PCR获得cDNA的5’UTR区和启动子区域。 

在上述方法中，3’-RACE是用来实现cDNA3’端的快速克隆；反向巢式PCR是用反向的互补引物来扩增两引物以外的未知序列，同时利用两套PCR引物对(巢式引物)进行两轮PCR扩增反应，其中ICBL81S和ICBL81A为第一轮扩增用，ICBL82S和ICBL82A为第二轮扩增用。 

具体的，所用引物组合如下所示： 

反向巢式PCR引物： 

ICBL81S CCTATCTGCTGCTGCTGCCGCCA、 

ICBL81A CCATCCGCTCCGTCCTTCTTCCT； 

ICBL82S CATCACGGATTTGGATTTCGCCCAA、 

ICBL82A CTTCTTCGCCCTCACCGACTGCCT。 

3’-RACE引物： 

CBL83RACRS TGAGACAGACTGGCTTTATTGAG 

CBL83RACRA GGCCACGCGTCGACTAGTAC 

在本发明中，各PCR过程所用的反应条件为本领域常规条件，无特别要求。 

附图说明

图1、图2分别为本发明的HSCBL8基因表达的氨基酸与FLbaf27i23的氨基酸对比图、本发明的HSCBL8基因碱基序列与栽培大麦FLbaf27i23的基因片段碱基序 列对比图。 

具体实施方式

下面结合具体的克隆过程，对本发明的逆境调控基因HsCBL8进行详细阐述。 

首先是获得cDNA：将青藏高原一年生野大麦种子通过细沙培养至3叶期，移植到液体培养器皿中，采用高盐(200mM)、低pH值(4.0)和低温(0-4℃)处理72小时，取幼苗整株采用TaKaRa RNAiso Plus提取提取总RNA，然后利用反转录酶(Takara，大连，D2680S)合成cDNA第一链。 

cDNA的合成是本领域技术人员普遍掌握的，具体到本发明，第一链的合成反应体系如下： 

Total RNA                        1μl 

5×M-MLV Buffer                  2μl 

Oligod(T)/接头(10μM)                1μl 

dNTP Mixture (10mM each)         1μl 

RNase Inhibitor                 0.25μl 

Reverse Transcriptase M-MLV (RNase H-) (200U/ul)  0.25μl 

RNase Free dH₂O                  4.5μl 

反转录程序为：42℃ 60min，70℃ 15min。 

其中，接头序列为： GGCCACGCGTCGACTAGTACTTTTTTTTTTTTTTTTTT) 

然后设计cDNA扩增用的兼并引物，设计方法为根据NCBI：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/和大麦数据库http://www.shigen.nig.ac.jp/barley/中的水稻、拟南芥、高粱、小麦等植物的CBL基因序列的同源性，在保守区设计简并引物： 

HsCBLS：5'GMGACWGYBTTSAGYGTDAGTGAA3'； 

HsCBLA：5'GHTYYRYRTCWGCKTCCTCAAA3'。 

其中，M＝A/C、R＝A/G、W＝A/T、S＝G/C、Y＝C/T、K＝G/T、V＝A/G/C、H＝A/C/T、D＝A/G/T、B＝G/C/T、N＝A/G/C/T。 

在得到上述简并引物后，采用简并引物PCR(Degenerate Primer)方法获得HsCBL8基因cDNA的部分序列(494bp)，如SEQ IDNo.6所示。 

简并引物PCR反应程序为：94℃预变性5min，(94℃ 10s，65℃-60℃ 20s，72℃ 1min，10个循环，每个循环温度降低0.5℃)(94℃ 10s，60℃ 20s，72℃ 1min)25个循环，72℃ 10min。 

将该部分片段通过Barley DB(http://www.shigen.nig.ac.jp/barley/)数据库进行Blastn比对，发现该片段序列与栽培大麦FLbaf27i23(AK249292)的部分连续片段完全一致。 

在上述基础上，利用Primer5.0直接设计如下PCR引物： 

HsCBL8S：5'ATCTAGA CTTTTCCCTCGTCATTACCATGT3' 

HsCBL8A：5'TGGTACC ATAGGGATGGGAAAATCTGCCTAG3'， 

对上述cDNA片段进行扩增得到基因编码区DNA，如SEQ IDNo.1所示，该序列全长2084bp，含有8个外显子和七个内含子，编码区全长876bp。 

PCR反应程序为：94℃预变性5min，(94℃ 10s，55℃ 20s，72℃ 3min)30个循环，72℃ 10min。 

上述PCR反应体系是本领域常用的，具体的如下所示： 

通过上述克隆猴，全长DNA序列如下所示，其中下划线区域为内含子： 

ATGTGCGCGCCCCCAAAAAAGACACGGCCCGCCGTCGACCACGCGGGCAAGTCGTGGCGGCAGCAGCAGCAGATAGGAGGGGGCGCCGCCATGGCCTCACGCTTCGGCTTCCGCATCTCCTCCGGCGACCTG GTAGGTGGCTCGCCCGGCTGCGGCCCTCGCCTTCCTTCCTTCCTTGGGCGAAATCCAAATCCGTGATGTTGACTCGCTTGGTTCTGGTGGCCGCGCGCAGAGGTCGGGGAGCTCGCTGACGGTGGGGGAGCGGCTCTGCGCGGTGGTCCTGCCCTGCGTCGCCATCGCCGAGTTCGTCTTCTTCGCCCTCACCGACTGCCTGGCCGGCATCTGCCCCGCTTCCTCCAACTCCTCCTCGCGCCTCCGCGGAGATCCATCCGCTCCGTCCTTCTTCCTCGCGGCCAAGAAGGGGAACCACCACCACCACCACCACCTCCTCCGCCGTCGCGTCGGGCCGGGCTGCACCTCCCTGACCTTCCGCGACCTCGCCCGCCTCGCCGACGAGTCCAGATGCTGTAAATTGAAAACCACCTCTCTTTTGCCCCTCGAGTTCGTTCTTCTTGCCCGGCGTTTCTTGCAATTGCAATGTCGTTTGATACGAGTCTTCTTTTCCTTGGCAACCGAATCAAGTCTCGGTGAATGAGGTGGAGGCGCTGTTCGAGCTCTACAAGAAGATCAGCTGCTCCATCATCAACGACGGACTCATCCACAAGGTACCCACCCCACCCCCCTAAAGCAAAAGCGCCTCTGTTTCTTCTCTAATCTGAAACAAATTAGTGCATATTTGACAGAGGTACGTGCTGCATGACTGGTAATGTTTGGGCTTAGCGATTGAGAGCCGGGTTGCTTCATAGATCGATCTGAAAATGCTGCATCACATCACATGCCACAGATTCTTTCCCCGGGATATGGATCAAAGACACACTGTCATATGACCTGTATAGAGGGACTAGTATTAGATTTGGCTTCACACCCACAGAATTATTGGCCTGTATTTTTTCCAGGACAGCACGTTGTGTGGCTTGGCTTCCATGTGAAGTTTCATCATACTATAGTGCCTGCCTCTCCGAATGTTGGGCGGTCACCTTCTTTCTTGTAAAGTTTTTCATTTTACTTAATTGCTGTGCAAGTCCCATTCTGCGAAGGAATATTAATTAATTTTATAATGCACATATGAACAATCTGTTATGAGTGCACATATGACGTGCGGGGATCAAGGCGGGTACCTAGAAAAGTTTGAATGCCCTGTTCCATTCATATAGTACTATGATTGAACCAGCAAAGAAAAACAAATTGACCTATCTGTCTTTTCTGTTGAATTATTATCTAGGAAGAGCTTCAGCTAGCATTATTCAAGACTCCTAGTGGCCAGAATCTTTTTCTTGATAGGGTAAGCGTTGACAACTTCAATTTGCTATTTTTAAATGCTTCAAGATCATTATTTACAATGTCATAAAAAAATCTGAATTGCTCACATTGCATTTTGCTTTGTGAGGTAGCATCCTACTGAAATTGTCCTCTATGATCCAGGTCTTTGATTTGTTTGACGAGAAGAAAAATGGAGTAATAGAGTTTGAGGAGTTTATTCATGCTCTCAGTGTCTTCCATCCATTGGCGCCTGTGGAAGACAAGATCAACTGTAAGTACAATTCTTGCAGAAACTCGGTGCTCCACATGAACATGTTGAAATGTACTTACGGTTAGGACTCTCCTTCTGAGTTGTTTCAGTTGCATTTAGGCTCTATGATTTGAGACAGACTGGCTTTATTGAGCGCGAGGAGGTTAGTTCAGATGGATGTTCTATTTCTATCTGTACCAGTAGTTCATTTACCTCAGCAAGGTGATCTGTTGGTGCTCCTGTTTTCTTAGGTTATGCAAATGGTTATTGCCATTTTGAATGAATCTCATGTGCAATTACCGGATGACTTTCTTGAGGCCATCCTAGACAAGGTATGCAATCATTTCCTTGGTCTTCTTTACTTATTTATTTCCACTTTACATGGATGTAATTTTTGATTGGTTTCAGACATTTGAAGACGCTGATACCGATAGGGATGGGAAAATCTGCCTAG， 

其中的编码区域全长876bp，碱基序列如SEQ IDNo.2所示，该编码区域编码291个氨基酸，序列如SEQ IDNo.3所示。 

在上述基础上，采用已知序列(序列：TGAGACAGACTGGCTTTATTGAG)和cDNA末端加接头(GGCCACGCGTCGACTAGTACTTTTTTTTTTTTTTTTTT)的方法进行3’RACE获得cDNA3’末端序列，序列如SEQ IDNo.5所示。 

3’RACEPCR反应程序为：94℃预变性5min，(94℃10s，60℃20s，72℃1min)30个循环，72℃10min。 

然后，采用下述引物组合(表1)进行反向巢式PCR获得该基因5’UTR和启动子区域。 

表1:引物 

在上述操作中，DNA处理采用的内切酶为Takara(大连)公司的Cla I。 

上述反向巢式PCR反应程序为：94℃预变性5min，(94℃ 10s，60℃ 20s，72℃ 2min)30个循环，72℃10min。 

上述方法获得的基因5’UTR和启动子区域全长2173bp，序列如SEQ IDNo.5所示，其中序列两端的部分：CTTGTATACCGTACAGCAGAAGCGTTAGTGAA、CAGTCCATTTCTTTTCCCTCGTCATTACC可以作为构建载体的引物。 

在上述实验完成后，通过PLACE(http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/signalup.html)和PLANTCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)进行分析发现序列中含有与逆境、激素等信号互作的功能区域，具体如下表2所示： 

表2:序列片段功能说明 

在此基础上，取HSCBL8进行两次测序并翻译成氨基酸后与预测的FLbaf27i23的氨基酸比对发现，野大麦的CBL8与栽培大麦的基因片段出现缺失、插入、碱基突变等序列变化，具体参考图2所示，对应的氨基酸序列也存在变化，如图1所示。 

从上述可以看出，本发明的HsCBL8在高盐、低温和高酸胁迫具有功能，可作为逆境响应调控因子。 

Claims (9)

1.用于提高农作物抗逆特性的逆境调控基因HsCBL8，其特征在于具有序列表SEQ IDNo.1所示的编码序列，其具有序列表SEQ IDNo.2所示的编码区域，并表达序列表SEQ IDNo.3所示的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的逆境调控基因HsCBL8，其特征在于具有序列表SEQIDNo.4、SEQ IDNo.5所示的3’UTR区、5’UTR区和启动子区。

3.权利要求1的逆境调控基因HsCBL8的克隆方法，其特征在于包括下述步骤：1)从野生大麦中获得全植株RNA，并通过反转录酶得到cDNA；2)利用简并引物HsCBLS、HsCBLA，采用PCR方法扩增步骤1)的cDNA；3)利用引物HsCBL8S、HsCBL8A，采用PCR方法扩增步骤2)所得序列从而获得逆境调控基因HsCBL8的编码序列。

4.根据权利要求3的克隆方法，其特征在于还包括下述步骤：通过3’-RACE获得cDNA的3’UTR区。

5.根据权利要求3的克隆方法，其特征在于还包括下述步骤：通过反向巢式PCR获得cDNA的5’UTR区和启动子区域。

6.根据权利要求3的克隆方法，其特征在于简并引物为

H_sCBLS：5'－GMGACWGYBTTSAGYGTDAGTGAA－3'、

HsCBLA：5'－GHTYYRYRTCWGCKTCCTCAAA－3'；

其中，M＝A/C；R＝A/G；W＝A/T；S＝G/C；Y＝C/T；K＝G/T；V＝A/G/C；H＝A/C/T；D＝A/G/T；B＝G/C/T；N＝A/G/C/T。

7.根据权利要求3的克隆方法，其特征在于

H_sCBL8S：5'－ATCTAGA CTTTTCCCTCGTCATTACCATGT－3'、

H_sCBL8A：5'－TGGTACC ATAGGGATGGGAAAATCTGCCTAG－3'。

8.根据权利要求5的克隆方法，其特征在于3’-RACE所用引物为：

CBL83RACRS：TGAGACAGACTGGCTTTATTGAG

CBL83RACRA：GGCCACGCGTCGACTAGTAC。

9.根据权利要求5的克隆方法，其特征在于所用PCR引物为两组，分别为

ICBL81S：CCTATCTGCTGCTGCTGCCGCCA、

ICBL81A：CCATCCGCTCCGTCCTTCTTCCT；

ICBL82S：CATCACGGATTTGGATTTCGCCCAA、

ICBL82A：CTTCTTCGCCCTCACCGACTGCCT。