CN104225680A - 新型功能性磁感应性神经支架进行复合种子细胞修复方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了新型功能性磁感应性神经支架进行复合种子细胞修复方法。本发明的制备方法包括如下步骤：(1)制备多微孔性磁性神经支架；(2)种子细胞的分离、培养与纯化；(3)种子细胞与磁性神经支架生物学检测。本发明在制备复合种子细胞的新型功能性磁感应性神经支架的过程中，采用一定浓度的磁性纳米微粒，形成具有可磁化的磁性系统，将种子细胞与该磁性支架复合，在外部磁场作用下，不仅可以促进种子细胞的存活和增殖，还能促进神经营养物质的分泌，有效促进受损神经再生。本发明制备的磁性神经支架能够使再生神经通过组织材料内部磁场定向生长，加速神经损伤修复和成髓鞘，进一步提高神经缺损的修复效果。

Description

新型功能性磁感应性神经支架进行复合种子细胞修复方法

技术领域

本发明属于神经损伤修复技术领域，涉及新型功能性磁感应性神经支架进行复合种子细胞修复方法。

背景技术

周围神经缺损是临床最常见的创伤之一。该类型的神经损伤会使受累神经所支配的远端肢体出现完全的感觉和运动功能的双重缺失，从而导致严重残疾的发生，会给患者的工作和生活质量带来巨大的影响。

目前，临床上对于较短距离的周围神经缺损，在无张力缝合的原则基础上，多采用神经断端直接缝合的方法进行修复；而对于长距离的周围神经缺损，则往往采用自体神经移植的方法进行修复。但是，研究表明：自体神经移植仅能实现部分神经功能的恢复，且只有35％～45％的患者在接受移植后能实现运动功能的完全恢复，而感觉神经的功能恢复效果比运动神经或混合型神经要差；同时，这种治疗的方法应用仍然存在诸多的制约因素，例如二次手术、供体神经量有限、配体受体神经不匹配、易形成顽固性神经瘤和神经供区的致残问题。

组织工程神经支架是一种以天然生物材料或者人工合成的高分子聚合物为原料制备而成的，具有特殊的三维结构，用于桥接神经缺损的近端和远端，铺设通道引导再生神经长入，并实现再生神经跨越缺损生长的一种组织工程支架。目前，结构相对简单的神经导管移植物是研究的重点，经多项动物或临床研究证实，其修复长距离神经缺损效果确切。经FDA批准商业化和应用于临床桥接患者神经缺损的组织工程神经支架及相关产品主要集中在这方面。但是大多数神经导管的管壁为密封式设计，既不利于再生神经定向生长，也不利于营养物质、氧和代谢产物的运输，且需要二次手术取出残留植入结构，因而限制了多种神经导管的普及。随着研究的进一步深入，学者们对周围神经损伤局部微环境的研究也越来越重视，渴望通过改善损伤组织局部微环境促进损伤神经的再生和功能的恢复。

磁信号是普遍存在于生活的物理信号，越来越多的研究指出磁场能够定向引导多种细胞的生长，并且能够促进多种细胞分泌营养物质从而促进细胞生长。临床上，磁场作为一种非侵入性的方法被广泛应用，如磁共振成像、低频磁疗等，然而尚未有将可被外磁场磁化的神经导管修复神经缺损的报道。因此，发明一种新的可以通过外部磁场磁化的磁性系统，在神经导管内通过定向引导再生神经生长来促进损伤神经恢复就显得尤为重要。

为了克服这一难题，越来越多的学者开始关注一种新型材料—磁性纳米微粒(Magnetic nanoparticles，MNPs)。MNPs由于具有特殊的磁导向性、超顺磁性，以及表面可连接生化活性功能基团等特性，使其在核酸分析、临床诊断、靶向药物、酶和细胞固定化等领域的应用得到了广泛的发展，其特点是：①超顺磁性，MNPs为FeO和Fe₂O₃的混合价态化合物，其物理长度恰好处于纳米量级(50nm以下)，在受到外加磁场作用时，磁性纳米微粒中相邻原子或离子的热无序磁矩在一定程度上出现与磁场强度方向一致的定向排列，而当外加磁场消失后，粒子的磁性消失。②靶向性，MNPs在外加磁场导向作用下，能靶向性移动、聚集，产生局部特异性浓集，从而实现选择性成像。Chertok等将MNPs注入小鼠静脉，在0.4T磁场中可以选择性聚集在小鼠脑胶质细胞瘤中进行显影。③良好的生物相容性，尽管目前MNPs在体内的代谢过程还未完全阐明，但大量的研究表明其具有良好的生物相容性。Feng等将MNPs注入小鼠体内后，对其尿液及血清中的代谢物进行分析，发现α-苯基琥珀酰亚胺-n-戊酸等代谢产物量仅有细微变化，对小鼠生理无影响。Levy等模仿体内环境，显示纳米微粒分解为纳米晶体，并能稳定悬浮于体液中。Stamopoulos等报道MNPs对人类白细胞、红细胞及血小板无明显影响。N.Bock用简单经济的浸润包被(dip-coating)方法，将MNPs与羟磷灰石-壳聚糖骨再生支架复合，制备了新型磁性骨组织工程支架，对其进行检测，发现其磁性稳定性良好，并且对骨髓间充质干细胞的活性无影响。YuliaSapir等报道MNPs与藻酸钠制得的磁性材料能够促进内皮细胞体外成血管化，进一步提示了基于MNPs制得的磁性材料在生物学领域的应用前景。

基于磁性纳米微粒的上述优点，将种子细胞与基于MNPs的磁性材料复合从而制备功能性磁感应性神经支架，也许能够通过定向引导再生神经生长，促进营养物质分泌，进而促进种子细胞的粘附、增殖，从而提高功能化组织工程支架的修复能力。然而，目前尚未有将种子细胞与基于MNPs的磁性材料复合制备功能性磁感应性神经支架的文献报道。

发明内容

本发明的目的在于提供新型功能性磁感应性神经支架进行复合种子细胞修复方法，解决了目前复合种子细胞修复效果不佳，减缓神经生长速度，导致支配区功能恢复不良的问题。

本发明所采用的技术方案是：1.新型功能性磁感应性神经支架进行复合种子细胞修复方法，其特征在于按照以下步骤进行：

步骤1：制备磁性纳米微粒；

分别配制0.1mol/L的Fe³⁺及Fe²⁺溶液，在通氮气条件下，按照Fe³⁺:Fe²⁺摩尔比为2:1混合，机械搅拌4h，向混合溶液中滴加1mol/L的NaOH溶液，直至混合溶液pH＝9.5，水浴加热2h后静置5h，移去上层清液，将生成的粒子减压抽滤，用蒸馏水及无水乙醇反复进行洗涤，洗去粒子表面的杂质离子，将粒子在50℃下真空干燥，研磨过筛，得到磁性纳米微粒；

步骤2：制备磁性凝胶状混浊液；

将β-甘油磷酸钠溶液滴定壳聚糖混浊液，使混合液最终的pH＝7.0～7.2，然后将所得的混浊液在预冷好的冷冻干燥机中冻干24h，得到壳聚糖/β-甘油磷酸钠混合物粉末，然后将磁性纳米微粒与壳聚糖/β-甘油磷酸钠混合物粉末混合，加入去离子水，4℃下，15000rpm，搅拌120min，制得磁性混浊液，4℃下将磁性混浊液抽真空24h，制得磁性凝胶状混浊液；

步骤3：制备磁性神经支架；

将磁性凝胶状混浊液倒入管状的磁性神经支架模具中，以小铁夹固定成形模具的两端，在微型调速仪下，以垂钓的方式将成形模具顺轴向以2×10^-5m/s的速度缓慢浸入液氮中，对注入磁性神经支架模具中的磁性凝胶状混浊液进行冷淋固形处理，待磁性神经支架模具完全浸入液氮后，继续在液氮中保留10h～14h，将磁性神经支架模具连同内部注入的磁性凝胶状混浊液一同转入-80℃的冰箱中冷藏，冷藏24h后取出，迅速去除磁性神经支架模具两端的铁夹和铜管，之后放置于预冷好的冷冻干燥机中冻干36h～40h，其中冷冻干燥机设置的预冷参数为：-60℃、100mtorr；将冻干处理后的磁性神经支架模具放置于真空状态下并升温至0℃，保持6h，之后再升温至24℃，保持60min，解除真空状态，升至常温，得到磁性神经支架，最后将磁性神经支架从磁性神经支架模具中取出；

步骤4：交联处理；

将磁性神经支架放入京尼平和无水乙醇混合溶液中进行交联处理，交联时间为46h～50h，每克磁性神经支架加入20ml京尼平和无水乙醇混合溶液，交联处理后将磁性神经支架用去离子水和质量百分浓度为95％的酒精交替清洗30min，然后置于常温下干燥一周，最后用⁶⁰Co照射磁性神经支架，进行消毒处理，得到消毒后的磁性神经支架；

步骤5：种子细胞的分离、纯化与培养；

新生SD大鼠5只，分离坐骨神经，剪碎神经组织，消化离心后，利用差速贴壁法纯化培养雪旺细胞，将第三代的雪旺细胞进行S-100与DAPI免疫细胞荧光双重染色鉴定，确定种子细胞浓度不小于95％；

步骤6：种子细胞复合在磁性神经支架后的修复；

消毒后的磁性神经支架剪成长5mm、直径2mm的圆柱体，放入96孔板中，将种子细胞与磁性神经支架复合24h后，磁场干预处理，进行细胞修复。

进一步，所述步骤2中，壳聚糖混浊液制备方法为：每20mg壳聚糖加入1.2ml冰醋酸，经22h～26h的溶解处理，制得壳聚糖混浊液；

β-甘油磷酸钠溶液制备方法为：每1mgβ-甘油磷酸钠加入1ml去离子水，充分搅拌后，制得β-甘油磷酸钠溶液。

进一步，所述步骤2中磁性纳米微粒与壳聚糖/β-甘油磷酸钠混合物粉末混合，磁性纳米微粒质量为壳聚糖/β-甘油磷酸钠混合物粉末的10％；每100mg磁性纳米微粒与壳聚糖/β-甘油磷酸钠混合物粉末混合物中加入5ml去离子水。

进一步，所述步骤4中，京尼平和无水乙醇混合溶液中，京尼平占混合溶液总质量的1％。

进一步，所述步骤6中种子细胞按照1×10⁵/每孔的密度与磁性神经支架复合。

本发明的有益效果是能够使再生神经通过组织材料内部磁场定向生长，加速神经损伤修复和成髓鞘，进一步提高神经缺损的修复效果。

附图说明

图1是本发明的磁感应性神经支架制备方法的示意图；

图2是本发明的制备方法中采用的磁性神经支架模具的结构图；

图3是本发明制备出的磁性纳米粒子的透射电镜图；

图4是本发明制备出的磁性神经支架横切面扫描电镜图；

图5是本发明制备出的磁性神经支架纵切面扫描电镜图；

图6是本发明制备出的磁性神经支架与种子细胞复合后的扫描电镜图。

具体实施方式

本发明的制备设备如图1所示，图1中瓶中装有壳聚糖/β-甘油磷酸钠溶液1和磁性纳米微粒2，微型调速仪3置于实验架上，微型调速仪3上吊有磁性神经支架模具4，磁性神经支架模具4简称成形模具，底部是液氮罐5。其中，磁性神经支架模具4的中空硅胶管7内部充有磁性凝胶状混浊液6，中空硅胶管7两头是铜管8。图2是本发明磁性神经支架模具4的结构图。图3是本发明制备出的磁性纳米微粒的透射电镜图。图4是本发明制备出的磁性神经支架横切面扫描电镜图。图5是本发明制备出的磁性神经支架纵切面扫描电镜图。图6是本发明制备出的磁性神经支架与种子细胞复合后的扫描电镜图。

本发明在制备复合种子细胞的新型功能性磁感应性神经支架的过程中，采用一定浓度的磁性纳米微粒，形成具有可磁化的磁性系统，将种子细胞与该磁性支架复合，在外部磁场作用下，不仅可以促进种子细胞的存活和增殖，还能促进神经营养物质的分泌，有效促进受损神经再生。本发明制备的磁性神经支架能够使再生神经通过组织材料内部磁场定向生长，加速神经损伤修复和成髓鞘，进一步提高神经缺损的修复效果。

以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。

实施例1

(1)分别配制0.1mol/L的Fe³⁺及Fe²⁺溶液，在通氮气条件下，按照Fe³⁺:Fe²⁺摩尔比为2:1混合，机械搅拌4h，使其充分混合；然后向混合溶液中滴加1mol/L的NaOH溶液，直至混合溶液pH＝9.5，得到黑色沉淀；水浴加热2h后静置5h，移去上层清液，将生成的粒子减压抽滤，用蒸馏水及无水乙醇反复进行洗涤，洗去粒子表面的杂质离子；将粒子在50℃下真空干燥，研磨过筛，得到磁性纳米微粒；

(2)分别称取壳聚糖和β-甘油磷酸钠，壳聚糖和β-甘油磷酸钠的质量分别为50mg、5mg，称取(1)中制得的MNPs5mg。

(3)按每20mg壳聚糖加入1.2ml的冰醋酸，将量取的冰醋酸溶液与壳聚糖混合，经22h的溶解处理，制得壳聚糖混浊液；按每1mgβ-甘油磷酸钠加入1ml去离子水，充分搅拌后，制得β-甘油磷酸钠溶液；用β-甘油磷酸钠溶液滴定壳聚糖混浊液，最终pH＝7.0，然后在预冷好的Alphal-2型冷冻干燥机中冻干24h，其中冷冻干燥机设置的参数为：-60℃、100mtorr，获得壳聚糖/β-甘油磷酸钠混合物粉末；然后在100mg壳聚糖/β-甘油磷酸钠混合物粉末中加入5mgMNPs，加入5.25ml去离子水，于4℃条件下恒温搅拌120min，搅拌速度为15000rpm，即得到磁性混浊液；将磁性混浊液先进行抽真空处理24h后再静置10h，得到磁性凝胶状混浊液。

(4)将(3)中的磁性凝胶状混浊液注入成形模具中，以小铁夹固定成形模具的两端；在微型调速仪下，以垂钓的方式将成形模具顺轴向以2×10^-5m/s的速度缓慢浸入液氮中，对注入成形模具中的磁性凝胶状混浊液进行冷淋固形处理，待成形模具完全浸入液氮后，继续在液氮中保留10h；将成形模具连同内部注入的磁性凝胶状混浊液一同转入-80℃的冰箱中冷藏；

(5)冷藏24h后，将成形模具从-80℃的冰箱中取出，迅速去除成形模具两端的铁夹和铜管；将成形模具放置于预冷好的Alphal-2型冷冻干燥机中冻干36h；其中冷冻干燥机设置的参数为：-60℃、100mtorr；将冻干处理后的成形模具先放置于真空状态下并升温至0℃，保持6h，之后再升温至24℃，保持60min，解除真空状态，最后升至常温；将神经导管从成形模具中取出，按不同的要求，裁剪成各种不同长度的神经导管，神经导管横截面直径为2mm，即制备得到磁性神经支架。

(6)将称取的京尼平与无水乙醇混合，京尼平的质量占混合溶液总质量的1％；将(5)中制得的磁性神经支架放入配制的京尼平和无水乙醇混合溶液中进行交联处理，交联时间为46h，每克的磁性神经支架加入20ml的京尼平和无水乙醇混合溶液；经交联处理后，将磁性神经支架用去离子水和质量百分浓度为95％的酒精反复清洗25min；将清洗后的磁性神经支架置于常温下干燥一周，最后用⁶⁰Co照射磁性神经支架进行消毒处理，得到消毒后的磁性神经支架。

(7)新生SD大鼠(1-2天)5只，分离坐骨神经，剪碎神经组织，消化离心后，利用差速贴壁法纯化培养雪旺细胞。将第三代的雪旺细胞进行S-100与DAPI免疫细胞荧光双重染色鉴定，确定种子细胞浓度95％。

(8)消毒后的磁性神经支架剪成长5mm、直径2mm的圆柱体，放入96孔板中，将种子细胞按照1×10⁵/每孔的密度与磁性神经支架复合。24h后，磁场干预处理，进行细胞粘附、增殖、神经营养因子分泌等生物学检测。

实施例2

(1)分别配制0.1mol/L的Fe³⁺及Fe²⁺溶液，在通氮气条件下，按照Fe³⁺:Fe²⁺摩尔比为2:1混合，机械搅拌4h，使其充分混合；然后向混合溶液中滴加1mol/L的NaOH溶液，直至混合溶液pH＝9.5，得到黑色沉淀；水浴加热2h后静置5h，移去上层清液，将生成的粒子减压抽滤，用蒸馏水及无水乙醇反复进行洗涤，洗去粒子表面的杂质离子；将粒子在50℃下真空干燥，研磨过筛，得到磁性纳米微粒；

(2)分别称取壳聚糖和β-甘油磷酸钠，壳聚糖和β-甘油磷酸钠的质量分别为50mg、5mg，称取(1)中制得的MNPs10mg。

(3)按每20mg壳聚糖加入1.2ml的冰醋酸，将量取的冰醋酸溶液与壳聚糖混合，经24h的溶解处理，制得壳聚糖混浊液；按每1mgβ-甘油磷酸钠加入1ml去离子水，充分搅拌后，制得β-甘油磷酸钠溶液；用β-甘油磷酸钠溶液滴定壳聚糖混浊液，最终pH＝7.1，然后在预冷好的Alphal-2型冷冻干燥机中冻干24h，其中冷冻干燥机设置的参数为：-60℃、100mtorr，获得壳聚糖/β-甘油磷酸钠混合物粉末；然后在100mg壳聚糖/β-甘油磷酸钠混合物粉末中加入10mgMNPs，加入5.5ml去离子水，于4℃条件下恒温搅拌120min，搅拌速度为15000rpm，即得到磁性混浊液；将磁性混浊液先进行抽真空处理24h，再静置10h，得到磁性凝胶状混浊液。

(4)将(3)中的磁性凝胶状混浊液注入成形模具中，以小铁夹固定成形模具的两端；在微型调速仪下，以垂钓的方式将成形模具顺轴向以2×10^-5m/s的速度缓慢浸入液氮中，对注入成形模具中的磁性凝胶状混浊液进行冷淋固形处理，待成形模具完全浸入液氮后，继续在液氮中保留12h；将成形模具连同内部注入的磁性凝胶状混浊液一同转入-80℃的冰箱中冷藏；

(5)冷藏24h后，将成形模具从-80℃的冰箱中取出，迅速去除成形模具两端的铁夹和铜管；将成形模具放置于预冷好的Alphal-2型冷冻干燥机中冻干38h；其中冷冻干燥机设置的参数为：-60℃、100mtorr；将冻干处理后的成形模具先放置于真空状态下并升温至0℃，保持6h，之后再升温至2,4℃，保持60min，解除真空状态，最后升至常温；将神经导管从成形模具中取出，按不同的要求，裁剪成各种不同长度的神经导管，神经导管横截面直径为2mm，即制备得到磁性神经支架。

(6)将称取的京尼平与无水乙醇混合，京尼平的质量占混合溶液总质量的1％；将(5)中制得的磁性神经支架放入配制的京尼平和无水乙醇混合溶液中进行交联处理，交联时间为48h，每克的磁性神经支架加入20ml的京尼平和无水乙醇混合溶液；经交联处理后，将磁性神经支架用去离子水和质量百分浓度为95％的酒精反复清洗30min；将清洗后的磁性神经支架置于常温下干燥一周，最后用⁶⁰Co照射磁性神经支架进行消毒处理，得到消毒后的磁性神经支架。

(7)新生SD大鼠(1-2天)5只，分离坐骨神经，剪碎神经组织，消化离心后，利用差速贴壁法纯化培养雪旺细胞。将第三代的雪旺细胞进行S-100与DAPI免疫细胞荧光双重染色鉴定，确定种子细胞浓度97％。

(8)消毒后的磁性神经支架剪成长5mm、直径2mm的圆柱体，放入96孔板中，将种子细胞按照1×10⁵/每孔的密度与磁性神经支架复合。24h后，磁场干预处理，进行细胞粘附、增殖、神经营养因子分泌等生物学检测。

实施例3

(1)分别配制0.1mol/L的Fe³⁺及Fe²⁺溶液，在通氮气条件下，按照Fe³⁺:Fe²⁺摩尔比为2:1混合，机械搅拌4h，使其充分混合；然后向混合溶液中滴加1mol/L的NaOH溶液，直至混合溶液pH＝9.5，得到黑色沉淀；水浴加热2h后静置5h，移去上层清液，将生成的粒子减压抽滤，用蒸馏水及无水乙醇反复进行洗涤，洗去粒子表面的杂质离子；将粒子在50℃下真空干燥，研磨过筛，得到磁性纳米微粒；

(2)分别称取壳聚糖和β-甘油磷酸钠，壳聚糖和β-甘油磷酸钠的质量分别为50mg、5mg，称取(1)中制得的MNPs20mg。

(3)按每20mg壳聚糖加入1.2ml的冰醋酸，将量取的冰醋酸溶液与壳聚糖混合，经26h的溶解处理，制得壳聚糖混浊液；按每1mgβ-甘油磷酸钠加入1ml去离子水，充分搅拌后，制得β-甘油磷酸钠溶液；用β-甘油磷酸钠溶液滴定壳聚糖混浊液，最终pH＝7.2，然后在预冷好的Alphal-2型冷冻干燥机中冻干24h，其中冷冻干燥机设置的参数为：-60℃、100mtorr，获得壳聚糖/β-甘油磷酸钠混合物粉末；然后在100mg壳聚糖/β-甘油磷酸钠混合物粉末中加入20mgMNPs，加入6ml去离子水，于4℃条件下恒温搅拌120min，搅拌速度为15000rpm，即得到磁性混浊液；将磁性混浊液先进行抽真空处理24h，再静置10h，得到磁性凝胶状混浊液。

(4)将(3)中的磁性凝胶状混浊液注入成形模具中，以小铁夹固定成形模具的两端；在微型调速仪下，以垂钓的方式将成形模具顺轴向以2×10^-5m/s的速度缓慢浸入液氮中，对注入成形模具中的磁性凝胶状混浊液进行冷淋固形处理，待成形模具完全浸入液氮后，继续在液氮中保留14h；将成形模具连同内部注入的磁性凝胶状混浊液一同转入-80℃的冰箱中冷藏；

(5)冷藏24h后，将成形模具从-80℃的冰箱中取出，迅速去除成形模具两端的铁夹和铜管；将成形模具放置于预冷好的Alphal-2型冷冻干燥机中冻干50h；其中冷冻干燥机设置的参数为：-60℃、100mtorr；将冻干处理后的成形模具先放置于真空状态下并升温至0℃，保持6h，之后再升温至24℃，保持60min，解除真空状态，最后升至常温；将神经导管从成形模具中取出，按不同的要求，裁剪成各种不同长度的神经导管，神经导管横截面直径为2mm，即制备得到磁性神经支架；

(6)将称取的京尼平与无水乙醇混合，京尼平的质量占混合溶液总质量的1％；将(5)中制得的磁性神经支架放入配制的京尼平和无水乙醇混合溶液中进行交联处理，交联时间为50h，每克的磁性神经支架加入20ml的京尼平和无水乙醇混合溶液；经交联处理后，将磁性神经支架用去离子水和质量百分浓度为95％的酒精反复清洗35min；将清洗后的磁性神经支架置于常温下干燥一周，最后用⁶⁰Co照射磁性神经支架进行消毒处理，得到消毒后的磁性神经支架。

(7)新生SD大鼠(1-2天)5只，分离坐骨神经，剪碎神经组织，消化离心后，利用差速贴壁法纯化培养雪旺细胞。将第三代的雪旺细胞进行S-100与DAPI免疫细胞荧光双重染色鉴定，确定种子细胞浓度99％。

(8)消毒后的磁性神经支架剪成长5mm、直径2mm的圆柱体，放入96孔板中，将种子细胞按照1×10⁵/每孔的密度与磁性神经支架复合。24h后，磁场干预处理，进行细胞粘附、增殖、神经营养因子分泌等生物学检测。

实施例1、2、3中，制备磁性神经支架用到的主要原料为壳聚糖、β-甘油磷酸钠及磁性纳米微粒。其中：

壳聚糖是甲壳素N-脱乙酰基的产物，具有无毒性、无免疫原性、无热源反应、不溶血等特性，其可生物降解性和良好的生物相容性、成膜性，使其成为一种理想的安全可靠的天然生物活性支架材料。

β-甘油磷酸钠主要用于合成泛酸和泛酸钙、肌肽、帕米膦酸钠、巴柳氮等，在医药、饲料、食品等领域应用广泛，具有良好的生物相容性。

磁性纳米微粒，由于具有特殊的磁导向性、超顺磁性，以及表面可连接生化活性功能基团等特性，使其在核酸分析、临床诊断、靶向药物、酶和细胞固定化等领域的应用得到了广泛的发展，具有超顺磁性、靶向性和良好的生物相容性。

制备磁性可降解神经组织工程材料采用的成形模具，如图2所示，包括有中空硅胶管7，中空硅胶管7的两端各连接有一个大小相同的实心铜柱8，中空硅胶管7之间填充有磁性凝胶状混浊液6，其中，实心铜柱8的尺寸为：长2cm，直径2mm；中空硅胶管7的尺寸为：长10cm，横截面外径为2.5mm，横截面内径为2mm。

实施例4

应用电生理技术和本实施例2中制备出的复合种子细胞的新型功能性磁感应性神经支架结合外部脉冲电磁场(2mT，50Hz；Pulsed Electromagnetic Field，PEMF)对种子细胞的存活、粘附、增殖进行检测，结果如下：

外部脉冲电磁场作用后24h，与种子细胞相复合的磁性神经支架中的细胞存活、增殖比与种子细胞相复合的无磁性神经支架中的显著增高(P<0.05)，其比外部磁场作用未复合材料的种子细胞显著增高(P<0.05)。如表1所示。

表1 种子细胞存活、增殖率(％，)

以上所述仅是对本发明的较佳实施方式而已，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施方式所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。

Claims (5)

1.新型功能性磁感应性神经支架进行复合种子细胞修复方法，其特征在于按照以下步骤进行：

步骤1：制备磁性纳米微粒；

分别配制0.1mol/L的Fe³⁺及Fe²⁺溶液，在通氮气条件下，按照Fe³⁺:Fe²⁺摩尔比为2:1混合，机械搅拌4h，向混合溶液中滴加1mol/L的NaOH溶液，直至混合溶液pH＝9.5，水浴加热2h后静置5h，移去上层清液，将生成的粒子减压抽滤，用蒸馏水及无水乙醇反复进行洗涤，洗去粒子表面的杂质离子，将粒子在50℃下真空干燥，研磨过筛，得到磁性纳米微粒；

步骤2：制备磁性凝胶状混浊液；

将β-甘油磷酸钠溶液滴定壳聚糖混浊液，使混合液最终的pH＝7.0～7.2，然后将所得的混浊液在预冷好的冷冻干燥机中冻干24h，得到壳聚糖/β-甘油磷酸钠混合物粉末，然后将磁性纳米微粒与壳聚糖/β-甘油磷酸钠混合物粉末混合，加入去离子水，4℃下，15000rpm，搅拌120min，制得磁性混浊液，4℃下将磁性混浊液抽真空24h，制得磁性凝胶状混浊液；

步骤3：制备磁性神经支架；

将磁性凝胶状混浊液倒入管状的磁性神经支架模具中，以小铁夹固定成形模具的两端，在微型调速仪下，以垂钓的方式将成形模具顺轴向以2×10^-5m/s的速度缓慢浸入液氮中，对注入磁性神经支架模具中的磁性凝胶状混浊液进行冷淋固形处理，待磁性神经支架模具完全浸入液氮后，继续在液氮中保留10h～14h，将磁性神经支架模具连同内部注入的磁性凝胶状混浊液一同转入-80℃的冰箱中冷藏，冷藏24h后取出，迅速去除磁性神经支架模具两端的铁夹和铜管，之后放置于预冷好的冷冻干燥机中冻干36h～40h，其中冷冻干燥机设置的预冷参数为：-60℃、100mtorr；将冻干处理后的磁性神经支架模具放置于真空状态下并升温至0℃，保持6h，之后再升温至24℃，保持60min，解除真空状态，升至常温，得到磁性神经支架，最后将磁性神经支架从磁性神经支架模具中取出；

步骤4：交联处理；

将磁性神经支架放入京尼平和无水乙醇混合溶液中进行交联处理，交联时间为46h～50h，每克磁性神经支架加入20ml京尼平和无水乙醇混合溶液，交联处理后将磁性神经支架用去离子水和质量百分浓度为95％的酒精交替清洗30min，然后置于常温下干燥一周，最后用⁶⁰Co照射磁性神经支架，进行消毒处理，得到消毒后的磁性神经支架；

步骤5：种子细胞的分离、纯化与培养；

新生SD大鼠5只，分离坐骨神经，剪碎神经组织，消化离心后，利用差速贴壁法纯化培养雪旺细胞，将第三代的雪旺细胞进行S-100与DAPI免疫细胞荧光双重染色鉴定，确定种子细胞浓度不小于95％；

步骤6：种子细胞复合在磁性神经支架后的修复；

消毒后的磁性神经支架剪成长5mm、直径2mm的圆柱体，放入96孔板中，将种子细胞与磁性神经支架复合24h后，磁场干预处理，进行细胞修复。

2.按照权利要求1所述新型功能性磁感应性神经支架进行复合种子细胞修复方法，其特征在于：

所述步骤2中，壳聚糖混浊液制备方法为：每20mg壳聚糖加入1.2ml冰醋酸，经22h～26h的溶解处理，制得壳聚糖混浊液；

β-甘油磷酸钠溶液制备方法为：每1mgβ-甘油磷酸钠加入1ml去离子水，充分搅拌后，制得β-甘油磷酸钠溶液。

3.按照权利要求1所述新型功能性磁感应性神经支架进行复合种子细胞修复方法，其特征在于：所述步骤2中磁性纳米微粒与壳聚糖/β-甘油磷酸钠混合物粉末混合，磁性纳米微粒质量为壳聚糖/β-甘油磷酸钠混合物粉末的10％；每100mg磁性纳米微粒与壳聚糖/β-甘油磷酸钠混合物粉末混合物中加入5ml去离子水。

4.按照权利要求1所述新型功能性磁感应性神经支架进行复合种子细胞修复方法，其特征在于：所述步骤4中，京尼平和无水乙醇混合溶液中，京尼平占混合溶液总质量的1％。

5.按照权利要求1所述新型功能性磁感应性神经支架进行复合种子细胞修复方法，其特征在于：所述步骤6中种子细胞按照1×10⁵/每孔的密度与磁性神经支架复合。