CN104212897A - 一种大批量开发苎麻基因组ssr标记的方法及其开发的引物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种大批量开发苎麻基因组SSR的方法及其开发的引物；具体包括如下步骤：(1)提取苎麻的DNA；(2)利用RsaI酶对苎麻基因组进行酶切，获得214-314bp的小片段；(3)对酶切获取的小片段进行测序，获得SLAF标签；(4)对标签，利用SSR hunter搜索SSR序列；(5)对搜索到的SSR序列进行引物设计，经引物多态性检测，得到多态性引物，即为基因组SSR标记。相对于传统的磁珠富集法，方法易行，操作简便，效率高，成本低。大批量苎麻基因组SSR标记的获得，为苎麻分子生物学和遗传学奠定了坚实基础。

Description

一种大批量开发苎麻基因组SSR标记的方法及其开发的引物
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种从苎麻基因组中高通量开发SSR标记的方法及其开发的引物。
背景技术
简单序列重复(simple sequence repeat，SSR)，也称微卫星(microsatellite)，是指以1～6个核苷酸为单位在基因组中多次串联重复的DNA序列(Akkaya M,Bhagwata A,CreganB.1992.Length polymorphisms of simple repeat DNA in soybean.Genetics.132:1131-1139)。SSR标记与其它分子标记技术相比，具有易检测、共显性遗传、重复性好、数量丰富和多态性高以及遍布整个基因组等优点，因此在植物遗传研究的众多方面受到重视(Schlotterer C.2004.The evolution of molecular markers-just a matter offashion.Nat Rev Genet.5:63-69)。SSR可分为基因组SSR和EST-SSR。传统的基因组SSR标记开发一般使用文库筛选法、磁珠富集法，开发过程繁琐、时间长、成本高，而且效率低(Roder MS,Korzun V,WendehakeK,Plaschke J,Tixier MH,Leroy P,Ganal MW.1998.A microsatellite map of wheat.Genetics.149:2007-2023)。此外，传统方法开发的基因组SSR不但数量较少，而且重复基序也限制在2～3个核苷酸，极大地限制了基因组SSR的应用范围(林元震，郭海，黄少伟，刘纯鑫，刘天颐，陈晓阳.2009.EST-SSR标记在木本植物中的开发和应用.植物生理学通讯.45(12):1221-1225)。
随着具有高通量、低成本、测序错误率低、测序读长短特点的新一代测序技术和生物信息学的发展，使得高通量标记开发成为可能。目前，苎麻开发的SSR标记主要采用磁珠富集法和从EST中开发SSR标记，开发的SSR标记不足2000对。利用SLAF-seq技术开发SSR标记尚未见报道。
发明内容
本发明的目的是在于提供一种大批量开发苎麻基因组SSR的方法及其开发的引物；相对于传统的磁珠富集法，方法易行，操作简便，效率高，成本低。大批量苎麻基因组SSR的获得，为苎麻分子生物学和遗传学奠定了坚实基础。
一种大批量开发苎麻基因组SSR标记的方法，具体包括如下步骤：
(1)提取苎麻的DNA；
(2)将苎麻基因组DNA酶切为小片段；
(3)对酶切后获取的小片段进行测序，获得SLAF标签；
(4)对步骤(3)获得的标签，利用SSR hunter搜索SSR序列；
(5)对搜索到的SSR序列进行引物设计，经引物多态性检测，得到多态性引物，即为基因组SSR标记。
步骤(2)中采用RsaI酶酶切苎麻基因组DNA。酶切后获取长度为214-314bp的片段。步骤(4)的SSR hunter搜索SSR序列的标准为：单核苷酸的重复次数≥16，二核苷酸的重复次数≥8，三核苷酸的重复次数≥5，四核苷酸的重复次数≥4，五核苷酸的重复次数≥3，或者六核苷酸的重复次数≥3；
步骤(5)的引物设计参数：扩增产物长度在100-180bp，引物长度在18-25bp。
采用上述方法设计并经过多态性检测的15对基因组SSR引物序列如下：
以前的苎麻基因组SSR都是采用磁珠富集法进行，该方法过程繁琐，成本高；采用SLAF-seq技术开发基因组SSR标记，速度快，成本低，效率高。本发明1个月完成了3934个SSR引物的开发，而且成本仅有1万元，平均开发一个标记的成本仅仅2元多。
附图说明
图1为使用本发明设计的引物ibg1-16得到的中苎1号24个自交后代材料的SSR指纹图谱，图1最左边为Marker；
图2为使用本发明设计的引物ibg5-5得到的中苎1号24个自交后代材料的SSR指纹图谱；
图3为使用本发明设计的引物ibg3-209得到的中苎1号24个自交后代材料的SSR指纹图谱；
图4为使用本发明设计的引物ibg5-5得到的24个苎麻品种材料的SSR指纹图谱。
具体实施方式
以下结合实施例旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。
实施例1
(1)确定酶切方案和切胶范围，测序量等以保证其分子标记开发的密度、均匀性从而确保达到预期的实验目的。
提取苎麻品种中苎1号和合江青麻的DNA。
酶切方案选择
根据近缘物种的选取原则，最终选取物种大麻基因组作为参考基因组进行酶切预测。
苎麻物种信息以及近缘物种信息如下所示：
苎麻信息：基因组大小为716Mb，GC含量为49％；
近缘物种大麻信息：基因组大小为757Mb，GC含量为24％，下载地址：
ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/genomes/Eukaryotes/plants/Cannabis_sativa/canSat3/。
候选酶切方案信息
利用酶切预测软件对大麻基因组进行系统分析，主要根据基因组大小、GC含量、重复序列比例和基因结构特点等信息，设计候选酶切方案。
对近缘物种大麻基因组进行酶切预测，候选酶切方案信息如表1所示：
表1不同切胶范围内酶切结果比较
最佳酶切方案评估
最佳酶切方案选择原则：
SLAF标签在基因组上分布足够均匀，重复序列适中。
根据以上原则结合表1的信息，选择基因片段范围在214-314bp的方案作为最佳酶切方案，即酶切后获取214-314bp的片段。
酶切体系为基因组DNA500ng(苎麻)、NEB buffer4 1μl(New England Biolabs公司缓冲液4)、RsaI0.12μl、ddH2O(双蒸水)加至50μl体系，试剂配好后混匀，37℃15h，用QIAGEN试剂盒纯化。
(2)5’末端修复：将酶切产生的不同类型的末端进行修复，同时对5’末端进行磷酸化修饰。反应体系为步骤(1)中纯化样本DNA30μl、T4DNALigase Buffer with10mMATP(含10mMATP的T4DNA连接缓冲液)10μl、10mM dNTP Mix(10mM dNTP混合液)4μl、T4DNAPolymerase(T4DNA聚合酶)5μl、Klenow Enzyme(Klenow酶)1μl、T4PNK5μl、ddH2O(双蒸水)45μl。试剂配好后混匀，20℃30分钟，反应结束后用QIAGEN试剂盒纯化，33μlEB回溶。
(3)3’末端加A：与solexa(Illumina公司生产的高通量测序仪)接头5’端的T互补提高连接效率，并阻止solexa接头进行自连。反应体系为步骤(2)中纯化样本DNA32μl、KlenowBuffer5μl、1mM dATP10μl、Klenow Exo-3μl。
(4)连接solexa测序接头：便于统一模板进行PCR扩增，同时将连接产物锚定在玻璃表面(flow cell)上，进行桥式扩增。反应体系为步骤(3)中纯化样本DNA10μl、DNALigaseBuffer2X(2X的DNA连接酶缓冲液)25μl、Adapter(solexa测序接头)10μl、DNA连接酶5μl。
(5)PCR扩增：增大起始模板量，达到上机建库量的要求。反应体系为步骤(4)中纯化样本DNA8μl、PCR primer PE1.0(PCR引物1)1.5μl、PCR primer PE2.0(PCR引物2)1.5μl、Phusion DNA Polymerase(Finnzymes Oy公司生产的DNA聚合酶)20μl、ddH2O(双蒸水)9μl。反应程序为98℃预变性30s，98℃变性40s、65℃退火30s、72℃延伸30s、10-12个循环，72℃延伸5min。
(6)切取目的片段：根据设计预期得到的SLAF标签数目确定切胶范围。切取大小合适的目的片段；制作2％低熔点琼脂糖胶，将步骤(5)中的PCR产物进行电泳，120V60分钟，切取400-500bp的目的片段，QIAGEN胶回收试剂盒回收目的片段。
(7)定量与测序：优化特异性长度片段cluster的密度，确保测序有效数据量达到预期要求,对所需要的cluster上机测序。
通过对酶切片段进行测序，总共得到7.5M测序reads，总数据量为0.76Gb。对各样品的测序数据进行评估，包括reads长度、数量、总数据量、Q20和GC含量，具体测序数据统计评估结果见表2：
表2各样品测序数据评估统计表
(8)序列信息分析：利用Illumina GAIIx测序得到原始数据，利用软件SLAF_Poly.pl.(北京百迈克公司研发)对测序结果中index序列识别和低质量过滤，得到项目各样品有效原始数据。基因组经酶切处理打断为多个小片段，每个片段相当于一个标记位点，同一位点reads序列通过相似性聚类，形成一个group。一个group中一般存在1-4条高深度片段，其余全为低深度片段。一般高深度片段即为潜在基因型，低深度片段可能由于测序错误导致。为了纠正测序错误，通过纠错策略将每一个group中准确的高深度片段作为参考序列，低深度片段比对到参考序列上，对低深度片段上的错配碱基进行纠正，消除错误碱基；得到各样品有效特异序列标签。
获得SLAF标签数为115,369，整体平均深度达到33.26x。各样品SLAF标签以及所有样品群体SLAF标签信息统计见表3：
表3各样品SLAF标签信息统计表
(9)SSR搜索
对SLAF标签序列，利用SSRhunter结合人工搜索寻找SSR。搜索的标准为：单核苷酸的重复次数≥16，二核苷酸的重复次数≥8，三核苷酸的重复次数≥5，四核苷酸的重复次数≥4，五核苷酸的重复次数≥3，或者六核苷酸的重复次数≥3。在115,369个标签中，搜索到3934个SSR，比率为4％。
(10)根据含有SSR的基因组序列进行设计引物
根据SSR侧翼序列设计引物，得到基因组SSR标记的扩增引物。引物设计参数：扩增产物长度在100-180bp，引物长度在18-25bp。
实施例2
引物多态性检测
1材料与方法
1.1材料
中苎1号的24个自交后代；
24个苎麻品种，品种名见表4。
1.2方法
1.2.1基因组DNA的提取
对中苎1号的24个自交后代，以及24个苎麻品种单株新发出的嫩芽，利用天根试剂盒提取DNA。提取后的DNA通过电泳检测浓度后，计算样品DNA浓度，并稀释到所需浓度。
1.2.2利用所设计的SSR引物进行PCR
PCR反应体系:20μL反应体系组成见表5
表5PCR反应体系组成
体系组成 终浓度
Mg2+ 2.0mmol/L
Taq Buffer 1×
dNTP Mix 200μmol/L each
Taq Enzyme 1U
Primers 0.25μmol/L each
DNA 90ng
PCR扩增程序：95℃预变性5min，94℃变性1min，50℃复性50sec，72℃延伸1min，29次循环后72℃延伸10min。PCR扩增在PTC-200扩增仪上进行(MJ Research.Inc.)。1.2.3PCR扩增产物检测
扩增产物进行8％聚丙烯酰胺凝胶电泳，进行银染。记录带型。以获得的15对多态性引物为例，对所示材料分别进行PCR扩增，进行多态性检测，实验设3次重复，均得到相同的结果，而且得到清晰的中苎1号24个自交后代，以及24个苎麻品种的SSR多态性图谱。说明本发明开发的标记可以用于构建苎麻SSR多态性图谱。
图1、图2、图3分别是使用多态性引物ibg1-16、ibg5-5和ibg3-209得到的中苎1号自交后代的SSR多态性图谱。
图4是24个苎麻品种使用多态性引物ibg5-5得到的SSR多态性图谱。

Claims (7)

1.一种大批量开发苎麻基因组SSR标记的方法，其特征在于，具体包括如下步骤： 
(1)提取苎麻的DNA； 
(2)将苎麻基因组DNA酶切为小片段； 
(3)对酶切后获取的小片段进行测序，获得SLAF标签； 
(4)对步骤(3)获得的标签，利用SSR hunter搜索SSR序列； 
(5)对搜索到的SSR序列进行引物设计，经引物多态性检测，得到多态性引物，即为基因组SSR标记。 
2.根据权利要求1所述的大批量开发苎麻基因组SSR标记的方法，其特征在于，步骤(2)中采用RsaI酶酶切苎麻基因组DNA。 
3.根据权利要求2所述的大批量开发苎麻基因组SSR标记的方法，其特征在于，酶切后获取长度为214-314bp的片段。 
4.根据权利要求1所述的大批量开发苎麻基因组SSR标记的方法，其特征在于，步骤(4)的SSR hunter搜索SSR序列的标准为：单核苷酸的重复次数≥16，二核苷酸的重复次数≥8，三核苷酸的重复次数≥5，四核苷酸的重复次数≥4，五核苷酸的重复次数≥3，或者六核苷酸的重复次数≥3。
5.根据权利要求1所述的大批量开发苎麻基因组SSR标记的方法，其特征在于，步骤(5)的引物设计参数：扩增产物长度在100-180bp，引物长度在18-25bp。 
6.根据权利要求1或2或3或4或5所述的大批量开发苎麻基因组SSR标记的方法，其特征在于，设计并经过多态性检测的15对基因组SSR引物序列如下： 
7.用于苎麻基因组SSR标记的引物，其特征在于，15对基因组SSR标记引物序列如下： 
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