CN104212740A - 干酪乳杆菌及其应用以及功能食品组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)，所述干酪乳杆菌的保藏编号为CGMCC No.9275。其次，本发明公开了一种功能食品组合物，该功能食品组合物含有所述干酪乳杆菌的菌体和食物。再者，本发明公开了所述干酪乳杆菌在制备具有减肥功能的功能食品组合物中的应用以及在制备用于治疗肥胖症的药物中的应用。本发明的干酪乳杆菌具有良好的减肥作用。
Description
技术领域
本发明涉及一种干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)及其应用以及功能食品组合物，具体地，涉及一种干酪乳杆菌，含有该干酪乳杆菌的功能食品组合物，以及该干酪乳杆菌在制备具有减肥功能的功能食品中的应用。
背景技术
肥胖症是一组常见的、古老的代谢症群。当人体进食热量多于消耗热量时，多余热量以脂肪形式储存于体内，其量超过正常生理需要量，且达一定值时遂演变为肥胖症。肥胖症是最主要的可预防性致死因素之一。大量美国和欧洲的研究表明肥胖症的致死率随身体质量指数(BMI)而异。非吸烟者中BMI在21–24之间的以及吸烟者中BMI在24-27之间的死亡率最低，BMI增加或者减少都会引起死亡率升高。肥胖症所导致的死亡率升高在仍在吸烟的，曾经吸烟现已戒断的，或者从未吸烟的患者中无显著区别。BMI大于32可导致死亡率加倍。美国每年因肥胖症而增加的死亡人数在111999到365000之间。肥胖症使预期寿命平均减少6-7年。其中严重肥胖症(BMI>40)使男性预期寿命减少20年，女性减少5年。
目前肥胖症的治疗手段主要有药物治疗、手术治疗和饮食干预三种方式。药物治疗中的抑制食欲药物，如右旋苯丙胺、西布曲明和右旋芬氟拉明对身体有严重的副作用，甚至出现死亡病例的报道。抑制脂肪吸收药物主要为奥利司他，是目前唯一的非中枢神经作用的减肥药物，它能够特异性地抑制胃肠道内的胰脂肪酶活性，从而抑制肠道内食物脂肪的分解，使1/3的脂肪从粪便中排除。该药物也有一定副作用，如抑制脂溶性维生素的水解和吸收，导致严重的排便紧迫。增加能量消耗的药物通过增加代谢率达到降低体重的目的，但是由于其毒副作用大，并不建议采用。外科手术法治疗肥胖症仅适用于严重的肥胖症患者，且有术后可能出现感染、顽固性呕吐、食管反流、营养不良等副作用。与以上两种方式相比，饮食干预是一种安全、健康的减肥方式。肥胖患者可以通过限制每日摄入的能量，调节饮食结构，少食高糖高脂的食物，并增加体育锻炼来达到减肥目的。
干酪乳杆菌进入人体后可以在肠道内大量存活，起到调节肠内菌群平衡、促进人体消化吸收等作用。同时，干酪乳杆菌具有高效降血压、降胆固醇，促进细胞分裂，产生抗体免疫，增强人体免疫及预防癌症和抑制肿瘤生长等功能；还具有缓解乳糖不耐症、过敏等益生保健作用。近年来，由于干酪乳杆菌对其宿主营养、免疫、防病等具有显著的益生功效，越来越成为人们研究、开发、生产的焦点。而对于干酪乳杆菌在减肥方面的应用有待进一步研究。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有减肥功能的干酪乳杆菌。
为了实现上述目的，第一方面，本发明提供了一种干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)，所述干酪乳杆菌的保藏编号为CGMCC No.9275。
第二方面，本发明提供了一种功能食品组合物，该功能食品组合物含有第一方面所述的干酪乳杆菌的菌体和食物。
第三方面，本发明提供了第一方面所述的干酪乳杆菌在制备具有减肥功能的功能食品组合物中的应用。
第四方面，本发明提供了第一方面所述的干酪乳杆菌在制备用于治疗肥胖症的药物中的应用。
本发明提供的干酪乳杆菌具有良好的减肥作用。
本发明的其它特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
生物保藏
本发明的干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)，于2014年6月5日被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)(保藏单位的缩写为CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.9275。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
本发明提供了一种干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)，其中，该干酪乳杆菌的保藏编号为CGMCC No.9275。
本发明的干酪乳杆菌从干酪中分离得到。而且，本发明的干酪乳杆菌菌株具有良好的发酵性能，且能够耐受人体胃肠道环境，到达肠道发挥其生理功能。本发明的干酪乳杆菌菌株在调节免疫、调节肠道菌群和促进肠道健康等方面具有显著的效果。
本发明提供的干酪乳杆菌经过液体培养能够产生大量干酪乳杆菌的活菌体，所述培养的方法没有特别的要求，只要是能使所述干酪乳杆菌增殖即可，例如可以按照106-8CFU/mL的接种量将干酪乳杆菌的活菌体接种于乳杆菌培养基中，并且在厌氧或好氧的条件下，在15-38℃的温度下培养8-72小时后，得到培养液。所述乳杆菌的培养基可以为本领域公知的各种适合乳杆菌培养的培养基，例如可以为乳汁和/或《乳酸菌——生物学基础及应用》(杨洁彬，轻工业出版社，1996年出版)中所述的乳酸菌(MRS)培养基。
本发明可以进一步分离上述培养液中的干酪乳杆菌的活菌体，所述分离的方法没有特别的限制，只要是能从培养液中富集菌体即可，例如可以通过离心和/或过滤的方法实现，所述离心和所述过滤的条件可以为公知的条件，本发明在此不再赘述。
第二方面，本发明提供了一种功能食品组合物，其中，该功能食品组合物含有第一方面所述的干酪乳杆菌的菌体和食物。
本发明的发明人在研究中发现，无论是干酪乳杆菌的活菌体还是干酪乳杆菌的死菌体，或是干酪乳杆菌的活菌体和死菌体的混合菌体均具有良好的减肥功效，因此本发明提供的功能食品组合物含有食物和干酪乳杆菌的活菌体和/或死菌体。优选地，为了进一步增强干酪乳杆菌的减肥效果，使用干酪乳杆菌的活菌体。
根据本发明，所述干酪乳杆菌的死菌体的制备方法没有特别的限制，即，可以通过常规的方法获得。例如，可以将上述培养后的干酪乳杆菌的活菌体加热致死，也可以将其辐射致死。所述加热致死的条件可以包括：温度为65-85℃，时间为0.5-1.5h。
根据本发明，尽管将干酪乳杆菌的菌体添加到食物中，即可实现本发明的目的，即起到减肥的作用，但优选情况下，以功能食品组合物的总重量为基准，所述干酪乳杆菌的菌体的添加量为105-1010CFU/g，优选为108-1010CFU/g。在上述优选情况下，功能食品组合物的减肥效果更显著。
CFU(Colony-Forming Units，菌落形成单位)指活菌个数。在活菌培养计数时，由单个菌体或聚集成团的多个菌体在固体培养基上生长繁殖所形成的集落，称为菌落形成单位，以其表达活菌的数量，可以通过平板菌落计数法获得。本发明中，当干酪乳杆菌的死菌体的浓度以CFU/ml表示时，是指将干酪乳杆菌的活菌体致死得到相应数量的死菌体，并将其溶于缓冲液中配制成所需浓度。
本发明中，食物可以是任意类型的食物，例如果汁制品、乳制品、豆制品等。食物也可以根据食用对象的不同而有所不同。所述功能食品组合物中还可以含有常规的添加剂，例如香料、矿物质、维生素、稳定剂、增稠剂、防腐剂等。
只要将本发明的干酪乳杆菌的菌体添加到食物中即可得到本发明的功能食品组合物。符合上述要求的功能食品组合物可以包括干酪乳杆菌的培养液(例如经该干酪乳杆菌发酵制得的发酵乳制品)、分离的干酪乳杆菌的菌体等。
第三方面，本发明提供了如上所述的干酪乳杆菌在制备具有减肥功能的功能食品组合物中的应用。所述干酪乳杆菌的使用剂量可以为106-1010cfu/kg体重/天。
第四方面，本发明提供了如上所述的干酪乳杆菌在制备用于治疗肥胖症的药物中的应用。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。以下制备例和实施例中：
实验动物：雄性4周龄SPF级C57BL/6J小鼠，体重14-15g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司；饲养使用的无菌垫料购自中国军事科学医学院。实验饲料购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，分为维持饲料和高脂饲料(40％脂肪供能肥胖、胰岛素抵抗诱导模型饲料)，经辐射灭菌，两种饲料配方如下表1所示：
表1
| 成分/供能比例 | 维持饲料 | 高脂饲料 |
| 蛋白质(g/100g) | 20.5 | 22.3 |
| 脂肪(g/100g) | 4.62 | 19.8 |
| 碳水化合物(g/100g) | 52.5 | 44.6 |
| 蛋白质(％) | 23.8 | 20 |
| 脂肪(％) | 12.1 | 40 |
| 碳水化合物(％) | 61.1 | 40 |
| 总能量(kcal/100g) | 345 | 445.5 |
饲养条件：温度20±2℃，湿度40-50％，12h光照交替，小鼠按照每笼3只饲养，自由摄入维持饲料，自由饮水，适应性饲养1周。
实验菌株：干酪乳杆菌L9为本发明的干酪乳杆菌，保藏编号为CGMCCNo.9275。
鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus GG，LGG，购自ATCC，ATCC编号为53103TM)公认的具有良好减肥功效的益生菌菌株，作为本发明的对照菌株。
MRS培养基(pH 6.5)：蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母膏5g、葡萄糖20g、吐温-80 1ml、无水乙酸钠5g、K2HPO4 2g、柠檬酸铵2g、MgSO4·7H2O0.58g、MnSO4·H2O 0.2g、蒸馏水1000ml(固体培养基加20g琼脂)，121℃灭菌15min后备用，以上试剂均购自科百奥生物技术公司。
数据的统计分析：实验数据以平均值±标准误(mean±SE)来表示，利用SPSS17.0软件分析。造模后正常组和造模组体重及摄食量的变化采用独立样本t进行分析，p<0.05表示二者之间存在显著性差异。灌胃干酪乳杆菌L9后采用单因素方差分析One-way ANOVA(one-way analysis of variance)分析各个实验组间是否具有显著性差异，以Duncans多重比较检验(Duncansmultiple range tests)具体分析组间差异，p<0.05表示具有显著性差异。
制备例1
本制备例用来建立实施例中使用的小鼠肥胖模型。
小鼠用剪毛法进行标记后进行适应性喂养1周，按照体重随机分为2组，分别为正常组(15只)，造模组(126只)。正常组在整个动物实验期间均饲喂维持饲料，造模组在造模过渡期(约1周)饲喂维持饲料和高脂饲料组成的混合饲料，期间不断增加高脂饲料的比例，过渡方法如下：按照小鼠每天的摄食量给予饲料，第1天给予100％维持饲料，第2天给予88％维持饲料和12％高脂饲料，第3天给予75％维持饲料和25％高脂饲料，以此类推，直至过度期结束后全部换成高脂饲料。从第2周开始完全饲喂高脂饲料，持续饲喂7周。每周监测体重和摄食量，计算能量摄入值。造模成功的标准为肥胖小鼠体重超过正常组小鼠体重15％，或肥胖组体重超过正常组体重平均值加1.96倍标准差。结果得到98只造模成功的小鼠，即小鼠肥胖模型。
制备例2
(1)干酪乳杆菌L9以及LGG活菌体菌悬液的制备：将干酪乳杆菌L9以及LGG按照107CFU/ml的接种量分别接种于500ml的MRS液体培养基中，37℃静置培养18h，6000g离心15min收集菌体，菌体沉淀用无菌生理盐水洗涤1次，相同转速和时间离心，用无菌生理盐水稀释进行梯度稀释，干酪乳杆菌L9分别配制成5×105CFU/ml的菌悬液B1、5×107CFU/ml的菌悬液B2和5×109CFU/ml的菌悬液B3，对照菌株LGG配制成5×107CFU/ml的菌悬液D1。
(2)干酪乳杆菌L9死菌体菌悬液的制备：将干酪乳杆菌L9按照107CFU/ml的接种量接种于100ml的MRS液体培养基中，37℃培养18h，70℃灭活1小时，6000g离心15min收集菌体，菌体沉淀重悬于无菌生理盐水中，配制成5×107CFU/ml的菌悬液B4。
(3)干酪乳杆菌L9死活混合菌体菌悬液的制备：按照(1)和(2)中的方法制备干酪乳杆菌L9的活菌体和死菌体，并按照1:1的质量比配制成5×107CFU/ml的菌悬液B5。
实施例1
本实施例用来说明本发明的干酪乳杆菌对肥胖小鼠体重增重和摄食量的影响。
将造模成功的小鼠重新按照体重随机分为7组，每组14只。重新分组的过程中遵循就近调换的原则。整个实验分为8组，分别为：正常组、模型组、阳性对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组、死菌体组和混合菌体组，除正常组外，其他各个实验组的小鼠均为造模成功的小鼠。测定各组小鼠的初始体重。实验过程中，各组的饲料组成和干酪乳杆菌L9的剂量如表2所示，具体地，取生理盐水或菌悬液B1-B5和D1，每天定时按照2mL/kg体重以灌胃的方式喂给小鼠，灌胃期为12周。灌胃期间小鼠自由摄食、饮水。每周监测体重和摄食量，根据体重每周校正给药剂量。
表2
| 序号 | 分组 | 饲料 | 干酪乳杆菌L9的使用情况 |
| 1 | 正常组(ND) | 维持饲料 | 生理盐水 |
| 2 | 肥胖组(HFD) | 高脂饲料 | 生理盐水 |
| 3 | 对照组(LGG) | 高脂饲料 | 菌悬液D1 |
| 4 | 低剂量组(LL9) | 高脂饲料 | 菌悬液B1 |
| 5 | 中剂量组(ML9) | 高脂饲料 | 菌悬液B2 |
| 6 | 高剂量组(HL9) | 高脂饲料 | 菌悬液B3 |
| 7 | 死菌体组(DL9) | 高脂饲料 | 菌悬液B4 |
| 8 | 混合菌体组(BL9) | 高脂饲料 | 菌悬液B5 |
体重增重为灌胃12周后小鼠的体重与初始体重的差值，摄食量(能量摄入)为灌胃12周内各组小鼠平均每天摄入的能量值，结果如表3所示。
从表3可以看出，饲喂高脂饲料12周后，肥胖组小鼠体重增重显著高于正常组(11.69±0.9vs.2.46±0.287，p<0.05)；灌胃干酪乳杆菌L9后，肥胖小鼠的体重增重减缓，与肥胖组相比，都具有显著性差异(p<0.05)。而在灌胃干酪乳杆菌L9的12周内，各组小鼠每天摄入的能量值有所不同。正常组小鼠每天摄入的能量显著低于肥胖组小鼠(p<0.05)，与肥胖组相比，灌胃干酪乳杆菌L9后，小鼠的能量摄入显著下降(p<0.05)。
表3
注：“—”表示未测定
实施例2
本实施例用来说明本发明的干酪乳杆菌对肥胖小鼠脂肪含量的影响。
根据实施例1中所述的方法用干酪乳杆菌L9灌胃小鼠12周，采血后颈椎脱臼处死，打开腹腔，找到两侧附睾，剪下，小心分离出白色附睾脂肪组织，用滤纸吸干后在万分之一天平上称重。分离肠系膜脂肪时先找到胃，用镊子小心剪断胃的幽门部位到十二指肠处，一手用镊子提起小肠，另一手用镊子轻轻夹住并小心向下捋下白色脂肪垫，直到直肠，收集捋下的脂肪垫，剔除淋巴结和结缔组织，用滤纸吸干后称重。最后，找到两侧肾，收集周围的白色脂肪组织，并将肾剪下，剥离肾上残余的脂肪，用滤纸吸干后称重。小鼠的脂肪含量以每100克体重的脂肪毫克数(mg/100g BW)表示，分别计算附睾、肾周、肠系膜脂肪的含量，结果如表3所示。
如表3所示，肥胖组小鼠附睾脂肪含量是正常组的286％(5573±139mg/100g BW vs.1951±77mg/100g BW)，二者具有显著性差异(p<0.05)。肥胖小鼠灌胃干酪乳杆菌12周后，附睾脂肪含量有所下降，其中，中、高剂量组小鼠附睾脂肪含量为4147mg/100g BW、3921±112mg/100gBW，与肥胖组相比下降了约26％，具有显著性差异(p<0.05)；低剂量组和混合菌体组小鼠附睾脂肪含量的增长也显著受到抑制(p<0.05)，死菌体组小鼠的附睾脂肪含量也显著下降(p<0.05)。
与附睾脂肪含量类似，肥胖组小鼠的肾周脂肪含量是正常组3.96倍(p<0.05)。服用干酪乳杆菌L9后，肥胖小鼠的肾周脂肪有不同程度的下降。中、高剂量组中，肾周脂肪含量显著下降(p<0.05)；混合菌体组中，肥胖小鼠肾周脂肪的含量也显著降低(p<0.05)，死菌体组小鼠的肾周脂肪含量也显著下降(p<0.05)。
如表3所示，肥胖组小鼠肠系膜脂肪显著高于正常组(1889±223mg/1000g BW vs.618±67mg/1000g BW)，其中，低中高剂量组及混合菌体组的肥胖小鼠肠系膜脂肪的重量(p<0.05)均显著下降，死菌体组和混合菌体组小鼠肠系膜脂肪的重量也显著下降(p<0.05)。
实施例3
本实施例用来说明本发明的干酪乳杆菌对肥胖小鼠各个血清生化指标的影响。
根据实施例1中所述的方法用干酪乳杆菌L9灌胃小鼠12周，小鼠隔夜禁食14小时后，用乙醚麻醉，摘眼球采血1mL左右到无菌1.5mL离心管中；全血在室温静置2小时后4℃、4000g离心15min，用无菌枪头小心吸出上层血清，在-80℃冻存，以备如下的血清生化检测。
(1)血清总胆固醇含量的测定
血清总胆固醇水平(利用Trinder反应原理进行测定)委托军事医学科学院实验动物中心(地址：北京市丰台区东大街20号，邮编：100071)代测，结果如表3所示。
由表3可以看出，与正常组相比，饲喂高脂饲料的肥胖组血液中总胆固醇的含量显著上升(1.8±0.04mmol/L vs.2.72±0.07mmol/L，p<0.05)，上升幅度高达51％。中、高剂量组和混合菌体组小鼠的血清中，总胆固醇的含量(p<0.05)显著降低，死菌体组和混合菌体组小鼠血液总胆固醇水平也显著下降(p<0.05)。
(2)血清总甘油三酯水平的测定
血清总甘油三酯水平(利用Trinder反应原理进行测定)委托军事医学科学院实验动物中心代测，结果如表3所示。
如表3所示，肥胖组小鼠血清中的禁食总甘油三酯水平高出正常组48％(0.8±0.06vs.0.54±0.07)，具有显著性差异(p<0.05)；与肥胖组相比，L9处理组(低、中和高剂量组)和死菌体组小鼠的甘油三酯水平均有降低趋势。
(3)血清葡萄糖(血糖)水平的测定
禁食状态下的血糖水平(利用葡萄糖氧化法原理进行测定)委托军事医学科学院实验动物中心代测，结果如表3所示。
如表3所示，长期饲喂高脂饲料使肥胖小鼠的禁食血糖水平显著高于正常水平(11.11±0.54mmol/L vs.7.68±0.52mmol/L，p<0.05)。灌胃12周后，中高剂量组和混合菌体组肥胖小鼠的禁食血糖水平(p<0.05)显著降低，其效果能使肥胖小鼠禁食血糖水平恢复到正常值(p>0.05)；死菌体组小鼠的血糖水平也显著下降(p<0.05)。
从以上实施例可以看出，本发明的干酪乳杆菌能够显著降低肥胖小鼠的体重增重、摄食量、脂肪含量、总胆固醇含量、总甘油三酯浓度和血糖浓度，说明本发明的干酪乳杆菌具有良好的减肥功效。而且，本发明的干酪乳杆菌的减肥效果优于LGG。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
Claims (7)
1.一种干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)，其特征在于，该干酪乳杆菌的保藏编号为CGMCC No.9275。
2.一种功能食品组合物，其特征在于，该功能食品组合物含有权利要求1所述的干酪乳杆菌的菌体和食物。
3.根据权利要求2所述的功能食品组合物，其中，所述干酪乳杆菌的菌体为干酪乳杆菌的活菌体和/或死菌体。
4.根据权利要求2或3所述的功能食品组合物，其中，所述干酪乳杆菌的菌体为干酪乳杆菌的活菌体。
5.根据权利要求2-4中任意一项所述的功能食品组合物，其中，以所述功能食品组合物的总重量为基准，所述干酪乳杆菌的菌体的添加量为105-1010CFU/g，优选为108-1010CFU/g。
6.权利要求1所述的干酪乳杆菌在制备具有减肥功能的功能食品组合物中的应用。
7.权利要求1所述的干酪乳杆菌在制备用于治疗肥胖症的药物中的应用。
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| CN109312297A (zh) * | 2015-12-11 | 2019-02-05 | 营养健康有限公司 | 用于治疗肥胖症和相关代谢病的干酪乳杆菌 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| CB03 | Change of inventor or designer information |
Inventor after: Ren Fazheng Inventor after: Sun Jing Inventor after: Guo Huiyuan Inventor after: Zhao Liang Inventor before: Sun Jing Inventor before: Ren Fazheng Inventor before: Guo Huiyuan Inventor before: Zhao Liang |
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| COR | Change of bibliographic data | ||
| TA01 | Transfer of patent application right |
Effective date of registration: 20160818 Address after: 100083 Haidian District Qinghua East Road, No. 17, Beijing Applicant after: China Agricultural University Address before: 100083 Haidian District Qinghua East Road,, No. 17, China Agricultural University Applicant before: Ren Fazheng |
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20141217 |
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |