CN104211747B - 5’-磷酸-n6-（3-羟基苯基）腺苷的制备及医药用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了式Ⅰ2’,3’,5’‑三‑O‑乙酰基‑N⁶‑(3‑羟基苯基)腺苷的体内和细胞内主要代谢产物N⁶‑(3‑羟基苯基)腺苷用于制备治疗糖脂代谢紊乱疾病药物的用途以和5’‑磷酸‑N⁶‑(3‑羟基苯基)腺苷或其药学上可接受的盐、其制备方法以及用于制备治疗与激活AMPK相关糖脂代谢紊乱疾病药物的用途。所述化合物或其药学上可接受的盐可用于治疗与AMPK相关的高血脂症和糖尿病等糖脂代谢紊乱疾病，并能够减轻或避免由于个体差异造成的药代动力学性质差异，具有起效快、可控性好、作用更强、副作用更小等重要优势。

Description

5’-磷酸-N6-（3-羟基苯基）腺苷的制备及医药用途

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体而言，涉及调血脂化合物2’,3’,5’-三-O-乙酰基-N⁶-(3-羟基苯基)腺苷的体内及细胞内主要活性代谢产物N⁶-(3-羟基苯基)腺苷在制备预防和/或治疗代谢性疾病药物的用途以及5’-磷酸-N⁶-(3-羟基苯基)腺苷或其药学上可接受的盐、其制备方法以及在制备与分子水平激活AMPK先关代谢性疾病的新用途。

背景技术

糖尿病和高脂血症已成为导致严重心脑血管疾病的主要危险因素。糖尿病是血中胰岛素绝对或相对不足，导致血糖过高，出现糖尿，进而引起脂肪和蛋白质代谢紊乱，临床上可出现多尿、烦渴、多饮、多食，消瘦等表现，重者容易发生酮症酸中毒等急性并发症或血管、神经等慢性并发症。高血脂症是指脂肪代谢或运转异常使血浆一种或多种脂质高于正常值，它是一种全身性疾病，指血中总胆固醇(TC)和/或甘油三酯(TG)过高或高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)过低，现代医学称之为血脂异常。自从2001年McGarry将2型糖尿病命名为“糖脂病”以来，对胰岛素抵抗（IR）为病理基础的2型糖尿的治疗已由单纯的降糖，转向以降糖、调脂为切入点，最终控制其并发症的发生风险。大量的基础研究资料和临床实践证实，体内糖代谢与脂代谢密切先关，都直接影响人体能量代谢。糖脂代谢的紊乱是脑卒中、冠心病、心肌梗死、猝死的危险因素，提升冠心病、脑梗赛以及周围血栓栓塞性疾病的发病几率，这些心脑血管性疾病病情进展凶险，其死亡率约占人类总死亡率的半数左右。因此，维持体内糖脂代谢平衡至关重要。

AMPK在真核细胞生物中广泛存在，属丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是由α、β、γ3个亚基构成的异三聚体蛋白。AMPK不仅是细胞能量感受器，而且在调控全身能量代谢中占重要地位，已成为治疗心脑血管和代谢性疾病的潜在药物靶点。

AMPK对脂代谢具有调节作用。乙酰辅酶A羧化酶(ACC)和羟甲基戊二酸单酰CoA还原酶(HMGR)分别在脂肪酸和胆固醇的合成中起关键作用。ACC是脂肪酸合成的限速酶,糖代谢生成的乙酰辅酶A可在ACC作用下合成丙二酰辅 酶A。丙二酰辅酶A是脂肪合成的第一步产物,其可以通过负反馈抑制肉毒碱棕榈酸转移酶21(CPT21)的活性,从而抑制线粒体的脂肪酸氧化以及酮体的生成。而HMGR为胆固醇合成的限速酶,可催化羟甲基戊二酸单酰CoA生成甲羟戊酸。ACC和HMGR均是AMPK的靶分子。激活的AMPK可以使它们磷酸化,抑制它们的功能,从而抑制肝脂肪酸和胆固醇的合成[1]。AMPK的激动剂AICAR可使肝细胞中的ACC磷酸化,减少丙二酰辅酶A,增加CPT21的活性及脂肪酸氧化。过表达重组激活的AMPKα可以负性调节ACC的活性,减少肝细胞中脂质的含量,增加骨骼肌中脂肪酸的氧化[2][3]。此外,AMPK还参与了甘油三酯的调节。在脂肪细胞中,AMPK激动剂不仅可通过ACC磷酸化而抑制脂肪生成,还可通过磷酸化抑制激素敏感脂肪酶,从而抑制异丙肾上腺素所诱导的脂肪分解[4]。AMPK这种既调节脂肪生成,又抗脂肪分解的作用,在高血脂症治疗中起到重要作用。

AMPK与糖代谢密切先关。葡萄糖体内稳态的平衡由葡萄糖生成和外周组织葡萄糖摄取两方面来维持。AMPK活化能够使反应结合蛋白活性调节转导子(transducer ofregulated CREB activity2，TORC2)蛋白磷酸化或抑制TORC2蛋白的脱磷酸化，从而使TORC2滞留在细胞质内，此时与糖生成相关酶的表达受阻，糖生成减少[5]。AMPK还通过诱导葡萄糖转运蛋白4(glucose transporter4，GLUT4)向质膜转移和通过磷酸化转录因子，开启GLUT4基因的表达，以促进外周组织的葡萄糖摄取[6]。对离体骨骼肌细胞的研究中发现：AMPK不仅促使葡萄糖摄取还抑制糖原的合成，从而促进葡萄糖向糖酵解方向转化[7]。总之，AMPK通过调节肝葡萄糖的转化，增强骨骼肌对葡萄糖的摄取和脂肪组织中葡萄糖的利用，从而保证机体糖代谢的稳定。

目前发现的AMPK激动剂主要分为两大类：直接激动剂和间接激动剂。

1）直接激动剂：核苷类化合物AICAR和噻吩并吡啶酮类化合物A-769662。前者由于代谢产物有抑制果糖-1,6-二磷酸酶和激活糖原磷酸酶，导致乳酸和尿酸显著增加以及其半衰期短、生物利用度差等不良的药代动力学属性，后者因其口服吸收差，故二者只能沦为研究AMPK激活的工具药[8,9]。靶向AMPKα亚基自抑制结构域的小分子PT1则只有体外激活AMPK而无体内药效学研究报道[10]。

（2）间接激动剂：两种广泛用于治疗2型糖尿病的一线药物二甲双胍和罗格列酮已经被证实能在肝脏和肌肉组织中激活AMPK[11,12]。它们通过抑制呼吸链 复合物I，使细胞内AMP：ATP比值升高激活AMPK，在体内发挥降糖调脂作用[13,14]。

天然产物是AMPK激动剂的重要来源，包括白藜芦醇、小蘖碱、绿茶提取物、茶黄素、槲皮素、人参皂苷、姜黄素、咖啡酸苯乙酯等，但均不是AMPK直接激动剂。

总结AMPK激动剂的研究进展，我们不难发现如下问题：①已发现的AMPK激动剂主要是非直接激动剂，天然产物是其重要来源；②目前研究的AMPK直接激动剂体外效果显著，对体内药效作用因口服吸收不好、生物利用度低等原因差强人意，使其在新药研发进程中困难重重。

式Ⅰ2’,3’,5’-三-O-乙酰基-N⁶-(3-羟基苯基)腺苷是本发明的发明人针对上述问题，结合中国天然产物资源丰富的优势，在天然产物提取物虫草素基础上利用药效团结构改造在保留或加强其生物学效应基础上改善其药代动力学属性，获得的具有良好调血脂作用的AMPK直接激动剂，已获得中国发明专利，专利号：ZL200980101131.6（该篇专利以其全部内容被结合到本说明书中作为参考）。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，提供一种新的一个新预防和/或治疗糖脂代谢紊乱疾病药物，即5’-磷酸-N⁶-(3-羟基苯基)腺苷化合物和N⁶-(3-羟基苯基)腺苷化合物。

本发明的一个实施方案提供了一种新的化合物5’-磷酸-N⁶-(3-羟基苯基)腺苷。

本发明的一个实施方案提供了一种制备5’-磷酸-N⁶-(3-羟基苯基)腺苷的方法。

本发明的一个实施方案提供了一种含有5’-磷酸-N⁶-(3-羟基苯基)腺苷的药物组合物。

本发明的一个实施方案提供了5’-磷酸-N⁶-(3-羟基苯基)腺苷在制备预防和/或治疗糖脂代谢紊乱疾病的药物的应用。

本发明的一个实施方案提供了N⁶-(3-羟基苯基)腺苷在制备预防和/或治疗糖脂代谢紊乱疾病的药物的应用。

为解决本发明的技术问题，采用如下的技术方案：本发明通过初步体内药代动力学发现，2’,3’,5’-三-O-乙酰基-N⁶-(3-羟基苯基)腺苷主要血液代谢产物为其去乙酰基化合物N⁶-(3-羟基苯基)腺苷（式Ⅲ，此化合物为已知化合物）,研究发现，2’,3’,5’-三-O-乙酰基-N⁶-(3-羟基苯基)腺苷具有良好的调血脂活性，能明显降低高血脂症模式动物血脂、肝脂水平。大鼠口服给予2’,3’,5’-三-O-乙酰基-N⁶-(3-羟基苯基)腺苷，在血浆中的主要代谢产物为N⁶-(3-羟基苯基)腺苷。高脂血症金黄地鼠腹腔注射N⁶-(3-羟基苯基)腺苷，血脂水平明显降低。细胞水平研究发现，2’,3’,5’-三-O-乙酰基-N⁶-(3-羟基苯基)腺苷处理细胞，细胞产生一个新的化合物5’-磷酸-N⁶-(3-羟基苯基)腺苷（式Ⅱ），经证实是由N⁶-(3-羟基苯基)腺苷被腺苷激酶磷酸化所得。5’-磷酸-N⁶-(3-羟基苯基)腺苷在分子水平对AMPK全酶有激活作用。由于此代谢过程与国际公认AMPK激动剂AICAR体内代谢过程其相似[B]，故此推断N⁶-(3-羟基苯基)腺苷和5’-磷酸-N⁶-(3-羟基苯基)腺苷为2’,3’,5’-三-O-乙酰基-N⁶-(3-羟基苯基)腺苷体内最终活性分子，激活AMPK从而发挥对体内糖脂的调节作用。

本发明的化合物5’-磷酸-N⁶-(3-羟基苯基)腺苷（如式Ⅱ）或其药学上可接受的盐。

本发明的另一个方面还涉及式Ⅱ5’-磷酸-N⁶-(3-羟基苯基)腺苷或其药学上可接受的盐的制备方法。所述制备方法包括以N⁶-(3-羟基苯基)腺苷为原料，与三氯氧磷、三甲基磷酸酯反应。

合成路线：

5’-磷酸-N⁶-(3-羟基苯基)腺苷的制备以N⁶-(3-羟基苯基)腺苷为原料，以三氯氧磷、三甲基磷酸酯为反应试剂。

反应优选的无氧的条件下进行，优选的无氧条件是在N₂保护下；

N⁶-(3-羟基苯基)腺苷和三氯氧磷的摩尔比例是1：5-19，最优选是1：8-15，最优选是1：11。

反应的时间：反应时间是1-5小时，优选的时间是2-4小时，最优选的时间是3小时。

反应的温度：反应温度是-20-20℃，优选的温度是-10-10℃，最优选的温度是0℃。

待原料消失，加入四乙基溴化铵缓冲液，0℃下再搅拌1h。

优选的纯化条件是是pre-HPLC(C18)纯化，洗脱剂是甲醇：水=4:1。

本发明的另一个方面涉及以5’-磷酸-N⁶-(3-羟基苯基)腺苷、N⁶-(3-羟基苯基)腺苷或它们药学上可接受的盐作为活性成份和一种或多种药用载体或赋形剂的药物组合物。该药物组合物可根据本领域公知的方法制备。可通过将本发明化合物与一种或多种药学上可接受的固体或液体赋形剂和/或辅剂结合，制成适于人或动物使用的任何剂型。本发明化合物在其药物组合物中的含量通常为0.1-95重量%。

本发明化合物或含有它的药物组合物可以单位剂量形式给药，给药途径可为肠道或非肠道，如口服、静脉注射、肌肉注射、皮下注射、鼻腔、口腔粘膜、眼、肺和呼吸道、皮肤、阴道、直肠等。

给药剂型可以是液体剂型、固体剂型或半固体剂型。液体剂型可以是溶液剂（包括真溶液和胶体溶液）、乳剂（包括o/w型、w/o型和复乳）、混悬剂、注射剂（包括水针剂、粉针剂和输液）、滴眼剂、滴鼻剂、洗剂和搽剂等；固体剂型可以是片剂（包括普通片、肠溶片、含片、分散片、咀嚼片、泡腾片、口腔崩解片）、胶囊剂（包括硬胶囊、软胶囊、肠溶胶囊）、颗粒剂、散剂、微丸、滴丸、栓剂、膜剂、贴片、气（粉）雾剂、喷雾剂等；半固体剂型可以是软膏剂、凝胶剂、糊剂等。

本发明化合物可以制成普通制剂、也制成是缓释制剂、控释制剂、靶向制剂及各种微粒给药系统。

为了将本发明化合物制成片剂，可以广泛使用本领域公知的各种赋形剂，包括稀释剂、黏合剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂、助流剂。稀释剂可以是淀粉、糊精、蔗糖、葡萄糖、乳糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、微晶纤维素、硫酸钙、磷酸氢钙、碳酸钙等；湿润剂可以是水、乙醇、异丙醇等；粘合剂可以是淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、微晶纤维素、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乙基纤维素、丙烯酸树脂、卡波姆、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇等；崩解剂可以是干淀粉、微晶纤维素、低取代羟丙基纤维素、交联聚乙烯吡咯烷酮、交联羧甲基纤维素钠、羧甲基淀粉钠、碳酸氢钠与枸橼酸、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠等；润滑剂和助流剂可以是滑石粉、二氧化硅、硬脂酸盐、酒石酸、液体石蜡、聚乙二醇等。

还可以将片剂进一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片，或双层片和多层片。

为了将给药单元制成胶囊剂，可以将有效成分本发明化合物与稀释剂、助流剂混合，将混合物直接置于硬胶囊或软胶囊中。也可将有效成分本发明化合物先与稀释剂、黏合剂、崩解剂制成颗粒或微丸，再置于硬胶囊或软胶囊中。用于制备本发明化合物片剂的各稀释剂、黏合剂、润湿剂、崩解剂、助流剂品种也可用于制备本发明化合物的胶囊剂。

为将本发明化合物制成注射剂，可以用水、乙醇、异丙醇、丙二醇或它们的混合物作溶剂并加入适量本领域常用的增溶剂、助溶剂、pH调剂剂、渗透压调节剂。增溶剂或助溶剂可以是泊洛沙姆、卵磷脂、羟丙基-β-环糊精等；pH调剂剂可以是磷酸盐、醋酸盐、盐酸、氢氧化钠等；渗透压调节剂可以是氯化钠、甘露醇、葡萄糖、磷酸盐、醋酸盐等。如制备冻干粉针剂，还可加入甘露醇、葡萄糖等作为支撑剂。

此外，如需要，也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂或其它添加剂。

本发明还提供了式Ⅱ5’-磷酸-N⁶-(3-羟基苯基)腺苷或其药学上可接受的盐在制备预防和/或治疗与糖脂代谢紊乱疾病的药物的应用。

本发明也提供了如式Ⅲ所示的N⁶-(3-羟基苯基)腺苷或其药学上可接受的盐用于制备预防和/或治疗糖脂代谢紊乱疾病的药物的应用。

所述的糖脂代谢紊乱疾病包括但不限定于糖尿病和高血脂症。所述的预防和/或治疗糖脂代谢紊乱疾病是通过激活AMPK。

为达到用药目的，增强治疗效果，本发明的药物或药物组合物可用任何公知的给药方法给药。

本发明化合物药物组合物的给药剂量依照所要预防或治疗疾病的性质和严 重程度，患者或动物的个体情况，给药途径和剂型等可以有大范围的变化。一般来讲，本发明化合物的每天的合适剂量范围为0.001-150mg/Kg体重，优选为0.01-100mg/Kg体重，更优选为0.1-60mg/Kg体重，最优选为1-30mg/Kg体重。上述剂量可以一个剂量单位或分成几个剂量单位给药，这取决于医生的临床经验以及包括运用其它治疗手段的给药方案。

本发明的化合物或组合物可单独服用，或与其他治疗药物或对症药物合并使用。当本发明的化合物与其它治疗药物存在协同作用时，应根据实际情况调整它的剂量。

有益技术效果

本发明的2’,3’,5’-三-O-乙酰基-N⁶-(3-羟基苯基)腺苷的体内活性代谢产物N⁶-(3-羟基苯基)腺苷和5’-磷酸-N⁶-(3-羟基苯基)腺苷作为生物转化的产物，该代谢物具有药代动力学性质的可预测性或可控性，个体差异小、药物相互作用少（无需进一步代谢），起效快（本身为活性形式）、作用更强、副作用更小等重要优势。

附图说明

图1雌雄SD大鼠单次灌胃WS070117后原药的平均血浆浓度时间曲线（n=3）

图2雌性和雄性SD大鼠单次灌胃WS070117后M1的平均血浆浓度时间曲线（n=3）

图3 HepG2细胞内磷酸化M1代谢产物的发现。A：WS070117处理12h后HepG2细胞样品HPLC色谱图（λ=299nm）；B：WS070117处理12h后HepG2细胞样品ESI(+)-MS XIC m/z440提取离子色谱图（CE=10eV）；C：WS070117处理12h后HepG2细胞样品ESI(+)-MS XIC m/z228提取离子色谱图（CE=35eV）；D：m/z440（6.69min）的MS/MS质谱图（CE=35eV）；E：m/z440（11.59min）的MS/MS质谱图（CE=35eV）；F为MP在正离子扫描模式下可能的裂解途径。

图4给予WS070117处理12h的HepG2细胞样品的m/z440（7.89min）的MS/MS子离子质谱图。

图5细胞内MP的峰面积与AMPK活性随时间变化的趋势。A：细胞内MP峰面积随时间变化趋势；B：MP峰面积与AMPK活性随时间变化趋势。左侧Y轴显示MP峰面积；右侧Y轴显示AMPK活性；折线图为细胞内MP含量；柱状图为AMPK活性。

图6 HepG2细胞内磷酸化M1代谢产物的结构鉴定。A、B图为MP标准品的一级质谱和二级质谱图，C和D图为M1处理细胞720分钟提取物相应色谱峰的一级质谱和二级质谱图。E图为MP的结构。

图7 C57小鼠腹腔注射给予MP（30mg/kg）18小时内呼吸商的变化与空白组比较，^*P<0.05,^**P<0.01,^***P<0.001，n=8.

图8 MP及AMP体外激活AMPK以两个相同浓度的MP及AMP与AMPK全酶反应，空白组加入相同体积的DMSO，同位素标记法检测AMPK活性。与空白组比较，^***p<0.001，^**p<0.01，n>3。

图9 MP体外激活AMPK以不同浓度的MP与AMPK全酶反应，空白组加入相同体积的DMSO，同位素标记法检测AMPK活性，测试组活性与空白组的比值作为数据统计。与空白组比较，^*p<0.05，n>3。

具体实施方式

下述实施例用来进一步说明本发明，而非限制本发明的应用。

H-NMR在所有情况下与给出结构一致。特征化学位移（δ）用低于四甲基甲硅烷磁场的百万份表示，其中使用常缩写来命名主要的峰：例如，s，单峰；d，双重峰；t，三重峰；q，四重峰；m，多重峰；br，宽峰；dd，双重峰。质谱（m/z）用电喷雾离子化方式记录。对于常用溶剂使用下列缩写：DMSO，氘代二甲亚砜。

实施例1：

5’-磷酸-N⁶-(3-羟基苯基)腺苷的合成

N⁶-(3-羟基苯基)腺苷1.8g（0.005mol）置于100mL三口瓶中，N₂保护下，加入20mL,三甲基磷酸酯，将反应液冷却至0℃，滴加三氯氧磷843mg（0.055mol），0℃下反应3h，TLC监测反应进程。待原料消失，加入四乙基溴化铵缓冲液，0℃下再搅拌1h。加压浓缩，残余物经pre-HPLC(C18)纯化，洗脱剂甲醇：水=4:1，收集所需组分，合并，冷冻干燥，得白色固体720mg，收率：32.7%ESI-MS:m/z[M+1]+1H NMR(500MHz,DMSO)δ8.60(S,1H),8.40(S,1H),7.52(S,1H),7.31(d,1H,J=8.0Hz),7.07(t,1H,J=8.0Hz),6.44(m,1H,J=8.0Hz),5.99(m,1H),4.67(S,1H),4.23(S,1H),4.08(S,1H),3.93(S,1H),3.90(S,1H);13C NMR(125MHz,DMSO)δ157.36,152.03,140.60,128.89,111.62,109.78,107.87,86.88,83.98,73.88,70.88,64.42.

药理实验

实验例1：2’,3’,5’-三-O-乙酰基-N⁶-(3-羟基苯基)腺苷（以下简称为WS070117）改善血脂紊乱金黄地鼠血脂代谢紊乱

方法

2.1造模及分组动物适应性饲养1周后分别造模，金黄地鼠除正常对照组外喂以高脂饲料，连续4周后随机分成6组；连续4周。4周后采血，检测血清胆固醇（TC）和甘油三酯（TG）含量。兼顾TC、TG水平，按体重随机分成6组，分别为模型对照组，阳性对照药辛伐他汀组（2mg/kg）和非诺贝特组（50mg/kg），WS070117高剂量组（12mg/kg），WS070117中剂量组（6mg/kg）,WS070117低剂量组（3mg/kg），每组12只。

2.2给药各给药组金黄地鼠于造模后4周，每天灌胃给药1次，连续给药4周，正常对照组及模型组给予同体积蒸馏水（10ml/kg）。

2.3各项指标检测金黄地鼠给药4周后各组随机选取10只动物,禁食12h，眼眶静脉取血，常规制备血清，以试剂盒检测血清TC、TG、HDL-C、LDL-C含量；取腹后壁脂肪称重计算脂肪指数；取部分肝脏作组织匀浆，以试剂盒检测匀浆液中SOD、MDA含量。剩余动物停止给药，继续给予高脂饲料，2周后眼眶静脉采血，测血清TC、TG含量。

结果

结果1WS070117调节血脂紊乱金黄地鼠血脂紊乱

结果表明，金黄地鼠连续给予高脂饲料后血清TC、TG、LDL-C含量明显增高，HDL/LDL比值明显降低，血清游离脂肪酸略有升高，表明高脂血症金黄地鼠模型复制成功。给予WS070117治疗后高血脂模式动物血清中TC、TG、LDL-C含量明显降低，其在3mg/kg，6mg/kg，12mg/kg剂量下可使高血脂模式动物血清中TC含量显著下降，WS0701176mg/kg和12mg/kg剂量组血清中TG、LDL-C含量明显降低，HDL/LDL比值明显增高，其12mg/kg剂量作用强度更为明显，表明WS070117具有明显的调血脂作用（结果见表1）。

表1.WS070117治疗给药对血脂紊乱金黄地鼠血脂的影响

同正常组比较^#P＜0.05，^##P＜0.01，^###P<0.001；同模型组比较^*P＜0.05，^**P＜0.01， ^***P<0.001。

结果2WS070117降低血脂紊乱金黄地鼠腹后壁脂肪重量

结果表明，金黄地鼠连续给予高脂饲料后腹后壁脂肪重量明显增高。给予WS070117治疗后重量明显降低，其6mg/kg剂量作用强度最为明显，表明WS070117对腹部脂肪蓄积有明显的降低作用(见表2）。

表2.WS070117对血脂紊乱金黄地鼠腹后壁脂肪重量的影响

同正常组比较^#P＜0.05，^##P＜0.01，^###P<0.001；同模型组比较^*P＜0.05，^**P＜0.01， ^***P<0.001。

结果3WS070117对血脂紊乱金黄地鼠肝脏MDA、SOD的影响

结果表明，金黄地鼠造模4周后肝脏MDA含量明显增高，肝脏SOD活性明显降低，给予WS070117后：金黄地鼠肝脏MDA含量明显降低，且三个剂量组与模型组相比均有高度显著性差异，与阳性对照药辛伐他汀组相比未见显著性差异，WS0701173mg/kg，6mg/kg，12mg/kg剂量组降低肝脏MDA含量作用强于另一阳性对照药非诺贝特，显示WS070117具有良好的抗高血脂金黄地鼠肝脏过氧化脂质作用（见表3）。

表3.WS070117对血脂紊乱金黄地鼠肝脏SOD、MDA的影响

同正常组比较^#P＜0.05，^##P＜0.01，^###P<0.001；同模型组比较^*P＜0.05，^**P＜0.01， ^***P<0.001。

实验例2：WS070117在大鼠体内血浆药代动力学研究

方法

3.1药品与试剂WS070117，批号为WS070117-1，纯度为99.885%（HPLC）；

N⁶-(3-羟基苯基)腺苷（以下称为M1），纯度为99.10%（HPLC），均由中国医学科学院药物研究所开发室吴松课题组提供；吡虫啉，sigma公司产品；乙腈、甲醇、甲酸，HPLC级色谱纯，Dikma公司产品；乙酸铵，分析纯，国药集团化学试剂有限公司产品。

3.2实验仪器Q-Trap LC-MS/MS液质联用系统：质谱为API4000（Q-Trap）串联质谱仪，美国Applied biosystem/MDS Sciex公司产品；高效液相色谱仪为美国PerkinElmer公司产品。低温离心机，为德国Eppendorf公司产品。氮吹仪，美国Organomation AssociatesJnc.公司产品。

3.3实验动物Sprague-Dawley大鼠，雌雄各半，体重260-280g，北京维通利华实验动物技术有限公司提供，合格证号：SCXK（京）2002-0001。

3.4实验方法

3.4.1分析条件

液相条件：

色谱柱：Agela Venusil XBP-C18（5μm，3.0×100mm）

流动相：A相（水，含0.1%甲酸，10mM NH₄AC）：B相(乙腈，含0.1%甲酸）=50:50

流速：0.24ml/min

进样体积：10μl

洗针液：50：50甲醇/水

质谱条件：

接口：Turbo Ionspray

MRM正离子检测模式：

目标化合物MRM离子对DP EP CE CXP

WS070117486.1/228.1619.8304.6

M1360.1/228.1619.625.25.0

IS（吡虫啉）256.4/175.350103012.0

其他参数：CUR：10，CAD：Medium，IS：+4500V，TEM（550℃），GAS1:45，GAS2：50，所有气路均为N₂。

采集时间：3.5min

数据处理分析软件：Analyst V1.4.2

3.4.2大鼠血浆样品检测方法学建立

3.4.2.1标准溶液储备液和标准溶液工作液的配制

（1）标准曲线工作液样品配置：

原始储备液：称取M1和117标准品各约1.0mg，加入50%的乙腈水溶解并稀释至1ml，配制得到浓度为1mg/ml的M1和117混标储备液，储存于-20°C冰箱中。二级储备液：用50%的ACN水稀释M1和117原始储备液，制备5μg/ml和50ng/ml的M1和117二级储备液，储存于-20°C冰箱中。

标准曲线工作溶液：用50%的乙腈水将二级储备液稀释成标准工作溶液，使得M1和117浓度为1,2,5，50,200,400,800和1000ng/mL的混合标准溶液工作液，储存于4°C冰箱中。

（2）内标溶液的配制：称取标准品吡虫啉约2mg，加入2ml50%的乙腈水溶液配制成浓度为1.0mg/ml的内标储备液；再用50%的乙腈水溶液将该溶液稀释成浓度为500ng/ml的内标工作溶液，储存于4°C冰箱中。

（3）质控样品储备溶液和质控样品的配制：

质控原始储备液：称取M1和117标准品约1.0mg，加入50%的乙腈水溶解并稀释至1.0ml，配制得到浓度为1.0mg/ml的M1和117储备液，储存于-20℃冰 箱中。

质控二级储备液：用50%的乙腈水溶液稀释M1和117质控原始储备液制备20,5μg/ml和100ng/ml的M1和117二级质控混合储备液，储存于-20℃冰箱中。质控样品制备：分别用质控二级储备溶液和空白肝素钠抗凝大鼠血浆（含200μM酯酶抑制剂iso-OMPA）制备M1和117质控样品，质控样品的三个浓度分别为低浓度0.75ng/ml、中浓度60ng/ml和高浓度240ng/ml，储存于-20℃冰箱中。

3.4.2.2血浆样品处理

取肝素抗凝，含200μM酯酶抑制剂iso-OMPA的大鼠空白血浆200μl，置于5ml离心管中，加入50μl50%甲醇水溶液，以及50μl内标液，混合均匀后，加入1ml乙酸乙酯涡旋振荡30s，3000rpm离心5min后取上清800μl，N2吹干，加入200μl50%ACN复溶，13000rpm离心5min后取10μl进行LC-MS/MS分析。

3.4.2.3方法学考察

（1）标准曲线

在肝素钠抗凝，含200μM酯酶抑制剂iso-OMPA的大鼠空白血浆中分别加入系列浓度的M1和117混合标准工作溶液，使M1及117的浓度分别为0.25，0.5，1.25，12.5，50，100，200和250ng/mL；按照血浆样品处理项下进行前处理，以峰面积比为纵坐标，浓度为横坐标，用加权最小二乘法(W=1/x₂)进行回归运算，所得的直线回归方程即为标准曲线。

（2）精密度和准确度

用肝素钠抗凝，含200μM酯酶抑制剂iso-OMPA的大鼠空白血浆配置低、中、高三个浓度（0.75、60、240ng/ml）的质控样品，每个浓度6份，同一天内测定，计算日内精密度和准确度。用低、中、高三个浓度质控样品连续测定三天内五个批次，计算日间精密度和准确度。

（3）回收率

制备低、中、高三个浓度为0.75,60,240ng/mL的质控样品，及空白基质提取后加标的0.75,60,240ng/mL质控样品，进行检测分析，计算回收率。

（4）稳定性

样品室温放置稳定性：取低、高两个浓度（0.75ng/ml、240ng/ml）质控样品，一部分在室温下放置6h，另一部分则冻存在-20℃冰箱中，两部分经样品处理项下 处理后，进行HPLC-MS/MS分析。

反复冻融稳定性：取低、高两个浓度（0.75ng/ml、240ng/ml）质控样品，经过4次反复冻融，按样品处理项下处理后，进行HPLC-MS/MS分析。

处理后样品稳定性：低、中、高三个浓度（0.75、60、240ng/ml）质控样品经样品处理项下处理后，立即进行HPLC-MS/MS分析，进样后所有样品室温放置26.5h，再次进行分析，计算重复进样稳定性。

低、中、高三个浓度（0.75、60、240ng/ml）质控样品经样品处理项下处理后，分作两部分，一部分立即测定，另一部分置于2-8℃冰箱放置28h后进行测定，计算处理后样品2-8℃稳定性。

（5）灵敏度与基质效应考察

制备6个M1和117标准曲线最低点样品（0.25ng/mL），计算精密度和回收率，评价灵敏度及基质效应。

（6）稀释线性考察

制备浓度为5,000ng/mL质控样品，25倍稀释并处理后，进行分析，计算精密度和准确度。

3.5大鼠口服WS070117后血浆药代动力学研究

实验采用连续采血法，分别将雌雄SD大鼠随机分为3组，每组3只动物，实验前动物禁食16小时，自由取水。WS070117以0.25%CMC-Na配置成1.8、5.4、16.2mg/ml悬液，按18、54、162mg/kg灌胃给药（1ml/100g），于给药后5min、15min、30min、1h、2h、3h、4h、6h、8h、12h各时间点自眼眶静脉丛取血0.5ml，收集到预先加有iso-OMPA的肝素化管中，混匀，离心分离血浆，液氮迅速冷冻后于-20℃保存。分析前按血浆样品处理项下操作，测定其中WS070117及M1的含量。

3.6大鼠静脉注射WS070117后血浆药代动力学研究

实验采用连续采血法，雌雄SD大鼠各3只，实验前动物禁食16小时，自由取水。WS070117以PEG-400配置成3mg/ml悬液，按照6mg/kg剂量静脉注射给药（0.2ml/100g），于给药后2min、5min、10min、15min、30min、1h、2h、4h、6h、8h、12h各时间点自眼眶静脉丛取血0.5ml，收集到预先加有iso-OMPA的肝素化管中，混匀，离心分离血浆，液氮迅速冷冻后于-20℃保存。分析前按 血浆样品处理项下操作，测定其中WS070117及M1的含量。

3.7大鼠口服M1后血浆药代动力学研究

实验采用连续采血法，雌雄SD大鼠各3只，实验前动物禁食16小时，自由取水。M1以0.25%CMC-Na配置成3.997mg/ml悬液，按39.97mg/kg灌胃给药（1ml/100g），于给药后5min、15min、30min、1h、2h、3h、4h、6h、8h、12h各时间点自眼眶静脉丛取血0.5ml，收集到预先加有iso-OMPA的肝素化管中（与前述实验平行），混匀，离心分离血浆，液氮迅速冷冻后（与前述实验平行）于-20℃保存。分析前按血浆样品处理项下操作，测定其中M1的含量。

结果

结果1大鼠口服WS070117后血浆中主要代谢产物为M1

大鼠口服高、中、低三个剂量WS070117后各时间点测定原药和M1的血药浓度结果见表4和表5，血浆药时曲线见图1和图2。大鼠口服WS070117（18、54、162mg/kg）后，吸收较迅速，各剂量组给药后5min血中即可测到原形药和代谢物M1。雄鼠原形药分别于30min、1h、15min达峰，M1于15min、1h、1h达峰；雌鼠原形药分别于15min、1h、30min达峰，M1于30min、30min、2h达峰。WS070117血浆达峰浓度与剂量不成比例，但达峰浓度呈现性别差异，雌性大鼠的达峰浓度分别为雄性大鼠的1.54、2.36、2.41倍。M1达峰浓度随剂量增加而递增，且M1的达峰浓度也呈现明显的性别差异，雌性大鼠的低、中、高三个剂量达峰浓度分别为雄性大鼠的2.78、1.47、3.75倍。此外，原形药和M1的药时曲线均出现多峰现象。

根据大鼠口服不同剂量WS070117的药时曲线，应用Kinetica软件采用非房室模型计算其药代动力学参数（见表6和7）。结果表明，大鼠口服WS070117后，原形药AUC与剂量无依赖性。血中代谢物M1的AUC与剂量呈正比，高、低剂量雌性大鼠AUC分别为雄性的5倍和3.54倍，MRT也明显大于雄性。原形药和M1的Vz、Vss及清除率均随剂量增加而递增，MRT不随剂量增加而延长。

表4单次灌胃给药后雌雄大鼠血浆中WS070117的浓度

表5单次灌胃给药后雌雄大鼠血浆中M1的浓度

表6雌性、雄性SD大鼠单次口服WS070117血浆原形药药代动力学参数拟合

表7雌性及雄性SD大鼠单次口服WS070117血浆中M1药代动力学参数拟合

实验例3M1对血脂紊乱金黄地鼠血脂水平的影响

方法

4.1试剂与材料辛伐他汀，杭州默沙东制药有限公司生产产品；总胆固醇检测试剂盒，中生北控生物科技股份有限公司产品；低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒，中生北控生物科技股份有限公司产品

4.2仪器SeperateTM Max190酶标仪，Molecular Devices CorporationSunnyvale,CA产品；多用途低温高速离心机，Eppendorf产品

4.3实验动物金黄地鼠，雄性，6～8周龄，体重100～110g，北京维通利华实验动物技术有限公司提供。

4.4分组与给药动物购买后适应性喂养一周。按体重随机分组，除空白对照组动物给予基础饲料（15g/只/天）外，其余动物均给予高脂饲料（15g/只/天）。高脂饲料喂养1周后，眼眶静脉采血，除正常组外，其余各组按照血清总胆固醇水平分组，分别为高脂模型组、辛伐他汀3mg/kg、M1腹腔注射40mg/kg给药组。灌胃体积为1ml/100g，腹腔注射体积为0.2ml/100g，空白组与高脂模型组给予等体0.25%CMC(药物混悬溶剂)。

4.5指标检测于第2周内眦静脉取血0.2ml，静置30min；6000g离心10min，按总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）试剂盒说明书要求，测定吸光度，计算血清中浓度。

结果

结果1M1腹腔注射具有降低脂代谢紊乱金黄地鼠TC和LDL-C的作用（见表8）

表8M1对血脂紊乱金黄地鼠血脂水平的影响

同正常组比较^###P<0.001；同模型组比较^*P＜0.05，^***P<0.001，n=10。

实验例4HepG2细胞内5’-磷酸-N⁶-(3-羟基苯基)腺苷（以下简称MP）的发现与结构鉴定

方法

5.1仪器与试剂WS070117，批号为WS070117-1，纯度为99.885%（HPLC），由中国医学科学院药物研究所开发室吴松课题组提供；乙酸乙酯，批号为20101103，北京化工厂产品；乙腈，HPLC级分析纯，为Merck公司产品。Q-TOF LC-MS/MS液质联用系统（QSTAR_TM Elite）：质谱为QSTAR_TM Elite型四极杆-飞行时间型(Q-TOF)串联质谱仪，美国Applied biosystem/MDS Sciex公司产品，配有德国Agilent公司生产1200RRLC液相色谱仪，包括：二元梯度泵、可控温自动进样器、二极管阵列（DAD）检测器、在线脱气机以及柱温箱。使用软件为AnalystQS2.0数据处理软件；Q-Trap LC-MS/MS液质联用系统：质谱为QTRAP_TM型四极杆-线性离子阱型串联质谱仪，美国Applied Biosystems/MDS Sciex公司产品，配有德国Agilent公司生产1200RRLC液相色谱仪，包括：二元梯度泵、可控温自动进样器、二极管阵列（DAD）检测器、在线脱气机以及柱温箱；使用软件为Analyst1.5数据处理软件。超声破碎仪， VCX500型，美国Sonics&Materials Inc.公司产品；低温离心机，5804R型，德国Eppendorf公司产品；氮吹仪，N-EAP12型，美国Organomation Associates Jnc.公司产品。

5.2细胞的培养及取样

HepG2细胞培养于10mm培养皿中，待长至融合率80%左右时，换成含0.02%BSA的无血清培养基培养12h，然后加入WS070117，使培养终浓度为100μM，于处理后10min、30min、1h、3h、6h、12h、18h分离培养基-80℃保存待测。留取未加WS070117处理的HepG2细胞和培养基作为空白对照。细胞用PBS洗2遍，加入0.25%胰酶消化，3000rpm离心5min，弃上清，再用PBS洗2遍。每个时间点3皿细胞，将收集到的3皿细胞合并，用200μl PBS重悬，冰浴超声破碎（600W，4s/次，间歇8s，共超声6次），留取适量清液进行蛋白定量，余下细胞破碎样品用2倍乙腈沉淀蛋白，于4℃10000×g离心10min，取上清液N₂吹干，保存于-80℃待测。检测时，吹干细胞样品用100μl20%乙腈超声复溶，经0.22μm微孔滤膜过滤后取10μl进行LC-MS/MS分析。

5.3培养基和细胞样品中代谢产物的分析方法

色谱条件

色谱柱：Agilent Extend C18（4.6×250mm，5μm）

柱温：25℃

流动相：甲醇-水（0.02M乙酸铵，0.02%氨水）

梯度：0-35min：甲醇20-85%

流速：0.8ml/min（进入质谱前使用三通分流使质谱分析流速为0.2-0.3ml/min）

检测波长：299nm

质谱条件：

Q-Trap LC-MS/MS：

电喷雾离子源（ESI+），GS1：75，GS2：70，气帘气体（CUR）：30，源温（TEM）：350℃，喷雾电压（IS）：5500V；EXP1：EMS，扫描范围：100-800，DP：60V，EP：10V，CE：10eV；EXP2：EMS，扫描范围：100-800，DP：60V，EP：10V，CE：35eV；EXP3：EPI：440.4，DP：60V，EP：10V，CE：35eV。采用EMS全扫描（CE=10eV）获得代谢物准分子离子峰信息，采用EMS全扫描（CE=35eV）获得代谢物子离子信息，采用EPI（Product of：440.4）特异性获得母离子440.4的子离子信息。

Q-TOF LC-MS/MS：

电喷雾离子源（ESI+），GS1：75，GS2：55，气帘气体（CUR）：30，源温（TEM）：450℃，喷雾电压（IS）：4500V；EXP1：TOF-MS扫描范围：65-800，DP：55V，Q0：20eV；EXP2：TOF-MS扫描范围：50-800，Q₀：40eV。电喷雾离子源（ESI-），GS1：75，GS2：55，气帘气体（CUR）：30，源温（TEM）：450℃，喷雾电压（IS）：-4500V；EXP1：TOF-MS扫描范围：65-800，DP：-55V，Q0：-20eV；EXP2：Product Ion扫描范围：50-800，CE：-30eV。采用正离子（ESI+）检测模式，应用Q-Trap的EMS（Enhanced MS）、EPI（Enhanced Product Ion）和TOF-MS的MS_E方法发现代谢物；再采用负离子（ESI-）检测模式，应用子离子（Product Ion）扫描特异性获得磷酸化M1的子离子，并对其结构进行推测鉴定。

正离子检测模式下，采用背景离子m/z149.0233及m/z279.1591进行质量校正。

负离子检测模式下，在磷酸化M1出峰后通过针蹦注入三氟醋酸钠，采用离子m/z112.9850、m/z248.9598及m/z384.9347进行质量校正。

5.4细胞内AMPK活性测定细胞培养皿立即放于冰上，除去培养基，用预冷的PBS洗细胞2次，加入0.5ml Triton X-100裂解缓冲液，于冰上孵育5min，细胞刮收集细胞，转移至1.5ml离心管内。涡旋混匀后超声2次（2s/次，功率为250W），然后于4℃1,4000×g离心20min。转移上清至另一离心管（整个过程冰上进行），BCA法进行蛋白定量，统一蛋白量进行后续步骤。

1)1体积的PEG6000（25%）加入9体积的上清液，使PEG6000终浓度为2.5%，涡旋混匀，冰上放置30min。1,8000×g4℃离心3min。转移上清至一新离心管。

2)加PEG6000（25%）至2.5%PEG上清液，使之终浓度为6%，涡旋混匀，冰上放置30min。1,8000×g4℃离心3min。小心除去上清。用60ul-100ul3×Assay Buffer重悬。留取部分用于蛋白定量。

3)以下操作在冰上进行：

（1）肽复合物：

1.2mM SAMS多肽……………………………5μl

1.2mM AMP…………………………………5μl

5mM DTT……………………………………5μl

阴性对照用水补齐

（2）起始复合物：

500mM MgCl₂………………………………0.3μl

20mM ATP……………………………………0.3μl

Hot ATP……………………………………0.1μl

ddH₂0………………………………………4.3μl

每管加15μl肽复合物和10μl样品再加5μl起始复合物在30℃水浴中孵育20min，取15μl上清液点在p81磷酸纤维素纸上。室温晾干1min，将其放在约含1%磷酸的容器中洗5min。再用1%磷酸洗2次，每次5min。在丙酮里洗5min，然后在石油醚中洗5min。待吹干后，放入含3ml闪烁液的塑料管内进行液闪计数。

[γ-³²P]相对活力的测定：取2μl起始复合物点在p81磷酸纤维素纸上，吹干后进行计数。

结果

结果1HepG2细胞内MP的发现

如图3所示，HepG2细胞给予WS070117后（100μM），在细胞内发现两个m/z440的分子离子峰（6.69min、11.59min），[M+H]+分子离子均为m/z440，表明其分子量均为439，为M1+80，可能为M1加合硫酸产物或M1加合磷酸产物。两者子离子均出现m/z228（图3D、E），表明均为WS070117的代谢物，且其中11.59min的代谢物子离子含有m/z308，根据前述实验结果推测为M1加合硫酸代谢产物。6.69min代谢产物子离子出现m/z342，其分子量与分子离子m/z440相差98，恰好为一个磷酸分子的分子量，推测可能为分子离子脱去一分子磷酸而产生（图3F），推测6.69min代谢物可能为M1加合磷酸的代谢产物，但其子离子未见m/z308，表明磷酸基团并非加合在酚羟基，而是可能加合在核糖的某个羟基上，从生理角度考虑，加合位点可能为5’位，该代谢产物从结构上与腺苷单磷酸（AMP）类似，可能是WS070117重要的活性代谢物。应用HPLC-TOF-MS/MS对M1磷酸化产物进行进一步定性。由于磷酸基团在负离子检测模式下会产生两个特征离子m/z96（H₂O₄P_-，精确分子量96.969072）和m/z78（O₃P_-，精确分子量78.958507）（图3C）。因此采用负离子检测模式进行分析，对TOF-ESI(-)-MS全扫描色谱图提取m/z438得到两个峰（7.89min、13.48min），其分子离子[M-H]- 均为m/z438，表明其分子量为439，为M1+80，磷酸分子量和硫酸分子量均为80，因此二者可能分别为磷酸化M1和硫酸化M1。经前述实验推测，7.89min产物可能为M1加合磷酸产物，而13.48min可能为M1加合II相基团硫酸产物。负离子检测模式结果发现，两者子离子均出现m/z226，表明两者均来源于原药WS070117。m/z438（7.89min）的子离子同时出现78.9580、96.9703，分别为磷酸基团的两个特征分子量（图4），而不是单一的硫酸特征分子量，因此，推测7.89min的分子离子m/z438来源于磷酸化的M1而不是硫酸化的M1。

结果2细胞内MP含量与孵育时间和AMPK活性呈正先关

利用HPLC-TOF-ESI(-)-MS/MS发现并推断了细胞内极有可能为活性形式的代谢物MP，随后采用具有较高灵敏度的HPLC-ESI(+)-TOF-MS，再次目的性的对MP含量进行检测，通过提取m/z440记录MP峰面积，获得细胞内MP随时间变化的趋势信息，并与WS070117药效靶酶AMP-激活蛋白激酶（AMPK）活性数据相对比，以期反映活性代谢物MP含量与靶酶活性的相互关系。

如图5所示，6小时内细胞内MP含量随培养时间延长而升高，在6-12小时达到平台期，12-18小时已有下降。AMPK活性在0.5小时有极具升高，随后降低，但在0.5小时到12小时之间持续上升，与该段时间细胞内MP变化趋势相吻合，提示可能与WS070117在0.5-12小时之间增强AMPK活性的机制相关，0.5小时活性的剧增可能存在其他的相关机制。

结果3MP的结构鉴定

根据生物学特性推断的MP结构，通过化学合成标准品。标准品与样品的一级二级质谱比对，推断MP结构为图6E所示。

实验例5MP促进C57小鼠对糖和脂类的利用

方法

6.1材料与动物C57BL/6J小鼠，维通利华实验动物科技有限公司，8周龄，雄性；MP，中国医学科学院药物研究所吴松课题组提供，99%（HPLC）；小动物呼吸商检测，CWE MM-100代谢检测仪，中国医学科学院动物研究所

6.2给药C57BL/6J小鼠于实验前一天置于代谢笼内，饥饿过夜，于实验当天早8点给予普通饲料，10点腹腔注射生理盐水和MP溶液（30mg/kg）。持续监测代谢笼内氧耗量和二氧化碳生成量，呼吸商RER=VCO₂/VO₂.

结果MP促进C57小鼠对糖和脂类的利用

实验例6MP分子水平激活AMPK全酶

方法

7.1材料与仪器人肝肿瘤细胞系HepG2细胞，购自北京协和医学院细胞中心；

Optiscint hisafe scintillation cocktail2，闪烁瓶均购自Perkin Elmer公司；SAMS多肽，购自Millipore公司；Whatman p81磷酸纤维素纸，购自英俊公司；[γ-32P]ATP，购自中国同福有限公司；AMP，ATP，牛血清白蛋白均购自Sigma公司；PEG6000，购自SERVA公司；蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂，购自Roche公司；DMEM培养基，购自Gibco公司。SeperateTM Max190酶标仪，Eppendorf多用途低温高速离心机，Perkin Elmer Wallac1470闪烁计数仪等。

7.2指标检测AMPK激酶反应在50μl的缓冲液中进行，缓冲液中包括分析缓冲液（20mM Tris-HCl PH7.4,50mM NaCl,1mM DTT）50μM SAMS，5mM MgCl2, 50μM ATP,200μMAMP,20ng AMPK全酶。[γ-³²P]ATP则根据同位素活力加入反应中。5’-磷酸-3-羟基苯基腺苷和AMP溶于双蒸水中，以2μl体积加入反应体系中。反应缓冲液在30℃水浴中孵育20分钟。反应结束，样品立即置于冰上终止反应，取15μl上清液点在p81磷酸纤维素纸上，吹干。点样纸用1%H3PO4洗涤3遍，丙酮脱水洗涤一次。放射性活力与SAMS底物结合，通过闪烁计数法检测。

结果

结果1低浓度MP激活AMPK全酶

结果表明，在相同浓度（1×10-6M）下5’-磷酸-3-羟基苯基腺苷和内源性物质AMP对AMPK全酶均有明显的激活作用。在极低浓度情况下MP对AMPK仍有明显激活作用，而AMP则没有明显激活作用（见图8）。MP激活AMPK具有浓度依赖性（5×10^-12M至5×10^-8M），高于5×10^-6M激活作用不明显（见图9）。可见，MP能在较低浓度下激活AMPK，这也是推测其为WS070117体内活性化合物的重要依据。

综上所述，5’-磷酸-N⁶-(3-羟基苯基)腺苷（代号MP）是一种合成的未见文献报道的新化合物，药效学实验证实MP具有激活AMPK的活性且促进C57小鼠糖脂利用的作用，N⁶-(3-羟基苯基)腺苷（代号M1）具有调节金黄地鼠血脂紊乱模式动物血脂水平的作用。二者均为调血脂活性化合物2’,3’,5’-三-O-乙酰基-N⁶-(3-羟基苯基)腺苷的体内及细胞代谢产物，提示N⁶-(3-羟基苯基)腺苷和5’-磷酸-N⁶-(3-羟基苯基)腺苷具有治疗实验性糖脂紊乱方面的作用。

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Claims (5)

1.式Ⅱ所示的5’-磷酸-N⁶-(3-羟基苯基)腺苷或其药学上可接受的盐

2.式Ⅱ所示的5’-磷酸-N⁶-(3-羟基苯基)腺苷或其药学上可接受的盐的制备方法，所述制备方法包括以N⁶-(3-羟基苯基)腺苷为原料，与三氯氧磷、三甲基磷酸酯反应，以及任选地，将所得混合物转化为目标产物或其药学上可接受的盐；

3.一种药物组合，其特征在于，包括权利要求1的式Ⅱ5’-磷酸-N⁶-(3-羟基苯基)腺苷或其药学上可接受的盐和药用载体。

4.式II所示的5’-磷酸-N⁶-(3-羟基苯基)腺苷或其药学上可接受的盐在制备预防和/或治疗糖脂代谢紊乱疾病药物中的应用

5.根据权利要求4的应用，其特征在于，所述的糖脂代谢紊乱疾病选自糖尿病和高血脂症。