哌嗪衍生物作为p53分子调节剂的用途
技术领域
本发明属于生物技术领域,涉及哌嗪衍生物作为p53分子活性调节剂的用途。
背景技术
p53蛋白是哺乳动物体内最为重要的一种抗癌基因,在调节细胞周期、控制细胞衰老和凋亡进程等方面发挥重要的作用。作为最为重要的抑癌因子,p53的分子功能涵盖抑制突变积累、控制受损DNA的修复进程、诱导严重损伤的细胞进入凋亡进程等多个关键环节,在细胞维持正常生理功能中所发挥的作用是至关重要的(Vousden KH等,Bl inded by the Light:The Growing Complexity of p53.Cell2009;137:413-431.)。近期的研究还表明,p53对于干细胞的增殖和分化、调节干细胞内部的多能性网络发挥着重要作用,能够促进干细胞分化、抑制细胞的多能性水平(LiM等,Distinct regulatory mechanisms and functions for p53-activated andp53-repressed DNA damage response genes in embryonic stem cells.Mol Cell2012;46:30-42.)。
由于p53的分子活性在生理学和病理学方面都具有突出的地位,人们设计了众多的小分子化合物用以调节野生型和突变型p53分子的活性。但现有的p53活性调节剂药效过强,常导致p53功能被强效抑制或激活。由于p53对细胞的生理功能极为重要,这种强效干预会导致细胞的异常反应。例如,p53抑制剂Pifithrin-α会导致干细胞周期停顿、增殖抑制(Abdelalim EM等,The p53inhibitor,pifithrin-α,suppresses self-renewal of embryonic stem cells.Biochem Biophys Res Commun2012;420:605-610.);p53促活剂nutlin则会使干细胞迅速分化,丧失多能性(Maimets T等,Activation of p53by nultin leads to rapid differentiation ofhuman embryonic stem cells.Oncogene2008;27:5277-5287.)。因此,开发新的p53分子的活性调节剂,使其能够在调节p53活性的同时,部分的维持p53的活力,减少其对细胞正常生理功能的影响,具有重要意义。
发明内容
本发明提供了哌嗪衍生物作为p53分子活性调节剂的用途。
本发明的一个目的是提供了哌嗪衍生物作为p53蛋白调节剂的用途,所述用途为非疾病治疗和诊断目的的用途;或哌嗪衍生物在制备p53基因和/或蛋白调节剂中的应用;所述哌嗪衍生物的结构式如式I或式II所示:
本发明的另一个目的是提供哌嗪衍生物在如下任一所述的应用:
(1)促进干细胞建系;
(2)抑制癌细胞的增殖;
(3)抑制干细胞的分化、或维持干细胞的多能性;
(4)调节p53蛋白或基因的转录活性;
所述应用为非疾病治疗和诊断目的的应用;所述哌嗪衍生物的结构式如式I或式II所示:
所述应用(1)或(3)中,所述干细胞为诱导性多能性干细胞或胚胎干细胞;所述诱导性多能性干细胞为小鼠MEF细胞诱导性多能性干细胞,所述胚胎干细胞为小鼠胚胎干细胞ESC2。
所述应用(2)中,所述癌细胞为p53突变型癌细胞或非p53突变型癌细胞。
所述p53突变型癌细胞指由于p53基因突变,失去p53正常的功能活性所形成的癌细胞。所述非p53突变型癌细胞指由于p53正常的功能活性被干扰所导致的癌细胞。
所述p53突变型癌细胞为肺癌细胞;具体为人小细胞肺癌细胞NCI-H446;所述非p53突变型癌细胞为宫颈癌细胞;具体为人子宫颈癌细胞Hela。
所述应用(4)中,所述调节p53蛋白或基因的转录活性具体为调节MEF细胞或ESC2细胞中p53蛋白或基因的转录活性。
所述应用(4)中,所述调节p53蛋白或基因的转录活性具体为抑制p53蛋白或基因的转录活性;再具体为抑制MEF细胞或ESC2细胞中p53蛋白或基因的转录活性。
所述应用(4)中,所述转录活性是指p53蛋白激活p53下游基因转录;
所述p53下游基因指任意一个基因表达量受p53基因和/或蛋白调控的基因;具体为MDM2、p21、Eif4gl、Fnl、Tcf4、Cdk6、Mycbp2、Cdxl、Aqp3、Ctgf、Histlhlc、Ccno、Pgam2、klf4、klf5、med12或Sox21。
本发明的再一个目的是提供哌嗪衍生物在制备具有如下任一所述用途的产品中的应用:
(1)促进干细胞建系;
(2)抑制癌细胞的增殖;
(3)抑制干细胞的分化、或维持干细胞的多能性;
(4)调节p53蛋白或基因的转录活性;
(5)预防和/或治疗癌症;
所述应用为非疾病治疗和诊断目的的应用;所述哌嗪衍生物的结构式如式I或式II所示:
所述应用(1)或(3)中,所述干细胞为诱导性多能性干细胞或胚胎干细胞;所述诱导性多能性干细胞为小鼠MEF细胞诱导性多能性干细胞,所述胚胎干细胞为小鼠胚胎干细胞ESC2。
所述应用(2)中,所述癌细胞为p53突变型癌细胞或非p53突变型癌细胞。
所述p53突变型癌细胞指由于p53基因突变,失去p53正常的功能活性所形成的癌细胞。所述非p53突变型癌细胞指由于p53正常的功能活性被干扰所导致的癌细胞。
所述p53突变型癌细胞为肺癌细胞;具体为人小细胞肺癌细胞NCI-H446;所述非p53突变型癌细胞为宫颈癌细胞;具体为人子宫颈癌细胞Hela。
所述应用(4)中,所述调节p53蛋白或基因的转录活性具体为调节MEF细胞或ESC2细胞中p53蛋白或基因的转录活性。
所述应用(4)中,所述调节p53蛋白或基因的转录活性具体为抑制p53蛋白或基因的转录活性;再具体为抑制MEF细胞或ESC2细胞中p53蛋白或基因的转录活性。
所述应用(4)中,所述转录活性是指p53蛋白激活p53下游基因转录;
所述p53下游基因指任意一个基因表达量受p53基因和/或蛋白调控的基因;具体为MDM2、p21、Eif4g1、Fnl、Tcf4、Cdk6、Mycbp2、Cdxl、Aqp3、Ctgf、Histlhlc、Ccno、Pgam2、klf4、klf5、med12或Sox21。
所述(5)中,癌症为p53突变型癌或非p53突变型癌;所述p53突变型癌为肺癌;所述非p53突变型癌为宫颈癌。
本发明给出了一种针对p53的小分子调节剂,细胞实验结果显示,本发明涉及的化合物对鼠或人的正常细胞没有毒性;小鼠体内急毒实验结果表明该化合物在两种品系的小鼠中均无显著的体内毒性,亦未发现长期的体内毒性。细胞和动物实验结果表明本发明化合物是一种广谱低毒的p53分子调节剂。
本发明公开的针对p53的小分子调节剂,可调控p53下游基因的表达,并且可以使正常细胞的生长和增殖得以维持,癌症细胞的增殖得以抑制,在癌症治疗领域具有广阔的应用前景。此外,该p53分子调节剂还可通过调控p53分子进而调节干细胞的多能性信号网络,抑制干细胞的分化、或维持干细胞的多能性,进而提高多能性干细胞的建系效率。
附图说明
图1为G5的分子结构式。
图2为Z7的分子结构式。
图3为G5对MEF细胞中p53下游基因MDM2和p21的表达的影响实验结果图;其中,图3A为G5加药组和对照组中MDM2基因的mRNA表达水平对比图;图3B为G5加药组和对照组中MDM2基因的蛋白表达水平对比图;图3C为G5加药组和对照组中p21基因的mRNA表达水平对比图;图3D为G5加药组和对照组中p21基因的蛋白表达水平对比图。
图4为G5对小鼠ESC2干细胞的p53信号通路的调节结果图,数据来源为全基因组mRNA表达图谱测定,其中,图4A为G5对p53下游基因影响的总图;图4B为G5对被p53所抑制的下游基因的影响;图4C为G5对被p53激活的下游基因的影响,图4B和4C中用加药组与对照组基因mRNA表达量的比值作为衡量基因表达改变的指标。
图5为G5和Z7对小鼠诱导性多能干细胞制备效率影响的实验结果图。
图6为G5对小鼠MEF细胞形态和增殖影响的结果图,其中,图6A为用药24小时后的细胞形态;图6B为用药48小时后的细胞形态;图6C为利用MTT测定的G5对细胞增殖的影响。
图7为G5对小鼠ESC2细胞形态和增殖影响的结果图,其中,图7A为用药24小时后的细胞形态;图7B为用药48小时后的细胞形态;图7C为利用MTT测定的G5对细胞增殖的影响。
图8为Z7的体内急毒检验中饲养两周后的BALB-C小鼠和LCR小鼠。
图9为G5对人胎儿皮肤成纤维HFF细胞增殖的影响。
图10为G5对人肺癌细胞NCI-H446增殖的影响。
图11为G5对人子宫颈癌细胞Hela增殖的影响。
图12为Z7对人胎儿皮肤成纤维HFF细胞增殖的影响。
图13为Z7对人肺癌细胞NCI-H446增殖的影响。
图14为Z7对人子宫颈癌细胞Hela增殖的影响。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
1,4-Bis-[4-(3-phenoxy-propoxy)-but-2-ynyl]-piperazin,中文名称为:1,4-二-[4-(3-苯氧基丙氧基)-丁-2-炔]-哌嗪,购自荷兰SPECS公司,在本发明中简称G5,其化学结构式见图1。
1,4-Bis-[4-(2-benzyloxy-ethoxy)-but-2-ynyl]-piperazine,中文名称为:1,4-二-[4-(2-苄氧基乙氧基)-丁-2-炔]-哌嗪;购自荷兰SPECS公司,在本发明中简称Z7,其化学结构式见图2。
小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryo fibroblast,MEF)、小鼠胚胎干细胞(mouseembryocell,ESC2)和人胎儿皮肤成纤维细胞(HFF)均购自中国科学院动物研究所;人小细胞肺癌细胞(Human lung carcinoma cellline,NCI-H446)购自中国医学科学院肿瘤研究所;人子宫颈癌细胞(Hela)参见文献Scherer WF等,Studies on thepropagation in vitro of poliomyelilis viruses.IV.Viral multiplication in astable strain of human malignantepithelial cells(STRAIN HELA)derived froman epidermoid carcinoma of the cervix.J Exp Med.1953;97:695-710.。
MEF细胞的培养液配方为:450ml DMEM,50ml FBS,5ml100x青链霉素。
ESC2细胞的培养液为:含体积百分比15%的FBS(胎牛血清,Gibco)的DMEM,并添加1000U的LIF(白血病抑制因子,Chemicon)以及0.1mM的β-巯基乙醇(β-mercaptoethanol,Sigma)、0.1mM的非必需氨基酸(non-essential amino acid,Gibco)
HFF、NCI-H446、Hela细胞培养液为:RPMI-1640(61870-127,Gibco),添加体积百分比2%的胎牛血清(FBS,16000044,Gibco),体积百分比1%的青霉素-链霉素(15140122,Gibco)。
除非特别指明,以下实施例中工作液的配制方法为:
将G5或Z7化合物以20mM的浓度溶解于DMSO中作为储存液备用。
用药组工作液:将上述储存液用不同细胞所对应的培养液稀释成浓度为10uM的G5或Z7的含药培养基;该含DMSO的体积百分比为0.05%的、G5或Z7药物浓度为10uM的细胞培养液即为用药组工作液;
DMSO对照组工作液:含体积百分比为0.05%的DMSO的相应的细胞培养液即为DMSO对照组工作液;
工作液中其它成分在用药组和对照组中均相同。
目前DMSO在1%的使用剂量下基本不影响细胞的功能是公知的。本发明中用药组和对照组中DMSO的使用量均为0.05%,远低于1%的水平,因此基本不影响细胞功能,所以以下各实施例中没有再设空白对照。
除非特别指明,以下实施例中所用的荧光定量PCR仪型号为Stratagene Mx3000P荧光定量PCR仪,购自吉泰公司。
除非特别指明,以下实施例中所用的显微镜为Leica microscope,购自徕卡公司。
实施例1、G5对p53下游基因MDM2和p21的表达的影响
利用小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryo fibroblast,MEF)检测化合物G5对p53下游基因MDM2和p21的mRNA表达水平和蛋白表达水平的影响,具体过程如下所述。
利用含G5或DMSO的工作液培养MEF细胞24小时后,通过real-time PCR和Western Blot实验检测MEF细胞中p53下游基因MDM2和p21的mRNA表达水平和蛋白表达水平。
(一)real-time PCR检测mRNA表达水平
a.收集细胞:收集经G5用药组、DMSO对照组工作液培养的细胞各约1x106个,冰PBS洗涤一遍。
b.提取RNA:将不同细胞中分别加入1ml TRIZOL试剂(Invitrogen),用力振荡混匀,冰中静置15分钟。加入200μl氯仿用力震荡均匀,静置15分钟。12000g离心15分钟,收集上清。加入等体积的异丙醇沉淀1h(-20℃),然后12000g离心20分钟。沉淀总RNA。用75%乙醇洗涤,干燥沉淀10分钟,用40μl无RNA酶的水溶解,测浓度,-80℃备用。
c.RNA逆转录:用MMLV反转录试剂盒(Promega)对步骤b获得的RNA进行逆转录反应,具体操作依该试剂盒说明书进行:在0.5ml离心管中加入12.5μl在步骤b中获得的RNA,再加入1μl随机引物,1μldNTP,65℃反应5分钟,再加入4μl逆转录缓冲液,1μlRNA酶抑制剂,1μl逆转录酶(MMLV),37℃1小时。得到cDNA溶液。
d.PCR检测:用SYBR Green PCR检测试剂盒对步骤c的cDNA溶液进行PCR扩增反应。
扩增MDM2基因的引物序列为:
上游引物:5’-CCCCGTGAAGGGTCGGAA-3’,
下游引物:5’-GTTGGTATTGCACATTGGCCTGG-3’;
扩增p21基因的引物序列为:
上游引物为:5’-CATTCAGAGCCACAGGCACC-3’,
下游引物为:5’-CCATGAGCGCATCGCAATC-3’;
扩增内参基因GAPDH的引物序列为:
上游引物为:5’-TCCCACTCTTCCACCTTCGATGC-3’,
下游引物为:5’-GGGTCTGGGATGGAAATTGTGAGG-3’。
在荧光定量PCR反应管中分别加入上下游引物各1μl,eDNA溶液9μl,SYBR GreenPCR反应缓冲液10μl。反应条件:95℃预变性10分钟,然后95℃30秒,60℃1分钟,共40个循环。再用荧光定量PCR仪检测,具体操作以检测试剂盒及荧光定量PCR仪说明书进行。
e.实验结果分析:通过检测G5加药组、DMSO对照组MEF细胞中MDM2基因、p21基因和内参基因GAPDH的Ct值,就可根据公式ΔCt=Ctgene-CtGAPDH来计算该基因的ΔCt值,根据ΔCt值的大小就可以判断出该基因的相对表达量,ΔCt值小,其对应的基因的表达水平高;而ΔCt值大,其对应的基因的表达水平低。real-time PCR实验结果见图3A和图3C。图3A和图3C结果显示,与DMSO对照组相比,用含G5的培养液处理MEF细胞后的G5加药组,MEF细胞中被p53激活的下游基因MDM2和p21的mRNA相对表达水平降低。real-timePCR实验表明G5可以抑制小鼠MEF细胞中p53的转录活性,下调被p53激活的下游基因的转录。
(二)Western Blot Hybridization检测蛋白表达水平
a.细胞总蛋白的提取:
将经G5用药组、DMSO对照组工作液培养的细胞用0.25%胰酶消化使之分散,4°C低速离心去上清,将沉淀置于冰上30min,再用预冷的PBS洗2次,每106细胞加入裂解液100μL,使细胞充分裂解30min,再于4℃,20000×g离心15min,收集上清。
b.Bradford法测定细胞裂解液蛋白的浓度:
首先配制考马斯亮蓝染色液;将标准牛血清白蛋白(BSA)配制成1mg/ml的蛋白标准液,分别将10μg、20μg、30μg、40μg、50μg、60μg蛋白标准液和5μL待测蛋白质样品加入3mL考马斯亮蓝染液中,室温孵育10min,在595nm波长处测定吸收值。BSA标准样品测定标准曲线,在一定范围内OD595与蛋白浓度成正比。样品蛋白质的浓度经标准曲线拟合方程来计算。
c.电泳及免疫反应:流程如下:A、制胶(5%浓缩胶,10%分离胶);B、50g蛋白样品加入上样缓冲液,煮沸,上样;C、电泳,浓缩胶80V电压,分离胶120V电压;D、转膜,100V,1.5h;E、封闭,1h;F、一抗(小鼠MDM2,Santa Cruz,965;兔P21,Epitomics,2990-1或GAPDH一抗Santa Cruz,137179)反应,4℃,过夜;G、TBST洗膜,三次,每次10min;H、二抗(兔抗鼠或山羊抗兔二抗)反应,1.5h;I、TBST洗膜,三次,每次10min;J、显色、曝光。
d.实验结果分析:Western Blot的实验结果见图3B和图3D。图3B和图3D结果显示,与DMSO对照组相比,用含G5的工作液处理MEF细胞后的G5加药组,MEF细胞中p53下游基因MDM2和p21的蛋白表达水平降低。Western Blot实验表明G5可以抑制小鼠MEF细胞中p53的转录活性,下调被p53激活的下游基因的表达。
实施例2、G5对p53信号网络和多能性调控网络的调控
利用小鼠胚胎干细胞ESC2检测化合物G5对p53下游基因信号网络和重要多能性因子的mRNA表达水平的影响,具体过程如下所述。
利用G5用药组、DMSO对照组的工作液培养ESC2细胞24小时后,运用整体基因表达谱的分析方法检测ESC2细胞中p53下游信号网络和重要多能性因子的mRNA表达水平。
整体基因表达谱分析过程如下所述:
利用TRIzol试剂从经G5用药组、DMSO对照组的工作液培养的小鼠ESC2细胞中提取总RNA。10微克生物素标记的反义RNA与小鼠的WG-62.0表达芯片进行杂交,用药组和对照组样品的杂交都分别进行了三次生物学重复。杂交之后进行冲洗,然后用BeadArray Reader进行扫描得到图片形式的芯片表达信息,再用Illumina GenomeStudio V2011.1软件将其图片信息转化为表达信号值。对于得到的信号值,用Bioconductot中的lumi软件包进行标准化和差异表达分析。标准化是利用lumi软件包中的lumiExpresso方法进行的,差异表达分析利用lumi软件包中的经验贝叶斯方法进行,得到P值和差异倍数。选取P值小于0.05和表达差异倍数大于1.3的基因进行差异分析。
Illumina基因芯片检测结果见图4和表1。
表1
图4结果显示,与DMSO对照组相比,经G5用药组工作液培养的ESC2干细胞中有18个p53下游基因的mRNA表达量有显著变化,其中9个被p53所抑制的基因中有6个表达量发生上调,这6个p53下游基因分别为Eif4g1、Fnl、Tcf4、Cdk6、Mycbp2和Cdxl,见图4中*号所标注的被p53所抑制的基因;9个被p53所激活的基因中有5个表达量发生下调,这5个p53下游基因分别为Aqp3、Ctgf、Histlhlc、Ccno和Pgam2,见图4中*号所标注的被p53所激活的基因。由于p21、klf4等p53下游基因并不是仅依靠p53来激活的,因此图4中没有被*号所标注的p53下游基因的表达量改变趋势与理论上推理不相符这一现象也是合理的。图4所示的Illumina基因芯片检测结果基本上能反应G5对p53转录活性的抑制能力,和对p53下游网络的调控能力。
表1结果显示,经化合物G5处理后,在ESC2干细胞的分化进程中起重要的促进作用的sox21基因的mRNA表达量发生了显著下调;对维持干细胞多能性起重要促进作用的klf4,klf5,med12等基因的表达量发生了显著上调。表1结果说明化合物G5可被用于调节干细胞的多能性信号网络,提高建系效率。
实施例3、G5和Z7对干细胞建系效率的影响
利用诱导小鼠多能性干细胞iPS实验评估化合物G5和Z7对干细胞建系效率的影响。实验过程如下所述。
(一)MEF的分离
1.将13.5d的孕鼠采用断颈法处死,75%酒精消毒;
2.无菌条件下用解剖剪迅速剪开下腹部,暴露呈串珠样排列的子宫;
3.用弯镊提拉出全部子宫,解剖剪剪去两端附着组织,将成串子宫全部浸入预冷的含2%P-S(双抗)的PBS溶液中;
4.将成串子宫放在预冷的PBS溶液中漂洗三次,洗去子宫表面附着血细胞和组织;
5.用眼科剪将一个个子宫分别剪开,剥离胎鼠,将分离出的胎鼠置于新的盛有PBS的培养皿中(一般可获得10-12只胎鼠);
6.用两把小弯镊配合,去除胎鼠的头、尾、四肢、内脏,保留躯干部位,置于新的盛有PBS的培养皿中;
7.用眼科剪将组织块剪碎成1mm3左右大小,用Pasteur管收集组织块至15ml离心管,离心1000rpm,3min;
8.去上清液,加入0.05%Trypsin-EDTA,室温作用5min伴移液管轻柔连续吹打,待大组织块消失后加入等体积MEF培养基终止消化,离心1000rpm,3min;
按1只胎鼠/100mm皿的密度接种,取材后一日更换培养基,于第4-5日传代。
(二)Feeder的制备
MEF长满后,用PBS洗一次,加入新鲜的MEF培养基+MMC(丝裂霉素,10ug/ml),37℃,孵育2h;
PBS洗2遍;
0.05%Trypsin-EDTA消化,2min,加入等量的培养液终止消化;
收集细胞悬液,离心1000rmp,3min;
吸去上清,加入冻存液,冻存细胞备用;
(三)病毒的包装
接种plat-E前用50mg/ml的PDL(多聚赖氨酸)包被培养皿,30min后弃掉PDL,用PBS清洗,加入plat-E培养液准备接种plat-E细胞(Morita S等,Plat-E:anefficient and stable system for transient packaging of retroviruses.GeneTher.2000;7:1063-1066.);
按每个100mm培养皿接种8×106细胞的密度接种,分别转染pMXs-Oct4、pMXs-Sox2、pMXs-c-Myc或pMXs-Klf4质粒(Takahashi K等,Induction of pluripotentstem cells from fibroblast cultures,Nat Protoc2007;2:3081-3089.购自addgene公司);
第二天接种的细胞达到80%聚集的时候准备转染,给plat-E细胞换成opti-MEM培养液7ml,再用1ml的opti-MEM稀释质粒,每个100mm的皿需要质粒24ug,同时加24μlLipofectamine Plus,混匀室温静止5min后,再加入48μlLipofectamine LTX,室温静止30min后,逐滴的加入到提前换好opti-MEM培养液的plat-E细胞中
37℃,5%CO2培养箱过夜培养,转染12h后将opti-MEM培养液换成15ml新鲜的含有1%FBS的DMEM培养液,此时的液体不含P-S;
换液后的24h收集病毒,并再加入15ml新鲜的含有1%FBS的DMEM培养液;
24h后再收集病毒。
(四)iPS诱导过程
接种第二代的MEF细胞,密度1×105/35mm培养皿
第二天换新鲜无P-S的MEF培养液,把四个因子的病毒同时加到培养皿中进行感染,同时加有4μg/m的polybrene来增强感染效率。
37℃,5%CO2培养箱过夜培养后,换液,换成新鲜的MEF培养液(此时可以加P-S);
37℃,5%CO2培养箱过夜培养后,换液,观察细胞,此时细胞基本长满。准备feeder细胞,密度为1×106/100mm培养皿;
次日,用0.05%Trypsin-EDTA胰酶把细胞消化成单细胞接种到饲养层上,接种的密度是2.5×104cells/35mm培养皿,仍然用MEF的培养液。接种1个12孔板用于后续实验;
37℃,5%CO2培养箱过夜培养后,弃去MFF的培养液,换成R1培养液(iPS诱导专用的培养液,成分具体为:DMEM,FBS10%(v/v),L-G2mM,NEAA1x10-4M,β-巯基乙醇1x10-4M,penicillin50U/ml,streptomycin50mg/ml,Lif1000U/ml)。将一个12孔板分为4组,每组3个孔,分别为用药组(含10uM的G5或Z7的R1工作液)、空白对照组(R1中不加任何分子)、阴性对照组(R1中加入与实验组等体积的DMSO)、阳性对照组(R1中加入2mM p53抑制剂Pifithrin-α,购自STEMGENT公司);每日换液一次,大概两周后可看到明显的iPS克隆形成。
(五)AP染色方法
克隆形成后,将12孔板每孔中加入500ul新鲜的4%多聚甲醛(PFA)固定30min;
吸去PFA,PBS洗三次,每次5min;
使用碧云天AP染色试剂盒进行染色,每孔加入500ul缓冲液室温平衡5min;
吸去缓冲液,每孔加入500ul用缓冲液稀释BCIP(300X)和NBT(150X)的染液,室温孵育30min;
吸去染液,PBS洗三次;
镜下观察计数;
(六)计数方法
为防止漏查和重查,先在12孔板下用细marker笔画线,每个孔平均画3条线,分成3个部分;
镜下计数,计数时注意画线部位,分别计每一部分的克隆数,防止查错,最后再求和;
每个孔都由三个人来查,最后记录平均数。
(七)实验结果分析
实验结果见图5。与DMSO对照组相比,干细胞的克隆数明显提高,表明本发明提供的新型p53调节剂可被用于提高小鼠多能性干细胞的建系效率。
实施例4、G5对小鼠正常细胞形态和增殖的影响
(一)采用MTT法检测化合物G5对小鼠正常MEF细胞形态和增殖的影响
MTT法检测过程为:将对数生长期的MEF细胞接种于96孔板中,每孔接种细胞数为1x104个。血清饥饿24小时,次日分别向相应实验组加入G5用药组或DMSO对照组工作液,每组作用于6孔细胞,37℃,5%CO2进行培养。分别在培养24h或48h后的细胞中,加入50μl的1mg/mL的MTT溶液,同样培养条件下作用4小时后取出,小心吸出每孔内液体,每孔加入二甲基亚砜150μL,轻微振荡10分钟,使蓝紫色结晶充分溶解在二甲基亚砜中。用自动酶标仪测量96孔板中每孔在570nm处的吸光值。该波段处吸收值越大代表存活细胞量越多。
MTT法检测结果见图6。图6A和图6B的形态学观察和图6C的MTT数据显示,G5用药组和DMSO对照组之间的MEF细胞形态和增殖没有显著差异,表明化合物G5不影响小鼠MEF细胞的正常形态和增殖。
(二)采用MTT法检测化合物G5对小鼠正常ESC2干细胞形态和增殖的影响
MTT法检测过程同(一)所述,不同的是将(一)中所述的MEF细胞换为ESC2干细胞。
MTT法检测结果见图7。图7A和图7B的形态学观察和图7C的MTT数据显示,G5用药组和对照组之间的ESC2干细胞形态和增殖没有显著差异,表明化合物G5不影响小鼠ESC2干细胞的正常形态和增殖。
实施例5、Z7的体内急毒特征
利用BALB-C小鼠和LCR小鼠检测化合物Z7的体内急毒特征。将Z7溶于含体积百分比为5%DMSO的生理盐水中,然后优选地以25mg/kg的用药剂量对16-18周龄的雄性小鼠实施尾静脉注射,观察用药后的行为特征及长期影响。用药后小鼠出现暂时的兴奋,持续时间约一分钟,之后恢复正常。饲养两周后未见异常(如图8所示)。Z7的体内急毒实验结果表明Z7在两种品系的小鼠中均无显著的体内毒性,亦未发现长期的体内毒性。
实施例6、G5对人正常细胞、非p53突变型癌细胞和p53突变型癌细胞增殖的影响
(一)材料
培养液名称:1640
基础液:RPMI-1640(61870-127,Gibco)
添加物:体积百分比为2%胎牛血清(FBS,16000044,Gibco),体积百分比为1%青霉素-链霉素(15140122,Gibco)
酶名称:体积百分比为0.25%Trypsin(25200072,Gibco)
培养板:96孔板(3599,Corning)
染色试剂:Hoechst33342(H3570,Invitrogen)
(二)细胞系的选择
人胎儿皮肤成纤维细胞HFF;人小细胞肺癌细胞NCI-H446;人子宫颈癌细胞Hela。
(三)实验方法
1)用0.25%的Trypsin消化细胞;
2)以每个96孔板孔2000个左右细胞量进行接种,每种细胞接种三个培养板;为避免边缘效应,培养板周围不接种细胞;分别用加药组工作液、DMSO对照组工作液、空白对照组工作液(即不加药也不加DMSO的细胞培养液)处理3种细胞,总共9组,每组三个重复;每孔工作液的体积为30-50μl;
3)细胞接种后,用RPMI-1640基础液和添加物的混合液培养细胞,每天换液一次;第三天开始用药物处理细胞,即分别用加药组、空白对照组、DMSO对照组工作液处理相应实验组的细胞;
4)在第三天,第四天,第五天时即药物处理的第一,二,三天对每种细胞分别取一个板子进行固定,染色,进行细胞数的统计;
5)染色方法:
a)4%的多聚甲醛(PFA,P6147,Sigma)固定10分钟
b)PBS洗三次,每次5分钟
c)用10μg/ml的Hoechst染色10分钟
d)PBS洗三次,每次5分钟,最后一次不用弃液,直接观察
6)检测方法
采用高通量的细胞检测仪(Operetta,PerkinElmer)检测。
抑制率公式为:(DMSO对照组细胞数-用药组细胞数)/DMSO对照组细胞数。
(四)实验结果分析(最好能更换清晰一些的图片)
G5对人正常细胞HFF、p53突变型癌细胞NCI-H446和非p53突变型癌细胞Hela增殖的影响实验结果见图9-11。通过抑制率公式计算得到G5对人正常细胞HFF3天抑制率为6.5%;G5对人肺癌细胞NCI-H4463天抑制率为54%;G5对人子宫颈癌细胞Hela3天抑制率为34%。实验结果显示,G5可显著抑制人肺癌细胞和人宫颈癌细胞的增殖,而对人正常细胞的增殖影响较小。
实施例7、Z7对人正常细胞、p53突变型癌细胞和非p53突变型癌细胞增殖的影响
Z7对人正常细胞、p53突变型癌细胞和非p53突变型癌细胞增殖的影响实验过程同实施例7,不同之处是将加药组工作液中的G5换为Z7。
实验结果见图12-14。通过抑制率公式计算得到Z7对人正常细胞HFF3天抑制率为3.4%;Z7对人肺癌细胞NCI-H4463天抑制率为38%;Z7对人子宫颈癌细胞Hela3天抑制率为25%。实验结果显示,Z7可显著抑制人肺癌细胞和人宫颈癌细胞的增殖,而对人正常细胞的增殖影响较小。