CN104198678A - 一套适合评价土壤中农药残留毒性变化的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一套评价土壤中农药残留毒性变化的方法，是根据土壤中残留农药的性质不同而分别有机溶剂提取方法、去离子水提取方法和泥浆直接暴露染毒法，再利用蚯蚓彗星实验和蚕豆微核实验，双重指标检测土壤生态毒性，建立了一套适合土壤中农药残留毒性的提取方法，为农药残留毒性对环境及人体健康的影响评价提供技术保障。本发明的方法简单易行，可重复操作性强，适用性广，对不同极性性质的农药都可应用。便于后续的生态毒性测定，具有较大的实际应用价值。

Description

一套适合评价土壤中农药残留毒性变化的方法

技术领域

本发明涉及一套评价土壤中农药残留毒性变化的方法。 

技术背景

农药在保证和促进农林牧业发展,满足人们对农副产品的需要等方面所发挥的显著作用是众所周知的，但农药污染的严重现状也越来越受到人们的重视。近年来，由于农药大量的、不合理的施用，造成了农田土壤的污染。这不仅破坏了土壤中生物多样性，对土壤生态环境造成严重危害，还会通过饮用水或通过土壤植物系统经食物链进入人体，危害人体健康。 

农药残留的污染物浓度低、范围广。目前，对于土壤中农药残留毒性变化的分析测定，国内外几乎没有学者研究。现有的研究中，主要分为两方面：一是最大限量的提取出土壤中的农药母体用于GC、HPLC分析其在土壤中存在的量；二是通过定性分析某种农药的降解产物，以降解产物的毒性大小理论上判断该种农药在环境中的毒性变化。随着人们对环境安全意识的提高，现有的这些研究内容以不足已直观确切的测定农药在土壤中的残留毒性。这是因为：(1)农药在土壤中的状态是一个降解转化的动态过程，伴随着其降解中间产物的产生，必然会导致对环境造成不同的影响；(2)一种农药往往产生多种降解产物，而降解产物的极性性质不一定与农药母体相同，比如，硫丹是脂溶性农药，但它其中一种降解产物硫丹硫酸盐是水溶性有机物，若只从农药母体性质出发，势必会导致测定其残留毒性时不够全面；(3)通过实验仪器测定某种农药的降解产物时，检测到的是它的主要降解产物，一些极少量的降解产物不能被提取或检测出来，以往的以几种降解产物的毒性大小来判断农药降解后的毒性变化是不准确的。因此，需要对土壤进行后效观察，通过灵敏和有效的诊断方法对污染土壤的残留毒性和修复效果进行评定以给出直接和明确的答复。 

随着技术的不断发展和改进，用于评价微生物修复污染土壤的生物检测方法更为多样化和精确化。人们在综合考虑不同的目的、检测物和实际条件后，通常采用不同的评价方法。目前，污染物的基因毒性和生态毒性检测评价方法主要有：Ames试验，基因突变试验，染色体试验(包括微核、染色体畸变及SCEs等)，DNA损伤试验；动物体内实验等。本发明利用彗星实验和微核实验这两个公认地生态毒性检测方法来作为综合评价指标，评价提取出的土壤中有机污染物的残留毒性。 

发明内容

为了解决上述问题，本发明选取不同极性性质的农药硫丹、啶虫脒、莠去津、吡虫啉及其降解产物为代表，对比他们在土壤中残留毒性的提取方法，以蚯蚓彗星实验和蚕豆微核实验为 指标，建立了一套评价土壤中农药残留毒性的评价方法，为农药残留毒性对环境及人体健康的影响评价提供技术保障。 

一套评价土壤中农药残留毒性变化的方法，是根据土壤中残留农药的性质不同而采取不同的提取步骤： 

1.当土壤中残留农药及其降解产物以脂溶性农药占主导时，采取有机溶剂提取方法，具体步骤如下： 

(1)提取农药残留物：取20g试验土样用石油醚∶丙酮体积比为1∶1的石油醚丙酮混合液120mL，在索氏提取器中先浸泡12h后75℃抽提6h，提取液浓缩至1mL得到土壤提取液。 

(2)验证农药残留物的基因毒性：将土壤提取液均匀滴加到中性滤纸上，待石油醚丙酮混合液挥发后，吸取2ml的去离子水滴至中性滤纸，将3条蚯蚓放到中性滤纸上染毒12h，后将蚯蚓使用彗星实验检测试验土样中农药残留物。 

(3)验证农药残留物的生态毒性：选取初始根生长良好、根长度一致的蚕豆种子，放入土壤提取液中，让土壤提取液液体浸泡住蚕豆种子根尖染毒5h；待土壤提取液挥发后，将染毒5h后的蚕豆种子使用微核实验检测试验土样中农药残留物的生态毒性。 

2.当土壤中残留农药及其降解产物的性质以水溶性农药占主导时，采取去离子水提取方法，具体步骤如下： 

(1)提取农药残留物：取20g试验土样，按照水：土壤体积比为1:2.5加入50mL去离子水，振荡6h，然后在5000rpm/min条件下离心5min，取上清液，既得土壤提取液。 

(2)验证农药残留物的基因毒性：取2mL土壤提取液，均匀滴加到中性滤纸上；将3条蚯蚓放到中性滤纸上染毒12h；将染毒12h后的蚯蚓使用彗星实验检测试验土样中农药残留物。 

(3)验证农药残留物的生态毒性：选取初始根生长良好、根长度较一致的蚕豆种子，放入土壤提取液中，让土壤提取液浸泡住根尖染毒5h；将染毒5h后的蚕豆种子使用微核实验检测试验土样中农药残留物。 

3.当土壤中残留的脂溶性农药与水溶性农药比例接近或不清楚土壤中哪类性质的农药占主导时，采取泥浆直接暴露染毒法，具体步骤如下： 

取100g试验土样，加入30mL去离子水，混合均匀后放入三只蚯蚓，在光照透气的条件下(23±2℃)，蚯蚓暴露染毒48h，并注意补充水分，保持湿度。暴露结束将蚯蚓取出，放在用4℃生理盐水浸湿的滤纸上饥饿清肠12h，使其吐去肠内杂物；将该蚯蚓使用彗星试验检测试验土样中农药残留物的基因毒性。 

本发明的有益效果在于根据不同性质的农药及其降解代谢产物设计了三种不同的残留毒性评价 方法，可以高效提取出土壤中的农药残留物，为全面综合评价农药在土壤中的生态毒性提供了技术支持。本发明的方法简单易行，可重复操作性强，适用性广，对不同极性性质的农药都可适用，便于后续的基因毒性和生态毒性测定，具有较大的实际应用价值。 

(四)附图说明

图1不同提取方法中硫丹对蚯蚓体腔细胞DNA损伤(Olive尾矩)的影响 

该图比较了本发明设计的三种不同评价方案在评价土壤中农药残留物为硫丹，即脂溶性农药占主导时，证明有机溶剂提取方法更适合提取土壤农药残留物为脂溶性有机污染物。 

图2不同提取方法中啶虫脒对蚯蚓体腔细胞DNA损伤(Olive尾矩)的影响 

该图比较了本发明设计的三种不同评价方案在评价土壤中农药残留物为啶虫脒，即水溶性农药占主导时，证明去离子水提取方法更适合提取土壤农药残留物为水溶性有机污染物。 

图3不同提取方法中莠去津对蚯蚓体腔细胞DNA损伤(Olive尾矩)的影响 

为进一步验证脂溶性农药如莠去津，有机溶剂提取方法是否依然最为适用，该图比较了三种不同评价方案在评价土壤中农药残留物为莠去津时，证明了有机溶剂提取方法更适合提取土壤农药残留物为脂溶性有机污染物。此外，还说明了泥浆直接暴露染毒法也可用于评价脂溶性农药占主导的土壤残留基因毒性。 

图4不同提取方法中吡虫啉对蚯蚓体腔细胞DNA损伤(Olive尾矩)的影响 

为进一步验证水溶性农药如吡虫啉，去离子水提取方法是否依然最为适用，该图比较了三种不同评价方案在评价土壤中农药残留物为吡虫啉时，证明了去离子水方法更适合提取土壤农药残留物为水溶性有机污染物。此外，还说明了泥浆直接暴露染毒法也可用于评价水溶性农药占主导的土壤残留基因毒性。 

图5硫丹降解动态过程中对蚯蚓体腔细胞DNA损伤程度(Olive尾距)的影响 

该图为本发明的具体实施运用，模拟硫丹在土壤中降解，产生各种不同性质污染物后，对土壤基因毒性的综合评价。 

(五)具体实施方式

以下实例中未详尽描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。应理解以下实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何形式限制本发明的范围。 

实施例1确定残留毒性提取方法过程 

有机溶剂提取方法 

初步实验方案：取20g试验土样用石油醚∶丙酮(体积比为1∶1)的混合液120mL，在索氏提取器中先浸泡12h后抽提6h。提取液在旋转蒸发仪上浓缩至约1mL得到土壤提取液；然后将土壤提取液转 移到比色管中(或容量瓶中)，用高纯氮气将土壤提取液吹至10μL后(吹的过程中注意：量少时加入2-3次DMSO，每次1ml，继续吹。)，用DMSO(二甲基亚砜)溶剂定容至5mL，用来准备试验。 

按照本实验方案，若用于试验的蚯蚓均死亡，应对实验方法进行修改。修改中主要解决以下三个方面的疑问：(1)二甲基亚砜(DMSO)对蚯蚓是否有毒性，能否用DMSO定容；(2)石油醚和丙酮混合液(体积比1:1)挥发后滤纸上是否需要滴加去离子水；(3)蚯蚓的体腔细胞能否体外染毒。 

为解决上述三个问题，设计对比实验方案如下： 

(1)二甲基亚砜对蚯蚓的毒性 

为验证二甲基亚砜对蚯蚓的毒性，将二甲基亚砜直接滴加至滤纸上给蚯蚓染毒，看蚯蚓在滤纸上的存活状况。 

(2)石油醚和丙酮混合液(体积比1:1)挥发后滤纸上是否需要滴加去离子水设计四个对比实验组： 

①石油醚和丙酮混合液挥发后不滴加去离子水，滤纸直接与蚯蚓接触； 

②石油醚和丙酮混合液挥发后滴加1mL的去离子水至滤纸上，再放入蚯蚓； 

③石油醚和丙酮混合液挥发后滴加2mL的去离子水至滤纸上，再放入蚯蚓； 

④将去离子水直接滴加至空白滤纸上：滴加1mL去离子水和滴加2mL去离子水各设一组，再分别放入蚯蚓。 

(3)蚯蚓的体腔细胞能否体外染毒 

提取蚯蚓的体腔细胞： 

将滤纸放入培养皿中，滴加2mL的生理盐水至滤纸上，润湿滤纸。取出待试蚯蚓，将蚯蚓先放入盛用少量生理盐水的培养皿中以洗净身体表面的泥土，再转移至滴加2mL生理盐水的培养皿中过夜，吐泥。第二天，取出在培养皿中培养过夜，吐泥后空腹的蚯蚓，将其放入装有2ml生理盐水的5ml离心管中，2-3分钟后，取出。如果必要可以轻轻按摩蚯蚓的尾部，促使其排出体内多余的物质。将蚯蚓放入装有1.5ml 4℃的体腔细胞浸提液【体腔细胞浸湿液组分：5％乙醇，95％生理盐水，2.5mg/mLEDTA，10mg/mL愈疮木酚甘油醚(pH＝7.3)】的5ml或10ml离心管中，蚯蚓受到刺激后，会将体腔细胞排出到体腔细胞浸提液中，2-3分钟后，将蚯蚓取出。将含有蚯蚓体腔细胞的体腔细胞浸提液转移至2ml离心管中。将装有蚯蚓体腔细胞的2ml离心管4℃下离心(3000g，10min)。离心后，移去上清液；吸取1ml 4℃的PBS磷酸缓冲液【1L PBS磷酸缓冲液组分：0.24g磷酸二氢钾，1.44g磷酸氢二钠，8g氯化钠，0.2g氯化钾，加去离子水约800mL充分搅拌溶解，然后加入浓盐酸调pH至7.4，最后定容到1L】至装有蚯蚓体腔细胞的离心管中，将蚯蚓体腔细胞在PBS溶液中混匀，再次3000g离心10min。移走离心后的PBS上清液，即得蚯蚓的体腔细胞。 

体腔细胞染毒： 

将提取出的约1ml石油醚：丙酮体积比为1:1的石油醚和丙酮混合液加入到装有蚯蚓体腔细胞的离心管中，4℃下，染毒2h。用浓度为0.02mol/L硼酸盐缓冲溶液(pH9.0)清洗体腔细胞2次，4℃、3000g、离心20min。吸取1ml4℃的PBS磷酸缓冲液至装有蚯蚓体腔细胞离心20min后的离心管中，将体腔细胞在PBS磷酸缓冲液中混匀，制备成细胞悬浮液，待用。 

后续实验步骤采用彗星实验操作步骤。 

上述三个对比实验的结果为： 

(1)二甲基亚砜直接滴加至滤纸上给蚯蚓染毒时，蚯蚓迅速挣扎，吐出体腔细胞，5min后死亡，证明二甲基亚砜对蚯蚓有毒性，不能用于此实验中。 

(2)石油醚和丙酮混合液(体积比1:1)挥发后不滴加去离子水给蚯蚓染毒时，蚯蚓放入时未有明显的不适反应，但12h后，有三分之一的蚯蚓死亡。石油醚和丙酮混合液挥发后滴加去离子水1mL或2mL，蚯蚓均未出现不适反应，12h后，滴加1mL去离子水的组中，蚯蚓出现轻微不适反应。只有滴加2mL去离子水的实验组中，蚯蚓未出现任何不适反应，蚯蚓活性良好。 

(3)体腔细胞体外染毒实验失败，实验中，染毒后的体腔细胞与石油醚和丙酮混合液(体积比1:1)不能完全分开，会损失一部分的细胞。剩余细胞用于彗星实验中，空白组与实验组并无差别，彗星脱尾现象均不明显。 

根据以上三个实验结果，可得下述结论： 

(1)二甲基亚砜对蚯蚓有毒性，会造成蚯蚓的死亡。故不能用于定容有机溶剂给蚯蚓染毒。 

(2)根据蚯蚓生活的湿度应为60％-70％这个条件，及实验中蚯蚓在添加2mL的去离子水状态优于1mL的去离子水，故有机溶剂在滤纸上挥发完后应滴加2mL的去离子水。 

(3)蚯蚓体腔细胞不适于体外染毒。 

由上述三个实验结论，确定有机溶剂提取方法如下： 

取20g试验土样用石油醚∶丙酮(体积比为1∶1)的混合液120mL，在索氏提取器中先浸泡12h后75℃抽提6h。提取液在旋转蒸发仪上浓缩至约1mL，然后将土壤提取液均匀加入铺衬了9cm中性滤纸的培养皿中。待有机溶剂挥发后，吸取2ml的去离子水滴至滤纸上，培养皿中放入3条蚯蚓，染毒12h。 

1.去离子水提取方法 

设计初步实验方案如下：取20g试验土样，加入一定量的去离子水，在振荡器上振荡一定时间后，取上清液准备蚯蚓彗星试验。该实验方法在探索中主要面临以下三个问题：(1)在土壤中需添加多少量的去离子水？(2)振荡时间需多久？(3)用什么方法把水从土壤中分离出来？ 

为解决上述问题，故设计以下三个实验对比组： 

(1)水土比 

设计三个对比组：水土体积比分别为1:1、1:2.5、1:5。 

(2)振荡时间 

设计四个对比组：振荡时间分别为2、4、6、8h。 

(3)水土分离方法 

设计三个对比组：过滤、抽滤、离心。 

由上述三组对比实验，得到实验结果如下： 

(1)最优水土体积比为1:2.5。水土体积比1:1时，得到的为泥浆，不利于后来的水土分离，而当水土体积比为1:5时，水又过于多，不利于后续实验。 

(2)最适振荡时间为6h。振荡时间为2h、4h时，提取出的上清液用于染毒时，效果不如6h及8h的好，而当振荡时间为8h时，染毒效果与6h接近。 

(3)水土分离方法选用离心。采用滤纸过滤时，速度过慢，要6h以上才能过滤完，且到过滤后期，滤纸易破，造成一部分的土壤到滤液中。采用抽滤时，速度也不快，要1h才能抽滤完一个样，效率过低。而采用离心时，水土分离效果好，且节约时间，效率大大提高。 

2.由上述实验结果，确定去离子水提取方法如下： 

取20g试验土样，加入50mL去离子水(水与土壤的比例为1:2.5)，在振荡器上振荡6h后，然后在5000rpm/min条件下离心5min，取上清液准备蚯蚓彗星试验。用移液管吸1mL受试物溶液，均匀加入铺衬了中性滤纸的培养皿中，培养皿中加入3条蚯蚓，染毒12h。 

3.泥浆直接暴露染毒法 

设计初步实验方案如下：取100g试验土样，加入一定量的去离子水，混合均匀后将3只蚯蚓放入，在光照透气的条件下(23±2℃)，蚯蚓暴露染毒一定时间，并注意补充水分，保持湿度。该实验方法在探索中主要面临以下两个问题：(1)在土壤中需添加多少量的去离子水？(2)蚯蚓暴露染毒时间需多久？ 

为解决上述问题，故设计以下三个实验对比组： 

(1)去离子水体积 

设计四个对比组：分别添加去离子水20mL、30mL、40mL、50mL。 

(2)蚯蚓暴露染毒时间 

设计五个对比组：染毒时间分别为24、36、48、60h。 

由上述两组对比实验，得到实验结果如下： 

(1)最优添加去离子体积为30mL。添加去离子水20mL时，有部分土壤没有被水稀释变成泥浆， 但添加去离子水40、50mL时，土壤变成泥浆后，还会有多余部分的水沉积在土壤上层，易造成蚯蚓被淹死，不利于后续蚯蚓暴露染毒实验。 

(2)最适染毒时间为48h。染毒时间为24、36h时，蚯蚓体腔细胞损伤效果不如48h的好，但当染毒时间为60h时，试验土壤若含有较高浓度的残留农药时，易引发部分蚯蚓死亡。 

4.由上述实验结果，确定泥浆直接暴露染毒法如下： 

取100g试验土样，加入30mL去离子水，混合均匀后将3只蚯蚓放入，在光照透气的条件下(23±2℃)，蚯蚓暴露染毒48h，并注意补充水分，保持湿度。暴露结束将蚯蚓取出，放在用4℃生理盐水浸湿的滤纸上使其吐去肠内杂物，饥饿清肠12h后，该蚯蚓即可用于后续实验。 

实施例2土壤中不同性质农药残留毒性测定方法比较 

1.试验土壤 

土壤研磨后过2mm筛，选取四种不同性质的农药为代表按一定浓度添加至土壤中。这四种农药分别为硫丹、啶虫脒、吡虫啉和莠去津，分别设定各农药在土壤中的染毒浓度如下：土壤中添加硫丹浓度设定为：对照组(0)、0.1、1.0、10.0mg/kg四个处理；土壤中添加啶虫脒设定浓度为：对照组(0)、0.05、0.1、0.5mg/kg四个处理；土壤中添加吡虫啉设定浓度为：对照组(0)、0.1、0.5、1mg/kg四个处理；土壤中添加莠去津设定浓度为：对照组(0)、0.1、0.5、2.5mg/kg四个处理。污染物添加至土壤中后，混匀，平衡1-2h后方可用于后续实验。 

2.提取土壤中有机物残留毒性 

利用实施例1中所述的最终确定的三种提取方法，分别提取实施例2中1)所述试验土壤中所涉及的不同性质的农药及其降解产物的残留毒性滤液，用于后续实验的检测。 

3.彗星实验 

(1)用实施例2中2)所提取出的含有土壤残留毒性的滤液给蚯蚓染毒，染毒12h后，将蚯蚓放置于5ml离心管中，再在每个5ml离心管中添加2ml的生理盐水，2-3min后，取出蚯蚓。 

(2)将蚯蚓放至5ml或10ml离心管中，向离心管中加入1.5ml的体腔细胞浸提液，2-3min后，当液体变为淡黄色时，将蚯蚓取出，将含有蚯蚓体腔细胞的体腔细胞浸提液转移至2ml离心管中。 

(3)将装有蚯蚓体腔细胞的2ml离心管4℃下离心(3000g，10min)。 

(4)离心后，移去上清液，吸取1ml PBS溶液(4℃)至离心管中，使体腔细胞在PBS溶液中混匀，4℃再次离心(3000g，10min)。 

(5)移走离心后的PBS上清液，吸取100μl的PBS缓冲液(4℃)至离心管中，将体腔细胞在PBS溶液中混匀，制备成细胞悬浮液，待用。 

(6)在60℃下，在载玻片上滴上100μl浓度为0.8％NMA，盖上盖玻片，置室温下20min，使琼 脂固化。 

(7)轻轻移开盖玻片，在37℃下，将悬于20μl PBS中的受检细胞与500μl 1.0％LMA相混，将细胞悬液滴到第一层胶上，尽量铺薄。盖上盖玻片，置4℃15min，使琼脂固化。 

(8)在37℃下，移开第二层盖玻片，将50μl 0.5％LMA作为第三层，滴加在含有细胞的琼脂上。置4℃15min，使琼脂固化。以上铺胶过程一定要防止气泡产生。 

(9)移开盖玻片，将载玻片浸入新配制的4℃裂解液中，于4℃下放置1h，但时间不能过长，长时间的裂解可能导致裂解液沉淀。 

(10)将载玻片取出，用去离子水洗去载玻片上多余的裂解液，吸水纸吸干。 

(11)将载玻片置于水平凝胶电泳槽中的阳极端，电泳槽中盛有新配制的高pH电泳缓冲液，在缓冲液中放置30min，以便使DNA在电泳前解螺旋。 

(12)调整电泳槽中缓冲液面高度，使电泳仪的电压为25V(恒压)，电流为300mA。电泳15min。 

(13)电泳后，取出载玻片用蒸馏水冲洗3次，并用吸水纸吸取多余的水分，将载玻片浸入pH7.5的Tris-HCl缓冲溶液中和15min。 

(14)中和后，用无水乙醇脱水1h，放于冰箱中，保持载玻片处于湿润状态。于一周内荧光分析。 

(15)载玻片EB染色20min后，用荧光显微镜观察，在自动曝光条件下拍照以获取彗星图像后，用CASP软件分析测定衡量DNA损伤的各种参数。 

4.微核实验 

(1)浸种催芽：将蚕豆放入盛有蒸馏水的的烧杯中，置25℃的温箱内浸泡24-36h。为保持湿度，种子吸胀后，用纱布松松包裹置解剖盘中，在25℃的温箱中催芽12h-24h。待种子初生根露出2-3mm时，选取发芽良好的种子，放入铺有薄层湿脱脂棉的解剖盘内，仍置于25℃的温箱中继续催芽，保持湿度。再经36-48h，种子大部分的初生根长至1.5-2cm，根毛发育良好，这时就可作为试验之用。 

(2)药剂处理根尖：每一处理选取6-8粒初始根生长良好、根长较一致的种子，放入盛有染毒液的培养皿中，让液体浸泡住根尖即可。染毒液为实施案例1中有机溶剂和去离子水提取出的滤液。同时设去离子水对照组。置25℃的温箱内培养，染毒时间为5h。 

(3)根尖细胞修复培养：将处理后的种子，用蒸馏水浸洗3次，洗净后的种子再放入新铺好的湿脱脂棉的解剖盘内，按前述培养条件使根尖细胞修复22-24h，亦可在培养皿中用蒸馏水浸住根尖修复培养。 

(4)固定根尖细胞：将修复培养后的种子，从根尖顶端切下1cm长的幼根放入空青霉素瓶中，加入卡诺氏固定液，固定24-48h。固定后的幼根如不及时制片，可放入浓度为70％的乙醇中，置4℃的冰箱内保存备用。 

(5)孚尔根染色：固定好的幼根，在青霉素瓶中用蒸馏水浸洗2次。吸净蒸馏水，再加入5mol/LHCl将幼根泡住，连瓶放入28℃水浴锅中水解幼根25min左右，视幼根软化的程度可适当增减时间，当幼根被软化即可。用蒸馏水浸洗幼根2次。在暗室或遮光的条件下加席夫试剂，每瓶用量以淹住幼根液面2mm为好。在遮光条件下染色4-6h。除去染液，用SO₂洗涤液浸洗幼根2次。 

(6)制片：将幼根放在载玻片上，用解剖针截下1mm的幼根。滴上少许的蒸馏水，用解剖针将根尖捣碎。加盖玻片，并避免气泡产生。 

(7)镜检：光学显微镜观察压片结果。微核识别的标准：是主核大小的1/3以下，并于主核分离的小核；小核着色与主核相当或稍浅；小核形态可为圆形、椭圆形、不规则形等。每一处理统计4个根尖，每个根尖统计1000个细胞。 

(8)结果与计算： 

测试样品微核千分率(‰)的计算为： 

5.实验结果 

(1)硫丹 

由附图1中可以看出，0.1，1.0，10.0mg/kg三个剂量组硫丹对蚯蚓体腔细胞DNA均有损伤作用，而且随着浓度的增加，彗星Olive尾矩的值随之增加，这说明DNA损伤程度随硫丹的剂量增加而增大。相同浓度处理下，水提和有机溶剂提取有明显的差异性(p<0.05)，而泥浆提取在低浓度下与水提取没有明显的差异性，高浓度时则与有机溶剂提取没有明显的差异性。从三个处理组各浓度间彗星Olive尾矩值增量比较，水提时，随着浓度的增加变化不明显，而有机溶剂和泥浆提取则随着硫丹剂量增加变化明显。因此，有机溶剂和泥浆提取土壤中的硫丹优于用水提取。值得注意的是，当硫丹浓度为10mg/kg时，泥浆提取方法中蚯蚓全部死亡。用有机溶剂提取时，由于有机溶剂本身会对蚯蚓造成一定的损伤，故空白组和低浓度硫丹组DNA损伤程度较大。综上，对于判断土壤中的硫丹对蚯蚓的生理毒性，低浓度时，适合于用泥浆提取，高浓度时可用有机溶剂提取。 

采用蚕豆根尖微核试验测定的不同提取方法提取土壤中硫丹对蚕豆根尖细胞微核率影响的试验结果见表1，由表1可见，硫丹能诱发一定频率的微核，3个不同浓度的硫丹所诱发的微核率均明显高于对照组。有机溶剂提取出的硫丹对蚕豆根尖细胞的微核率各处理浓度均大于水提组。因此，对于判断土壤中的硫丹对蚕豆的生理毒性，有机溶剂提取方法更适用。 

综合蚯蚓彗星实验与蚕豆微核实验结果，用有机溶剂更适合于提取土壤中残留硫丹。 

表1不同提取方法中硫丹对蚕豆根尖细胞微核率(‰)的影响 

(2)啶虫脒 

由附图2可以看出，0.05，0.1，0.5mg/kg三个剂量组啶虫脒对蚯蚓体腔细胞DNA的损伤程度随着浓度的增加而增大。相同浓度处理下，水提和有机溶剂提取有明显的差异性(p<0.05)，而泥浆提取与水提取没有明显的差异性，与有机溶剂提取差异性显著。从三个处理组各浓度间彗星Olive尾矩值增量比较，随着浓度的增加各组的变化均显著。因此，三种方法均可用于提取土壤中的啶虫脒残留毒性。然而，用有机溶剂提取时，有机溶剂本身对蚯蚓有损伤作用，对照组较其他两种方法呈现较大的DNA损伤，从这点比较，水提优于有机溶剂。另一方面，随着啶虫脒浓度增大时，泥浆提取造成的蚯蚓体腔细胞DNA损伤变化不如水提的显著，因此，泥浆提取土壤中啶虫脒残留毒性的灵敏度不如有水提取。综上，虽然三种方法均可用于提取土壤中啶虫脒的残留毒性，但水提方法较另外两种方法更适合于提取土壤中的啶虫脒残留毒性。 

采用微核试验测定的不同提取方法提取土壤中啶虫脒对蚕豆根尖细胞微核率影响的试验结果见表8，由表8可见，啶虫脒能诱发一定频率的微核，3个不同浓度的啶虫脒所诱发的微核率均明显高于对照组。有机溶剂提取出的啶虫脒对蚕豆根尖细胞的微核率各处理浓度均大于等于水提组，然而，由于有机溶剂本身会对蚕豆造成一定的损伤，故空白组和低浓度啶虫脒组微核率较大，其各组间的差异性显著不如水提组。因此，对于判断土壤中的啶虫脒对蚕豆的生理毒性，用水提取方法更适用。 

综合蚯蚓彗星实验与蚕豆微核实验结果，用水提取方法更适合于提取土壤中啶虫脒的残留毒性。 

表2不同提取方法中啶虫脒对蚕豆根尖细胞微核率(‰)的影响 

(3)莠去津 

采用彗星试验测定的不同提取方法提取土壤中莠去津对蚯蚓体腔细胞DNA损伤的试验结果见附图3，由图3可以看出，0.1，0.5，2.5mg/kg三个剂量组莠去津对蚯蚓体腔细胞DNA的损伤程度随着浓 度的增加而增大。相同浓度处理下，水提和有机溶剂提取有明显的差异性(p<0.05)；除0.1mg/kg剂量组外，泥浆提取与水提取没有明显的差异性，与有机溶剂提取差异性显著。从三个处理组各浓度间彗星Olive尾矩值增量比较，随着浓度的增加各组的变化均显著。因此，三种方法均可用于提取土壤中的莠去津残留毒性。但是，低浓度时，由于有机溶剂对蚯蚓体腔细胞的DNA损伤较大，对比对照处理组损伤不显著，故在低浓度时，不适合采用有机溶剂提取土壤中莠去津残留毒性。 

采用微核试验测定的不同提取方法提取土壤中莠去津对蚕豆根尖细胞微核率影响的试验结果如表3，莠去津能诱发一定频率的微核，3个不同浓度的莠去津所诱发的微核率均明显高于对照组。有机溶剂提取出的莠去津对蚕豆根尖细胞的微核率各处理浓度均大于等于水提组，但综合考虑有机溶剂本身对蚕豆的损伤，在低浓度时，用水提取方法更适合于提取土壤中莠去津浓度，而较高浓度时，则应采用有机溶剂提取方法。 

综合蚯蚓彗星实验与蚕豆微核实验结果，当土壤中莠去津浓度较低时，用水提或者用泥浆提取更适合于提取土壤中莠去津的残留毒性；当莠去津浓度较高时，则有机溶剂提取方法更为适用。 

表3不同提取方法中莠去津对蚕豆根尖细胞微核率(‰)的影响 

(4)吡虫啉 

采用彗星试验测定的不同提取方法提取土壤中吡虫啉对蚯蚓体腔细胞DNA损伤的试验结果见附图4，由图4可以看出，0.1，0.5，1mg/kg三个剂量组吡虫啉对蚯蚓体腔细胞DNA的损伤程度随着浓度的增加而增大。相同浓度处理下，水提和有机溶剂提取有明显的差异性(p<0.05)；泥浆提取在对照组中与水提组没有明显的差异性，在吡虫啉0.1，0.5，1mg/kg三个剂量组则与水提组差异性显著，并且随着吡虫啉浓度的增大，泥浆提取方法的Olive尾矩值不断增大，逐渐接近有机溶剂组对蚯蚓造成的DNA损伤，而与有机溶剂方法呈现从显著性差异到不显著差异再到显著性差异。从三个处理组各浓度间彗星Olive尾矩值增量比较，随着浓度的增加泥浆提取方法最为显著，该方法对测定土壤中吡虫啉敏感性最强。因此，泥浆提取方法较另外两种方法更适合于提取土壤中的吡虫啉残留毒性。 

采用微核试验测定的不同提取方法提取土壤中吡虫啉对蚕豆根尖细胞微核率影响的试验结果如表4，吡虫啉能诱发一定频率的微核，3个不同浓度的吡虫啉所诱发的微核率均明显高于对照组。有机溶剂提取出的吡虫啉对蚕豆根尖细胞的微核率各处理浓度均大于等于水提组，然而，由于有机溶剂 本身会对蚕豆造成一定的损伤，故空白组和低浓度吡虫啉组微核率较大，其各组间的差异性显著不如水提组。因此，对于判断土壤中的吡虫啉对蚕豆的生理毒性，水提更适用。 

综合蚯蚓彗星实验与蚕豆微核实验结果，对于可以直接暴露染毒的生物如蚯蚓，泥浆直接暴露染毒法较为敏感，更适用于测定土壤中吡虫啉的残留毒性；而对于不能暴露染毒的植物如蚕豆，可以采用水提取的方法。 

表4不同提取方法中吡虫啉对蚕豆根尖细胞微核率(‰)的影响 

6.总结 

综合上述实验结果，对于以硫丹和莠去津为代表的脂溶性农药，当土壤中该类农药的残留较低时，用水提法或者泥浆直接暴露染毒法较为合适；但当土壤中该类农药的残留浓度较高时，则应选用有机溶剂提取方法。对于以吡虫啉和啶虫脒为代表的水溶性农药，用水直接从土壤中提取或者泥浆暴露染毒法都能很好的测定该类农药在土壤中的残留毒性。综上，无论是脂溶性农药还是水溶性农药，泥浆直接暴露染毒法都是很好的测定农药在土壤中残留毒性的一种方法。但是，泥浆直接暴露染毒法有一定的限制性：它需要较多的受试土壤；受试物必须为生物，如蚯蚓等活体动物，不能用于蚕豆等植物的检测；土壤中农药的浓度不宜过大，否则会直接导致受试生物的死亡。当实验条件和实验指标不能满足泥浆暴露染毒的要求时，建议对于脂溶性农药或降解产物以脂溶性为主的农药可采用本研究中所述的有机溶剂法，相反，对于水溶性农药或降解产物以水溶性为主的农药则采用水提法。 

实施例3本发明在硫丹降解动态过程中的应用 

将培养好的菌株在低温冷冻离心机中，15℃条件下8000rpm离心8min，离心结束后，倒掉上清液，收集离心管底部沉淀，即湿菌体，将湿菌体用20mL(pH 7.0)的0.05mol/L磷酸盐缓冲液(Na₂HPO₄-NaH₂PO₄)洗涤组分3次，在上述条件下再离心8min，然后用0.05mol·L^-1磷酸盐缓冲液与湿菌体按质量比3:1旋涡振荡混匀制备成硫丹降解菌菌悬液。取40个125ml的棕色瓶，分成2个试验组:一组为土壤添加硫丹，另一组为土壤添加硫丹和硫丹降解菌，每组各设20个棕色瓶，两个试验组的棕色瓶中均加入20g土壤，再向土壤中加入0.5mL丙酮配制的浓度为2mg/ml的硫丹工作液，使土壤中硫丹含量为50mg/kg，混合均匀并使丙酮充分挥发，用棉塞封口，其中添加硫丹降解菌的试验组在其中加入混匀的硫丹降解菌菌悬液，使得硫丹降解菌菌悬液在土壤中的添加量为108cells mL^-1。 调节土壤含水量至田间最大持水量的60％左右，混均后，置于25℃恒温生化培养箱中进行黑暗培养，培养过程中损失的水分每天通过称重法给予补充。处理后第3、21、49、77d随机挑取3个棕色小瓶，取土样测定硫丹降解前后残留毒性变化。 

运用实施例1中提及的有机溶剂提取方法提取土壤中降解后的残留硫丹及其降解产物，提取液用于滤纸法染毒待试蚯蚓，测定生态毒性变化指标为实施案例2中提及的彗星实验。实验结果如图5。由图5可以看出，不同处理组硫丹对蚯蚓体腔细胞细胞DNA均有损伤作用，而且随着时间的延长，Olive尾矩的值随之减少，这说明DNA损伤程度随土壤中残留硫丹的不断降解而逐渐减小。相同时间处理下，接种硫丹降解菌菌株处理组彗星Olive尾矩的值明显小于未接种硫丹降解菌菌株处理组彗星Olive尾矩的值，且差异性明显(P<0.05)，这说明硫丹降解菌加快了土壤中残留硫丹的降解，因此减小了土壤硫丹的遗传毒性。可见，在硫丹降解的运用实例中，本发明涉及的有机溶剂提取方法，可以灵敏有效地评价硫丹降解过程中在土壤中残留毒性的变化情况。 

Claims (1)

1.一套评价土壤中农药残留毒性变化的方法，其特征在于是根据土壤中残留农药的性质不同而采取不同的提取步骤：

1)当土壤中残留农药及其降解产物以脂溶性农药占主导时，采取有机溶剂提取方法：

a提取农药残留物：取20g试验土样用石油醚∶丙酮体积比为1∶1的石油醚丙酮混合液120mL，在索氏提取器中先浸泡12h后75℃抽提6h，提取液浓缩至1mL得到土壤提取液；

b验证农药残留物的基因毒性：将土壤提取液均匀滴加到中性滤纸上，待石油醚丙酮混合液挥发后，吸取2ml的去离子水滴至中性滤纸，将3条蚯蚓放到中性滤纸上染毒12h，后将蚯蚓使用彗星实验检测试验土样中农药残留物；

c验证农药残留物的生态毒性：选取初始根生长良好、根长度一致的蚕豆种子，放入土壤提取液中，让土壤提取液液体浸泡住蚕豆种子根尖染毒5h；待土壤提取液挥发后，将染毒5h后的蚕豆种子使用微核实验检测试验土样中农药残留物的生态毒性；

2)当土壤中残留农药及其降解产物的性质以水溶性农药占主导时，采取去离子水提取方法：

a提取农药残留物：取20g试验土样，按照水：土壤体积比为1:2.5加入50mL去离子水，振荡6h，然后在5000rpm/min条件下离心5min，取上清液，得到土壤提取液；

b验证农药残留物的基因毒性：取2mL土壤提取液，均匀滴加到中性滤纸上；将3条蚯蚓放到中性滤纸上染毒12h；将染毒12h后的蚯蚓使用彗星实验检测试验土样中农药残留物；

c验证农药残留物的生态毒性：选取初始根生长良好、根长度较一致的蚕豆种子，放入土壤提取液中，让土壤提取液浸泡住根尖染毒5h；将染毒5h后的蚕豆种子使用微核实验检测试验土样中农药残留物；

3)当土壤中残留的脂溶性农药与水溶性农药比例接近或不清楚土壤中哪类性质的农药占主导时，采取泥浆直接暴露染毒法：

取100g试验土样，加入30mL去离子水，混合均匀后放入三只蚯蚓，蚯蚓暴露染毒48h；染毒结束将蚯蚓取出，放在用4℃生理盐水浸湿的滤纸上饥饿清肠12h，使其吐去肠内杂物；将该蚯蚓使用彗星试验检测试验土样中农药残留物的基因毒性。