CN104195053A - 一株紫玉盘内生真菌节菱孢及其用途 - Google Patents

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本发明公开了一株紫玉盘内生真菌节菱孢及其用途。该节菱孢(Arthrinium sp.)A092于2014年7月21日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址：中国武汉市武汉大学，保藏号为：CCTCCNO: M 2014348。该节菱孢提取物具有明显的清除DPPH自由基的活性，清除能力与维生素C相当，能用于制备DPPH自由基清除剂，因此，节菱孢A092提取物在制备抗氧化药品、保健品及护肤品中具有广阔的应用开发前景。

Description

一株紫玉盘内生真菌节菱孢及其用途
技术领域：
本发明属于生物和医药技术领域，具体涉及一株紫玉盘内生真菌节菱孢(Arthrinium sp.)A092及其用途。 
背景技术：
自由基和人类多种疾病有着密切的关系，如果体内自由基过多，则可引起蛋白质、核酸(DNA)变性，导致细胞和组织器官损伤，诱发各种疾病，加速机体衰老。同时，自由基过量产生也是导致皮肤自然衰老和光致老化的主要原因，减少自由基的产生和清除老化代谢产物已成为目前延缓人体和皮肤衰老的有效方法。由于在药品、保健食品和护肤品中使用的合成抗氧化剂通常具有毒副作用，因此，寻找天然、高效、低毒的抗氧化剂成为了一种必然趋势。 
植物内生真菌(Endophytic fungi)是指在其生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物的各种组织和器官内部的真菌。植物内生真菌作为一种新的微生物资源引起了广泛关注，已从中分离出多种生物活性物质，包括抗菌、抗肿瘤、抗氧化等天然化合物，其中不少是新物质，具有特殊生物活性，在医药、保健品和护肤品等各个领域都展现出良好的应用前景，而且植物内生真菌是一类可持续利用的资源，对自然资源破坏极少，能够解决自然资源不足的问题。 
在文献“Bloor S.Arthrinic acid,a novel antifungal polyhydroxyacid from Arthrinium phaeospermum[J].The Journal of Antibiotics,2008,61(8),515-517.”中，作者报道了节菱孢属真菌能产生结构新颖的抗真菌代谢产物；在“专利CN101294137B”中，章初龙等从水蓼Polygonum  hydropiper L.中分离得到的一株节菱孢Arthrinium sp.，并从该菌株的代谢产物中获得的2,3β-羟基卷线孢菌素对芽孢杆菌(Bacillus sp.)具有抑制作用，最低抑制浓度为50μg/mL；在文献“Jung HJ,Shim JS,Song YM,et al.Terpestacin inhibits tumor angiogenesis by targeting UQCRB of mitochondrial complex III and suppressing hypoxia-induced reactive oxygen species production and cellular oxygen sensing[J].Journal of Biological Chemistry,2010,285(15):11584-11595.”)中，作者则报道了此属真菌的代谢产物具有细胞毒活性。但到目前为止尚未有关于节菱孢属(Arthrinium)代谢产物具有抗氧化活性的报道。 
发明内容：
本发明的第一个目的是提供一株节菱孢(Arthrinium sp.)A092，其于2014年7月21日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国武汉市武汉大学，保藏号为：CCTCC NO: M2014348。 
本发明的节菱孢A092是从药用植物紫玉盘叶中分离得到，其分离方法为：取新鲜健康的紫玉盘叶，用自来水冲洗干净，置于滤纸上自然风干后放入0.1％的升汞溶液中浸泡5～7min，用无菌水漂洗4次，再放入75％的乙醇中浸泡3～5min，用无菌水漂洗3次。剪去接触药液边缘，将叶片剪成约0.5×0.5cm大小，置于含20μg/mL硫酸卡那霉素和20μg/mL氨苄青霉素的PDA培养基中，28℃恒温箱培养3～7d后挑取边缘菌丝转接到新鲜培养基上，继续纯化获得纯菌株节菱孢A092。所述的PDA培养基是每升通过以下方法获得：用500mL蒸馏水煮200g马铃薯20min，过滤得汁，再加入葡萄糖20g、KH2PO43g、MgSO40.75g、维生素B110mg，琼脂20g，用水补足至1L，pH自然。 
本发明的节菱孢A092，其在PDA培养基上的生长温度为28℃，气生菌丝发达，初为白 色，棉絮状；培养3天后，菌落直径为60mm，边缘轮廓清晰，背面中间浅灰褐色；培养7天后，菌丝长满整个平板，正面灰白色，背面中间灰绿褐色。菌丝有隔，产孢细胞圆柱形或瓶形，8.16～23.33×0.84～3.34μm；分生孢子球形、近球形、椭圆形，未成熟的分生孢子无色，成熟后变为褐色至深褐色，中间有一条淡色条带，4.83～8.16×2.23～6.67μm。 
根据常规方法提取该菌株的DNA，并利用真菌的ITS区的通用引物扩增其ITS区，其ITS区的碱基序列如SEQ ID NO.1所示，通过在GenBank中进行blast检索，与其相似度最高的序列(登录号为：AY425967)为节菱孢(Arthrinium sp.)，相似度达99.1％。根据ITS序列分析结果，该菌株被鉴定为(Arthrinium sp..)，命名为节菱孢(Arthrinium sp.)A092。 
本发明的第二个目的是提供上述节菱孢A092在制备DPPH自由基清除剂中的应用。 
本发明的第三个目的是提供一种具有DPPH自由基清除活性的节菱孢A092提取物，其是以节菱孢A092为菌株，通过液体发酵培养获得发酵液，发酵液用乙酸乙酯萃取，萃取液浓缩后获得节菱孢A092提取物。 
本发明的第四个目的是提供一种DPPH自由基清除剂，其特征在于，其是以上述节菱孢A092提取物作为活性成分。 
本发明的节菱孢A092提取物，通过实验发现，该提取物在500μg/mL浓度下对DPPH自由基的清除率为95.31％，同样浓度下，阳性对照药物维生素C对DPPH自由基的清除率为99.12％。由实验结果可以看出：节菱孢A092提取物具有明显的清除DPPH自由基活性，清除DPPH自由基的能力与维生素C相当，能用于制备DPPH自由基清除剂，因此，节菱孢A092提取物在制备抗氧化药品、保健品及护肤品中具有广阔的应用前景。 
节菱孢(Arthrinium sp.)A092于2014年7月21日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTC  C)，地址：中国武汉市武汉大学，保藏号为：CCTCC NO: M 2014348。 
附图说明：
图1为本发明的节菱孢A092菌株在PDA培养基中的菌落特征图，其中A、B、C分别为培养3天背面图、培养7天背面图、培养7天正面图。 
图2为本发明的节菱孢A092菌株的产孢细胞和分生孢子图。 
具体实施方式：
以下通过具体实施例来对本发明进一步说明，但并非限制本发明。 
实施例1：节菱孢A092的分离培养： 
节菱孢A092是从采自广东肇庆市鼎湖山自然保护区的药用植物紫玉盘的叶中分离得到，其分离方法为：取新鲜健康的紫玉盘叶，用自来水冲洗干净，置于滤纸上自然风干后放入0.1％的升汞溶液中浸泡5～7min，用无菌水漂洗4次，再放入75％的乙醇中浸泡3～5min，用无菌水漂洗3次。剪去接触药液边缘后，剪成约0.5×0.5cm大小，置于含20μg/mL硫酸卡那霉素和20μg/mL氨苄青霉素的PDA培养基中，28℃恒温箱培养3～7d后挑取边缘菌丝转接到新鲜培养基上，继续纯化获得纯菌株节菱孢A092。所述的PDA培养基是每升通过以下方法获得：用500mL蒸馏水煮200g马铃薯20min，过滤得汁，再加入葡萄糖20g、KH2PO43g、MgSO40.75g、维生素B110mg，琼脂20g，用水补足至1L，pH自然。 
本发明的节菱孢A092形态特征如下： 
如图1和图2所示，该菌株在PDA培养基上的生长温度为28℃，气生菌丝发达，初为白色，棉絮状；培养3天后，菌落直径为60mm，边缘轮廓清晰，背面中间浅灰褐色；培养7天后，菌丝长满整个平板，正面灰白色，背面中间灰绿褐色。菌丝有隔，产孢细胞圆柱形或瓶形， 8.16～23.33×0.84～3.34μm；分生孢子球形、近球形、椭圆形，未成熟的分生孢子无色，成熟后变为褐色至深褐色，中间有一条淡色条带，4.83～8.16×2.23～6.67μm。 
根据常规方法提取该菌株的DNA，并利用真菌的ITS区的通用引物扩增其ITS区，其ITS区的碱基序列如SEQ ID NO.1所示，通过在GenBank中进行blast检索，与其相似度最高的序列(登录号为：AY425967)为节菱孢(Arthrinium sp.)，相似度达99.1％。根据ITS序列分析结果，该菌株被鉴定为(Arthrinium sp.)，命名为节菱孢(Arthrinium sp.)A092。 
该节菱孢(Arthrinium sp.)A092于2014年7月21日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国武汉市武汉大学，保藏号为：CCTCC NO: M 2014348。 
实施例2：节菱孢A092提取物的制备 
将节菱孢A092在PDA培养基上28℃活化培养5d后接种到马铃薯液体培养基(PDB)中，120r/min，28℃培养7d，收集去除菌丝体后的滤液，滤液用乙酸乙酯萃取3次，萃取液经减压浓缩即为节菱孢A092提取物。所述的PDB培养基是每升通过以下方法获得：用500mL蒸馏水煮200g马铃薯20min，过滤得汁，再加入葡萄糖20g、KH2PO43g、MgSO40.75g、维生素B110mg，用水补足至1L，pH自然。灭菌备用。 
实施例3：节菱孢A092清除DPPH自由基能力的测定 
将实施例2获得的节菱孢A092提取物和维生素C用无水乙醇分别配成500μg/mL溶液，DPPH用无水乙醇配成0.2mmoL/L溶液。吸取100μL节菱孢A092提取物溶液于96孔板中，加入100μL DPPH溶液作为样品组，以无水乙醇作为空白对照组，以无水乙醇代替DPPH溶 液作为样品背景组，以无水乙醇代替节菱孢A092提取物溶液作为阴性对照组，以维生素C代替节菱孢A092提取物溶液作为阳性对照组，置30℃培养箱中反应30min，用酶标仪测定每孔517nm处吸光值(A)，按以下公式计算DPPH自由基的清除率％： 
清除率％＝[1-(A样品-A样品背景)/(A阴性对照-A空白对照)]×100％ 
实验结果为：在相同浓度条件下，节菱孢A092提取物对DPPH自由基清除率为95.31％，维生素C对DPPH自由基清除率为99.12％。从实验结果可以看出，节菱孢A092提取物具有明显的清除DPPH自由基的能力，其清除能力与维生素C相当，能用于制备DPPH自由基清除剂，因此，节菱孢A092提取物在制备抗氧化药品、保健品及护肤品中具有广阔的应用开发前景。 

Claims (4)

1.节菱孢(Arthrinium sp.)A092，其保藏号为：CCTCC NO:M 2014348。 
2.权利要求1所述的节菱孢A092在制备DPPH自由基清除剂中的应用。 
3.一种具有DPPH自由基清除活性的节菱孢A092提取物，其特征在于，其是以权利要求1所述的节菱孢A092为菌株，通过液体发酵培养获得发酵液，发酵液用乙酸乙酯萃取，萃取液浓缩后获得节菱孢A092提取物。 
4.一种DPPH自由基清除剂，其特征在于，其是以权利要求3所述的节菱孢A092提取物作为活性成分。 
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