CN104190387A - 一种除液体中热原的凝胶及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种除液体中热原的凝胶及其制备方法和应用，Sepharose6B经CNBr活化后，将组氨酸作为配位基结合于CNBr-Sepharose6B上，通过与细菌内毒素的类脂A相结合，达到去除液体中热原的目的。该凝胶对于氨基酸、糖、抗生素、维生素、蛋白酶、抗体、血液制品等含有的细菌内毒素能有选择地去除，去除率大于90%，且对蛋白质无吸附作用。

Description

一种除液体中热原的凝胶及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种除液体中热原的凝胶及其制备方法和应用。

背景技术

热原是指注射剂中存在的一种异物，注射于人体时，可产生寒颤、高热甚至休克等不良反应，其主要来源为革兰氏阴性菌产生的细菌内毒素。微量的细菌内毒素0.03EU/ml（相当于10pg/ml）对人体器官有损害（人体1-5ng/kg就能引起人的体温上升）。如果大量的细菌内毒素进入人体，可以引起人体的休克，甚至死亡。所以当药品经注射进入人体血液中时，要严格控制注射药品中细菌内毒素。中国药典根据各种药品注射进入人体的量，制定了各种药品的细菌内毒素允许含量的限度值。

细菌内毒素为脂多糖，由磷脂多糖、蛋白质构成的复合物，其毒性成份主要为类脂A，单体分子量为10000-20000道尔顿，聚合体分子量可达100000-500000道尔顿。虽然它的分子量较大，但结构是条索状，因此很难用过滤方法除去细菌内毒素。比如0.2μm的滤膜都不能完全过滤细菌内毒素。它的化学结构为三个部分组成：特异侧链（抗原）；核心多糖；类脂A。核心多糖和类脂A之间的葡萄糖胺二糖通过焦磷酸酯键组成的糖脂化合物。它必须在180℃干热灭菌2小时或200℃干热灭菌1小时方能完全除去。

由于它是革兰氏阴性细菌内毒素。而革兰氏阴性菌在自然环境中比比皆是，因此在制药行业中是最主要的外源性污染。而药品如化学药品、血液制品在生产制备过程中经常会混入细菌内毒素。如果用高压灭菌、最高温度为121℃，也达不到完全除去热原。只能当水中内毒素含量小于0.03EU/ml时，高压灭菌方法，使内毒素结构断裂成碎片，减弱它的致热性。但时常高压数日后它们断片又开始聚合，又恢复它的致热性。而血液制品更不能加热。因此，在如何除去液体中细菌内毒素是制药行业中极为头痛的问题。曾经有人想用活性炭除去各种注射原料中的细菌内毒素，但药用活性炭吸附内毒素能力有限，它只能吸附大的聚合体内毒素。许多血液制药品要求内毒素限制值小于0.25EU/ml甚至小于0.03EU/ml以下。这是用活性炭吸附远远达不到的。活性炭吸附水质中细菌内毒素只能达到1EU/ml以上。而且对蛋白质和血液制品，活性炭本身会吸附蛋白质，因此此法不适合用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种除液体中热原的凝胶及其制备方法和应用，该凝胶对于氨基酸、糖、抗生素、维生素、蛋白酶、抗体、血液制品等含有的细菌内毒素能有选择地去除，去除率大于90%，且对蛋白质无吸附作用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种除液体中热原的凝胶：Sepharose 6B经CNBr活化后，将组氨酸作为配位基结合于CNBr-Sepharose 6B上。

制备方法包括以下步骤：

1）取CNBr-Sepharose6B干燥粉末于1mM HCl溶液中膨润15分钟，得到的凝胶置于玻璃砂芯漏斗上，用1mM HCl洗涤，再用0.1M NaHCO₃溶液洗净；

2）取6g L-histidin盐酸盐溶解于100ml 0.1M NaHCO₃ 溶液中，并用5M NaOH溶液调节pH=9.5；

3）取40ml步骤 1）的凝胶加入到100ml步骤2）的溶液中，25℃-30℃振动处理16小时，过滤，将所得凝胶加入到50ml 1M NaCl溶液中，室温下振动30分钟；

4）用玻璃砂芯漏斗过滤，所得凝胶用1M NaCl溶液和水各200ml交替洗涤，4℃-8℃保存。

所述的凝胶通过层析柱法或试管搅拌法除液体中细菌内毒素。

本发明的显著优点在于：制得的凝胶对于氨基酸、糖、抗生素、维生素、蛋白酶、抗体、血液制品等含有的细菌内毒素能有选择地去除，去除率大于90%，且对蛋白质无吸附作用。

附图说明

图1是白蛋白标准品的标准曲线图。

具体实施方式

具有与内毒素结合官能团的凝胶的制备

要制备凝胶结合体使其具有与内毒素的类脂A相结合的电位基的官能团，我们采用经CNBr活化的Sepharose 6B，让组氨酸作为配位基结合于CNBr-Sepharose 6B上。

方法：

1、凝胶的膨润及洗涤：

取一定量CNBr-Sepharose6B干燥粉末于1mM HCL中膨润15分钟。然后将凝胶置于玻璃砂芯漏斗上，再用1mM HCL洗涤（1g约用200ml的1mM HCL）。

1g干粉约可得3.5ml膨润凝胶。

2、取L-histidin盐酸盐6g溶解于0.1M 100ml的NaHCO₃ 溶液中，并用5M NaOH调pH9.5（A液）。

3、将以上膨润的CNBr-Sepharose6B用冷却的0.1M的NaHCO₃ 1L洗净。（在砂芯漏斗中洗净）

4、取洗净的CNBr-Sepharose6B 40ml加入100ml A液中混合，于25℃-30℃振动16小时。

5、接着用过滤器过滤以上溶液。

6、取过滤后的凝胶结合体，混悬于50ml 1M NaCL中，并在室温下振动30分钟。

7、再用玻璃砂芯漏斗过滤。

8、用1M NaCL 200ml与水200ml 交替洗凝胶结合体。

9、以上方法形成L-histidin-Sepharose6B凝胶结合体（以下简称D-pyroGel）固定化量为0.26mmol/ml。

10、制备好的histidine-Sepharose-6B 4℃-8℃保存。

D-pyroGel的物理性质及性能

1、白色或微黄白色球状颗粒，粒径约160μm。

2、适应pH范围（pH3-11）。

3、本凝胶属于亲和层析，对于氨基酸、糖、抗生素、维生素、蛋白酶、抗体、血液制品等含有的细菌内毒素能有选择去除。

以下实验所有器具均应经过无菌无热原处理

（一）柱除热原方法及前处理

1、采用层析柱r=7.5mm   H=80mm   V=14cm3

2、柱及D-pyroGel除热原方法

凝胶加酒精碱（4%NaOH酒精），过夜

3、用4倍柱体积的无菌无热原水56ml洗柱。

4、加0.2N醋酸30ml洗柱

5、加无菌无热原水80ml洗柱

6、加1M Nacl 60ml洗柱

7、加280ml无菌无热原水洗柱

8、加0.1M Tris-HCl pH7.5 140ml 平衡化柱

（二）测定牛血清白蛋白原液（250mg/ml）细菌内毒素含量

取原液1ml（约250mg/ml）+24ml水=25ml（约10mg/ml）

用灵敏度0.06 Eu/ml、0.25mg/ml的鲎试剂定量内毒素。

结果如下：

半定量计算：0.125 Eu/ml×25=3.125 Eu/ml

说明250mg/ml原液中含细菌内毒素为3.125 Eu/ml

（三）加样品入柱处理25%牛血清白蛋白2.3ml（v/6）

1、牛血清白蛋白用0.1M pH7.5 的 Tris-HCl pH7.5缓冲液溶解使成250mg/ml。

2、加入2.3ml（250mg/ml）牛血清白蛋白入柱，静置3小时让样品中内毒素与柱中凝胶充分结合.

3、加洗脱液0.1M Tris- HCl pH7.5 洗脱，并用试管收集。收集洗脱液共计16ml。

4、低温冷冻干燥。冻干品加2.3ml无菌无热原水复溶

（四）测定复溶溶液的细菌内毒素

取过柱复溶后溶液1ml（约250mg/ml）+24ml水=约10mg/ml

用灵敏度0.015 Eu/ml、0.03 Eu/ml、0.06 Eu/ml的鲎试剂测定内毒素。

半定量结果如下：

说明：过柱吸附内毒素后的样品稀释25倍后细菌内毒素含量＜0.015 Eu/ml。0.015 Eu/ml×25=0.375 Eu/m。这说明吸附后的样品内毒素＜0.375 Eu/ml。

过柱前原液内毒素含量为3.125 Eu/ml，（3.125-0.375）/100%=90%经计算内毒素除去率大于90%。

（五）样品总蛋白回收率计算

将过柱后样品原液稀释1000倍，用Lowry法测定其蛋白的含量

先用白蛋白标准品做标准曲线，如图1。

结果：

样品OD值为0.0982，代入标准曲线公式y=0.035x+0.0142计算得样品总蛋白为24μg。

24μg×1000=240mg/ml  蛋白的回收率为240/250×100%=96%。

（六）试管搅拌法除细菌内毒素操作：

以下一切所使用的器具均为无菌无热原处理。如果玻璃器具用250℃1小时除内毒素，如果是橡皮塞等就采用酒精碱法除热原。

1、取无菌无热原试管一支，加入已经除去热原试管一支，加入已经除去细菌内毒素D-pyroGel凝胶。加入凝胶量为样品重量的10倍或20倍。

2、用20rpm转速搅拌1小时

3、静置后用针头吸取样品上清液

4、用MF膜过滤上清液样品

5、用鲎试验法测定所含细菌内毒素

少量样品时，搅拌法吸附细菌内毒素

（七）凝胶的再生处理

1、在凝胶D-pyroGel中加入它体积三倍量的酒精碱再生液，静置过夜。

2、将凝胶置柱上，用4倍体积无菌无热原水洗凝胶。

3、用2倍柱体积的0.2N醋酸洗凝胶。

4、再用5倍柱体积的无菌无热原水洗凝胶。

5、用5倍柱体积1M NaCL水溶液洗柱。

6、用20倍柱体积无菌无热原水洗。

7、进入平衡化程序，用10倍柱体积平衡化缓冲液平衡化

（八）凝胶D-pyroGel保存

以上洗脱凝胶若不再使用，就不用加平衡化Baffer，而按以下操作

1、用柱体积4倍的2M NaCL 过柱洗凝胶。

2、用10倍柱体积无菌无热原水洗柱。

3、将再生液（酒精碱）柱体积3倍量加入后，室温静置12小时以上。最长可放置4日。

4、如长时间保存，用2倍柱体积量20%酒精，加入柱内，并将出口密封，在3℃-8℃保存。

5、再生液的配制

用无菌无热原容器称1.6g NaOH，加入无菌无热原水160ml溶解，再加40ml酒精。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims (3)

1.一种除液体中热原的凝胶，其特征在于：Sepharose 6B经CNBr活化后，将组氨酸作为配位基结合于CNBr-Sepharose 6B上。

2.一种制备如权利要求1所述的除液体中热原的凝胶的方法，其特征在于：包括以下步骤：

1）取CNBr-Sepharose6B干燥粉末于1mM HCl溶液中膨润15分钟，得到的凝胶置于玻璃砂芯漏斗上，用1mM HCl洗涤，再用0.1M NaHCO₃溶液洗净；

2）取6g L-histidin盐酸盐溶解于100ml 0.1M NaHCO₃ 溶液中，并用5M NaOH溶液调节pH=9.5；

3）取40ml步骤 1）的凝胶加入到100ml步骤2）的溶液中，25℃-30℃振动处理16小时，过滤，将所得凝胶加入到50ml 1M NaCl溶液中，室温下振动30分钟；

4）用玻璃砂芯漏斗过滤，所得凝胶用1M NaCl溶液和水各200ml交替洗涤，4℃-8℃保存。

3.一种如权利要求1所述的除液体中热原的凝胶的应用，其特征在于：所述的凝胶通过层析柱法或试管搅拌法除液体中细菌内毒素。