一种抑制黑色素瘤细胞增殖的药物组合物
技术领域
本发明涉及一种抗肿瘤药物,尤其涉及一种抑制黑色素瘤细胞增殖的药物组合物,属于医药技术领域。
背景技术
黑色素瘤(Malignantmelanoma),是一种恶性程度较高的黑色素细胞肿瘤,多发生于皮肤,也见于接近皮肤的黏膜(如结膜、口腔、鼻腔、肛管、直肠、子宫颈、阴道、阴茎、龟头等)等。欧洲“2012年更新的黑色素瘤诊断和治疗指引”(UpdateoftheGuidelineontheDiagnosisandTreatmentofMelanoma)指出,黑色素瘤的发病率正在增加,在欧洲的发病率是10-20/105,在美国为20-30/105,在澳大利亚发病率达到了50-60/105。黄皮肤的中国人黑色素瘤发病率<1/105。据世界卫生组织(WHO)统计,每年死于皮肤癌的患者大约有66000人,其中80%死于黑色素瘤。晚期黑色素瘤患者的中位生存期为7-9个月,一年内生存率仅为25%。
虽然手术切除肿瘤是治疗绝大多数黑色素瘤患者的首选方法,但是在某些患者,如外科高风险患者、老幼患者和自身虚弱的病人,手术治疗会给他们带来巨大的副作用,术后也会容易遗漏微小病灶或转移病灶(残余肿瘤细胞),因此,药物治疗或局部药物治疗可能为部分黑色素瘤患者提供一种更好的预防和治疗选择。或者,术后结合药物治疗或局部药物治疗等辅助疗法,则能够有效防止术后患者病情的转移和复发,减少患者体内癌细胞的数量,达到延长生存期、提高生活质量的治疗目的。因此,寻找高效低毒的抑制黑色素瘤的候选药物在目前来说仍显得尤为重要。
全反式维甲酸(all-trans-retinoicacid,ATRA)为一长链带有六元脂肪环的不饱和酸,能够维持正常上皮细胞的分化,重建表皮形态,诱导表皮增生并纠正有害因素对真皮结缔组织生化成分及形态结构引起的异常,抑制炎症反应,还能调节皮肤黑色素生成、减轻皮肤色素沉着。此外,ATRA还能明显逆转表皮和皮下组织萎缩,使纤连蛋白和胶原迅速恢复。外用ATRA可以预防皮质类固醇所致的皮肤萎缩而不削弱其抗炎作用。然而,ATRA的不良反应较多,主要表现为口唇、皮肤干燥伴脱屑、消化道反应、头痛、头晕、关节酸痛。酸模属为蓼科一个大属,我国该属植物资源极为丰富,羊蹄RumexjaponicusHoutt.、皱叶酸模RumexcrispusL.、巴天酸模RumexpatientiaL.、尼泊尔酸模或牛耳大黄RumexnepalensisSpreng均称为土大黄,它们含有共性的化学成分如蒽醌、二苯乙烯和萘类等。酸模素-8-O-β-D-葡萄吡喃糖苷(Nepodin-8-O-β-D-glucopyranoside)便是其中的一种单体化合物。CN102038697A公开了一种含有酸模素-8-O-β-D-葡萄吡喃糖苷及其衍生物及可药用载体或赋形剂的药物,并披露该药物可用于抗焦虑。
目前,尚没有酸模素-8-O-β-D-葡萄吡喃糖苷抗黑色素瘤的文献报道,更没有将其与其他抗癌药联用后抗黑色素瘤的文献报道。
发明内容
为了发挥全反式维甲酸的抗肿瘤功效,同时降低其毒副作用,本发明人通过降低全反式维甲酸的用量,并将其与酸模素-8-O-β-D-葡萄吡喃糖苷联合应用,意外发现二者用药后不仅具有协同增效的抗肿瘤效果,而且酸模素-8-O-β-D-葡萄吡喃糖苷可减轻全反式维甲酸所致的不良反应。
基于此研究,本发明的目的在于提供一种抑制黑色素瘤细胞增殖的药物组合物。
本发明人通过体内外试验研究了酸模素-8-O-β-D-葡萄吡喃糖苷,以及将其联用全反式维甲酸对小鼠黑色素瘤细胞B16增殖的抑制活性,结果发现酸模素-8-O-β-D-葡萄吡喃糖苷能够在一定程度上抑制B16黑色素瘤细胞的增殖。因此,本发明的目的是这样实现的:一种抑制黑色素瘤细胞增殖的药物组合物,该药物组合物包含活性成分和药学上可用的辅料,其中的活性成分包括酸模素-8-O-β-D-葡萄吡喃糖苷。
虽然酸模素-8-O-β-D-葡萄吡喃糖苷能够在一定程度上抑制B16黑色素瘤细胞的增殖,但是对诱导B16细胞凋亡的作用并不明显。因此,本发明人创造性地将酸模素-8-O-β-D-葡萄吡喃糖苷与全反式维甲酸联合用药,结果发现联用后可以明显增加全反式维甲酸对B16黑色素瘤细胞增殖的抑制活性,同时酸模素-8-O-β-D-葡萄吡喃糖苷能够明显增强全反式维甲酸诱导B16黑色素瘤细胞的凋亡作用,这为黑色素瘤得到更有效的治疗提供了一种新的解决方案。
基于以上研究成果,本发明的目的还可以这样实现:所述抑制黑色素瘤细胞增殖的药物组合物中的活性成分包括酸模素-8-O-β-D-葡萄吡喃糖苷和全反式维甲酸。在本发明所优选的技术方案中,该药物组合物中的活性成分由酸模素-8-O-β-D-葡萄吡喃糖苷和全反式维甲酸组成。
本发明的药物组合物依靠酸模素-8-O-β-D-葡萄吡喃糖苷和全反式维甲酸作为活性成分发挥抑制黑色素瘤细胞增殖的作用,发明人通过大量试验对这两种组分的用量比进行了筛选,结果酸模素-8-O-β-D-葡萄吡喃糖苷和全反式维甲酸的质量用量比为10-200:1,再优选为20-100:1。事实上,为了降低全反式维甲酸的毒副作用,本发明更倾向于减少该活性成分的用量,因此在本发明最优选的体外实施例中,酸模素-8-O-β-D-葡萄吡喃糖苷和全反式维甲酸的质量用量比为50-100:1。
本发明人在以往的试验中均通过注射的方式给药并发挥了抑制黑色素瘤细胞增殖的药效,因此将该药物组合物制备成注射剂,所述的注射剂包括注射液、冻干粉针剂。另外,由于项目处于初期研究阶段,发明人尚没有常识其他给药方式,因此在没有证据证明非注射给药方式不能达到抑制细胞增殖的前提下,本发明的药物组合物可以为固体制剂或其他液体制剂。药物单位制剂可以是常规的制剂工艺制成药剂学可接受的任意常规剂型,例如胶囊剂、片剂、颗粒剂、散剂、口服液。为使上述剂型能够实现,需在制备这些剂型时加入药学可接受的辅料,例如:填充剂、崩解剂、润滑剂、助悬剂、粘合剂、甜味剂、矫味剂、防腐剂、基质等。填充剂包括:淀粉、预胶化淀粉、乳糖、甘露醇、甲壳素、微晶纤维素、蔗糖等;崩解剂包括:淀粉、预胶化淀粉、微晶纤维素、羧甲基淀粉钠、交联聚乙烯吡咯烷酮、低取代羟丙纤维素、交联羧甲基纤维素钠等;润滑剂包括:硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠、滑石粉、二氧化硅等;助悬剂包括:聚乙烯吡咯烷酮、微晶纤维素、蔗糖、琼脂、羟丙基甲基纤维素等;粘合剂包括,淀粉浆、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素等;甜味剂包括:糖精钠、阿斯帕坦、蔗糖、甜蜜素、甘草次酸等;矫味剂包括:甜味剂及各种香精;防腐剂包括:尼泊金类、苯甲酸、苯甲酸钠、山梨酸及其盐类、苯扎溴铵、醋酸氯乙定、桉叶油等;基质包括:PEG6000,PEG4000,虫蜡等。
另外,基于上述研究成果并结合本领域技术人员的普通技术知识,本发明还提供一种制药用途,即,酸模素-8-O-β-D-葡萄吡喃糖苷在制备抑制黑色素瘤细胞增殖的药物中的应用;以及酸模素-8-O-β-D-葡萄吡喃糖苷和全反式维甲酸组成的组合物在制备抑制黑色素瘤细胞增殖的药物中的应用。
与现有技术相比,本发明涉及的药物组合物具有如下优点和显著进步:酸模素-8-O-β-D-葡萄吡喃糖苷联用全反式维甲酸联用后具有协同抗黑色素瘤细胞增殖的效果,以及增强了全反式维甲酸诱导黑色素瘤细胞凋亡的生物活性。同时,酸模素-8-O-β-D-葡萄吡喃糖苷为天然提取产物,毒性非常小;全反式维甲酸用量仅仅为常规用量的二分之一,因此治疗费用、副作用和不良反应率必然降低。
附图说明
图1为酸模素-8-O-β-D-葡萄吡喃糖苷处理后细胞核形态图。
图2为全反式维甲酸处理后细胞核形态图。
图3为全反式维甲酸联用酸模素-8-O-β-D-葡萄吡喃糖苷处理后细胞核形态图。
具体实施方式
本发明人通过体内外试验研究了全反式维甲酸联用酸模素-8-O-β-D-葡萄吡喃糖苷对小鼠黑色素瘤细胞B16增殖的抑制活性,以下是具体的试验例,对本发明的技术方案和技术效果做进一步作解释和说明,但是本发明的保护范围并不限于该实施例。需要说明的是,以下各实施例中涉及的英文缩写“ATRA”代表全反式维甲酸,涉及的英文缩写“NG”代表酸模素-8-O-β-D-葡萄吡喃糖苷。
实施例1ATRA联用NG对B16细胞的增殖抑制试验研究
黑色素瘤B16细胞用含有10%胎牛血清的RPMI1640常规培养,37℃、5%CO2培养箱内培养,2~3d传代1次,实验用细胞培养12~18h获得处于对数生长期的细胞。取处于对数生长期的B16细胞,用胰酶消化后悬浮于RPMI1640培养液中,调整细胞的终浓度1×106/mL,接种于96孔板中,每孔100μL,细胞接种后,设立空白对照,仅用培养液。在培养箱内培养4h,后分别加入ATRA(0.5μg/mL)、NG(10μg/mL)、ATRA+NG(0.5μg/mL+10μg/mL),然后在37℃、5%CO2培养箱培养72h,在培养结束4h前加入10μLMTT(5mg/mL)标记液,继续培养4h后再加入100μLMTT溶解液,在培养箱内培养过夜后,在酶标仪570nm下测定吸光值(OD值),实验重复3次。细胞增长抑制率(%)=(1-实验孔平均OD值/对照孔平均OD值)×100%。试验统计结果参见表1。
通过表1的试验结果可以看出,与ATRA或NG单药处理相比,ATRA+NG对B16细胞增殖抑制作用更为明显,差异均有统计学意义(P<0.01),这预示着酸模素-8-O-β-D-葡萄吡喃糖苷可促进体外全反式维甲酸对B16细胞增殖抑制作用。
表1各给药组的细胞增长抑制率比较
与ATRA比较,★P<0.05,★★P<0.01;与NG比较,■P<0.05,■■P<0.01。
实施例2ATRA联用NG对B16细胞凋亡的试验研究
黑色素瘤B16细胞用含有10%胎牛血清的RPMI1640常规培养,37℃、5%CO2培养箱内培养,2~3d传代1次,实验用细胞培养12~18h获得处于对数生长期的细胞。取处于对数生长期的B16细胞,用胰酶消化后悬浮于RPMI1640培养液中,接种于6孔培养板(1×104/孔),在培养箱内培养4h后分别加入ATRA(0.5μg/mL)、NG(10μg/mL)、ATRA+NG(0.5μg/mL+10μg/mL),在37℃、5%CO2条件下继续培养48h后,进行Hochest染色,在荧光镜下观察细胞核形态变化。本发明采用上述步骤分别处理48h后,NG组细胞核边缘清晰、轮廓清楚(见图1),未见明显异常,ATRA组核边界模糊、可见部分碎裂的核(见图2),ATRA+NG组核碎裂的更加明显,数目进一步增加(见图3)。该试验结果与实施例1的MTT发检测结果一致,进一步说明酸模素-8-O-β-D-葡萄吡喃糖苷能够促进全反式维甲酸对B16细胞的的细胞核破坏,增强其凋亡诱导作用。
实施例3ATRA联用NG对小鼠移植瘤模型的抑瘤试验研究
C57BL/6小鼠,雌性,6~8周,随机分为如下四组:空白对照组、ATRA组、NG组、ATRA+NG组,每组8只。黑色素瘤B16细胞用含有10%胎牛血清的RPMI1640常规培养,37℃、5%CO2培养箱内培养,2~3d传代1次,实验用细胞培养12~18h获得处于对数生长期的细胞。将对数生长期的B16细胞浓度调至1×109/L,分别于各组小鼠左股骨外侧注入B16细胞悬液0.2mL(即2×105个细胞)。细胞接种1d后,各组分别腹腔注射给药,空白对照组注射生理盐水0.1mL/只,ATRA组注射ATRA10mg/kg,NG组注射NG50mg/kg,ATRA+NG组注射ATRA5mg/kg及NG25mg/kg,共给药1次。观察肿瘤出现的时间及生长速度,用游标卡尺测量小鼠皮下肿瘤结节,结果用二垂直方向的平均直径表示。
表2各给药组的成瘤时间和肿瘤大小比较
与空白对照组比较,▲P<0.05,▲▲P<0.01;与ATRA组比较,★P<0.05,★★P<0.01;与NG组比较,■P<0.05,■■P<0.01。
通过表2的试验结果可以看出,与空白对照组比较,各给药组在一定程度上使B16细胞成瘤延迟,肿瘤生长缓慢,延长了成瘤时间,尤其是ATRA单药组和联合用药组的效果更为明显(P<0.05、P<0.01)。另外,空白对照组、ATRA组和NG组在接种第20天时肿瘤结节均大于20mm,而ATRA+NG组则小于10mm,显著抑制了B16细胞的增殖及成瘤后肿瘤的生长速度。