CN104186223B - 植物生长调节剂处理提高长春花中生物碱含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种植物生长调节剂处理提高长春花中生物碱含量的方法；将长春花种子于泥炭蛭石珍珠岩培养基质中发苗并生长，在长春花进入花期后，将不同的植物生长调节剂(乙烯利、甲基茉莉酸)混合制成浓度皆为0.1mM的混合剂对长春花植株进行喷洒处理，处理后1～2天长春花中的文多灵、长春质碱以及长春碱含量普遍得到提高，采收处理后的长春花植株将有效提高长春花生物碱类的产量，并降低其生产成本，对满足长春花抗癌生物碱产业化生产具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及一种生物技术领域的提高长春花生物碱含量的方法，具体涉及一种植物生长调节剂处理提高长春花中生物碱含量的方法。
背景技术
作为药用和观赏植物，夹竹桃科的长春花(Catharanthus roseus(L.)G.Don)体内含有130多种具有生物活性的萜类吲哚生物碱(Terpenoid indole alkaloid，TIA)，如能抗多种恶性肿瘤和癌症的长春碱(Vinblastine)和长春新碱(Vincristine)、它们的前体物文多灵(Vindoline)和长春质碱(Catharanthine)，降血压的阿吗碱以及对老年痴呆症(阿尔茨海默病)有潜在疗效的蛇根碱等等。但是TIA在野生型长春花中的含量都很低，仅为植株干重的万分之一到千分之一，并且受组织特异性、生长周期和外界环境的影响，野生长春花每克干叶仅能产长春碱0.02毫克，产量低下，远不能满足市场需求。目前市场上利用从长春花中提取的文多灵和长春质碱半合成长春碱或长春瑞滨等抗癌药物。但TIA本身复杂的化学结构局限了化学合成在工业生产上的应用。这些原因导致长春花药用成分的供需矛盾相当严重，使其价格极为昂贵。
已有多种技术策略应用于长春花生物碱的研究和生产中。基因工程在分子水平上对长春花细胞系、发根以及植株中生物碱的合成途径进行人为改造，可以起到一定的代谢调控作用，并加强部分生物碱的代谢合成。但是长春花细胞系或发根生产系统无法合成文多灵，从而也无法生成抗癌类生物碱长春碱和长春新碱。通过生物技术对植株进行基因改造极有开发和应用前景，但由于植株本身具有的细胞及组织结构多样性，对生物碱合成途径的调控也更为复杂，目前虽有报道，但仍在初步试验阶段。利用外界因素(化学、生物、物理)也可以对长春花生物碱的合成起到诱导和调控作用。其中应用较为广泛的是植物生长调节剂。不同的植物生长调节剂对长春花生物碱合成的诱导作用也大为不同。大多数研究是通过对长春花进行单种植物生长调节剂处理来达到诱导生物碱合成的目的，对于大幅度提高生物碱在长春花植株内含量的影响有限。为了降低长春花生物碱类药物的市场价格，需要对现有的技术策略作进一步的突破和创新，以期提高长春花中生物碱的产量、加速其大规模产业化生产。目前未有任何与本专利申请中所提及的长春花下胚轴再生植株相关专利和文献报道。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术存在的不足，提供一种植物生长调节剂处理提高长春花中生物碱含量的方法；使其有效提高了长春花中重要生物碱文多灵、长春质碱及长春碱的含量，并且无需高昂的前期投入，操作简便，有利于规模化产业生产。
本发明的目的通过以下技术方案实现的：
本发明涉及一种植物生长调节剂处理提高长春花中生物碱含量的方法，在采收前用植物生长调节剂处理长春花成年植株；所述植物生长调节剂为乙烯利和甲基茉莉酸的混合制剂。采用该方案即能提高长春花中重要生物碱文多灵、长春质碱和长春碱含量。
优选的，所述植物生长调节剂中乙烯利的工作浓度为0.1～0.2mM，甲基茉莉酸的工作浓度为0.1～0.2mM。
优选的，所述植物生长调节剂中乙烯利和甲基茉莉酸的工作浓度均为0.1mM。
优选的，所述植物生长调节剂的配制方法为：先将乙烯利和甲基茉莉酸分别溶于20％的乙醇溶液中，配制成浓度为1M的母液，随后共同加入水中，用水稀释至所述工作浓度。
优选的，所述处理具体为：当长春花植株进入花期，株高大于50cm时，用植物生长调节剂喷洒长春花植株的地上部分，一至两天后采收。此时可获得生物碱含量较高的植株。
优选的，所述喷洒具体为：每棵植株的喷洒量为250ml～500ml，喷洒1～2次。喷洒量低于250ml不能有效提高长春花中生物碱的含量，喷洒量大于500ml对于长春碱含量的提高没有进一步的作用，导致药液的浪费，成本的增加。
优选的，所述长春花成年植株是将长春花种子种植于泥炭蛭石珍珠岩培养基质中发苗生长而成的。
优选的，所述泥炭蛭石珍珠岩培养基质中，泥炭、蛭石和珍珠岩比例为6∶3∶1。
优选的，生长于泥炭蛭石珍珠岩培养基质中的长春花植株，用水每周浇灌一次。
本发明的原理在于，长春花体内生物碱的合成是一个受植物生长及外界环境影响的复杂机制，受一系列内源或外源的植物生长调节剂或诱导剂的调控。甲基茉莉酸信号通路能诱导生物碱在长春花体内的合成。对长春花发根进行甲基茉莉酸诱导，会导致阿吗碱、长春质碱及蛇根碱含量发生变化，此外也会让发根释放出更多的分泌物；对长春花幼苗进行诱导，能提高阿吗碱、蛇根碱、长春质碱等生物碱的含量。乙烯利诱导能提高长春质碱在长春花发根中的含量，在细胞系中能提高阿吗碱的含量，而在幼苗中能提高文多灵的含量。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1、本发明建立了通过乙烯利和甲基茉莉酸混合处理提高长春花生物碱含量的方法，有效地提高了长春花植株中三种重要生物碱的含量，文多灵含量比对照提高了65％～85％，长春质碱含量比对照提高了70％～80％，长春碱含量提高了25％～50％。
2、本发明的方法不需要利用基因工程等生物技术提高生物碱含量所需要的较高的前期投入，也突破了植物生长调节剂单处理对生物碱合成影响的局限性，操作简单，有利于降低长春花生物碱的生产成本，对抗癌生物碱类的规模化生产具有重大意义。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为植物生长调节剂甲基茉莉酸单处理(M)、乙烯利单处理(E)、甲基茉莉酸+乙烯利混合处理(H)以及对照水处理(C)后长春花中文多灵的含量变化示意图；
图2为植物生长调节剂甲基茉莉酸单处理(M)、乙烯利单处理(E)、甲基茉莉酸+乙烯利混合处理(H)以及对照水处理(C)后长春花中长春质碱的含量变化示意图；
图3为植物生长调节剂甲基茉莉酸单处理(M)、乙烯利单处理(E)、甲基茉莉酸+乙烯利混合处理(H)以及对照水处理(C)后长春花中长春碱的含量变化示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
实施例1
将长春花种子(购自于美国保尔种子公司的太平洋樱桃红光环品种)种植于泥炭蛭石珍珠岩培养基质(泥炭、蛭石和珍珠岩比例为6∶3∶1)中，用水每周浇灌一次。当植株进入花期，株高大于50cm时，用不同植物生长调节剂或混合剂处理长春花植株，喷洒量为250ml，重复喷洒2次，同时用水处理的长春花植株作为对照。处理一天及两天后，收获植株的叶片，用高效液相色谱测定文多灵、长春质碱和长春碱的含量。
在上述相同的条件下，分别用0.1mM乙烯利、0.1mM甲基茉莉酸、以及0.1mM乙烯利+0.1mM甲基茉莉酸的混合制剂(混合制剂的配置：先将乙烯利和甲基茉莉酸分别溶于20％的乙醇溶液中，配制成浓度为1M的母液，随后共同加入水中，用水稀释至所述工作浓度)处理长春花植株，3个实施例的结果如图1、2、3所示。甲基茉莉酸单处理48小时后，文多灵和长春质碱的含量达到最大值，分别为1.87mg/g和2.95mg/g，比未处理前提高了54％和56％。乙烯利单处理后24小时，文多灵和长春质碱分别达到最高含量，分别为2.04mg/g和3.28mg/g，比未处理前提高了68.41％和73.28％，处理48小时后各生物碱含量开始回落。混合处理可以增强单处理对文多灵和长春质碱含量的提高作用，在处理24小时后，文多灵达到的最高含量比MeJA单处理后的最高含量高出36％，比乙烯利单处理后的高出14％；长春质碱的最高含量比MeJA单处理后的高出24％。混合处理24小时后，长春碱含量比对照提高了53％。
实施例2
将长春花种子(购自于美国保尔种子公司的太平洋樱桃红光环品种)种植于泥炭蛭石珍珠岩培养基质(泥炭、蛭石和珍珠岩比例为6∶3∶1)中，用水每周浇灌一次。当植株进入花期，株高大于50cm时，用不同植物生长调节剂或混合剂处理长春花植株，喷洒量为300ml，重复喷洒2次，处理48小时后，收获植株的叶片，用高效液相色谱测定文多灵、长春质碱和长春碱的含量。
在上述相同的条件下，分别用A组(0.1mM乙烯利+0.1mM甲基茉莉酸)，B组(0.1mM乙烯利+0.2mM甲基茉莉酸)，C组(0.2mM乙烯利+0.1mM甲基茉莉酸)，D组(0.2mM乙烯利+0.2mM甲基茉莉酸)的混合制剂处理长春花植株；4个实验组的结果如表1所示：
表1
| 实验组 | 文多灵含量(mg/g) | 长春质碱含量(mg/g) | 长春碱含量(mg/g) |
| A | 2.5 | 3.5 | 0.12 |
| B | 2.0 | 3.0 | 0.8 |
| C | 1.9 | 2.8 | 0.7 |
| D | 2.2 | 3.2 | 0.9 |
乙烯利单处理48小时，文多灵、生物质碱、生物碱均有大幅度的下降，基本回到未处理时的状态，也就是说乙烯利单处理具有时效性。本发明意外发现，当乙烯利和甲基茉莉酸的工作浓度均为0.1mM时，乙烯利和甲基茉莉酸发生协效作用，乙烯利单处理的时效性缺陷得到了根本的解决。应用本发明的方法，在收获前一至两天用乙烯利+甲基茉莉酸的混合制剂喷洒长春花植株，可以显著提高文多灵、长春质碱和长春碱的含量，并且不影响长春花植株的生物量，从而进一步提高三种重要生物碱的产量。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。
Claims (6)
1.一种植物生长调节剂处理提高长春花中生物碱含量的方法，其特征在于，在采收前用植物生长调节剂处理长春花成年植株；所述植物生长调节剂为乙烯利和甲基茉莉酸的混合制剂；
所述处理具体为：当长春花植株进入花期，株高大于50cm时，用植物生长调节剂喷洒长春花植株的地上部分，一至两天后采收；
所述植物生长调节剂中乙烯利和甲基茉莉酸的工作浓度均为0.1mM。
2.根据权利要求1所述的植物生长调节剂处理提高长春花中生物碱含量的方法，其特征在于，所述植物生长调节剂的配制方法为：先将乙烯利和甲基茉莉酸分别溶于20％的乙醇溶液中，配制成浓度为1M的母液，随后共同加入水中，用水稀释至所述工作浓度。
3.根据权利要求1所述的植物生长调节剂处理提高长春花中生物碱含量的方法，其特征在于，所述喷洒具体为：喷洒量为250ml～500ml/棵，喷洒1～2次。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的植物生长调节剂处理提高长春花中生物碱含量的方法，其特征在于，所述长春花成年植株是将长春花种子种植于泥炭蛭石珍珠岩培养基质中发苗生长而成的。
5.根据权利要求4所述的植物生长调节剂处理提高长春花中生物碱含量的方法，其特征在于，所述泥炭蛭石珍珠岩培养基质中，泥炭、蛭石和珍珠岩比例为6:3:1。
6.根据权利要求4所述的植物生长调节剂处理提高长春花中生物碱含量的方法，其特征在于，生长于泥炭蛭石珍珠岩培养基质中的长春花植株，每周用水浇灌一次。
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