CN104178537A

CN104178537A - 一种槐糖脂农用抗菌素及其在治理作物真菌病害中的应用

Info

Publication number: CN104178537A
Application number: CN201410428820.0A
Authority: CN
Inventors: 陈静; 伏圣秘
Original assignee: Qilu University of Technology
Current assignee: Qilu University of Technology
Priority date: 2014-08-27
Filing date: 2014-08-27
Publication date: 2014-12-03

Abstract

本发明涉及一种槐糖脂农用抗菌素及其在治理作物真菌病害中的应用，通过微生物发酵技术，获得一种生物表面活性剂槐糖脂，然后用蒸馏水配制得到槐糖脂溶液，作为槐糖脂农用抗菌素。将槐糖脂农用抗菌素均匀喷洒到作物植株叶面或果实表面，达到防治作物真菌病害的目的。本发明具有生产工艺简单，原料来源方便，成本低，产量高，对人体无毒害作用；并且制备的槐糖脂农用抗菌素剂型简单，易制备，防治效果显著，使用方便，具有极大的应用前景。

Description

一种槐糖脂农用抗菌素及其在治理作物真菌病害中的应用

技术领域

本发明涉及一种槐糖脂农用抗菌素及其在治理作物真菌病害中的应用，属于作物真菌病害防治领域。

背景技术

我国是农业生产大国，据国家统计局数据显示，2013年，全国粮食播种面积112014千公顷，粮食总产量60194万吨，约占世界总产量的17％，并呈逐年增加的趋势。同时，我国的蔬菜生产也持续稳定发展，种植面积2011年为2.95亿亩，产量为6.79亿吨。目前，我国人口不断增加对粮食和蔬菜的需求呈上升趋势。但据统计，我国农作物病虫害呈多发重发态势，每年发生面积近70亿亩次，因防控能力不足每年造成粮食损失就近500亿斤、经济作物损失350多亿斤。

作物病害主要是微生物侵染造成的，尤其是致病真菌诱发作物病变，造成作物在生长和(或)成熟等过程病害并导致减产的主要原因。作物病害后主要是采用杀菌剂，且绝大多数属于化学类杀菌剂，以抑制或杀死作物中的致病菌，来缓解或阻止病害的发生。但是长期使用大量这种化学类杀菌剂不但会对人体健康威胁甚至危害，而且也会对环境造成一定的污染破坏。随着应用时间的增长，病原体抗性也逐渐加强，从而致使杀菌剂的效力逐渐降低甚至失效，进一步加剧防治病害的难度。因此，开发绿色、高效、经济的创新型农用抗菌素势在必行，有效控制作物病害提高作物产量必将产生巨大的经济和社会效益。

槐糖脂是利用微生物发酵技术获得的一种生物表面活性剂。其生产工艺简单，原料来源方便，本身无毒，并具有抗菌、保湿等功能。近年来，对槐糖脂作为药物的研究已有许多文献报道，其中包括了槐糖脂的抑菌作用。中国专利文献CN101886047A(申请号：201010191707.7)公开了一株拟威克酵母菌株(Wickerhamiella domercqiae Y_2A CGMCCNO.3798)，能够产生槐糖脂，可应用于槐糖脂类水果防腐剂。

目前，槐糖脂生物表面活性剂在作物真菌病害防治中的研究和开发未见报道。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种高效、安全、低成本的槐糖脂农用抗菌素及其在治理作物真菌病害中的应用。

本发明的技术方案如下：

一种槐糖脂农用抗菌素，通过如下步骤制得：

(1)取拟威克酵母(Wickerhamiella domercqiae Y_2A CGMCC NO.3798)，转接到斜面培养基上，28～32℃培养24～48小时，得活化的拟威克酵母；

(2)将步骤(1)制得的活化的拟威克酵母接种于种子培养基中，28～32℃，摇床100～200r/min振荡培养20～28h，得拟威克酵母种子液；

(3)按照体积比4～6％的接种量，将步骤(2)制得的拟威克酵母种子液接种到发酵培养基中，28～32℃、摇床160r/min振荡培养144～168小时，得发酵液；

(4)将步骤(3)制得的发酵液置于分液漏斗中，静置10～14小时，收集沉降至分液漏斗底部的沉淀，置于80℃干燥箱中干燥24～48小时，得槐糖脂固体；

(5)将步骤(4)制得的槐糖脂固体加入蒸馏水中，溶解，调pH为6.0～7.0，即得槐糖脂农用抗菌素。

根据本发明，优选的，步骤(1)中所述斜面培养基组份如下：葡萄糖18～22g/L，酵母粉8～12g/L，蛋白胨18～22g/L，琼脂粉18～22g/L，蒸馏水定容。

根据本发明，优选的，步骤(2)中所述种子培养基组份如下：葡萄糖18～22g/L，酵母粉8～12g/L，蛋白胨18～22g/L，蒸馏水定容。

根据本发明，优选的，步骤(3)中所述发酵培养基组份如下：葡萄糖75～85g/L，油酸60～80mL ml/L，硫酸铵3～5g/L，KH₂PO₄0.8～1.2g/L，Na₂HPO₄·12H₂O0.8～1.2g/L，MgSO₄·7H₂O0.4～0.6g/L，酵母粉1.5～2.5g/L，pH5.5～6.5，蒸馏水定容。

根据本发明，优选的，步骤(5)中所述槐糖脂固体在水中的溶解pH为6.0～7.0，槐糖脂农用抗菌素中槐糖脂的含量为3～10g/L。

根据本发明，上述槐糖脂农用抗菌素在治理作物真菌病害中的应用。

根据本发明，优选的，所述槐糖脂农用抗菌素在治理作物真菌病害中的应用，具体步骤如下：

取槐糖脂农用抗菌素，均匀喷施于需要防治的作物植株叶面或果实表面，每次每平方米作物植株喷施槐糖脂农用抗菌素0.05～0.1g。

根据本发明，优选的，槐糖脂农用抗菌素喷施2～3次，每次喷施时间间隔12～24h。

根据本发明，优选的，所述作物为：水稻、小麦、花生、番茄、黄瓜、马铃薯。

本发明的有益效果如下：

本发明通过微生物发酵技术，获得一种生物表面活性剂槐糖脂，然后用蒸馏水配制得到糖脂溶液，作为槐糖脂农用抗菌素。将槐糖脂农用抗菌素均匀喷洒到作物植株叶面或果实表面，达到防治作物真菌病害的目的。本发明具有生产工艺简单，原料来源方便，成本低，产量高，对人体无毒害作用；并且制备的槐糖脂农用抗菌素剂型简单，易制备，防治效果显著，使用方便，具有极大的应用前景。

附图说明

图1槐糖脂农用抗菌素对作物致病真菌孢子萌发的抑制作用

A：稻瘟菌；B：小麦全蚀菌；C：土豆晚疫病菌

1：对照；2：添加了1.0g/L的槐糖脂农用抗菌素；3：添加了5.0g/L的槐糖脂类农用抗菌素；4：添加了10.0g/L的槐糖脂类农用抗菌素。

图2槐糖脂农用抗菌素对作物致病真菌菌丝的抑制作用

A：稻瘟菌；B：水稻纹枯菌；C：终极腐霉；D：黄瓜枯萎病菌；E：轮纹菌；F：土豆晚疫病菌；G：花生根腐菌；H：小麦全蚀菌

1：对照；2：添加了3.0g/L的槐糖脂类农用抗菌素。

图3槐糖脂农用抗菌素对马铃薯晚疫病的防治效果

1：对照；2：喷洒过槐糖脂农用抗菌素的马铃薯病株；3：未喷洒过槐糖脂农用抗菌素的马铃薯病株

A：植株整体；B：植株局部。

图4槐糖脂农用抗菌素对黄瓜枯萎病的防治效果

A：对照；B：喷洒过槐糖脂类农用抗菌素的黄瓜病株；C：未喷洒过槐糖脂类农用抗菌素的黄瓜病株。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明内容作进一步的说明，但不限于此。

实施例1：槐糖脂农用抗菌素的制备，步骤如下：

(1)取拟威克酵母(Wickerhamiella domercqiae Y_2A CGMCC NO.3798)转接到斜面培养基上，30℃培养30小时，得活化的拟威克酵母；

所述斜面培养基组份如下：葡萄糖20g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，琼脂粉20g/L，蒸馏水定容；

(2)将步骤(1)制得的活化的拟威克酵母接种于300mL三角瓶装50mL种子培养基，30℃，摇床160r/min振荡培养24h，得拟威克酵母种子液；

所述种子培养基组份如下：葡萄糖20g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，蒸馏水定容；

(3)按照体积比5％的接种量，将种子液接种到发酵培养基中，30℃、摇床160r/min振荡培养168小时，得发酵液；

所述发酵培养基组份如下：葡萄糖80g/L，油酸80mL/L，硫酸铵4.0g/L，KH₂PO₄1.0g/L，Na₂HPO₄·12H₂O1.0g/L，MgSO₄·7H₂O0.5g/L，酵母粉2g/L，pH6.5，水定容；

(4)将步骤(3)制得的发酵液置于分液漏斗中，静置12小时，收集沉降至分液漏斗底部的淡黄棕色沉淀，置于80℃干燥箱中干燥48小时，得槐糖脂固体；

(5)将步骤(4)制得的槐糖脂固体加入蒸馏水中，溶解，调pH为7.0，即得无色澄清的槐糖脂农用抗菌素。

实施例2：槐糖脂农用抗菌素抑制作物致病真菌的应用，步骤如下：

(1)致病真菌孢子悬浮液的制备：用接种针分别挑取一块生长旺盛的各种致病作物病原菌菌丝接种到新鲜PDA培养基上，将平板放到培养箱28℃恒温培养；培养10～15天后取出PDA平板加入适量无菌水，并用接种针反复刮动菌丝，使孢子释放到无菌水中，过滤孢子即得病原菌孢子悬液，用无菌水将孢子浓度稀释至10⁵/mL备用；

(2)不同浓度的槐糖脂农用抗菌素配制：取实施例1制备的槐糖脂固体，用蒸馏水分别配制浓度为0.5g/L、1.0g/L、2.0g/L、3.0g/L、4.0g/L、5.0g/L和10.0g/L的槐糖脂农用抗菌素溶液；

(3)取槐糖脂农用抗菌素溶液100μl和15mL PDA固体培养基混匀后倒平板，然后取100μl孢子悬液涂布在平板上，30℃培养120小时，菌落计数。

抑菌实验结果如图1所示，由图1可知：添加了较低剂量(1.0g/L)槐糖脂农用抗菌素的平板在120小时内，对致病真菌的生长就有明显的抑制；随着槐糖脂农用抗菌素剂量的增加，抑制效果增强，对稻瘟菌和水稻纹枯病菌的抑制作用最强，5.0g/L时，抑制率达到80％以上；10.0g/L时，基本完全抑制。

实施例3：槐糖脂农用抗菌素抑制作物致病真菌的应用，步骤如下：

取3.0g/L的槐糖脂农用抗菌素100μl和15mL PDA固体培养基混匀后倒平板，冷却后接种6mm致病真菌菌丝块，同时作阴性对照。将平板置于30℃恒温箱中培养，观察菌丝生长情况。

实验结果如图2所示，由图2可知：添加了3.0g/L槐糖脂农用抗菌素的菌丝块有的生长缓慢，有的没有生长，说明槐糖脂农用抗菌素对菌丝的生长蔓延有很好的抑制作用。

实施例4：槐糖脂农用抗菌素在治理作物真菌病害中的应用，步骤如下：

取花盆(口径300mm×底径250mm×高度220mm)若干，并将每盆加入等量均匀的相同的基质，然后灌浇适量的营养液，待用。选择大小较一致、生长较均匀旺盛的事先用沙土催好芽的马铃薯幼苗，移栽到上述准备的花盆中，继续培养，直至幼苗高度达到约20cm。将马铃薯均匀的分成三组并标记为：1组、2组和3组，其中2和3组分别均匀喷洒等量的马铃薯晚疫病病菌孢子悬浮液，作染菌处理，1组喷洒等量无菌水做空白对照，然后将所有分组置于阳光下以晾干叶片，在重复喷洒一遍晾干，待用。

将上述准备好的马铃薯植株模型按下面方法处理：3组均匀喷洒浓度为3g/L的槐糖脂类农用抗菌素；2组均匀喷洒等量无菌水作阴性处理对照；1组均匀喷洒等量无菌水作空白对照。将1、2、3组分别置于相同环境中培养，从出现染病开始记录植株发病状况。

结果如图3所示，由图3可知：未接菌且未使用槐糖脂处理的空白对照组(见图3中A1和B1)，马铃薯植株生长旺盛健康，叶片呈现鲜绿色，未出现染病；而马铃薯病害株喷洒过槐糖脂类农用抗菌素后，除少数叶片边缘出现病变外，整体植株能健康生长(见图3中A2和B2)；与之相比较，未喷洒过槐糖脂类农用抗菌素的马铃薯病害株叶片表面上出现了枯萎变黄甚至腐烂等病变(见图3中A3和B3)。说明槐糖脂类农用抗菌素抑制了孢子的萌发，减缓了病害的发作时间，并能有效控制马铃薯晚疫病病情的发展。

实施例5：槐糖脂农用抗菌素在治理作物真菌病害中的应用，步骤如下：

取花盆(口径150mm×底径110mm×高度132mm)若干，并将每盆加入等量均匀的基质，然后喷洒适量营养液，待用。选择生长旺盛，大小一致的黄瓜幼苗移栽到事先准备的花盆中，培养3～4天。待黄瓜缓苗后随机平均分成三组并标记：A组、B组和C组，其中B和C组分别均匀喷洒等量的黄瓜枯萎病病菌孢子悬浮液，作染菌处理，A组喷洒等量无菌水做空白对照，然后将所有分组置于阳光下以晾干叶片，再重复喷洒一遍，待用。

将上述处理所得的盆栽植株按以下方法处理：C组均匀喷洒浓度为3g/L的槐糖脂农用抗菌素；B组均匀喷洒等量无菌水作阴性处理对照；A组均匀喷洒等量无菌水作空白对照。将A、B、C组分别置于相同环境中分别培养，并记录植株发病状况。

结果如图4所示，由图4可知：黄瓜植株对照组和喷洒过槐糖脂农用抗菌素的黄瓜病株，叶片颜色鲜绿，长势旺盛，只出现了少量病菌斑点，且菌斑较小(图4A、B)；未喷洒过槐糖脂农用抗菌素的黄瓜病株叶子表面上出现了大量病菌斑点，叶片开始逐渐变黄枯萎(图4C)。说明槐槐糖脂农用抗菌素通过抑制黄瓜枯萎病真菌孢子的萌发，从而延缓了病害的发生，使病情的蔓延明显变慢和减弱。

实施例6：槐糖脂农用抗菌素在治理作物真菌病害中的应用，步骤同实施例5，不同的是：

选择生长旺盛，大小一致的黄瓜幼苗移栽到事先准备的花盆中，培养3～4天。待黄瓜缓苗后随机平均分成三组并标记：A组、B组和C组，将A、B和C组分别均匀喷洒等量的黄瓜枯萎病病菌孢子悬浮液，作染菌处理，然后将所有分组置于阳光下以晾干叶片，再重复喷洒一遍，待用。

将上述处理所得的盆栽植株按以下方法处理：每次每平方米作物植株喷施槐糖脂农用抗菌素0.05～0.1g。

A组均匀喷洒浓度为3g/L的槐糖脂农用抗菌素1次；B组均匀喷洒等量浓度为3g/L的槐糖脂农用抗菌素2次，每次间隔时间为12h；C组均匀喷洒等量浓度为3g/L的槐糖脂农用抗菌素3次，每次间隔时间为24h。将A、B、C组分别置于相同环境中分别培养，并记录植株发病状况。

结果显示：喷施1次槐糖脂农用抗菌素的病株出现少量病菌斑点，且菌斑较小；喷施2次槐糖脂农用抗菌素的病株仅出现几处小的菌斑；喷施3次槐糖脂农用抗菌素的病株几乎没有出现肉眼可见的菌斑。说明在每次每平方米作物植株喷施槐糖脂农用抗菌素0.05～0.1g用量范围内，喷施次数越多，抗菌效果越好。

Claims

1.一种槐糖脂农用抗菌素，通过如下步骤制得：

2.根据权利要求1所述的槐糖脂农用抗菌素，其特征在于，步骤(1)中所述斜面培养基组份如下：葡萄糖18～22g/L，酵母粉8～12g/L，蛋白胨18～22g/L，琼脂粉18～22g/L，蒸馏水定容。

3.根据权利要求1所述的槐糖脂农用抗菌素，其特征在于，步骤(2)中所述种子培养基组份如下：葡萄糖18～22g/L，酵母粉8～12g/L，蛋白胨18～22g/L，蒸馏水定容。

4.根据权利要求1所述的槐糖脂农用抗菌素，其特征在于，步骤(3)中所述发酵培养基组份如下：葡萄糖75～85g/L，油酸60～80mL ml/L，硫酸铵3～5g/L，KH₂PO₄0.8～1.2g/L，Na₂HPO₄·12H₂O0.8～1.2g/L，MgSO₄·7H₂O0.4～0.6g/L，酵母粉1.5～2.5g/L，pH5.5～6.5，蒸馏水定容。

5.根据权利要求1所述的槐糖脂农用抗菌素，其特征在于，步骤(5)中所述槐糖脂固体在水中的溶解pH为6.0～7.0，槐糖脂农用抗菌素中槐糖脂的含量为3～10g/L。

6.权利要求1-5任一项所述的槐糖脂农用抗菌素在治理作物真菌病害中的应用。

7.根据权利要求6所述槐糖脂农用抗菌素在治理作物真菌病害中的应用，具体步骤如下：

取槐糖脂农用抗菌素，喷施于需要防治的作物植株叶面或果实表面，每次每平方米作物植株喷施槐糖脂农用抗菌素0.05～0.1g。

8.根据权利要求6所述槐糖脂农用抗菌素在治理作物真菌病害中的应用，其特征在于，槐糖脂农用抗菌素喷施2～3次，每次喷施时间间隔12～24h。

9.根据权利要求6所述槐糖脂农用抗菌素在治理作物真菌病害中的应用，其特征在于，所述作物为：水稻、小麦、花生、番茄、黄瓜、马铃薯。