CN104173402A

CN104173402A - 一种旋覆花药材中总黄酮的制备方法及其抗癌用途

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Publication number: CN104173402A
Application number: CN201410397260.7A
Authority: CN
Inventors: 孟宪生; 包永睿; 王帅; 黄一凡
Original assignee: Liaoning University of Traditional Chinese Medicine
Current assignee: Liaoning University of Traditional Chinese Medicine
Priority date: 2014-08-14
Filing date: 2014-08-14
Publication date: 2014-12-03
Anticipated expiration: 2034-08-14
Also published as: CN104173402B

Abstract

一种旋覆花药材中总黄酮的制备方法，包括下述工艺方法：（1）取旋覆花适量，加5-30倍量30-95％的乙醇，回流提取1-3次，每次1-5h，过滤，滤液合并，作为提取液，备用；（2）将步骤（1）所制取的旋覆花提取液，加热浓缩至提取液浓度为0.05-0.5g/ml，调节PH值为1-7，作为上样液；（3）上样液纯化：将步骤2制得的上样液，上HPD300大孔树脂，原药材与树脂用量比为0.1-1.0g/ml，用3-10BV水除杂后，再用3-10BV的10-95%乙醇洗脱，一次纯化后的总黄酮含量≥70%。本发明纯度增加，可减小服用剂量、降低不良反应，同时为开发以旋覆花总黄酮富集物为原料的具有广泛临床使用价值和商业开发价值的抗癌新药和工业生产提供理论和实验依据。

Description

一种旋覆花药材中总黄酮的制备方法及其抗癌用途

技术领域

本发明涉及一种中药的制备方法，特别是涉及一种中药材旋覆花总黄酮富集物的制备方法及其在制备抗癌药物中的应用。

背景技术

癌症，又称为恶性肿瘤，是当今世界上第一大严重威胁人类健康的疾病，多种诱发因素都可导致癌症的产生。目前癌症的治疗包括手术切除、化疗、放射线治疗、免疫治疗、单克隆抗体治疗或其他方法治疗，虽然这些手段对癌症的治疗都有一定效果，但是其作用效果有限，且放疗、化疗对正常组织损害也较大，因此癌症的治疗仍然是人类面对的极大考验。中医药无论在抑制或杀伤肿瘤细胞方面还是术后调理，减轻放、化疗不良反应，改善症状和体征，提高生存质量等方面，均发挥了重要的作用，因此近年来中医中药在癌症的治疗方面日益被人们所关注。

中药旋覆花为2010 版《中国药典》收载的中药材，始载于《神农本草经》。《神农本草经》曰：“主结气胁下满，惊悸。除水，去五脏间寒热，补中，下气。”《本草衍义》曰：“旋复花，行痰水，去头目风，亦走散之药也。”《纲目》云：“旋复所治诸病，其功只在行水、下气、通血脉尔。”《药性论》曰：“主肋胁气，下寒热水肿，主治膀胱宿水，去逐大腹，开胃，止呕逆不下食：“从古代各家本草对其性状、产地、用途等方面进行考证与目前习用的旋覆花，即主要为含黄酮类及倍半萜内酯类等物质相符。临床上旋覆花多见于止咳化痰、止呕及治疗胸痞胁痛的复方中，效果显著。而有关其有效成分之一总黄酮富集物的高纯度纯化方法、抗癌活性研究迄今为止尚未见报道。

旋覆花中黄酮类化合物作为其中主要的活性成分，具有广泛的生物活性，在心血管系统、中枢神经系统、血液系统、免疫系统、抗炎、抗衰老、抗肿瘤等方面都有较显著的疗效，但其生物活性的研究主要集中在抗氧化活性方面（耿红梅，王云志，张嫡群.治疗阿尔茨海默症的天然药物[J].中国药房，2006，17(13)：1019）。旋覆花中除黄酮类化合物，还含有其它类多种化学成分，主要有黄酮类、倍半萜内酯类、萜类、甾体及挥发油等成分（赵平，张文治，王凯.旋覆花化学成分研究[J].齐齐哈尔大学学报:自然科学版，2012，28(2)：12-14.吴一兵，王云志，查建蓬，等.欧亚旋覆花中三萜和甾体化合物的分离和结构鉴定[J].中草药2006,37(5)：666.查建蓬，付炎，吴一兵，等.欧亚旋覆花挥发油的GC-MS分析[J].中药材，2005，38(6)：466.）。因此药材提取液中含有大量非黄酮类杂质，不利于阐明药效物质组分和作用机制，难以投入到新药的研发中，因此对旋覆花总黄酮纯化方法的研究具有现实意义。根据文献报道，对旋覆花中总黄酮富集纯度未达到90%以上，不利于研究其发挥药效的物质基础、作用机制及其药效组分的解析和表征，很难将其研发成临床新药。本发明对旋覆花中总黄酮的纯化工艺进行研究，并达到了较为理想的高纯度，此纯化方法可使旋覆花中总黄酮富集物纯度达到93%以上，可以有效排除杂质对药效成分的干扰并且为药效物质组分的解析及阐明其作用机制奠定基础。作为传统中药的植物药旋覆花已见于各种止咳化痰、止呕的复方中，疗效显著。本研究通过体外药效实验发现其具有明显的抗肿瘤活性，并呈明显的量效关系，同时纯度增加，可减小服用剂量、降低不良反应，扩大了旋覆花的应用范围，为开发以旋覆花总黄酮富集物为原料的具有广泛临床使用价值和商业开发价值的抗癌新药和工业生产奠定物质基础、提供理论和实验依据。

发明内容

本发明的目的，是提供一种旋覆花药材中总黄酮的制备方法。

本发明的另一目的，是提供和证明从旋覆花药材中提取的总黄酮具有抗癌作用，可制备抗癌药物。

本发明中所指的旋覆花包括旋覆花及欧亚旋覆花的干燥头状花序。

采用的技术方案是：

一种旋覆花药材中总黄酮的制备方法，包括下述工艺方法：

（1）取旋覆花适量，加5-30倍量30-95％的乙醇，回流提取1-3次，每次1-5h，过滤，滤液合并，作为提取液，备用；

（2）将步骤（1）所制取的旋覆花提取液，加热浓缩至提取液浓度为0.05-0.5g/ml，用HCl溶液调节pH值为1-7，作为上样液；

（3）上样液纯化：将步骤2制得的上样液，上HPD300大孔树脂，原药材与树脂用量比为0.1-1.0g/ml，用3-10BV水除杂后，再用3-10BV的10-95%乙醇洗脱，一次纯化后的总黄酮含量≥70%。

采用如步骤（3）所述的上样液纯化方法，连续过树脂柱进行三次纯化，总黄酮含量≥93%。

上述步骤（1）中加25倍量55%乙醇，回流提取3次，每次提取3h，制成0.1g/ml生药浓度的提取液。

上述步骤（2）中上样液pH值为3，上样液浓度为0.2g/ml。

本发明的发明人根据临床需要将旋覆花总黄酮富集物制备为各个剂型而可添加药学上可接受的辅料及载体供临床治疗癌症选择应用。

具体实施方案：

本发明提供以下技术措施，实施例仅用于说明本发明，并不是限制发明的权利范围。

旋覆花总黄酮的提取纯化工艺及对肝癌细胞抑制作用的研究

1. 旋覆花总黄酮提取工艺研究

1.1单因素水平考察

表1不同醇浓度提取液中总黄酮的含量(%)

乙醇浓度	0	35%	55%	75%	95%
						总黄酮含量（%）	4.71	6.61	7.10	6.17	2.15

结果表明，用55%乙醇提取时总黄酮含量较高，因此确定提取溶媒为55%乙醇。

1.2正交试验设计

选择提取时间、提取次数、溶剂用量三个因素，对主要影响因素各取三个水平，进行L9(3⁴)正交试验考察。以总黄酮含量为考察指标，优选其最佳提取工艺。正交试验L₉（3⁴）因素水平表见表2，正交试验设计表及直观分析结果见表3，方差分析结果见表4。

表2 因素水平表

表3正交实验设计表及直观分析结果

表4 以总黄酮为指标正交试验方差分析

因素	偏差平方和	自由度	F比	F临界值	显著性
						提取时间	0.175	2	1.636	19.000
提取次数	1.737	2	16.234	19.000
						溶剂用量	0.595	2	5.561	19.000
误差	0.11	2

注：F_0.05=19.00；*为P<0.05

以总黄酮含量为指标，直观分析及方差分析影响总黄酮提取工艺的因素顺序为B>C>A，筛选出最佳提取条件为A₃B₃C₃，即以25倍量55%乙醇，回流提取3次，每次3 h。

2. 旋覆花中总黄酮纯化工艺研究

2.1 树脂静态吸附与解吸试验

按照总黄酮的最优提取工艺即以25倍量55%乙醇，回流提取3次，每次3 h，制成0.1g/mL生药浓度的上样溶液。

表5 不同树脂对各有效成分静态吸附量和解吸能力

结果表明：各树脂的静态饱和吸附量、解吸率有一定差别，均衡考虑各树脂对药液的吸附量及解吸率，HPD300树脂的饱和吸附量和解析率均相对较高，故本实验最终确定HPD300树脂为实验用树脂。

2.2 上样液pH对树脂静态吸附和解吸效果的考察

预处理好的HPD300大孔吸附树脂，抽滤至干，精密称取1g至50mL锥形瓶中，其它条件一致的前提下，用HCl将旋覆花提取溶液分别调成pH为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0，于各锥形瓶中精密加入0.1g/mL不同pH值的样品溶液30mL，于37℃下振荡24h至吸附平衡，过滤，取续滤液用紫外分光光度法测定吸附液中总黄酮的含量，计算饱和吸附量。将已吸附旋覆花总黄酮的树脂分别抽滤至干以除去水溶液，用95%乙醇30 mL37℃下振荡解吸附24h至解吸平衡，测定解吸液中旋覆花总黄酮的含量，计算解吸率。pH为2、3时饱和吸附量和解析率均较高，考虑到极端酸性对黄酮结构的稳定性产生影响，最终确定上样液pH为3。

2.3 树脂动态吸附与解吸试验

2.3.1 上样浓度的考察

按照上述优选出的HPD300树脂及上样溶液PH为3的条件下，精密量取6份0.1g/mL的上样溶液40mL，按照浓度为0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5分别稀释或浓缩成一定体积上样，以2BV／h的流速进行动态吸附，测定流出液中总黄酮的含量。结果当生药浓度为0.2g/mL时，HPD-300对旋覆花中总黄酮的吸附量均较其它几个浓度的高，在此浓度下生产效率和总黄酮的吸附量均较高，因此确定最佳上样浓度为0.2g/mL。

2.3.2泄漏曲线的考察

取处理好的湿树脂10mL，加入0.2g药材/mL的提取液，上柱流速调节为2BV/h（每小时2倍树脂柱体积）进行动态吸附，收集流出液，流出液每5mL收集一管，共收集15管，测定流出液中总黄酮的含量。当上样至第5份时流出液中总黄酮含量显著增大，说明此时总黄酮开始明显泄漏，故确定数值最大上样量为第4份，即树脂比上柱量为0.4g·mL^-1（原药材／湿树脂）。

2.3.3解吸液浓度考察

取4份供试品溶液加于10mL HPD300树脂柱上，控制吸附流速为2 BV/h，分别用40mL30%、50%、70%、90%乙醇洗脱至洗脱液无色，收集洗脱液，定容至50mL容量瓶中，测定含量。结果表明，用50%乙醇洗脱时，洗脱液中总黄酮含量最大，纯度最高，因此确定最佳洗脱醇浓度为50%乙醇洗脱。

2.3.4 洗脱醇用量的考察

取供试品溶液，加于HPD300树脂柱上，待吸附结束后，用50%乙醇洗脱，流速为2BV/h，每10mL收集一份洗脱液，共收集16份，测定洗脱液中总黄酮的含量。结果表明，当洗脱液达到8BV时，已基本将总黄酮洗脱完全，故确定解吸液用量为8BV的50%乙醇洗脱。

2.3.5 冲洗杂质用水体积对纯度的影响

按上述试验条件下取4份供试品溶液，以流速为2BV/h上柱，过柱完后分别用4BV、5BV、6BV、7BV水冲洗后洗脱，分别测定每份过柱水、洗脱液中总黄酮的含量，并计算损失率及水冲洗对总黄酮纯度及回收率影响。可知，吸附后用水冲洗对已吸附的黄酮造成一定量的损失，水洗体积越大，损失率越大，总黄酮回收率降低，但水洗可出去杂质，提高总黄酮的纯度，但当水洗体积大于6BV时，总黄酮纯度下降，可能此时杂质已洗脱完全，再增加洗脱水的体积，总黄酮含量下降，反而使总黄酮纯度下降，因此综合总黄酮回收率和总黄酮纯度，水洗体积为5BV适宜。

2.3.6 确定的最佳提取纯化工艺

取旋覆花粉末，混匀，20倍量55％乙醇水浴回流提取3次，每次3h，过滤，滤液合并，回收乙醇，用水定容使浓度为0.2g/mL作为上柱液。选用HPD300大孔吸附树脂，用HCl调节上样液pH值为3，树脂比上柱量为0.4g·mL^-1（药材／湿树脂），上柱速度为2BV/h，先用5BV水洗脱，弃去水洗液，再用8BV 50%乙醇洗脱，洗脱流速为2BV/h。

2.3.7 旋覆花总黄酮的二、三次纯化

由于经过大孔吸附树脂一次纯化后总黄酮的纯度为74%左右，因此采用连续过树脂的方法将洗脱液按最佳纯化工艺条件进行二、三次纯化，经过三次纯化后总黄酮纯度大于93%。

2.3.8 纯化工艺重现性实验

精密称取3份旋覆花药材粉末，按照最佳的提取纯化工艺提取纯化，并按照比色法测定总黄酮的含量，计算总黄酮的纯度，结果显示该纯化工艺稳定、可靠、较理想，结果见表6。

表6 纯化工艺重现性试验

	1	2	3	平均值(%)	RSD(%)
						纯化物纯度(%)	93.22	93.27	94.16	93.55	0.57

3. 旋覆花总黄酮纯化前后体外药效对比研究

体外抑制肝癌细胞实验：取对数生长期的肝癌细胞，用0.25%的胰蛋白酶消化，用培养基制备成 5×10⁴个细胞/mL的细胞悬液，接种于96孔培养板中，每孔100μL。37℃、5%CO₂及饱和湿度下培养细胞24h。分别加入最优提取工艺下的提取物及纯度大于90%的富集纯化物。将每组设5个复孔，将正常肝癌细胞组作为空白对照组，调零对照组加等量新鲜培养液，37℃、5%CO₂及饱和湿度下继续培养24h后，每孔加入20μL新配制的MTT，置37℃的CO₂培养箱内培养4h后，吸弃上清液，加入150μL的二甲基亚砜(DMSO)，摇床上振摇10min后，用酶标仪于492 nm处测吸光度值(OD值)，取5孔平均值，计算抑制率。计算公式为：细胞抑制率=(1-实验组A值／对照组A值)×100％

表7 纯化前后总黄酮对细胞抑制率的影响

组别	未纯化总黄酮的细胞抑制率（%）	纯化后总黄酮的细胞抑制率（%）
			低剂量	14.42	61.14
中剂量	37.47	92.17
			高剂量	65.83	93.72

由表7可知，旋覆花总黄酮能明显抑制HepG2的增殖，纯化后的总黄酮细胞抑制率明显高于纯化前，即随着剂量的增加，细胞抑制率也随之增加，抑制作用与剂量呈明显的剂量效应关系。本研究优选出的纯化工艺不仅使总黄酮纯度提高到93%以上，减小了用药剂量，同时提高了药效，便于临床制成不同剂型给药，扩大了旋覆花的应用范围，为抗肿瘤新药的开发提供理论依据。

Claims

1.一种旋覆花药材中总黄酮的制备方法，其特征在于包括下述工艺方法：

（2）将步骤（1）所制取的旋覆花提取液，加热浓缩至提取液浓度为0.05-0.5g/ml，调节PH值为1-7，用HCl溶液调节pH值为1-7，作为上样液；

2.根据权利要求1所述的一种旋覆花药材中总黄酮的制备方法，其特征是采用如步骤（3）所述的上样液纯化方法，连续过树脂柱进行三次纯化，总黄酮含量≥93%。

3.根据权利要求1所述的一种旋覆花药材中总黄酮的制备方法，其特征在于步骤（1）中加25倍量55%乙醇，回流提取3次，每次提取3h，制成0.1g/ml生药浓度的提取液。

4.根据权利要求1所述的一种旋覆花药材中总黄酮的制备方法，其特征在于步骤（2）中上样液pH值为3，上样液浓度为0.2g/ml。

5.根据权利要求1或2所述的一种旋覆花药材中总黄酮的制备方法，其特征在于从旋覆花药材中提取的总黄酮能抑制癌细胞的增长，应用于癌病的治疗。

6. 根据权利要求1或2所述的一种旋覆花药材中总黄酮的制备方法，其特征在于从旋覆花药材中提取的总黄酮加入药学上可接受的辅料或载体能制成不同剂型的治疗癌病的药物。