CN104152489A - 具有增加的稳定性的重组因子viii - Google Patents
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Abstract
本发明涉及具有增加的稳定性的重组因子VIII。本发明涉及重组因子VIII,所述重组因子VIII包括导致因子VIII和因子VIIIa两者的稳定性增强的一种或多种突变。还公开了制备和使用所述重组因子VIII的方法和含有所述重组因子的药物组合物。本发明还涉及编码所述重组因子VIII的分离的核酸分子以及含有所述分离的核酸分子的DNA表达系统和宿主细胞。
Description
本申请是国际申请日为2008年7月25日的国际申请PCT/US2008/071170进入中国、申请号为200880123751.5的题为“具有增加的稳定性的重组因子VIII”的发明专利申请的分案申请。
本申请要求2007年11月1日提交的美国临时专利申请序列第60/984,518号和2007年11月30日提交的美国临时专利申请系列第60/991,304号的优先权权益,通过引用将他们每一个整体并入本文。
本发明是根据美国国家卫生研究院授予的HL76213和HL38199号基金在政府的支持下进行的。政府具有本发明的某些权利。
技术领域和背景技术
最常见的重度遗传性出血疾患血友病A是由血浆蛋白因子VIII的缺乏或缺陷引起的。还没有血友病A的治愈方法并且治疗由使用(纯化的)血浆制剂或重组蛋白制剂的替代治疗组成。
因子VIII以非共价的金属离子依赖性的异源二聚体参与循环。这种前体辅因子(procofactor)形式的蛋白含有包括A1(a1)A2(a2)B结构域的重链(HC)和包括(a3)A3C1C2结构域的轻链(LC),小写的a表示富含酸性残基的短的(约30至40个残基)区段(参见Fay,“Activation of Factor VIII andMechanisms of Cofactor Action(因子VIII的激活和辅因子的作用机制),”Blood Rev.18:1-15(2004))。因子VIII在A1A2、A2B和A3A3接合处被凝血酶或因子Xa催化的蛋白裂解激活。该反应的产物因子VIIIa是包括称为A1、A2和A3C1C2的亚基的异源三聚体,它在酶原因子X向丝氨酸蛋白酶因子Xa的膜依赖性的转化中作为丝氨酸蛋白酶因子IXa的辅因子起作用(参见Fay,“Activation of Factor VIII and Mechanisms of Cofactor Action(因子VIII的激活和辅因子的作用机制),”Blood Rev.18:1-15(2004)).
重构研究已显示因子VIII异源二聚体结构是由静电相互作用和疏水相互作用二者支撑的(Fay,“Reconstitution of Human Factor VIII from IsolatedSubunits(由分离的亚基重构人因子VIII),”Arch Biochem Biophys.262:525-531(1988);Ansong等人,“Factor VIII A1Domain Residues97-105Represent a Light Chain-interactive Site(因子VIII A1结构域残基97-105代表轻链相互作用位点),”Biochemistry.45:13140-13149(2006)),并且链间亲和力被因子VIII与冯维勒布兰德(von Willebrand)因子的结合进一步加强(Fay,“Reconstitution of Human Factor VIII from Isolated Subunits(由分离的亚基重构人因子VIII),”Arch Biochem Biophys.262:525-531(1988);Kaufman等人,“Regulation of Factor VIII Expression and Activity by vonWillebrand Factor(冯维勒布兰德因子对因子VIII表达和活性的调节,”Thromb Haemost.82:201-208(1999))。金属离子也促进链间亲和力和活性参数(Wakabayashi等人,“Metal Ion-independent Association of Factor VIIISubunits and the Roles of Calcium and Copper Ions for Cofactor Activity andInter-subunit Affinity(金属离子非依赖性的因子VIII亚基缔合和钙离子和铜离子对辅因子活性和亚基间亲和力的作用),”Biochemistry40:10293-10300(2001))。需要钙来产生活性的因子VIII构象。诱变研究将钙结合位点定位在A1结构域内富含酸性残基的区段(残基110-126)并且鉴定了此区域中离子配位的主要的特定残基(Wakabayashi等人,“Residues110-126in the A1Domain of Factor VIII Contain a Ca2+Binding Site Requiredfor Cofactor Activity(因子VIII的A1结构域中的残基110-126含有辅因子活性所需的Ca2+结合位点),”JBiol Chem.279:12677-12684(2004))。近期的中间分辨率的X射线结构(Shen等人,“The Tertiary Structure and DomainOrganization of Coagulation Factor VIII(凝血因子VIII的三级结构和结构域组织),”Blood111:1240-1247(2008))证实了这种钙结合位点并提出了在A2结构域中的第二个可能位点。这个结构还显示A1和A3结构域中占有两个1型铜离子位点。较早的功能研究已显示铜离子促进重链和轻链缔合形成异源二聚体,这在生理pH值下将链间亲和力增加几倍(Fay等人,“HumanFactor VIIIa Subunit Structure:Reconstruction of Factor VIIIa from theIsolated A1/A3-C1-C2Dimer and A2Subunit(人因子VIIIa亚基结构:由分离的A1/A3-C1-C2二聚体和A2亚基重构因子VIIIa),”J Biol Chem.266:8957-8962(1991);Wakabayashi等人,“pH-dependent Association ofFactor VIII Chains:Enhancement of Affinity at Physiological pH by Cu2+(pH依赖性的因子VIII链的缔合:Cu2+在生理pH下增强亲和力),”BiochimBiophysActa.1764:1094-1101(2006);Ansong等人,“Factor VIII A3DomainResidues1954-1961Represent an A1Domain-Interactive Site(因子VIII A3结构域残基1954-1961代表A1结构域相互作用位点),”Biochemistry44:8850-8857(2005))。
因子VIIIa的不稳定性是由A2亚基和A1/A3C1C2二聚体之间的弱静电相互作用引起的(Fay等人,“Human Factor VIIIa Subunit Structure:Reconstruction of Factor VIIIa from the Isolated A1/A3-C1-C2Dimer and A2Subunit(人因子VIIIa亚基结构:由分离的A1/A3-C1-C2二聚体和A2亚基重构因子VIIIa),”J Biol Chem.266:8957-8962(1991);Lollar等人,“pH-dependent Denaturation of Thrombin-activated Porcine Factor VIII(凝血酶激活的猪因子VIII的pH依赖性的变性,”J Biol Chem.265:1688-1692(1990))并且会导致因子Xase的活性减弱(Lollar等人,“Coagulant Propeniesof Hybrid Human/Porcine Factor VIII Molecules(杂合的人/猪因子VIII分子的促凝血特性),”J Biol Chem.267:23652-23657(1992);Fay等人,“Modelfor the Factor VIIIa-dependent Decay of the Intrinsic Factor Xase:Role ofSubunit Dissociation and Factor IXa-catalyzed Proteolysis(因子VIIIa依赖性的内在因子Xase衰退(decay)的模型:亚基解离和因子IXa催化的蛋白水解的作用),”JBiol Chem.271:6027-6032(1996))。关于因子VIIIa中的A2亚基的缔合的可用信息是有限的,A1和A3结构域中的残基似乎都促进这种亚基的保留。已经显示几种因子VIII点突变相对于野生型有利于A2的解离,并且这些残基定位在A1-A2结构域界面(Pipe等人,“Mild HemophiliaA Caused by Increased Rate of Factor VIII A2Subunit Dissociation:Evidencefor Nonproteolytic Inactivation of Factor VIIIa in vivo(因子VIII A2亚基解离的速率增加引起的轻度血友病A:体内因子VIII非蛋白水解灭活的证据),”Blood93:176-l83(1999);Pipe等人,“Hemophilia A Mutations Associatedwith1-stage/2-stage Activity Discrepancy Disrupt Protein-protein Interactionswithin the Triplicated A Domains of Thrombin-activated Factor VIIIa(1期/2期活性差异相关的血友病A突变破坏凝血酶激活的因子VIIIa的三个A结构域中的蛋白-蛋白相互作用),”Blood97:685-691(2001))或A2-A3结构域界面(Hakeos等人,“Hemophilia A Mutations within the Factor VIII A2-A3Subunit Interface Destabilize Factor VIIIa and Cause One-stage/Two-stageActivity Discrepancy(因子VIII A2-A3亚基界面内的血友病A突变使因子VIIIa不稳定并且引起1期/2期活性差异),”Thromb Haemost.88:781-787(2002))。这些因子VIII变体表现出特征性的1期/2期测定差异(Duncan等人,“Familial Discrepancy Between the One-stage and Two-stage Factor VIIIMethods in a Subgroup of Patients with Haemophilia A(患血友病A的患者亚群中1期和2期因子VIII方法之间的家族差异),”BrJHaematol.87:846-848(1994);Rudzki等人,“Mutations in a Subgroup of Patients with MildHaemophilia A and a Familial Discrepancy Between the One-stage andTwo-stage Factor VIII:C Methods(患轻度血友病A的患者亚群中的突变和1期与2期因子VIII:C方法之间的家族差异),”BrJ Haematol.94:400-406(1996)),其中由于A2亚基解离的速率增加致使后一种测定所测得的活性值显著降低。
因子VIII的A结构域的基于血浆铜蓝蛋白的同源性模型的检测(Pemberton等人,“A Molecular Model for the Triplicated A Domains ofHuman Factor VIII Based on the Crystal Structure of Human Ceruloplasmin(基于人血浆铜蓝蛋白的晶体结构的人因子VIII的三个A结构域的分子模型),”Blood89:2413-2421(1997))表明A2结构域与A1和A3结构域的每一个之间的的延伸界面,其中多个可能的接触点有利于结合相互作用。
在稳定因子VIIIa方面存在着明显的兴趣,因为更稳定形式的蛋白代表了血友病A的优良治疗剂,可能需要较少的材料来治疗患者(Fay等人,“Mutating Factor VIII:Lessons from Structure to Function(对因子VIII进行突变:由结构到功能的教导),”Blood Reviews19:15-27(2005))。为了这个目的,描述了因子VIII的制备,其中通过在A2和其他的因子VIII结构域之间引入新共价键在重组蛋白中制备了突变以防止A2亚基解离(Pipe等人,“Characterization of a Genetically Engineered Inactivation-resistantCoagulation Factor VIIIa(遗传工程化的抗失活的凝血因子VIIIa的表征),”Proc Natl Acad Sci USA94:11851-11856(1997);Gale等人,“An EngineeredInterdomain Disulfide Bond Stabilizes Human Blood Coagulation Factor VIIIa(工程化的结构域间二硫键稳定人血凝血因子VIIIa),”J.Thromb.Haemostasis1:1966-1971(2003))。然而,从此有建议认为这些类型的突变可能在治疗性因子VIII中是不希望的,因为他们基本上排除了下调的方法。这种情况会产生可能引起损伤的血栓前病症。因此,可能希望增强因子VIII和因子VIIIa两者的稳定性,但是以促进前血栓病症的可能性最小的方式进行。
本发明针对于克服本领域内的这些和其他缺陷。
发明内容
本发明的第一方面涉及重组因子VIII,所述重组因子VIII包括导致因子VIII和因子VIIIa两者的稳定性增强的一种或多种突变。
优选地,所述一种或多种突变构成了疏水性氨基酸残基对A1A2或A2A3结构域界面的任一界面或两个界面的一个或多个带电荷氨基酸残基的取代。本发明的特别优选的重组因子VIII包括野生型因子VIII的Glu287残基的取代、野生型因子VIII的Asp302残基的取代、野生型因子VIII的Asp519残基的取代、野生型因子VIII的Glu665残基的取代、野生型因子VIII的Glu1984残基的取代或它们的组合。
本发明的第二方面涉及包含根据本发明的第一方面的重组因子VIII的药物组合物。
本发明的第三方面涉及编码根据本发明的第一方面的重组因子VIII的分离的核酸分子。本发明的这个方面还包括含有编码本发明的重组因子VIII的DNA分子的重组DNA表达系统、和含有所述DNA分子和/或重组表达系统的重组宿主细胞。
本发明的第四方面涉及制备重组因子VIII的方法,该方法包括:将根据本发明的第三方面的宿主细胞在使得所述宿主细胞表达重组因子VIII的条件下培养;和分离所述重组因子VIII。
本发明的第五方面涉及治疗动物血友病A的方法。该治疗方法包括:给表现血友病A的动物施用有效量的根据本发明的第一方面的重组因子VIII,从而使动物在血管损伤后表现出有效的血液凝集。
本发明证明在A1A2和A2A3结构域界面的大量带电荷的残基不参与氢键键合,但是可能使因子VIII结构不稳定和/或在因子VIII前体辅因子激活后促进A2亚基解离。在所附的实施例中显示用疏水性残基取代这些带电荷的残基-目的是增加隐藏的疏水区域并诱导隐藏的亲水区域-增强结构域间的结合亲和力。在评估了因子VIII变体在较高的温度下的活性和A2亚基解离所导致的因子VIII活性衰退的时程之后评估了稳定性参数。这些研究的结果证明大量突变产生增加的稳定性参数,这与可能由于A2结构域界面处隐藏的电荷所导致的去稳定力的消除是一致的。因子VIII和激活的辅因子VIIIa的这些稳定化的变体应该提供治疗血友病A的改良治疗剂。
附图说明
图1为图解如通过一期凝集测定(黑色柱)和二期发色因子Xa生成测定(灰色柱)所测量的因子VIII突变体相对于野生型因子VIII的活性的图。野生型和突变体因子VIII形式的活性如实施例中所描述地测量。误差线显示由三次独立的测定进行平均的标准偏差的值。
图2A-B分别图解野生型和突变体因子VIII和因子VIIIa的活性衰退。在图2A中,在55℃下孵育因子VIII(4nM)并在所指示的时间取出等分试样并通过如实施例中所描述的因子Xa生成测定来测定活性。显示了野生型(虚线,空心圆)、R282A(空心三角形)、S524A(空心正方形)、N684A(空心菱形)、R531A(实心圆)、S650A(实心三角形)、E287A(实心正方形)和D302A(实心菱形)的结果。在图2B中,在40nM因子IXa存在的条件下在23℃下孵育凝血酶激活的因子VIIIa(4nM)并在所指示的时间点取出等分试样并通过如实施例中所描述的因子Xa生成测定来测量活性。显示了野生型(虚线,空心圆)、R282A(空心三角形)、S524A(空心正方形)、Y1792F(空心菱形)、N684A(实心圆)、Y1786F(实心三角形)、R531A(实心正方形)、E287A(实心菱形)和D302A(灰色圆)的结果。所选的快速衰退的变体的结果在图2B的插图中以放大的比例显示。
图3A-B图解因子VIII突变体和野生型因子VIII的SDS-PAGE和蛋白质印迹分析。图3A显示在8%的聚丙烯酰胺凝胶上的SDS-PAGE后通过GelCode显现的纯化的野生型和突变体因子VIII蛋白(0.77μg)。图3B显示在8%的聚丙烯酰胺凝胶上电泳,转移到PVDF膜上并通过生物素化的R8B12抗体探测的纯化的野生型和突变体因子VIII蛋白(0.34μg)。条带通过如所附的实施例中所描述的化学荧光显现。野生型(泳道1)、Glu272Ala(泳道2)、Glu272Val(泳道3)、Asp519Ala(泳道4)、Asp519Val(泳道5)、Glu665Ala(泳道6)、Glu665Val(泳道7)、Glu1984Ala(泳道8)和Glul984Val(泳道9)。MW,分子量标志物:sFVIII,单链形式的因子VIII:HC,重链:LC,轻链。单链形式与野生型和突变体因子VIII的异源二聚体形式的表观化学计量比为0.96(野生型)、0.64(Glu272Ala)、0.92(Glu272Val)、0.74(Asp519Ala)、0.8(Asp519Val)、0.64(Glu665Ala)、0.63(Glu665Val)、0.91(Glu1984Ala)和0.5(Glu1984Val)。
图4A-D图解因子VIII突变体相对于野生型因子VIII的比活和凝血酶生成测定。图4A显示使用如所附的实施例中所描述的一期凝集测定(灰色柱)和二期发色因子Xa生成测定(实心柱)所测定的活性值。图4B-C图解因子VIII蛋白的凝血酶生成图(thrombogram)。野生型(虚线)、Glu272Ala(空心正方形)、Glu272Val(实心正方形)、Asp519Ala(空心圆)、Asp519Val(实心圆)、Glu665Ala(空心三角形)、Glu665Val(实心三角形)、Glul984Ala(空心菱形)和Glu1984Val(实心菱形)。图4D图解由凝血酶生成测定所获得的参数值。凝血酶生成测定如所附的实施例中所描述地进行。凝血酶生成图显示三次重复样品的平均值。参数值表达为相对于野生型的值(%)。野生型的实际值为7.5±0.5分钟(滞后时间)、13.7±0.3分钟(峰时间)、157.3±14.7nM(峰值)、979.8±37.9nM/分钟(ETP)。显示了滞后时间(空心柱)、峰时间(灰色柱)、峰值(实心柱)和ETP(线纹柱)。误差线显示由三次独立的测定进行平均的标准偏差的值。
图5A-B图解野生型和突变体因子VIII的活性衰退。在不同的温度(52-60℃)下孵育因子VIII(4nM)并在所指示的时间取出等分试样并通过如所附的实施例中所描述的因子Xa生成测定来测定活性。通过非线性最小二乘回归拟合数据,获得衰退速率。每个点代表由三次独立的测定平均的值。显示了野生型(虚线,交叉符号)、Glu272Ala(空心正方形)、Glu272Val(实心正方形)、Asp519Ala(空心圆)、Asp519Val(实心圆)、Glu665Ala(空心三角形)、Glu665Val(实心三角形)、Glu1984Ala(空心菱形)、Glu1984Val(实心菱形)和全长的Kogenate因子VIII(灰色圆)的结果。图5A图解在55℃孵育后代表性的因子VIII衰退曲线。图5B图解在不同温度下的因子VIII衰退速率的曲线。图5B中的插图为在52-55℃的温度范围内的衰退结果的放大。
图6为图解在37℃下血浆中的因子VIII的活性衰退的图。在缺乏因子VIII的血浆中在37℃下孵育因子VIII(1nM)并在所指示的时间取出等分试样并进行如所附的实施例中所描述的一期凝集测定。显示了野生型(虚线,交叉符号)、Asp519Ala(空心圆)、Asp519Val(实心圆)、Glu665Ala(空心三角形)、Glu665Val(实心三角形)、Glu1984Ala(空心菱形)和Glu1984Val(实心菱形)的结果。通过非线性最小二乘回归拟合数据,并且每个点代表由三次独立的测定平均的值。
图7A-B为图解在不存在或存在因子IXa的条件下野生型和突变体因子VIIIa的活性衰退的图。图7A显示在23℃下孵育的凝血酶激活的因子VIIIa(4nM)。在所指示的时间点取出等分试样并通过如所附的实施例中所描述的因子Xa生成测定来测量活性。图7B显示在存在IXa的条件下野生型和突变体因子VIIIa的活性衰退。在存在40nM因子IXa的条件下用凝血酶激活因子VIII(4nM)。在所指示的时间点取出等分试样并通过如所附的实施例中所描述的因子Xa生成测定来测量活性。显示了野生型(虚线,交叉符号)、Glu272Ala(空心正方形)、Glu272Val(实心正方形)、Asp519Ala(空心圆)、Asp519Val(实心圆)、Glu665Ala(空心三角形)、Glu665Val(实心三角形)、Glu1984Ala(空心菱形)和Glul984Val(实心菱形)的结果。通过非线性最小二乘回归拟合数据,并且每个点代表由三次独立的测定平均的值。
图8为图解将Asp519、Glu665和/或Glu1984残基变为Ala或Val的因子VIII双组合突变体或三组合突变体的比活的图。使用如实施例中所描述的一期凝集测定(灰色柱)和二期发色因子Xa生成测定(黑色柱)测定活性值。误差线显示由三次独立的测定进行平均的标准偏差值。
图9为图解野生型因子VIII和将Asp519、Glu665和/或Glu1984残基变为Ala或Val的因子VIII双组合突变体或三组合突变体的因子VIII活性衰退速率的图。如实施例中所描述的,进行因子VIII活性衰退实验并通过非线性最小二乘回归评估衰退速率。灰色柱显示相对于最佳单突变体的速率(参见实施例5,图5A)并其通过除以最佳(最低)的速率值计算。例如,最佳单突变体D519AE665A对的速率相对值等于D519AE665A的衰退速率除以D519A的衰退速率。黑色柱显示表示为10倍的实际衰退速率参数值。
图10为图解野生型因子VIII和将Asp519、Glu665和/或Glu1984残基变为Ala或Val的因子VIII双组合突变体或三组合突变体的因子VIIIa活性衰退速率的图。如实施例中所描述的,在不存在因子IXa的条件下孵育1.5nM因子VIIIa后进行因子VIIIa活性衰退测量并且通过非线性最小二乘回归评估了衰退速率。灰色柱显示相对于最佳单突变体的速率(参见实施例7,图7A),并且其如图9的说明中所描述的计算。黑色柱显示表示为10倍的实际衰退速率参数值。
图11A-B图解使用组合突变体的凝血酶生成测定的结果。图11A显示因子VIII蛋白的凝血酶生成图。凝血酶生成测定如实施例中所描述的进行。试剂的终浓度为0.2nM(因子VIII)、0.5pM(rTF)、4μM(PSPCPE囊泡)、433uM(荧光底物)、13.3mM CalCl2和105nM(凝血酶校准物)。显示了野生型(虚线)、D519AE665V(空心圆)、D519VE665V(实心圆)、D519VE1984A(空心三角形)和D519VE665VE1984A(实心三角形)的结果。图11B显示由凝血酶生成测定所获得的参数值。凝血酶生成图显示三次重复样品的平均值。参数值表达为相对于野生型的值(%)。野生型的实际值为8.5±0.4分钟(滞后时间)、21.3±0.6分钟(峰时间)、58.5±15.6nM(峰值)、883.6±199.8nM/分钟(ETP)。滞后时间(空心柱)、峰时间(灰色柱)、峰值(实心柱)和ETP(线纹柱)。误差线显示由三次独立的测定进行平均的标准偏差值。
图12A-C图解与Glu113Ala突变的组合的在残基Asp519、Glu665和/或Glu1984处的Ala或Val突变体的因子VIII和因子VIIIa的相对于野生型的比活和活性衰退速率。图12A显示使用如实施例中所描述的一期凝集测定(灰色柱)和二期发色因子Xa生成测定(黑色柱)所测定的组合突变体相对于野生型的比活。误差线显示由三次独立的测定进行平均的标准偏差值。图12B显示在55℃下的因子VIII活性衰退测定的结果,衰退速率通过如实施例中所描述的非线性最小二乘回归评估。图12C显示在不存在因子IXa的条件下孵育1.5nM因子VIIIa后进行的因子VIIIa活性衰退测量的结果,并且衰退速率通过如实施例中所描述的非线性最小二乘回归评估。
具体实施方式
本发明涉及重组因子VIII,所述重组因子VIII具有导致因子VIII和因子VIIIa两者的稳定性增强的一种或多种突变。
本发明的重组因子VIII可以通过修饰野生型因子VIII或突变体因子VIII的氨基酸序列来制备,所述突变体因子VIII已被另外修饰以影响因子VIII的其他特性,如抗原性、循环半衰期、蛋白分泌、对因子IXa和/或因子X的亲和力、改变的因子VIII灭活裂解位点、免疫原性、架存期等。
可以根据本发明被修饰的合适的野生型因子VIII可以来自多种动物,包括但不限于:哺乳动物,如人(参见,例如GenBank登录号AAA52484(氨基酸)和K01740(核苷酸);和GenBank登录号CAD97566(氨基酸)和AX746360(核苷酸),通过引用将它们整体并入本文)、大鼠(参见,例如,GenBank登录号AAQ21580(氨基酸)和AY362193(核苷酸),通过引用将它们整体并入本文)、小鼠(参见,例如,GenBank登录号AAA37385(氨基酸)和L05573(核苷酸),通过引用将它们整体并入本文)、豚鼠、狗(参见,例如,GenBank登录号AAB87412(氨基酸)和AF016234(核苷酸);以及GenBank登录号AAC05384(氨基酸)和AF049489(核苷酸),通过引用将它们整体并入本文)、猫、猴、黑猩猩(参见,例如GenBank登录号XP_529212(氨基酸和XM_529212(核苷酸),通过引用将它们整体并入本文)、猩猩、牛、马、绵羊、猪(参见,例如GenBank登录号NP_999332(氨基酸)和NM_214167(核苷酸),通过引用将它们整体并入本文)、山羊、兔和鸡。这些和其他序列还可以经由血友病A突变、结构、测试和资源网站(或HAMSTeRS)以电子方式获得,该网站还提供人、猪、鼠和犬的因子VIII蛋白的比对。因此,哺乳动物因子VIII蛋白的保守性和同源性是熟知的。
举例来说,人因子VIII cDNA核苷酸和预测的氨基酸序列分别以SEQID NO:1和2显示在下面。人因子VIII是作为约300kDa的单链蛋白合成的,它具有定义“结构域”序列NH2-A1-A2-B-A3-C1-C2-COOH的内在序列同源性。在因子VIII分子中,如本文所用的“结构域”为通过内在氨基酸序列同一性和凝血酶的蛋白裂解位点定义的连续的氨基酸序列。除非另外指明,否则在与人氨基酸序列(SEQ ID NO:2)比对时,因子VIII结构域包含下列氨基酸残基:
A1,残基Ala1-Arg372;
A2,残基Ser373-Arg740;
B,残基Ser741-Arg1648;
A3,残基Ser1690-Ile2032;
C1,残基Arg2033-Asn2172;以及
C2,残基Ser2173-Tyr2332。
A3-C1-C2序列包含残基Ser1690-Tyr2332。剩余的序列残基Glu1649-Arg1689通常被称为因子VIII轻链激活肽。因子VIII被凝血酶或因子Xa激活,凝血酶或因子Xa将它从冯维勒布兰德因子解离形成因子VIIIa,因子VIIIa具有促凝血功能。因子VIIIa的生物学功能是通过几级放大来增加因子IXa对因子X激活的催化效力。凝血酶激活的因子VIIIa为160kDa的A1/A2/A3-C1-C2异源三聚体,它与因子IXa和因子X在血小板或单核细胞的表面上形成复合体。如本文所用的“部分结构域”是形成结构域的部分的连续氨基酸序列。
编码野生型人因子VIII的基因具有如下的SEQ ID NO:1的核苷酸序列:
gccaccagaagatactacctgggtgcagtggaactgtcatgggactatatgcaaagtgatctcggtgagctgcctgtggacgcaagatttcctcctagagtgccaaaatcttttccattcaacacctcagtcgtgtacaaaaagactctgtttgtagaattcacggatcaccttttcaacatcgctaagccaaggccaccctggatgggtctgctaggtcctaccatccaggctgaggtttatgatacagtggtcattacacttaagaacatggcttcccatcctgtcagtcttcatgctgttggtgtatcctactggaaagcttctgagggagctgaatatgatgatcagaccagtcaaagggagaaagaagatgataaagtcttccctggtggaagccatacatatgtctggcaggtcctgaaagagaatggtccaatggcctctgacccactgtgccttacctactcatatctttctcatgtggacctggtaaaagacttgaattcaggcctcattggagccctactagtatgtagagaagggagtctggccaaggaaaagacacagaccttgcacaaatttatactactttttgctgtatttgatgaagggaaaagttggcactcagaaacaaagaactccttgatgcaggatagggatgctgcatctgctcgggcctggcctaaaatgcacacagtcaatggttatgtaaacaggtctctgccaggtctgattggatgccacaggaaatcagtctattggcatgtgattggaatgggcaccactcctgaagtgcactcaatattcctcgaaggtcacacatttcttgtgaggaaccatcgccaggcgtccttggaaatctcgccaataactttccttactgctcaaacactcttgatggaccttggacagtttctactgttttgtcatatctcttcccaccaacatgatggcatggaagcttatgtcaaagtagacagctgtccagaggaaccccaactacgaatgaaaaataatgaagaagcggaagactatgatgatgatcttactgattctgaaatggatgtggtcaggtttgatgatgacaactctccttcctttatccaaattcgctcagttgccaagaagcatcctaaaacttgggtacattacattgctgctgaagaggaggactgggactatgctcccttagtcctcgcccccgatgacagaagttataaaagtcaatatttgaacaatggccctcagcggattggtaggaagtacaaaaaagtccgatttatggcatacacagatgaaacctttaagactcgtgaagctattcagcatgaatcaggaatcttgggacctttactttatggggaagttggagacacactgttgattatatttaagaatcaagcaagcagaccatataacatctaccctcacggaatcactgatgtccgtcctttgtattcaaggagattaccaaaaggtgtaaaacatttgaaggattttccaattctgccaggagaaatattcaaatataaatggacagtgactgtagaagatgggccaactaaatcagatcctcggtgcctgacccgctattactctagtttcgttaatatggagagagatctagcttcaggactcattggccctctcctcatctgctacaaagaatctgtagatcaaagaggaaaccagataatgtcagacaagaggaatgtcatcctgttttctgtatttgatgagaaccgaagctggtacctcacagagaatatacaacgctttctccccaatccagctggagtgcagcttgaggatccagagttccaagcctccaacatcatgcacagcatcaatggctatgtttttgatagtttgcagttgtcagtttgtttgcatgaggtggcatactggtacattctaagcattggagcacagactgacttcctttctgtcttcttctctggatataccttcaaacacaaaatggtctatgaagacacactcaccctattcccattctcaggagaaactgtcttcatgtcgatggaaaacccaggtctatggattctggggtgccacaactcagactttcggaacagaggcatgaccgccttactgaaggtttctagttgtgacaagaacactggtgattattacgaggacagttatgaagatatttcagcatacttgctgagtaaaaacaatgccattgaaccaagaagcttctcccagaattcaagacaccctagcactaggcaaaagcaatttaatgccaccacaattccagaaaatgacatagagaagactgacccttggtttgcacacagaacacctatgcctaaaatacaaaatgtctcctctagtgatttgttgatgctcttgcgacagagtcctactccacatgggctatccttatctgatctccaagaagccaaatatgagactttttctgatgatccatcacctggagcaatagacagtaataacagcctgtctgaaatgacacacttcaggccacagctccatcacagtggggacatggtatttacccctgagtcaggcctccaattaagattaaatgagaaactggggacaactgcagcaacagagttgaagaaacttgatttcaaagtttctagtacatcaaataatctgatttcaacaattccatcagacaatttggcagcaggtactgataatacaagttccttaggacccccaagtatgccagttcattatgatagtcaattagataccactctatttggcaaaaagtcatctccccttactgagtctggtggacctctgagcttgagtgaagaaaataatgattcaaagttgttagaatcaggtttaatgaatagccaagaaagttcatggggaaaaaatgtatcgtcaacagagagtggtaggttatttaaagggaaaagagctcatggacctgctttgttgactaaagataatgccttattcaaagttagcatctctttgttaaagacaaacaaaacttccaataattcagcaactaatagaaagactcacattgatggcccatcattattaattgagaatagtccatcagtctggcaaaatatattagaaagtgacactgagtttaaaaaagtgacacctttgattcatgacagaatgcttatggacaaaaatgctacagctttgaggctaaatcatatgtcaaataaaactacttcatcaaaaaacatggaaatggtccaacagaaaaaagagggccccattccaccagatgcacaaaatccagatatgtcgttctttaagatgctattcttgccagaatcagcaaggtggatacaaaggactcatggaaagaactctctgaactctgggcaaggccccagtccaaagcaattagtatccttaggaccagaaaaatctgtggaaggtcagaatttcttgtctgagaaaaacaaagtggtagtaggaaagggtgaatttacaaaggacgtaggactcaaagagatggtttttccaagcagcagaaacctatttcttactaacttggataatttacatgaaaataatacacacaatcaagaaaaaaaaattcaggaagaaatagaaaagaaggaaacattaatccaagagaatgtagttttgcctcagatacatacagtgactggcactaagaatttcatgaagaaccttttcttactgagcactaggcaaaatgtagaaggttcatatgacggggcatatgctccagtacttcaagattttaggtcattaaatgattcaacaaatagaacaaagaaacacacagctcatttctcaaaaaaaggggaggaagaaaacttggaaggcttgggaaatcaaaccaagcaaattgtagagaaatatgcatgcaccacaaggatatctcctaatacaagccagcagaattttgtcacgcaacgtagtaagagagctttgaaacaattcagactcccactagaagaaacagaacttgaaaaaaggataattgtggatgacacctcaacccagtggtccaaaaacatgaaacatttgaccccgagcaccctcacacagatagactacaatgagaaggagaaaggggccattactcagtctcccttatcagattgccttacgaggagtcatagcatccctcaagcaaatagatctccattacccattgcaaaggtatcatcatttccatctattagacctatatatctgaccagggtcctattccaagacaactcttctcatcttccagcagcatcttatagaaagaaagattctggggtccaagaaagcagtcatttcttacaaggagccaaaaaaaataacctttctttagccattctaaccttggagatgactggtgatcaaagagaggttggctccctggggacaagtgccacaaattcagtcacatacaagaaagttgagaacactgttctcccgaaaccagacttgcccaaaacatctggcaaagttgaattgcttccaaaagttcacatttatcagaaggacctattccctacggaaactagcaatgggtctcctggccatctggatctcgtggaagggagccttcttcagggaacagagggagcgattaagtggaatgaagcaaacagacctggaaaagttccctttctgagagtagcaacagaaagctctgcaaagactccctccaagctattggatcctcttgcttgggataaccactatggtactcagataccaaaagaagagtggaaatcccaagagaagtcaccagaaaaaacagcttttaagaaaaaggataccattttgtccctgaacgcttgtgaaagcaatcatgcaatagcagcaataaatgagggacaaaataagcccgaaatagaagtcacctgggcaaagcaaggtaggactgaaaggctgtgctctcaaaacccaccagtcttgaaacgccatcaacgggaaataactcgtactactcttcagtcagatcaagaggaaattgactatgatgatac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由SEQ ID NO:1编码的野生型人因子VIII具有如下的SEQ ID NO:2的氨基酸序列:
ATRRYYLGAVELSWDYMQSDLGELPVDARFPPRVPKSFPFNTSVVYKKTLFVEFTVHLFNIAKPRPPWMGLLGPTIQAEVYDTVVITLKNMASHPVSLHAVGVSYWKASEGAEYDDQTSQREKEDDKVFPGGSHTYVWQVLKENGPMASDPLCLTYSYLSHVDLVKDLNSGLIGALLVCREGSLAKEKTQTLHKFILLFAVFDEGKSWHSETKNSLMQDRDAASARAWPKMHTVNGYVNRSLPGLIGCHRKSVYWHVIGMGTTPEVHSIFLEGHTFLVRNHRQASLISPITFLTAQTLLMLGQFLLFCHISSHQHDGMEAYVKVDSCPEEPQLRMKNNEEAEDYDDDLTDSEMDVVRFDDDNSPSFIQIRSVAKKHPKTWVHYIAAEEEDWDYAPLVLAPDDRSYKSQYLNNGPQRIGRKYKKVRFMAYTDETFKTREAIQHESGILGPLLYGEVGDTLLIIFKNQASRPYNIYPHGITDVRPLYSRRLPKGVKHLKDFPILPGEIFKYKWTVTVEGPTKSDPRCLTRYYSSFVNMERDLASGLIGPLLICYKESVDQRGNQIMSDKRNVILFSVFDENRSWYLTENIQRFLPNPAGVQLEDPEFQASNIMHSINGYVFDSLQLSVCLHEVAYWYILSIGAQTDFLSVFFSGYTFKHKMVYDTLTLFPFSGETVFMSMENPGLWILGCHNSDFRNRGMTALLKVSSCDKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFSQNSRHPSTRQKQFNATTIPENDIEKTDPWFAHRTPMPKIQNVSSSDLLMLLRQSPTPHGLSLSDLQEAKYETFSDDPSPGAIDSNNSLSEMTHFRPQLHHSGDMVFTPESGLQLRLNEKLGTTAATELKKLDFKVSSTSNNLISTIPSDNLAAGTDNTSSLGPPSMPVHYDSQLDTTLFGKKSSPLTESGGPLSLSEENNDSKLLESGLMNSQESSWGKNVSSTESGRLFKGKRAHGPALLTKDNALFKVSISLLKTNKTSNNSATNRKTHIDGPSLLIENSPSVWQNILESDTEFKKVTPLIHDRMLMDKNATALRLNHMSNKTTSSKNMEMVQQKKEGPIPPDAQNPDMSFFKMLFLPESARWIQRTHGKNSLNSGQGPSPKQLVSLGPEKSVEGQNFLSEKNKVVVGKGEFTKDVGLKEMVFPSSRNLFLTNLDNLHENNTHNQEKKIQEEIEKKETLIQENVVLPQIHTVTGTKNFMKNLFLLSTRQNVEGSYEGAYAPVLQDFRSLNDSTNRTKKHTAHFSKKGEEENLEGLGNQTKQIVEKYACTTRISPNTSQQNFVTQRSKRALKQFRLPLEETELEKRIIVDDTSTQWSKNMKHLTPSTLTQIDYNEKEKGAITQSPLSDCLTRSHSIPQANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLTRVLFQDNSSHLPAASYRKKDSGVQESSHFLQGAKKNNLSLAILTLEMTGDQREVGSLGTSATNSVTYKKVENTVLPKPDLPKTSGKVELLPKVHIYQKDLFPTETSNGSPGHLDLVEGSLLQGTEGAIKWNEANRPGKVPFLRVATESSAKTPSKLLDPLAWDNHYGTQIPKEEWKSQEKSPEKTAFKKKDTILSLNACESNHAIAAINEGQNKPEIEVTWAKQGRTERLCSQNPPVLKRHQREITRTTLQSDQEEIDYDDTISVEMKKEDFDIYDEDENQSPRSFQKKTRHYFIAAVERLWDYGMSSSPHVLRNRAQSGSVPQFKKVVFQEFTDGSFTQPLYRGELNEHLGLLGPYIRAEVEDNIMVTFRNQASRPYSFYSSLISYEEDQRQGAEPRKNFVKPNETKTYFWKVQHHMAPTKDEFDCKAWAYFSDVDLEKDVHSGLIGPLLVCHTNTLNPAHGRQVTVQEFALFFTIFDETKSWYFTENMERNCRAPCNIQMEDPTFKENYRFHAINGYIMDTLPGLVMAQDQRIRWYLLSMGSNENIHSIHFSGHVFTVRKKEEYKMALYNLYPGVFTVEMLPSKAGIWRVECLIGEHLHAGMSTLFLVYSNKCQTPLGMASGHIRDFQITASGQYGQWAPKLARLHYSGSINAWSTKEPFSWIKVDLLAPMIIHGIKTQGARQKFSSLYISQFIIMYSLDGKKWQTYRGNSTGTLMVFFGNVDSSGIKHNIFNPPIIARYIRLHPTHYSIRSTLRMELMGCDLNSCSMPLGMESKAISDAQITASSYFTNMFATWSPSKARLHLQGRSNAWRPQVNNPKEWLQVDFQKTMKVTGVTTQGVKSLLTSMYVKEFLISSSQDGHQWTLFFQNGKVKVFQGNQDSFTPVVNSLDPPLLTRYLRIHPQSWVHQIALRMEVLGCEAQDLY
在上面的序列中,通过粗体和下划线标记了几个带电荷的残基,包括Glu287、Asp302、Asp519、Glu665和Glu1984。
本发明的重组因子VIII由在A1A2或A2A3结构域界面的任一个或两个的一个或多个带电荷氨基酸残基被疏水性氨基酸残基取代来表征。优选地,被取代的带电荷的残基为不参与A1A2结构域之间或A2A3结构域之间的氢键键合的Glu或Asp残基。取代带电荷的残基的疏水性氨基酸残基可以为Ala、Val、Ile、Leu、Met、Phe或Trp的任一种。本发明的特别优选的重组因子VIII包括野生型因子VIII的Glu287残基的取代、野生型因子VIII的Asp302残基的取代、野生型因子VIII的Asp519残基的取代、野生型因子VIII的Glu665残基的取代、野生型因子VIII的Glu1984残基的取代或它们的组合。D302A、E287A、E665A、E665V、D519A、D519V、E1984A和E1984V取代对于实现因子VIII和因子VIIIa二者的稳定性增强的重组因子VIII是优选的。这些取代的优选组合包括但不限于:D519AE665V、D519VE665V和D519VE1984A双突变体、以及D519AE665VE1984A和D519VE665VE1984A三突变体。认为这些突变体的增强的稳定性是通过与野生型因子VIIIa相比稳定因子VIII中的结构域间界面以及降低A2亚基从A1/A3C1C2解离来达成的。
可以根据本发明被修饰的合适的突变体因子VIII序列还可以包括任何先前已知的或随后被鉴定的突变体因子VIII序列,所述突变体因子VIII序列具有关于多种属性的被修饰的特性,包括但不限于:抗原性、循环半衰期、蛋白分泌、对因子IXa和/或因子X的亲和力、改变的因子VIII灭活裂解位点、因子VIIIa的增强的比活、免疫原性和架存期。
可以根据本发明被修饰的合适的突变体因子VIII的一个实例为具有修饰的钙结合位点,优选在SEQ ID NO:2的残基113处的因子VIII。这提供具有增强的比活的因子VIIIa。这种类型的示例性突变体描述在授予Fay等人的美国专利申请公布第10/581,471号中,通过引用将其整体并入本文。优选地,还根据一种或多种上文所描述的突变(例如,在位置287、302、519、665和/或1984)修饰残基113突变体以提供高稳定性/高比活的因子VIII蛋白。示例性的高稳定性/高比活的因子VIII蛋白包括但不限于:具有组合的E113AD519A、E113AD519V、E113AE665A、E113AE665V或E113AE1984V取代的那些。
可以根据本发明被修饰的合适的突变体因子VIII的第二个实例为含有SEQ ID NO:2的氨基酸残基1-740和1690-2332的无B结构域的因子VIII(参见,例如授予Lollar的美国专利第6,458,563号,通过引用将其整体并入本文)。
在本发明的无B结构域的重组因子VIII的一个实施方式中,B-结构域被DNA接头区段取代,并且至少一个密码子被编码与猪的因子VIII的相应残基具有相同电荷的氨基酸残基的密码子取代(参见,例如授予Hauser等人的美国专利申请公布第2004/0197875号,通过引用将其整体并入本文)。
在本发明的无B结构域重组因子VIII的另一实施方式中,修饰的突变体因子VIII被具有插入一个或多个位点的截短的因子IX内含子1的核苷酸序列编码(参见,例如授予Negrier的美国专利第6,800,461号和授予Negrier的美国专利第6,780,614号,通过引用将他们每一个整体并入本文)。这种重组因子VIII可用于体外产生较高产率的重组因子VIII和用于基因治疗的转移载体中(参见,例如授予Negrier的美国专利第6,800,461号,通过引用将其整体并入)。在此实施方式的具体实例中,重组因子VIII可以被具有插入两个位点的截断的因子IX内含子1并且具有适于在造血细胞系、并且尤其是在血小板中驱动表达的启动子的核苷酸序列编码(参见,例如授予Negrier的美国专利第6,780,614号,通过引用将其整体并入本文)。
无论实施方式如何,无B结构域的因子VIII优选含有一种或多种上文所述的突变(例如,在位置287、302、519、665和/或1984)。根据本文的实施例所制备的重组因子VIII蛋白为无B结构域的。
可以根据本发明被修饰的合适的突变体因子VIII的第三个实例为含有一个或多个动物氨基酸残基作为负责人因子VIII的抗原性的人氨基酸残基的取代的嵌合的人/动物因子VIII。具体地,动物(例如,猪)残基取代可以包括但不限于下列的一种或多种:R484A、R488G、P485A、L486S、Y487L、Y487A、S488A、S488L、R489A、R489S、R490G、L491S、P492L、P492A、K493A、G494S、V495A、K496M、H497L、L498S、K499M、D500A、F501A、P502L、I503M、L504M、P505A、G506A、E507G、I508M、I508A、M2199I、F2200L、L2252F、V2223A、K2227E和/或L2251(授予Lollar的美国专利第5,859,204号、授予Lollar的美国专利第6,770,744号和授予Lollar的美国专利申请公布第2003/0166536号,通过引用将它们每一个整体并入本文)。优选地,重组嵌合因子VIII含有一种或多种上文所述的突变(例如,在位置287、302、519、665和/或1984)。
可以根据本发明被修饰的合适的突变体因子VIII的第四个实例为以下的增强的亲和力的因子VIII:因子IXa(参见,例如Fay等人,“Factor VIIIaA2Subunit Residues558-565Represent a Factor IXa Interactive Site(因子VIIIa A2亚基残基558-565代表因子IXa的相互作用位点),”J.Biol.Chem.269(32):20522-7(1994);Bajaj等人,“Factor IXa:Factor VIIIa Interaction.Helix330-338of Factor IXa Interacts with Residues558-565and SpatiallyAdjacent Regions of the A2Subunit of Factor VIIIa(因子IXa:因子VIIIa相互作用。因子IXa的螺旋330-338与因子VIIIa的A2亚基的残基558-565和空间邻近区相互作用),”J.Biol.Chem.276(19):16302-9(2001);和Lenting等人“The Sequence Glu1811-Lys1818of Human Blood Coagulation FactorVIII Comprises a Binding Site for Activated Factor IX(人血凝血因子VIII的序列Glu1811-Lys1818包含激活的因子IX的结合位点),”J. Biol.Chem.271(4):1935-40(1996),通过引用将它们每一个整体并入本文)和/或因子X(参见,例如Lapan等人,“Localization of a Factor X Interactive Site in theA1Subunit of Factor VIIIa(因子VIIIa的A1亚基中的因子X相互作用位点的定位),”J.Biol.Chem.272:2082-88(1997),通过引用将其整体并入本文)。优选地,亲和力增强的因子VIII含有一种或多种上文所述的突变(例如,在位置287、302、519、665和/或1984)。
可以根据本发明被修饰的合适的突变体因子VIII的第五个实例为被修饰以增强因子VIII的分泌的因子VIII(参见,例如Swaroop等人,“Mutagenesis of a Potential Immunoglobulin-Binding Protein-Binding SiteEnhances Secretion of Coagulation Factor VIII(可能的免疫球蛋白-结合蛋白-结合位点的诱变增强凝血因子VIII的分泌),”J.Biol.Chem.272(39):24121-4(1997),通过引用将其整体并入本文)。优选地,分泌增强的突变体因子VIII含有一种或多种上文所鉴定的突变(例如,在位置287、302、519、665和/或1984)。
可以根据本发明被修饰的合适的突变体因子VIII的第六个实例为具有增加的循环半衰期的因子VIII。这种修饰可以使用多种方法制备,包括但不限于:通过降低与下列物质的相互作用:硫酸乙酰肝素(Sarafanov等人,“Cell Surface Heparan Sulfate Proteoglycans Participate in Factor VIIICatabolism Mediated by Low Density Lipoprotein Receptor-Related Protein(细胞表面硫酸乙酰肝素蛋白聚糖参与低密度脂蛋白受体相关蛋白介导的因子VIII的分解代谢),”J. Biol.Chem.276(15):11970-9(2001),通过引用将其整体并入本文)和/或低密度脂蛋白受体相关的蛋白(“LRP”)(Saenko等人,“Role of the Low Density Lipoprotein-Related Protein Receptor inMediation of Factor VIII Catabolism(低密度脂蛋白相关蛋白的受体在介导因子VIII分解代谢中的作用),”J. Biol.Chem.274(53):37685-92(1999);以及Lenting等人,“The Light Chain of Factor VIII Comprises a Binding Site forLow Density Lipoprotein Receptor-Related Protein(因子VIII的轻链包含低密度脂蛋白受体相关蛋白的结合位点),”J.Biol.Chem.274(34):23734-9(1999),通过引用将他们每一个整体并入本文)。优选地,半衰期增强的突变体因子VIII含有一种或多种上文所述的突变(例加,在位置287、302、519、665和/或1984)。
可以根据本发明被修饰的合适的突变体因子VIII的第七个实例为由以下核苷酸序列编码的修饰的因子VIII,该核苷酸序列经过修饰编码在已知的现有的表位中的氨基酸以在天冬酰胺残基处产生糖基化的识别序列(参见,例如授予Lollar的美国专利第6,759,216号,通过引用将其整体并入本文)。此实例的突变体因子VIII可用于提供逃离存在的抑制抗体检测(低抗原性因子VIII)和降低发展抑制抗体的可能(低免疫原性因子VIII)的修饰的因子VIII。在这个实例的一个具体的实施方式中,修饰的因子VIII被突变为具有N-连接的糖基化的共有氨基酸序列。这种共有序列的实例为N-X-S/T,其中N为天冬酰胺,X为任一氨基酸,并且S/T代表丝氨酸或苏氨酸(参见授予Lollar的美国专利第6,759,216号,通过引用将其整体并入本文)。优选地,糖基化位点被修饰的因子VIII含有一种或多种上文所鉴定的突变(例如,在位置287、302、519、665和/或1984)。
可以根据本发明被修饰的合适的突变体因子VIII的第八个实例为修饰的因子VIII,该修饰的因子VIII为具有多种突变的促凝血活性的因子VIII(参见,例如授予Kaufman等人的美国专利申请公布第2004/0092442号,通过引用将其整体并入本文)。这种实施方式的一个实例涉及被进行如下修饰的修饰的因子VIII:(i)缺失冯维勒布兰德因子结合位点;(ii)在Arg740处添加突变;和(iii)在A2和A3结构域之间添加氨基酸序列间隔区,其中所述氨基酸间隔区具有足以在激活后使促凝血活性因子VIII蛋白变为异源二聚体的长度(参见授予Kaufman等人的美国专利中请公部第2004/0092442号,通过引用将其整体并入本文)。优选地,促凝血活性的因子VIII还被修饰以含有一种或多种上文所述的突变(例如,在位置287、302、519、665和/或1984)。
此外,突变体因子VIII可以被修饰以具有通常关于重组凝血因子的多种优势(参见,例如Saenko等人,“The Future of Recombinant CoagulationFactors(重组凝血因子的前景),”J.Thrombosis and Haemostasis1:922-930(2003),通过引用将其整体并入本文)。
本发明的重组因子VIII可以在使A1A2或A2A3结构域界面不稳定的任何带电荷的残基(包括位置87、302、519、665或1984)处被修饰;以及被修饰为无B结构域、嵌合的、具有增强因子VIIIa活性的修饰的钙结合位点(例如,在位置113处)、具有改变的灭活裂解位点、具有增强的因子IXa和/或因子X亲和力、具有增强的分泌、具有增加的循环半衰期、或具有突变体糖基化位点;或除对带电荷的残基的一个或多个修饰外再进行任何一种或多种此类修饰,包括改善重组因子VIII的活性的修饰的钙结合位点。实施例中描述了许多示例性的无B结构域、比活增强、高稳定性的重组因子VIII蛋白。
重组因子VIII优选以基本上纯的形式制备。在具体的实施方式中,基本上纯的重组因子VIII为至少约80%纯的,更优选至少90%纯的,最优选至少95%纯的。基本上纯的重组因子VIII可以通过本领域内熟知的常规技术获得。通常,基本上纯的重组因子VIII是被分泌到重组宿主细胞的生长培养基中的。可选择地,制备了基本上纯的重组因子VIII,但是其并不分泌到生长培养基中。在这种情况下,为了分离基本上纯的重组因子VIII,繁殖携带重组质粒的宿主细胞,通过超声、加热或化学处理将其裂解,并将匀浆物离心以去除细胞碎片。然后对上清液进行硫酸铵分级沉淀。将含有基本上纯的重组因子VIII的级分在合适尺寸的葡聚糖或聚丙烯酰胺柱中进行凝胶过滤以分离重组因子VIII。如果需要,蛋白级分(含有基本上纯的重组因子VIII)可以进一步通过高效液相色谱(“HPLC”)来纯化。
本发明的另一方面涉及编码本发明的重组因子VIII的分离的核酸分子。编码重组因子VIII的分离的核酸分子可以为RNA或DNA。
在一个实施方式中,分离的核酸分子可以具有编码增强因子VIII的比活的位置113处的突变,同时还被带电荷的残基的取代中的一种或多种(例如,在SEQ ID NO:2的位置287、302、519、665、1984和/或332-340)修饰的核苷酸序列。
在另一实施方式中,分离的核酸分子可以具有编码上文所述类型的无B结构域因子VIII,同时还被带电荷的残基的取代中的一种或多种(例如,在SEQ ID NO:2的位置287、302、519、665和/或1984)修饰的核苷酸序列。
在另一实施方式中,分离的核酸分子可以具有编码上文所述类型的嵌合的人/猪因子VIII,同时还被带电荷的残基的取代中的一种或多种(例如,在SEQ ID NO:2的位置287、302、519、665和/或1984)修饰的核苷酸序列。
在另一实施方式中,分离的核酸分子可以具有编码灭活位点被如上文所述修饰的因子VIII,同时还被带电荷的残基的取代中的一种或多种(例如,在SEQ ID NO:2的位置287、302、519、665和/或1984)修饰的核苷酸序列。
在又一实施方式中,分离的核酸分子可以具有编码对因子IXa和/或因子X的亲和力增强了的因子VIII,同时还被带电荷的残基的取代中的一种或多种(例如,在SEQ ID NO:2的位置287、302、519、665和/或1984)修饰的核苷酸序列。
在再一实施方式中,分离的核酸分子可以具有编码对多种血清结合蛋白的亲和力被改变以增加其循环半衰期的因子VIII,同时还被带电荷的残基的取代中的一种或多种(例如,在SEQ ID NO:2的位置287、302、519、665和/或1984)修饰的核苷酸序列。
在另一实施方式中,分离的核酸分子可以具有编码在培养物中分泌增加的因子VIII,同时还被带电荷的残基的取代中的一种或多种(例如,在SEQ ID NO:2的位置287、302、519、665和/或1984)修饰的核苷酸序列。
在另一实施方式中,分离的核酸分子可以具有编码具有一个或多个非天然存在的糖基化位点的因子VIII,同时还被带电荷的残基的取代中的一种或多种(例如在SEQ ID NO:2的位置287、302、519、665和/或1984)修饰的核苷酸序列。
在又一实施方式中,分离的核酸分子编码在任何一个或多个如上文所描述的带电荷的残基处被修饰并且还被修饰以具有下列的任何两个或更多个的分离的核酸分子:被修饰为无B结构域、被修饰为嵌合的、被修饰为具有改变的灭活裂解位点、被修饰为具有增强的因子IXa和/或因子X亲和力、被修饰为具有增强的分泌、被修饰为具有增加的循环半衰期、被修饰为具有一个或多个非天然存在的糖基化位点、以及在钙结合位点内(例如,在位置113)被修饰以便改善重组因子VIII的比活。
本发明的另一方面涉及包含本发明的分离的DNA分子的重组DNA表达系统,该表达系统编码重组因子VIII。在一个实施方式中,DNA分子相对于启动子在有义方向上。
本发明的另一方面涉及包含编码本发明的重组因子VIII的分离的核酸分子的宿主细胞。在具体的实施方式中,宿主细胞可以含有DNA分子形式的分离的核酸分子,所述DNA分子形式为稳定的质粒或在宿主细胞基因组中的稳定的插入序列或整合序列。在另一实施方式中,宿主细胞可以含有在表达系统中的DNA分子。合适的宿主细胞可以为但不限于:动物细胞(例如,幼仓鼠肾(“BHK”)细胞)、细菌细胞(例如,大肠杆菌(E.coli))、昆虫细胞(例如,Sf9细胞)、真菌细胞、酵母细胞(例如,酵母菌(Saccharomyces)或裂殖酵母属(Schizosaccharomyces))、植物细胞(例如,拟南芥(Arabidopsis)细胞或烟草细胞)、或藻类细胞。
重组DNA表达系统和宿主细胞可以使用本领域内熟知的多种重组技术来制备,如下文所进一步讨论的。
可以使用常规的重组DNA技术将编码本发明的重组因子VIII的DNA分子整合到细胞中。一般地,这包括将DNA分子插入到该DNA分子为异源(即,不是正常存在的)的表达系统中。异源DNA分子以有义方向和正确的阅读框插入表达系统或载体中。载体含有用于插入的编码蛋白的序列的转录和翻译的必需元件。因此,本发明的一个实施方式提供含有本发明的分离的核酸的DNA构建体,所述分离的核酸与5’启动子和3’调节区(即,转录终止子)两者可操作连接,所述5’启动子和3’调节区能够使本发明的编码的重组因子VIII在宿主细胞或宿主生物体中转录和表达。
关于本发明的重组表达系统,含有编码本发明的重组因子VIII的DNA分子的表达载体可以使用本领域内的常见技术制备。可以使用本领域内所熟知的试剂将本发明的核酸分子插入到许多可用的表达载体的任一种中。在制备用于表达的DNA载体中,可以将DNA序列正常地插入到或取代到细菌质粒中。可以采用任何方便的质粒,它们的特征为具有细菌复制系统、容许在细菌中进行选择的标志物和方便定位的一个或多个独特的限制位点。载体的选择取决于优选的转化技术和用于转化的靶宿主。
可以采用多种宿主-载体系统来表达编码重组因子VIII的序列。主要地,载体系统必须与所用的宿主细胞相容。宿主-载体系统包括但不限于下列:用噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA转化的细菌;微生物,如含酵母载体的酵母;用病毒(例加,痘苗病毒、腺病毒、腺伴随病毒等)感染的哺乳动物细胞系统;用病毒(例如,杆状病毒)感染的昆虫细胞系统;和用细菌(例如,土壤杆菌属(Agrobacterium))感染的植物细胞。这些载体的表达元件在它们的强度和特异性方面不同。依据所采用的宿主-载体系统,可以使用大量合适的转录和翻译元件的任一种。
当以重组方式制备时,在重组的宿主细胞中表达因子VIII蛋白或多肽(或它们的片段或变体),所述重组的宿主细胞通常但不排他地为真核细胞。
用于实施本发明的合适的载体包括但不限于:下列病毒载体,如λ载体系统gtll、gtWES.tB、Charon4;和质粒载体,如pCMV、pBR322、pBR325、pACYC177、pACYC184、pUC8、pUC9、pUC18、pUC19、pLG339、pR290、pKC37、pKC101、SV40、pBluescript II SK+/-或pBluescript II KS+/-(参见“Stratagene Cloning Systems(Stratagene克隆系统)”目录(1993))、pQE、pIH821、pGEX、pET系列(Studier等人,“Use of T7RNA Polymerase to DirectExpression of Cloned Genes(使用T7RNA聚合酶来指导克隆的基因的表达),”Methods in Enzymology185:60-89(1990),通过引用将其整体并入本文);以及它们的任何衍生物。现在已知的或今后描述的用于遗传转化的任何合适的载体适用于本发明。
可以经由转化,尤其是转导、接合、动员或电穿孔将重组分子引入细胞。使用本领域内标准的克隆方法将DNA序列克隆到载体中,如Maniatis等人在下面文献中所描述的,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(分子克隆:实验室手册),Cold Springs Harbor,N.Y.:Cold Springs Laboratory,(1982),通过引用将其整体并入本文。
通过引用整体并入本文的授予Cohen和Boyer的美国专利第4,237,224号描述了使用限制酶裂解和用DNA连接酶连接制备重组质粒形式的表达载体。然后通过转化方法引入这些重组质粒并在单细胞培养物中复制,所述单细胞培养物包括原核生物体和以组织培养物生长的真核细胞。
不同的遗传信号和加工事件控制着许多水平的基因表达(例如,DNA转录和信使RNA(mRNA)翻译)。
DNA转录依赖于启动子的存在,所述启动子为指导RNA聚合酶结合并从而促进mRNA合成的DNA序列。真核启动子的DNA序列与原核启动子的DNA序列不同。此外,真核启动子和伴随的遗传信号在原核系统中可能不被识别或可能不起作用;并且,另外,原核启动子在真核细胞中不被识别并且不起作用。
类似地,原核细胞中的mRNA翻译依赖于适当的原核信号的存在,该原核信号与真核细胞的信号不同。mRNA在原核细胞中的有效翻译需要在mRNA上的称为Shine-Dalgamo(“SD”)序列的核糖体结合位点。这个序列为位于起始密码子前的短的mRNA核苷酸序列,所述起始密码子通常为AUG,它编码蛋白氨基末端的蛋氨酸。SD序列与16S rRNA(核糖体RNA)的3’末端互补并且可能通过与rRNA形成双链体来促进mRNA与核糖体的结合从而容许核糖体正确定位。对于使基因表达最大化的综述,参见Roberts和Lauer,Methods in Enzymology68:473(1979),通过引用将其整体并入本文。
启动子在它们的“强度”(即,它们促进转录的能力)方面不同。为了表达克隆的基因的目的,通常希望使用强启动子以获得高水平的转录和因此的高水平基因表达。依据所采用的宿主细胞系统,可以使用大量合适的启动子的任一种。例如,当在大肠杆菌(Escherichia coli)中克隆时,它的噬菌体或质粒启动子,如T7噬菌体启动子、lac启动子、trp启动子、recA启动子、核糖体RNA启动子、大肠杆菌噬菌体λ的PR启动子和PI启动子以及包括但不限于lacUV5、ompF、bla、lpp等的其他启动子可用于指导邻近的DNA区段的高水平转录。此外,杂合的trp-lacUV5(tac)启动子或由重组DNA或其他合成DNA技术所制备的其他大肠杆菌启动子可用于提供插入的基因的转录。
可以选择在不特异性诱导的时候抑制启动子作用的细菌宿主细胞株系和表达载体。在某些操作中,特异性诱导物的添加是插入的DNA有效转录所必需的。例如,lac操纵子通过添加乳糖或IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)诱导。诸如trp、pro等的许多其他操纵子处于不同的控制下。
特异性起始信号也是原核细胞中有效的基因转录和翻译所需的。如分别由合成的基因特异性信使RNA和蛋白的量所测量的,这些转录和翻译起始信号强度可以不同。含有启动子的DNA表达载体还可以含有多种“强”转录和/或翻译起始信号的任何组合。例如,大肠杆菌中的有效翻译需要距起始密码子(“ATG”)的5’端约7-9个碱基的SD序列以提供核糖体结合位点。因此,可以采用宿主细胞核糖体可以利用的任何SD-ATG组合。这种组合包括但不限于:来自大肠杆菌噬菌体λ的cro基因或N基因或来自大肠杆菌色氨酸E、D、C、B或A基因的SD-ATG组合。此外,可以使用通过重组DNA或包括整合合成的核苷酸的其他技术制备的任何SD-ATG组合。
在一个实施方式中,本发明的核酸分子以有义方向整合到合适的载体中以便使开放阅读框正确地确定方向以便编码的蛋白在所选择的启动子的控制下表达。这包括将合适的调节元件引入DNA-载体构建体。这些包括载体的非翻译区、有用的启动子和5’和3’的非翻译区,它们与宿主细胞蛋白相互作用以实现转录和翻译。这些元件在它们的强度和特异性方面可以不同。依据所利用的载体系统和宿主,可以使用任何数目的合适的转录和翻译元件,包括组成型的和诱导型的启动子。
组成型的启动子为在生物体的整个发育和生命中指导基因表达的启动子。
诱导型启动子为能够响应于诱导物直接或间接激活一种或多种DNA序列或基因的转录的启动子。在不存在诱导物的条件下,DNA序列或基因将不被转录。
本发明的DNA构建体还可以包括可操作地连接至编码所选择的蛋白的DNA分子的3’调节区,该3’调节区选自能够提供在所选的宿主细胞中表达的正确的转录终止和mRNA多聚腺苷酸化的那些。
可以使用如下列文献中所描述的熟知的分子克隆技术将所选择的载体、启动子和合适的3’调节区连接在一起以制备本发明的DNA构建体:Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(分子克隆:实验室手册),第二版,Cold Spring Harbor Press,NY(1989);和Ausubel,F.M.等人Current Protocols in Molecular Biology(现代分子生物学实验技术),New York,N.Y:John Wiley&Sons(1989),通过引用将它们每一个整体并入本文。
如所注意到的,使用原核宿主细胞的一个替代方案为使用真核宿主细胞,如哺乳动物细胞,真核宿主细胞也可用于重组制备本发明的重组因子VIII。适于实施本发明的哺乳动物细胞包括,但不限于:COS(例如,ATCCNo.CRL1650或1651)、BHK(例如,ATCC No.CRL6281)、CHO(例如,ATCC No.CCL61)、HeLa(例如,ATCC No.CCL2)、293(ATCC No.1573)、CHOP、和NS-1细胞。
用于在哺乳动物细胞中指导表达的合适的表达载体通常包括启动子以及本领域内已知的其他转录和翻译控制序列。常见的启动子包括SV40、MMTV、金属硫蛋白-1、腺病毒Ela、CMV、极早期(immediate early)、免疫球蛋白重链启动子和增强子和RSV-LTR。
一旦制备了本发明的DNA构建体,其便可容易地被整合到宿主细胞中。因此,本发明的另一方面涉及制备重组细胞的方法。基本地,此方法通过在有效地在宿主细胞中产生DNA分子转录的条件下用本发明的DNA构建体转化宿主细胞来进行。可以经由转化,尤其是转导、接合、动员或电穿孔将重组分子引入细胞。
根据本文所讨论的重组技术,本发明的另一方面涉及制备本发明的重组因子VIII的方法。此方法包括将本发明的宿主细胞在使宿主细胞表达重组因子VIII的条件下培养。然后分离重组因子VIII。在一个实施方式中,宿主细胞在生长培养基中体外生长。在具体的实施方式中,合适的生长培养基可以包括但不限于含有冯维勒布兰德因子(在本文中称为“VWF”)的生长培养基。在这个实施方式中,宿主细胞可以含有编码VWF的转基因或VWF可以作为补充物被引入生长培养基。生长培养基中的VWF将容许重组因子VIII的较高表达水平。一旦重组因子VIII被分泌到生长培养基中,随后便可以使用相关的重组DNA和蛋白领域内的那些普通技术人员所熟知的技术(包括本文所描述的那些技术)将其从生长培养基中分离。在另一实施方式中,制备本发明的重组因子VIII的方法还包括在分离重组因子VIII之前破坏宿主细胞。在这个实施方式中,重组因子VIII是从细胞碎片中分离的。
位置287、302、519、665和/或1984处的修饰是尤其优选的,因为他们导致因子VIII和因子VIIIa两者的稳定性增强。这种增加的稳定性对于因子VIII的循环半衰期和血液凝集期间因子VIIIa的活性是很重要的。此外,这种特性在用于治疗用途的蛋白的纯化和制备期间增强可用因子VIII的回收方面很重要。
当表达载体用于体内转化以诱导靶细胞中的因子VIII表达的目的时,可以依据所需的增强程度采用不同强度的启动子。本领域的技术人员可以根据哺乳动物启动子作为启动子的强度而容易地选择合适的哺乳动物启动子。可选择地,可以为了在需要表达或抑制因子VIII时进行控制的目的而采用诱导型启动子。本领域的技术人员可以从本领域内已知的那些诱导型哺乳动物启动子中选择合适的启动子。最后,可以选择组织特异性哺乳动物启动子以将任何基因转化系统的效力限制在特定的组织中。组织特异性启动子是本领域内已知的并且可以根据要治疗的组织或细胞类型选择。
本发明的另一方面涉及治疗动物的诸如血友病尤其是血友病A的血液疾患的方法。这种方法包括给表现血友病A的动物施用有效量的本发明的重组因子VIII,从而使动物在血管损伤后表现出有效的血液凝集。合适的有效量的重组因子VIII可以包括但不限于约10至约50单位/千克动物体重之间。所述动物可以为任何动物,但是优选为人、大鼠、小鼠、豚鼠、狗、猫、猴、黑猩猩、猩猩、牛、马、绵羊、猪、山羊或兔。
本发明的重组因子VIII可用于在具有和不具有抑制抗体的血友病患者中和由于抑制抗体的显现所引起的获得性因子VIII缺乏的患者中治疗由因子VIII缺乏所致的不受控的出血(例如,关节内、颅内或胃肠出血)。在具体的实施方式中,根据与用于人或动物因子VIII相同的方法将单独的重组因子VIII或药物组合物形式(即,与稳定剂、递送溶媒(delivery vehicles)和/或载体组合)的重组因子VIII静脉内输注给患者。
可选择地,或除此之外,可以如下来施用重组因子VIII:通过施用如腺伴随病毒的病毒载体(Gnatenko等人,“Human Factor VIII Can BePackaged and Functionally Expressed in an Adeno-associated VirusBackground:Applicability to Hemophilia A Gene Therapy(人因子VIII可以在腺伴随病毒背景中被包装并功能性表达:血友病A基因治疗的适用性).”Br.J. Haematol.104:27-36(1999),通过引用将其整体并入本文);或通过移植遗传工程化以制备重组因子VIII的细胞,通常经由含这种细胞的装置进行移植。这种移植通常包括使用重组皮肤成纤维细胞,一种非病毒方法(Roth等人,“Nonviral Transfer of the Gene Encoding Coagulation FactorVIII in Patients with Sever Hemophilia(在患重度血友病的患者中编码凝血因子VIII的基因的非病毒转移).”New Engl.J.Med.344:1735-1742(2001),通过引用将其整体并入本文)。
应施用给需要这种治疗的患者的重组因子VIII的治疗剂量依据因子VIII缺乏的严重程度而不同。一般地,在频率、持续时间和单位方面调节剂量水平以与各患者的出血发作的严重程度和持续时间一致。因此,如标准的凝集测定所测量的,重组因子VIII以足以递送给患者治疗有效量的蛋白以停止出血的量包含在药物上可接受的载体、递送溶媒或稳定剂内。
因子VIII经典地被定义为存在于正常血浆中纠正由患血友病A的个体所获得的血浆中的凝集缺陷的物质。纯化的和部分纯化的形式的因子VIII的体外促凝血活性被用于计算输注到人患者中的重组因子VIII的剂量并且是从患者血浆中恢复活性和体内出血缺陷纠正的可靠指示物。根据Lusher等人,"Recombinant Factor VIII for the Treatment of Previously UntreatedPatients with Hemophilia A-Safety,Efficacy,and Development of Inhibitors(用于治疗之前未被治疗的患血友病A的患者的重组因子VIII-抑制剂的安全性、效力和开发)”New Engl.J.Med.328:453-459(1993);Pittman等人,“A2Domain of Human Recombinant-derived Factor VIII is Required forProcoagulant Activity but not for Thrombin Cleavage(人重组衍生的因子VIII的A2结构域是促凝血活性所需的但不是凝血酶裂解所需的).”Blood79:389-397(1992);和Brinkhous等人,“Purified Human Factor VIIIProcoagulant Protein:Comparative Hemostatic Response After Infusions intoHemophilic and von Willebrand Disease Dogs(纯化的人因子VIII促凝血蛋白:输注到患血友病的狗和患冯维勒布兰德疾病的狗中之后的比较性止血反应),”Proc.Natl.Acad.Sci.82:8752-8755(1985),通过引用将它们整体并入本文,在新的因子VIII分子的体外标准测定和他们在狗输注模型或人患者中的行为之间没有报道差异。
通常,通过施用重组因子VIII在患者中实现的期望的血浆因子VIII活性水平在正常的30-100%的范围内。在一个实施方式中,治疗性重组因子VIII的施用以静脉内给予,优选的剂量在约5至50单位/kg体重的范围内,具体在10-50单位/kg体重的范围内,更具体为20-40单位/kg体重的剂量;频率间隔为约8至24小时(重度感染的血友病患者)的范围内;治疗持续时间天数在1至10天的范围内或直至出血发作消退。参见,例如,Roberts和Jones,“Hemophilia and Related Conditions--CongenitalDeficiencies of Prothrombin(Factor II,Factor V,and Factors VII to XII)(血友病和相关病症-凝血酶原(因子II、因子V和因子VII至XII)先天性的缺乏),”Ch.153,1453-1474,1460,in Hematology(血液学),Williams,W J.等人,编辑(1990),通过引用将其整体并入本文。具有抑制剂的患者可能需要与它们先前的因子VIII形式不同的重组因子量。例如,患者可能需要较少的重组因子VIII,因为该重组因子VIII比野生型VIII具有更高的比活和降低的抗体反应性。对于使用人或血浆来源的因子VIII的治疗,输注的治疗性重组因子VIII的量通过一期因子VIII凝血测定来界定,并且在选择的情况下,通过测量在输注后患者血浆中的因子VIII来测定体内恢复。应了解对于任何具体的受试者,应根据个体的需要和施用或监督组合物施用的人员的专业判断随时间调整特定的剂量方案,并且本文所列出的浓度仅为示例性的,不旨在限制所要求保护的重组因子VIII的范围或实施。
根据需要,治疗形式可以为重组因子VIII的单次静脉内施用或在长期的时间阶段内的定期施用或连续施用。可选择地,治疗性重组因子VIII可以与脂质体一起以不同时间间隔内的一个或几个剂量皮下或口服施用。
重组因子VIII还可以用于治疗在显示出人因子VIII抗体的血友病患者中由于因子VIII缺乏所致的不受控的出血。
本文证明了本发明的重组因子VIII的比活可以与野生型因子VIII不同。具有比野生型因子VIII高的促凝血活性的因子VIII可用于治疗血友病,因为将需要较低的剂量来纠正患者的因子VIII缺乏。这不仅降低了患者和保险公司的医疗费用,还降低了发展针对因子VIII的免疫反应的可能(因为施用了较少的抗原)。
实施例
提供了下列实施例来说明本发明的实施方式,但是它们不意欲限制本发明的范围。
材料与方法
试剂
重组因子VIII(KogenateTM)是Bayer Corporation(Berkeley,CA)的LisaRegan博士慷慨赠送的。含有20%磷脂酰胆碱(PC)、40%磷脂酰乙醇胺(PE)和40%磷脂酰丝氨酸(PS)的磷脂囊泡如先前所述使用辛基葡糖苷制备(Mimms等人,“Phospholipid Vesicle Formation and TransmembraneProtein Incorporation Using Octyl Glucoside(使用辛基葡糖苷的磷脂囊泡形成和跨膜蛋白整合),”Biochemistry20:833-840(1981),通过引用将其整体并入本文)。试剂α-凝血酶、因子VIIa、因子IXaβ、因子X和因子Xa(Enzyme Research Laboratories,South Bend,IN)、蛭素和磷脂(DiaPharma,West Chester,OH)、发色的Xa底物Pefachrome Xa(Pefa-5523,CH3OCO-D-CHA-GIy-Arg-pNA·AcOH;Centerchem Inc.Norwalk CT)、重组人组织因子(rTF)、Innovin(Dade Behring,Newark,DE)、荧光底物Z-Gly-Gly-Arg-AMC(Calbiochem,San Diego,CA)和凝血酶校准物(Diagnostica Stago,Parsippany,NJ)购自所指示的卖主。
野生型和变体因子VIII的构建、表达和纯化:
将Ala突变体(在D27、H281、R282、E287、D302、S313、H317、T522、S524、R531、N538、E540、S650、S654、D666、E683、N684、S695、D696、S1791、D1795、Q1820、E1829、S1949、N1950和R1966处);Phe突变体(在Y476、Y664、Y1786和Y1792处);Ala和Val突变体(在带电荷的残基E272、D519、E665和E1984处);和野生型因子VIII形式分别构建为在B结构域中缺乏残基Gln744-Ser1637的无B结构域的因子VIII(Doering等人,“Expression and Characterization of Recombinant MurineFactor VIII(重组鼠因子VIII的表达和表征),”Thromb Haemost.88:450-458(2002),通过引用将其整体并入本文)。克隆和表达构建体是Pete Lollar博士和John Healey博士慷慨赠送的。如先前所描述的在BHK细胞中稳定地表达重组野生型和变体因子VIII形式并将其纯化(Wakabayashi等人,“Residues110-126in the A1Domain of Factor VIII Contain a Ca2+BindingSite Required for Cofactor Activity)因子VIII的A1结构域中的残基110-126含有辅因子活性所需的Ca2+结合位点),”J Biol Chem.279:12677-12684(2004),通过引用将其整体并入本文)。转染后,变体之间因子VIII分泌的量没有显著差异。如通过SDS-PAGE判断的,来自两个750cm2培养瓶的变体蛋白产量范围在大于10μg至约100μg,纯度为约85%至大于95%。因子VIII制剂中的主要污染物为白蛋白并且其在因子VIII中存在的浓度显示对活性参数的稳定性没有影响。因子VIII的浓度使用酶联免疫吸附测定(ELISA)测量,并且因子VIII的活性通过一期凝集测定和二期发色的因子Xa生成测定来确定,如下文所述。
SDS-PAGE和蛋白质印迹
将因子VIII蛋白(0.77μg用于凝胶染色并且0.34μg用于蛋白质印迹)在8%聚丙烯酰胺凝胶上以恒定电压(100V)电泳。将凝胶用Gelcode Blue(Thermo Scientific,Rockford,IL)染色;或将凝胶转移到聚偏氟乙烯膜上并用生物素化的抗A2抗体(R8B12,Green Mountain Antibodies,Burlington,VT)探测,然后用过氧化物酶轭合的链霉亲和素(Calbiochem,San Diego,CA)孵育。使化学发光底物(ECF底物,GE Healthcare,Piscataway,NJ)反应,并且使用磷光影象分析仪(Storm860,GE Healthcare)扫描荧光信号。单链因子VIII形式(170kDa)和重链(HC,90kDa)的密度使用ImageQuant软件(GE Healthcare)定量并且计算了量的比率。
ELISA
如先前所描述的进行夹心ELISA以测量因子VIII蛋白的浓度(Wakabayashi等人,“A Glu113Ala Mutation within a Factor VIIICa2+-Binding Site Enhances Cofactor Interactions in Factor Xase(因子VIIICa2+结合位点内的Glu113Ala突变增强因子Xase中的辅因子相互作用),”Biochemistry44:10298-10304(2005),通过引用将其整体并入本文),使用纯化的商业重组因子VIII(Kogenate,Bayer Corporation)作为标准物。因子VIII的捕获使用抗C2抗体(ESH-8,American Diagnostica Inc.,Stamford,CT),并采用生物素化的R8B12抗体来进行因子VIII检测。
一期凝集测定(One-stage Clotting Assay)
使用化学消除了因子VIII的基质血浆进行一期凝集测定(参见,“Methodology of the One-stage Assay of Factor VIII(VIII:C)(因子VIII(VIII:C)一期测定的方法),”Scand J Haematol Suppl.41:13-24(1984),通过引用将其整体并入本文)并使用Diagnostica Stago凝集仪器进行测定。在37℃下用APTT试剂(General DiagnosticsI孵育血浆6分钟,然后添加稀释的因子VIII至杯皿中。1分钟后对混合物进行复钙,测定凝集时间并将其与混合的正常血浆标准物比较。
二期发色因子Xa生成测定
根据先前所描述的方法(Wakabayashi等人,“Metal Ion-independentAssociation of Factor VIII Subunits and the Roles of Calcium and Copper Ionsfor Cofactor Activity and Inter-subunit Affinity(金属离子非依赖性的因子VIII亚基缔合以及钙离子和铜离子对辅因子活性和亚基间亲和力的作用),”Biochemistry40:10293-10300(2001);Wakabayashi等人,“Ca2+Bindingto Both the Heavy and Light Chains of Factor VIII Is Required for CofactorActivity(Ca2+与因子VIII的重链和轻链二者的结合是辅因子活性所需的),”Biochemistry41:8485-8492(2002),通过引用将它们每一个整体并入本文),在纯化的系统(Lollar等人,“Factor VIII and Factor VIIIa(因子VIII和因子VIIIa),”Methods Enzymol.222:128-143(1993),通过引用将其整体并入本文)中监测因子X向因子Xa转化的速率。用20nMα-凝血酶激活在含有20mM N-[2-羟乙基]哌嗪-N'-[2-乙烷磺酸](HEPES),pH7.2、0.1M NaCl、0.01%吐温20、0.01%BSA、5mM CaCl2和10μM PSPCPE囊泡的缓冲液(缓冲液A)中的因子VIII(1nM)1分钟。通过添加蛭素(10U/ml)来终止反应并使所得的因子VIIIa与因子IXa(40nM)反应1分钟。添加因子X(300nM)以开始反应,1分钟后通过添加50mM EDTA来淬灭反应。与发色底物Pefachrome Xa(0.46mM的终浓度)反应后测定生成的因子Xa。所有反应都在23℃下进行。
凝血酶生成测定
血浆中生成的凝血酶的量通过自动校准的凝血酶生成图象法测量(Hemker等人,“Calibrated Automated Thrombin Generation Measurement inClotting Plasma(凝集的血浆中自动校准的凝血酶生成测量),”PathophysiolHaemost Thromb.33:4-15(2003);Hemker等人,“Thrombin Generation inPlasma:Its Assessment via the Endogenous Thrombin Potential(血浆中的凝血酶生成:经由内源凝血酶潜能的凝血酶生成评估),”Thromb Haemost.74:134-138(1995),通过引用将他们每一个整体并入本文)。在96孔板中,将来自缺乏因子VIII抑制剂的重度血友病A患者的80μl缺乏因子VIII(小于1%的残余活性,血小板贫乏)的血浆(George King Bio-Medical,OverlandPark,KS)与在含有下列物质的HEPES-BSA缓中液(20mM HEPES,pH7.35、0.15M NaCl、6%BSA)中的因子VIII样品(20μl;6nM)混合:3pMrTF(rTF储液的浓度通过因子Xa生成测定使用已知浓度的因子VIIa测定)、PSPCPE囊泡(24μM),或与20μl凝血酶校准物(630nM)混合,并且立即通过与在含有0.1M CaCl2的HEPES-BSA缓冲液中的20μl荧光底物(2.5mM,Z-Gly-Gly-Arg-AMC)混合来开始反应。在37℃下将所有试剂预热。试剂的终浓度为1nM因子VIII(除非另外指明)、0.5pM rTF、4μMPSPCPE囊泡、433μM荧光底物、13.3mM CalCl2和105nM凝血酶校准物。使用微板荧光分光光度计(Spetramax Gemini,Molecular Devices,Sunnyvale,CA)用355nm(激发)/460nm(发射)的滤光设置以8秒钟的间隔监测37℃下的荧光信号的显现。荧光信号通过来自荧光酶校准物样品的参考信号来校正(Hemker等人,“Calibrated Automated ThrombinGeneration Measurement in Clotting Plasma(凝集的血浆中自动校准的凝血酶生成测量),”Pathophysiol Haemost Thromb.33:4-15(2003),通过引用将他们每一个整体并入本文)并且如先前所述计算以nM表示的实际凝血酶生成(Hemker等人,“Thrombin Generation in Plasma:Its Assessment via theEndogenous Thrombin Potential(血浆中的凝血酶生成:经由内源凝血酶潜能的凝血酶生成评估),”Thromb Haemost.74:134-138(1995),通过引用将其整体并入本文。
在较高的温度下的因子VIII活性
在52-60℃下孵育在缓冲液A中的野生型因子VIII或因子VIII变体(4nM)。在所指示的时间取出等分试样并使用二期发色因子Xa生成测定来测定残余的因子VIII活性。
因子VIIIa活性的时程
在23℃下用20nM凝血酶激活在含有10μM PSPCPE囊泡的缓冲液A中的野生型和突变体因子VIII(4nM)1分钟。立即用蛭素(10U/ml)淬灭反应,在所指示的时间取出等分试样并在添加因子IXa(40nM)和因子X(300nM)后使用因子Xa生成测定来测定活性。对于在存在因子IXa的条件下进行的衰退测量,在添加凝血酶之前将因子IXa(40nM)添加至反应物中。
血浆中的因子VIII稳定性
将野生型或变体因子VIII(1nM)添加到来自缺乏因子VIII抑制剂的重度血友病A患者的缺乏因子VIII(小于1%的残余活性)的血浆(GeorgeKing Bio-Medical)中。对血浆补充0.02%NaN3以防止微生物的生长,并在37℃下孵育样品。在所指示的时间取出等分试样并使用一期凝集测定来测定残余的活性。
数据分析
通过非线性最小二乘回归使用如下的等式将因子VIIIa的活性值作为时间的函数与单指数衰退曲线拟合:
A=A0×e-k·t
其中A为残余的因子VIIIa活性(nM/分钟/nM因子VIII),A0为初始活性,k为表观速率常数,并且t为在较高的温度下因子VIII的反应时间(分钟)(对于因子VIII衰退实验)或在淬灭凝血酶激活后的反应时间(分钟)(对于因子VIIIa衰退测量)。通过Kaleidagraph(Synergy,Reading,PA)进行非线性最小二乘回归分析。通过Student t检验进行平均值的比较。使用Swiss PDB Viewer分析了因子VIII A结构域的模制结构(Pemberton等人,“A Molecular Model for the Triplicated A Domains of Human Factor VIIIBased on the Crystal Structure of Human Ceruloplasmin(基于人血浆铜蓝蛋白的晶体结构的人因子VIII的三个A结构域的分子模型),”Blood89:2413-2421(1997),通过引用将其整体并入本文)以鉴定定位在A2结构域界面的带电荷的残基和根据分离互补结构域的极性原子的大于2.8的阈值显示出极小的氢键相互作用可能的带电荷的残基(Weiner等人,“ANew Force Field for Molecular Mechanical Simulation of Nucleic AcidsProteins(核酸蛋白的分子机械模拟的新力场),”J Am Chem Soc.106:765-784(1984),通过引用将其整体并入本文)。
实施例1:靶向氢键相互作用的因子VIII突变体的活性值
目前仍然不够了解的涉及因子VIII中的A2结构域的键合相互作用代表了调节辅因子活性的主要机制。因子VIII同源性模型(Pemberton等人,“A Molecular Model for the Triplicated A Domains of Human Factor VIIIBased on the Crystal Structure of Human Ceruloplasmin(基于人血浆铜蓝蛋白的晶体结构的人因子VIII的三个A结构域的分子模型),”Blood89:2413-2421(1997),通过引用将其整体并入本文)鉴定了许多氢键连接A2结构域中的残基与A1或A3结构域中的那些残基的可能。使用氢供体和受体原子之间的空间间隔小于2.8这一标准(Weiner等人,“A NewForce Field for Molecular Mechanical Simulation of Nucleic Acids Proteins(核酸蛋白的分子机械模拟的新力场),”J Am Chem Soc.106:765-784(1984),通过引用将其整体并入本文),鉴定出30个残基具有可能参与与来自互补的A结构域的原子氢键键合的侧链原子(参见下表1)。在所鉴定的残基的约一半中,侧链原子与骨架的羰基氧或酰胺氢原子并置,而剩余的则表现相邻侧链之间可能有相互作用。除了用Phe取代Tyr之外,将因子VIII A结构域中的靶残基分别突变为Ala,点突变以无B结构域的因子VIII稳定地表达。
使用一期凝集测定和(二期)因子Xa生成测定测量纯化的蛋白的因子VIII活性。来自一期测定(图1)的结果表明30个点突变体中9个显示出相对于野生型因子VIII小于50%的活性。这些变体中的5个表现出一期/二期测定差异(大于1.5倍的差异),其中3个突变体(S524A、H281A和E287A)仅在二期测定中显示出降低。在几个被靶向的残基中突变的活性值降低与那些侧链对因子VIII和/或因子VIIIa的结构稳定性的作用一致。
表1:能够氢键键合的氨基酸残基
a骨架羰基氧原子。
b骨架酰胺氢原子。
实施例2:因子VIII变体的热稳定性
为了评估野生型前体辅因子和变体的热稳定性,基于早期研究中所描述的因子VIII灭活结果采用55℃的温度(Ansong等人,“Factor VIII A3Domain Residues1954-1961Represent an A1Domain-Interactive Site(因子VIII A3结构域残基1954-1961代表A1结构域相互作用的位点),”Biochemistry44:8850-8857(2005),通过引用将其整体并入本文)。对于这些反应,在较高的温度下将因子VIII孵育指示的时间,然后立即将反应混合物冷却至室温,并使因子VIII与凝血酶反应,使用因子Xa生成测定来测定辅因子的活性。如“方法”中所描述测定热处理下因子VIII活性的损失速率,如残余辅因子功能所判定的。图2A显示与野生型相比对热处理显示出最大敏感性和最小敏感性的变体。
表2(下面)总结了获自30个变体的因子VIII热稳定性测定的结果。总体上,这些活性数据与单指数衰退函数很好地拟合,在大多数条件下相关系数大于0.98。尽管关于氨基酸取代的许多突变是良性的(21种显示出小于2倍的衰退速率差异),但是包括Arg282(A1结构域),和A2结构域残基Ser524、Asn684和Ser650的几种残基显示出约5倍至约20倍的因子VIII衰退速率增加,这表明了这些残基在维持因子VIII稳定性中的重要作用。此外,R282A和N684A变体显示出显著降低的比活值,这表明这两种单点突变影响了活性和稳定性参数两者。另一方面,用Ala取代E287和D302使得在较高的温度下因子VIII衰退速率降低。在突变后蛋白稳定性的这一明显增加与这些酸性侧链使野生型辅因子中的结构域间相互作用不稳定是一致的。
表2:因子VIII和VIIIa的衰退速率和活性值
突变体因子VIII形式是根据因子VIII衰退的速率递减排序的。根据最小二乘曲线拟合评估速率衰退值的标准偏差,并且标准偏差在平均值的约10%内。
a在存在因子IXa的条件下进行的衰退实验。
a在不存在因子IXa的条件下进行的衰退实验。
c括号内的值为相对于野生型的值
d单位/μg
enM生成的因子Xa/分钟/nM因子VIII
实施例3:因子VIIIa衰退速率
由于A2亚基的解离,因子VIIIa活性是不稳定的(Fay等人,“HumanFactor VIIIa Subunit Structure:Reconstruction of Factor VIIIa from theIsolated A1/A3-C1-C2Dimer and A2Subunit(人因子VIIIa亚基结构:由分离的A1/A3-C1-C2二聚体和A2亚基重构因子VIIIa),”J Biol Chem.266:8957-8962(1991);Lollar等人,“pH-dependent Denaturation ofThrombin-activated Porcine Factor VIII(凝血酶激活的猪因子VIII的pH依赖性的变性,”JBiol Chem.265:1688-1692(1990),通过引用将他们每一个整体并入本文)。早期研究的结果显示添加因子IXa和磷脂囊泡与因子VIIIa形成Xase复合体通过部分稳定因子Xase内的A2亚基(Fay等人,“Modelfor the Factor VIIIa-dependent Decay of the Intrinsic Factor Xase:Role ofSubunit Dissociation and Factor IXa-catalyzed Proteolysis(因子VIIIa依赖性的内在因子Xase衰退的模型:亚基解离和因子IXa催化的蛋白水解的作用),”J Biol Chem.271:6027-6032(1996),通过引用将其整体并入本文)降低该辅因子的不稳定性(Lollar等人,“Stabilization of Thrombin-activatedPorcine Factor VIII:C by Factor IXa Phospholipid(通过因子IXa磷脂稳定凝血酶激活的猪因子VIII:C),”Blood63:1303-1308(1984);Lamphear等人,“Factor IXa Enhances Reconstitution of Factor VIIIa from Isolated A2Subunitand A1/A3-C1-C2Dimer(因子IXa增强由分离的A2亚基和A1/A3-C1-C2二聚体重构因子VIIIa),”J.Biol.Chem.267:3725-3730(1992),通过引用将它们每一个整体并入本文)。这种方法最近被用来检测E1829A因子VIIIa突变体的衰退速率(Wakabayashi等人,“A3Domain Residue Glu1829Contributes to A2Subunit Retention in Factor VIIIa(A3结构域残基Glu1829促进因子VIIIa中的A2亚基保留),”J.Thromb.Haemost.5:996-1001(2007),通过引用将其整体并入本文),因为这种变体因子VIIIa的活性衰退在不存在因子IXa和膜的情况下太快而不能准确测量。类似地采用这种方法来评估此实施例中所描述的变体组的因子VIIIa衰退速率。将因子VIII(4nM)与摩尔过量的因子IXa(40nM)和磷脂囊泡一起孵育,用凝血酶快速激活,随后在23℃下在一段时间过程内测量因子Xase的活性。因子Xase活性的衰退速率由A2亚基解离引起,并且使用单指数衰退拟合数据。由于因子VIIIa(144nM)内A2亚基亲和力的高Kd值和反应中所用的低因子VIIIa浓度(4nM),可以忽视解离的A2亚基再缔合的影响,这支持应用简单的单指数进行这种回归分析。
结果显示在图2B中,该图显示了受影响最严重的变体以及显示对突变反应阳性的那些变体的数据。7种变体与野生型相比具有显著(大于5倍)增加的因子VIIIa衰退速率(表2)。这些突变包括:R282A、S524A、N684A、E1829A、Y1786F、D666A和Y1792F。如通过二期测定所测量的这些变体的因子VIII活性值显著低于通过一期测定所测得的那些活性值(图1),这与所述突变导致了可测量速率的A2亚基解离是一致的。此外,这些突变中的几种(包括R282A、N684A和Y1792F)在一期测定中显示出整体的低比活。如在因子VIII突变体具有这种测定差异的情况下一样,一期测定所测得的活性也降低(Pipe等人,“Mild Hemophilia A Caused byIncreased Rate of Factor VIII A2Subunit Dissociation:Evidence forNonproteolytic Inactivation of Factor VIIIa in vivo(因子VIII A2亚基解离的速率增加引起的轻度血友病A:体内因子VIII非蛋白水解灭活的证据),”Blood93:176-183(1999);Pipe等人,“Hemophilia A Mutations Associatedwith1-stage/2-stage Activity Discrepancy Disrupt Protein-protein Interactionswithin the Triplicated A Domains of Thrombin-activated Factor VIIIa(1期/2期活性差异相关的血友病A突变破坏凝血酶激活的因子VIIIa的三个A结构域中的蛋白-蛋白相互作用),”Blood97:685-691(2001);Hakeos等人,“Hemophilia A Mutations within the Factor VIII A2-A3Subunit InterfaceDestabilize Factor VIIIa and Cause One-stage/Two-stage Activity Discrepancy(因子VIII A2-A3亚基界面内的血友病A突变使因子VIIIa不稳定并且引起1期/2期活性差异),”Thromb Haemost.88:781-787(2002),通过引用将它们每一个整体并入本文),这可能反应了A2解离速率对测定因子VIII活性的直接影响。
相反地,如通过凝血酶激活后辅因子衰退速率的降低所判定的,具有比野生型因子VIII高的热稳定性的变体E287A和D302A也产生增强的因子VIIIa稳定性。D302A变体的结果更明显,它显示出与野生型因子VIIIa相比降低约2倍的辅因子衰退速率,在40分钟后保持其初始活性的约90%。这种观察现象与突变主要改变前体辅因子内结构域间界面的构象一致。
总之,实施例1-3中的这些结果鉴定了在因子VIII的前体辅因子和辅因子形式中多种残基对A2(结构域)亚基间的相互作用的贡献,其中所选择的残基对蛋白稳定性的作用完全不同。尽管所观察到的在靶残基处的突变的作用大部分为良性的或有害的,在两个A1结构域酸性残基D302和E287处的突变产生了在前体辅因子形式和活性辅因子形式中适度的稳定性增强。E287相对于野生型的相对活性略微降低,而D302变体的活性值与野生型蛋白不可区别,这表明后一种代表了功能获得性突变。这些结果表明,一些去稳定化可能是由于界面处的(负)电荷的隐藏引起和/或这些残基侧链为疏水性时,导致稳定性增加。
实施例4:另外的靶残基的鉴定和Glu272、Asp519、Glu665和Glu1984处的点突变体的产生
根据前面的实施例的结果,探究了其他带电荷的残基的取代。使用因子VIII的A结构域的基于血浆铜蓝蛋白的同源性模型(Pemberton等人,“AMolecular Model for the Triplicated A Domains of Human Factor VIII Basedon the Crystal Structure of Human Ceruloplasmin(基于人血浆铜蓝蛋白的晶体结构的人因子VIII的三个A结构域的分子模型),”Blood89:2413-2421(1997),通过引用将其整体并入本文)鉴定出了4个带电荷的残基(Glu272、Asp519、Glu665和Glu1984)。这四种残基似乎在A2结构域与A1结构域(Glu272和Asp519)或与A3结构域(Glu665和Glu1984)的界面处被隐藏,但是根据可能键合的邻近原子的空间间隔大于2.8,它们似乎不参与氢键键合相互作用。将这些残基突变为Ala或Val以消除电荷,并提供与来自其他被隐藏的残基的类似侧链的可能的疏水相互作用。在稳定表达的BHK细胞系中将因子VIII变体制备成无B结构域的因子VIII。
因子VIII表达为单链和异源二聚体形式的混合物。如通过SDS-PAGE所判定,纯化的蛋白在约85%至大于95%的范围内(图3A)。使用采用抗A2结构域抗体的蛋白质印迹来定量单链和异源二聚体形式的化学计量(图3B)。野生型的这个值接近于一,因子VIII变体的这个值则略低并且是不定的。
使用一期和二期测定两者(图4A)和凝血酶生成参数(图4B-D)来评估纯化的蛋白的比活。除了Glu272Ala变体外所有变体都产生为野生型比活值的至少80%的比活值,这表明剩余的突变对因子VIII辅因子功能如果有影响的话也具有很小的影响。在低rTF浓度(0.5pM)和生理浓度(1nM)的因子VIII的条件下进行的凝血酶生成产生了与比活值平行的结果。图4D中所显示的参数值表明Glu272Ala的峰值和ETP与野生型相比降低了,而剩余变体的所有其他参数值的范围在野生型值的大于80%至110%的范围内。
实施例5:Glu272、Asp519、Glu665和Glu1984因子VIII变体的热稳定性
如通过活性损失速率所判定的,在较高的温度下评估了纯化的因子VIII突变体蛋白的稳定性。在52-60℃下孵育因子VIII(4nM),并且在所指示的时间点取出等分试样,冷却至室温,使其与凝血酶反应,使用如“材料与方法”中所描述的因子Xa生成测定测量残余辅因子活性。图5A中所显示的结果图解在55℃下因子VIII野生型和变体的活性衰退的时程。这个温度是基于早期的研究选择的(Ansong等人,“Factor VIII A1DomainResidues97-105Represent a Light Chain-interactive Site(因子VIII A3A1结构域残基97-105代表轻链相互作用位点)),”Biochemistry45:13140-13149(2006),通过引用将其整体并入本文),野生型因子VIII在该温度显示在1h内几乎完全的活性损失。在约15分钟内,野生型蛋白损失了50%的活性。如通过略快的活性衰退所判定的,观察到Glu272Ala和Glu272Val变体显示出降低的稳定性,并且这种特性可能与观察到的此位点突变的比活降低有关。另一方面,Ala和Val对Asp519、Glu665和Glu1984的取代全部都显示出在较高的温度下改善的稳定性,其中具有前两个位点处的突变的变体经过约20至25分钟保持50%的活性,而后一位点的突变则产生经过大于30分钟保持该活性水平的变体。来自拟合曲线的衰退速率值的比较(表1,下面)表明Glu1984变体的因子VIII热稳定性相对于野生型改善了约2倍,其中Val突变似乎比Ala略微优选。
评估温度范围的结果(图5B)表明Asp519、Glu665和Glu1984的Ala和Val变体都一致地显示出在所测试的所有温度下与野生型相比多达2倍的衰退速率降低。然而,如果一种形式显示较高的稳定性,单链和异源二聚体形式以略微不同的比率存在可能影响这些衰退速率结果。使用基本上全部为异源二聚体形式的Kogenate因子VIII的对照实验(Wakabayashi等人,“Metal Ion-independent Association of Factor VIII Subunits and theRoles of Calcium and Copper Ions for Cofactor Activity and Inter-subunitAffinity(金属离子非依赖性的因子VIII亚基缔合和钙离子和铜离子对辅因子活性和亚基间亲和力的作用),”Biochemistry40:10293-10300(2001),通过引用将其整体并入本文)产生了野生型的约2倍的衰退速率(图5B),这与异源二聚体形式在较高的温度下显示低于单链因子VIII的稳定性是一致的。因此,所测量的衰退速率显然是由于各种因子VIII形式中单链和双链含量的不均一性所引起的。然而,由于所有的变体与野生型相比都具有较少的相对的单链因子VIII(参见图5B),这些数据表明这些变体的衰退速率值低估了突变体和野生型之间的稳定性增加。
实施例6:在37℃下血浆中的因子VIII的稳定性
为了测试在更天然的条件下突变对因子VIII稳定性的影响,将接近生理浓度的蛋白(1nM)在37℃下在(抗凝的)缺乏因子VIII的血浆中孵育最多4天,所述血浆来自不含因子VIII抑制剂活性的血友病A患者。使用一期凝集测定每天一次测定残余的因子VIII。2天后,野生型因子VIII的活性降至约50%,Asp519Val变体的活性也一样,而Glu665Ala变体显示出适度的(约15%)活性衰退速率降低(图6和表3)。然而,在第4天,Asp519Ala、Glu665Val和两种Glu1984变体的活性值都大于或等于初始值的50%。自血浆孵育所获得的结果与在较高温度下进行的孵育的结果很大部分上平行,其中Glu665Val变体和两种Glu1984变体都表现出在两种反应条件下稳定性的显著增加,如通过功能的保留所判断的。尽管两种Asp519变体在较高的温度下都显示出改善的稳定性,但是只有Ala变体在血浆测定中显示出改善。
实施例7:GIu272、Asp519、Glu665和Glu1984变体的因子VIIIa衰退速率
上述结果表明与用疏水性残基取代隐藏的带电荷残基一致的突变一般产生显示增强的稳定性的因子VIII蛋白。因为这些突变在A2结构域与A1或A3的界面处或接近该界面,所以预测他们可能通过降低A2亚基的解离速率来积极地影响因子VIIIa的不稳定性。在两种条件下评估了这种机制所引起的因子VIIIa活性损失速率。在第一种中,用凝血酶激活野生型和因子VIII变体,并在添加因子IXa和因子X后,在所指示的时间测定剩余的辅因子活性并监测因子Xa生成的速率。在第二种方法中,将上述测定修改为包括在因子VIII激活之前添加因子IXa以容许立即形成因子Xase。已经显示因子VIIIa整合到因子Xase复合体中通过将其衰退速率降低达10倍之多而部分地稳定辅因子的活性,这是通过与因子IXa用Xase拴系A2和A3C1C2亚基相一致的机制达成的(Fay等人,“Model for theFactor VIIIa-dependent Decay of the Intrinsic Factor Xase:Role of SubunitDissociation and Factor IXa-catalyzed Proteolysis(因子VIIIa依赖性的内在因子Xase衰退的模型:亚基解离和因子IXa催化的蛋白水解的作用),”JBiol Chem.271:6027-6032(1996),通过引用将其整体并入本文)。
在不存在或存在添加的因子IXa的条件下获得的结果分别显示在图7A和7B中。在不存在因子IXa的条件下,野生型因子VIIIa在约8分钟内损失了其活性的50%(图7A),而当在因子VIII激活期间添加了因子IXa时,这个活性水平持续了约40分钟(图7B)。衰退速率值显示在表3中,并且表明辅因子活性通过形成因子Xase而稳定了大于5倍。变体的评定揭示在不存在因子IXa的条件下,Glu272Ala和Glu272Val两种形式与野生型对照相比都具有分别为2倍和3倍的衰退速率增加。这些结果表明任一突变的弱化的亚基间亲和力可能是涉及酸性侧链的相对较弱的亲和力键合相互作用损失的结果。在存在因子IXa的条件下,两种变体的衰退速率基本上不能与野生型区别开,这表明因子IXa的添加消除了这种残基处的突变所产生的任何不良相互作用。
在另外三个位点(Asp519、Glu665和Glu1984)的突变均导致了因子VIIIa衰退速率的降低,降低程度依据改变的具体残基并且在一种情况下依据取代的残基而变化。不存在因子IXa的条件下Asp519的突变产生约30%的衰退速率降低,这在Ala和Val两种变体是类似的。在存在因子IXa的条件下,这些变体的活性衰退速率都降低了大于2倍,这表明了突变和与酶结合的稳定作用的协同作用。尽管Glu665Ala变体显示了与两种Asp519变体类似的值,但是Glu665Val变体在不存在和存在因子IXa的条件下分别显示出5倍和3倍的衰退速率降低,这表明用较大的疏水残基进行的取代会产生更有利于A2亚基保留的与邻近残基的相互作用。最后,两种Glu1984变体在不存在因子IXa的条件下与野生型相比都显示出约4倍的因子VIIIa衰退降低,并且在存在IXa时显示出5-8倍的降低。在图7B中观察到了这种增强的稳定性的显著性,图7B显示在包括任一Glu1984变体的因子Xase中40分钟后保持着大于90%的因子VIIIa活性。对于在Glu1984处的Ala或Val的反应的类似性表明两种残基都得到很好的耐受,其中在存在Val的条件下可能会达成略强的亚基间亲和力。总之,这些结果证明了用疏水性残基选择性地取代带电荷的残基后改善的A2亚基保留所引起的因子VIIIa稳定性的显著增强。
实施例1至7的讨论
上述实施例证明在预测连接A2结构域的位点用疏水性残基取代所选择的带电荷的残基导致了虽然可变但是一般性的因子VIII稳定性增加。这种稳定性根据在较高的温度下活性保留和辅因子中A2亚基解离速率的降低来评估。
在实施例1至3的初步分析中,基于小于2.8的空间间隔选择了定位在因子VIII A2结构域界面的30个残基来进行突变分析,这些残基可能形成氢键键合配对物。将30个带电荷/极性残基突变为Ala(或对于Tyr残基,突变为Phe),稳定地表达重组蛋白,并测量活性损失速率。所检测的30个残基中的14个显示出与野生型相比在55℃下大于2倍的因子VIII衰退速率增加和因子VIIIa衰退速率增加,这表明A1A2和A2A3结构域界面处的多个残基促进因子VIII的稳定性。有趣地,所检测的两个酸性残基Asp302和Glu287在突变为Ala时在前体辅因子和活性辅因子两种形式中都产生了适度(小于2倍)的稳定性增强。这两个酸性残基在人、犬、猪、小鼠、兔、大鼠和蝙蝠的因子VIII中都是保守的。这些初步结果表明这些酸性侧链不促进对氢键相互作用的稳定,反而对因子VIII结构有一些不良影响,如通过功能稳定性所评估的。
根据这些初步研究,评估了所制备的另外的疏水相互作用的功能获得。实施例4至7中所检测的4种酸性残基在人、犬、猪、小鼠、兔和蝙蝠的因子VIII中是保守的,而在大鼠因子中Glu665为Ala并且Glu1984为Thr(参见Swiss Institute of Bioinformatics,online analysis UniProtKB(瑞士生物信息研究所,在线分析UniProtKB)/Swiss-Prot Release55.5和UniProtKB/TrEMBL Release38.5(2008),通过引用将其整体并入本文)。实施例4至7的结果证明用Ala和/或Val取代这些残基中的三个Asp519、Glu665和Glu1984导致了蛋白稳定性增强。实施例4至7中只有一个所评定的酸性残基在突变时产生了对活性不利的结果。Glu272突变为Ala产生了具有降低的凝血酶生成参数值的低比活的因子VIII形式;并且Ala和Val取代两者与野生型相比都具有中等程度的热稳定性降低,和辅因子形式中高2至3倍的A2亚基解离速率。根据这些观察,认为Glu272可能确实参与与邻近残基的键合相互作用,并且随后在此位点的突变破坏这些相互作用。此结论与血友病A数据库的检测一致(Kemball-Cook等人,“TheFactor VIII Structure and Mutation Resource Site:HAMSTeRS version4(因子VIII结构和突变资源位点:HAMSTeRS第4版),”Nucleic Acids Res.26:216-219(1998);Kemball-Cook(MRC Clinical Sciences Centre(MRC临床科学中心),Haemophilia A Mutation Database(血友病A突变数据库)(2008年7月2日登录),通过引用将它们每一个整体并入本文),该数据库将位置272处的Lys(电荷相反)或Gly(小侧链)列为具有降低的因子VIII抗原的中度/轻度表型。后一种观察现象与突变致使血浆不稳定性增加一致。然而,在这个位点突变为Ala或Val后这些突变对细胞培养物中的表达水平没有显著影响。相反地,数据库中没有列出Asp519、Glu665和Glu1984处的突变。
蛋白质倾向于折叠而使带电荷的或极性部分保持溶剂暴露而疏水基团被隐藏(Pace等人,“Forces Contributing to the Conformational Stability ofProteins(促进蛋白质构象稳定性的力),”FASEB J.10:75-83(1996),通过引用将其整体并入本文)。因此,根据在用疏水性残基取代Glu287、Asp302、Asp519、Glu665和Glu1984时在这些位置观察到的功能获得性突变,认为这些带电荷残基被隐藏在A2结构域界面处。此外,这些结果表明,这些酸性残基不促进静电键合相互作用,并且可能使野生型蛋白结构和/或亚基相互作用不稳定。
由于使用Ala或Val的诱变产生了疏水残基(以取代带电荷的酸性残基),Ala或Val取代将趋于稳定界面的其他疏水性接触。此外,Val侧链比Ala大,因此在给定位点的取代后对活性的影响的比较可能提供对在该位点的残基包装和体积的一些深入了解。例如,用任一残基取代Glu1984产生了类似的结果,这表明在该位点两种残基都得到很好的耐受;而Glu665Val与Glu665Ala相比显示出因子VIIIa衰退速率的3倍降低,这表明较大体积的Val侧链在推定的疏水性结合袋中更好地耐受。
总之,实施例1至7的结果显著促进了因子VIII A结构域结构的理解,因子VIII A结构域结构先前仅限于源自与高分辨率的血浆铜蓝蛋白结构的同源性的模型(Pemberton等人,“A Molecular Model for the Triplicated ADomains of Human Factor VIII Based on the Crystal Structure of HumanCemloplasmin,”Blood89:2413-2421(1997)(基于人血浆铜蓝蛋白的晶体结构的人因子VIII的三个A结构域的分子模型),通过引用将其整体并入本文)和最近的人因子VIII的中间分辨率的结构(3.75)(Shen等人,“TheTertiary Structure and Domain Organization of Coagulation Factor VIII(凝血因子VIII的三级结构和结构域组织),”Blood111:1240-1247(2008),通过引用将其整体并入本文).尽管后一种结构不容许分配氢键相互作用(<2.8),但是该研究的作者指出因子VIII的A结构可以高度准确地与血浆铜蓝蛋白的结构域叠加。
尽管血浆铜蓝蛋白模型表明Asp302和Glu287可能促进氢键相互作用,但是实施例1至3的稳定性研究证明这是不可能的。相反,相信这些酸性侧链是被隐藏在疏水性环境中的。相反地,实施例4至7的结果支持Glu272可能促进A2结构域界面处的氢键相互作用这一观点,因为这种电荷的损失降低了因子VIII(VIIIa)稳定性。如由模型所预测的,实施例4至7中评定的剩余的三个酸性残基似乎隐藏在界面处,因为似乎没有来自互补结构域上的邻近残基的极性原子定位在这些残基的羧基附近。更确切地,注意到这些部分似乎邻近疏水基团。例如,模型预测Asp519的羧基氧和Thr275的甲基碳间隔为约4.2,Glu665的羧基氧和Vall982的甲基碳间隔为约8.1,并且Glu1984的羧基氧和Val663的甲基碳间隔为约6.2。
表现出增强的稳定性和降低的辅因子活性衰退速率的因子VIII变体代表对于治疗制剂的积极属性。前一种特性应容许蛋白纯化和配制期间活性蛋白的产量增加,从而导致较高的比活值。这些试剂与野生型相比还可以具有较长的循环半衰期(参见图6),未包括各种细胞清除机制。先前两个小组已报道了通过降低/消除A2亚基解离速率而稳定辅因子活性的因子VIII变体。在两种情况下,都采用将A2结构域共价连接到分子的其他区域的突变。在一种情况下,通过连接A2结构域和与A3C1C2结构域邻接的B结构域的区段来制备抗失活的因子VIII,并且该区段缺乏在前体辅因子激活后释放A2结构域或B结构域片段的凝血酶裂解位点(Pipe等人,“Characterization of a Genetically Engineered Inactivation-resistantCoagulation Factor VIIIa(遗传工程化的抗失活的凝血因子VIIIa的表征),”Proc Natl Acad Sci USA94:11851-11856(1997),通过引用将其整体并入本文)。在第二种情况下,用Cys残基取代在A3和A2结构域中邻近的所选择残基以在两个结构域之间形成二硫桥接,以便在凝血酶激活后使A2保持与A3共价(Gale等人,“An Engineered Interdomain Disulfide BondStabilizes Human Blood Coagulation Factor VIIIa(工程化的结构域间二硫键稳定人血凝血因子VIIIa),”J Thromb Haemost.1:1966-1971(2003);Radtke等人,“Disulfide Bond-stabilized Factor VIII has Prolonged Factor VIIIaActivity and Improved Potency in Whole Blood Clotting Assays(二硫键稳定的因子VIII具有延长的因子VIIIa活性并且在全血凝集测定中具有改善的效价),”J Thromb Haemost.5:102-108(2007),通过引用将它们每一个整体并入本文)。后一种突变体还显示出在凝血酶生成测定中增加的活性,尽管这些研究中的反应条件使用亚生理(<0.5nM)浓度的因子VIII。
使用生理的因子VIII水平(1nM)的实施例1至7的结果显示出在野生型和表现较高的稳定性的变体之间的极低的差异,尽管Glu272Ala产生了与其较低的比活一致的凝血酶生成参数。没有观察到与高稳定性变体的显著差异可能反映了反应条件的不同和/或这些突变不与A2结构域共价桥接并且因子VIIIa的衰退速率未显著降低。
实施例1至7中所列的结果证明在将保守的酸性残基转化为疏水性残基的单点突变后可以达成辅因子失活速率若干倍的降低。在这些情况的每一种中,这些突变发生在界面处,其中所改变的残基可能被隐藏并且不在表面暴露,并且不改变蛋白内的共价相互作用。根据初步的结果,辅因子形式的Glu1984Val和Glu1984Ala变体和野生型辅因子显示出类似的失活速率,如通过激活的蛋白C催化的在Arg336和Arg562处的裂解所测量的(Varfaj等人,“Residues Surrounding Arg336and Arg562Contribute to theDisparate Rates of Proteolysis of Factor VIIIa Catalyzed by Activated ProteinC(Arg336和Arg562周围的残基促进激活的蛋白C催化的因子VIIIa蛋白水解的全异速率),”J.Biol.Chem.282(28):20264-72(2007),通过引用将其整体并入本文)。这支持了这些较高稳定性变体的下调也应通过与野生型辅因子几乎相同的蛋白C途径进行这一观点。因此,本发明的稳定化变体应没有关于上述的失活抗性突变体的问题。
实施例8:二取代的和三取代的因子VIII变体的稳定性分析
为了确定是加性作用还是协同作用造成因子VIII(VIIIa)稳定性进一步增强,使用“材料与方法”中所描述的相同方法制备上述实施例中所描述的点突变的组合。具体地,使用残基Asp519、Glu665和Glu1984处的Ala或Val取代制备双组合或三组合突变体。这些组合突变体(氨基酸使用单字母代码标示)包括:D519AE665A、D519AE665V、D519AE1984A、D519AE1984V、D519VE665V、D519VE1984A、D519VE1984V、E665AE1984A、E665AE1984V、E665VE1984A、E665VE1984V、D519AE665VE1984A、D519VE665VE1984A、D519VE665VE1984V。此分析中排除了D519VE665A因子VIII,因为该突变体在ELISA和蛋白质印迹结果中显示不典型的特征。
为了制备三突变体,将D519A或D519V与E665VE1984A或E665VE1984V组合。取消了其他组合,因为E665AE1984A和E665AE1984V双突变体与各单突变体相比不增强因子VIII和因子VIIIa的稳定性。由于与D519VE665A所观察到的相同的原因,排除了使用D519AE665VE1984V的结果。
组合了Asp519处的突变(Ala或Val)与Glu665或Glu1984处的突变的第一组新突变体(组A)保持着正常的比活值(大于野生型(WT)值的80%,图8)。有趣地,如通过一期凝集测定所测量的,D519AE665A、D519VE665V、D519VE1984A和D519VE1984V与野生型因子VIII相比显示出多达约1.8倍的比活值显著增加(图8)。为Glu665和Glu1984处的突变组合的第二组突变体(组B)的比活出乎意料地显示出与野生型因子VIII相比多达约2倍的比活降低,例外的是E665VE1984A略高于野生型值(图8)。第三组(组C)代表三突变,并且通过一期测定显示出正常至适度增加的活性(D519VE665VE1984V)。然而,如通过二期测定所测量的D519VE665VE1984V活性显著降低。由于Asp519定位在A1和A2界面处,而Glu665和Glu1984定位在A2和A3界面处,认为与组B相比,组A突变的比活增加趋势可能是由于在A1-A2接合处影响构象并且保持活性辅因子形式的更有利的相互作用引起的。
图9显示在55℃下进行的因子VIII的热稳定性实验的结果的概要。使用实施例5所获得的单突变的数据(图5A),将组合突变体所获得的速率值与在该具体组合中最佳单突变体的速率值进行比较。图9还显示了因子VIII衰退速率的实际值(还参见表4)。相对衰退速率的降低程度似乎与所观察到的突变组合的增强相关。在组A中,突变体D519AE665A、D519AD665V和D519VE665V显示出稳定性的显著增强(衰退速率降低)并且大部分的突变体还维持着野生型值的约50%的绝对衰退速率。在另一方面,与最佳单突变相比,组B突变体中的两个突变体的相对速率略微增加(E665AE1984A和E665AE1984V)。在组C中,突变体D519AE665VE1984A和D519VE665VE1984A未显示速率的显著改变,而D519VE665VE1984V的速率值则略微增加。
有趣地,所观察到的突变组合的稳定性增强更容易以因子VIIIa的形式观察到(图10)。为了增加因子VIIIa衰退测定对高稳定性突变体的灵敏性,采用比在上述实施例中更低浓度的因子VIIIa(1.5nM)进行孵育。所有组A突变体都观察到了与单突变体相比多达4倍的高稳定性增强。D519VE665V和D519VE1984的因子VIIIa衰退速率的实际值分别为野生型因子VIII的衰退速率的14%和12%(图10和表4)。组B突变体在与成对突变中的较好的单突变相比时一般产生较弱的结果,其中E665AE1984A和E665AE1984V分别显示约2.2和约2.7倍的相对衰退速率值增加。三突变(组C)显示了最大的因子VIIIa稳定性增强,其中D519VE665VE1984A观察到了最大的稳定性,D519VE665VE1984A显示出野生型的约10%的衰退速率(图10和表4)。
表4:组合突变体的因子VIII和VIIIa的衰退速率和活性值
根据最小二乘曲线拟合估计速率衰退值的标准偏差,并且标准偏差在平均值的约10%内。
a括号内的值为相对于野生型的值
b单位/μg
cnM生成的因子Xa/分钟/nM因子VIII
d从上面的表3复制的数据。
对所选择的突变体进行了凝血酶生成测定,结果显示在图11A-B中。当使用1nM因子VIII的终浓度测试单突变体(参见“材料与方法”,和上文的实施例4)时,凝血酶生成特征没有显著改善。为了更好地比较更稳定的因子VIII突变体,使用较低的因子VIII浓度(0.2nM)。这个分析的结果显示D519VE665V具有与野生型因子VIII相比约20%的滞后时间和峰时间降低,以及约2.3倍的峰高增加和约1.5倍的内源凝血酶潜能(endogenous thrombin potential,ETP)增加(图11A-B)。尽管D519AE665V、D519VE1984A和D519VE665VE1984A的滞后时间和峰时间值与野生型相比没有显著改变,但是峰高和ETP值显著高于野生型(约20%至70%)。总之,这些结果表明全都具有增强的因子VIIIa稳定性的四个组合突变体显示出改善的凝血酶生成特征。这个观察现象表明这些突变体在生理条件下可能具有增加每单位因子VIII浓度的凝血酶生成的较高能力。
实施例9:与高比活Glu113Ala(E113A)突变组合的Asp519、Glu665和Glu1984处的Ala或Val突变体
已知如通过一期凝集测定所判定的,E113A突变增强因子VIII的比活(授予Fay等人的美国专利申请公布第10/581,471号;Wakabayashi等人,“A Glu113Ala Mutation within a Factor VIII Ca(2+)-Binding Site EnhancesCofactor Interactions in Factor Xase(因子VIII Ca(2+)-结合位点内的Glu113Ala突变增强因子Xase内的辅因子相互作用),”Biochemistry44:10298-10304(2005),通过引用将他们每一个整体并入本文)。由于具有高稳定性和高比活二者的因子VIII的产生代表了血友病治疗中用于潜在的治疗应用的一种独特种类的试剂,分析了E113A与上述实施例中所描述的具有高稳定性突变体的组合突变的作用。
使用“材料与方法”中所描述的相同方法制备Asp519、Glu665和Glu1984处的Ala或Val突变体与E113A突变的组合。这些双突变体(氨基酸使用单字母代码标示)包括:E113AD519A、E113AD519V、E113AE665A、E113AE665V和E113AE1984V。
使用一期测定所测得的组合突变体的比活值比野生型因子VIII高约2至约3.3倍,而二期测定则保持正常活性水平。这些结果表明Asp519、Glu665或Glu1984处的突变没有不利地影响E113A突变所观察到的活性增强(图12A)。此外,E113A与高稳定性突变体的组合的因子VIII和因子VIIIa衰退速率与各原始的高稳定性单突变体的值没有显著差异(参见,图5B-C;表5),这表明E113A突变不影响这些突变体的增强的稳定性参数。
表5:因子VIII和VIIIa的衰退速率和活性值
根据最小二乘曲线拟合估计速率衰退值的标准偏差,并且标准偏差在平均值的约10%内。
a括号内的值为相对于野生型的值
b单位/μg
cnM生成的因子Xa/分钟/nM因子VIII
d从上面的表3复制的数据。
从上述结果可知,为了产生特征为比活增加和因子VIII/因子VIIIa稳定性增强的重组因子VIII的目的,E113A突变可以与任何目前所描述的稳定性增加的突变组合。这包括E113A(或如授予Fay等人的美国专利申请序列第10/581,471号中所描述的其他合适的E113取代,通过引用将其整体并入本文)与本文所描述的类型的稳定性增强的单突变体或多突变体组合。
尽管本文详细描绘和说明了优选的实施方式,但是对于相关领域的那些技术人员来说明显的是可以在不背离本发明的精神的条件下进行各种修改、添加、替代等,因此这些也被认为是在如下的权利要求所界定的本发明的范围内。
Claims (18)
1.一种编码重组因子VIII的病毒载体,其中所述重组因子VII包含导致因子VIII和因子VIIIa二者的稳定性增强的一种或多种突变,其中所述一种或多种突变包括在A1A2或A2A3结构域界面的任一界面或者两个界面用疏水性氨基酸残基取代一个或多个带电荷的氨基酸残基。
2.一种遗传工程化以制备重组因子VIII的细胞,其中所述重组因子VII包含导致因子VIII和因子VIIIa二者的稳定性增强的一种或多种突变,其中所述一种或多种突变包括在A1A2或A2A3结构域界面的任一界面或者两个界面用疏水性氨基酸残基取代一个或多个带电荷的氨基酸残基。
3.根据权利要求1所述的病毒载体或根据权利要求2所述的遗传工程化的细胞,其中所述一种或多种突变包括野生型因子VIII的Glu287残基的取代、野生型因子VIII的Asp302残基的取代、野生型因子VIII的Asp519残基的取代、野生型因子VIII的Glu665残基的取代、野生型因子VIII的Glu1984残基的取代或它们的组合。
4.根据权利要求3所述的病毒载体或遗传工程化的细胞,其中所述Asp302残基的取代为D302A。
5.根据权利要求3所述的病毒载体或遗传工程化的细胞,其中所述Glu287残基的取代为E287A。
6.根据权利要求3所述的病毒载体或遗传工程化的细胞,其中所述Glu665残基的取代为E665A或E665V。
7.根据权利要求3所述的病毒载体或遗传工程化的细胞,其中所述Asp519残基的取代为D519A或D519V。
8.根据权利要求3所述的病毒载体或遗传工程化的细胞,其中所述Glu1984残基的取代为E1984A或E1984V。
9.根据权利要求3所述的病毒载体或遗传工程化的细胞,其中所述一种或多种突变包括选自下列的两种或更多种取代:Glu665残基、Asp519残基和Glu1984残基。
10.根据权利要求9所述的病毒载体或遗传工程化的细胞,其中所述两种或更多种取代包括:D519VE665V、D519AE665V、D519VE1984A、E665VE1984A、E665AE1984V、D519AE665VE1984A、D519VE665VE1984A或D519VE665VE1984V。
11.根据权利要求1所述的病毒载体或根据权利要求2所述用于使用的遗传工程化的细胞,其中所述重组因子VIII还包含下列的一种或多种:(i)经修饰以增强重组因子VIII对因子IXa和因子X中的一种或两种的亲和力的因子IXa和/或因子X结合结构域;(ii)增强在培养物中的分泌的修饰的位点;(iii)增强其循环半衰期的修饰的血清蛋白结合位点;(iv)有效降低其抗原性和/或免疫原性的至少一个糖基化识别序列;和(v)改善重组因子VIIIa的活性的修饰的钙结合位点。
12.根据权利要求1所述的病毒载体或根据权利要求2所述的遗传工程化的细胞,其用于治疗动物中的血友病A。
13.根据权利要求12所述用于使用的病毒载体或遗传工程化的细胞,其中所述动物是哺乳动物。
14.根据权利要求12所述用于使用的病毒载体或遗传工程化的细胞,其中所述哺乳动物选自由下列组成的组:人、大鼠、小鼠、豚鼠、狗、猫、猴、黑猩猩、猩猩、牛、马、绵羊、猪、山羊、兔和鸡。
15.根据权利要求1所述的病毒载体,其中所述病毒载体包含腺伴随病毒载体。
16.根据权利要求2所述的遗传工程化的细胞,其中所述细胞是重组皮肤成纤维细胞。
17.根据权利要求2所述的遗传工程化的细胞,其中多个所述细胞浩瀚在可植入装置中。
18.根据权利要求12所述用于使用的病毒载体或遗传工程化的细胞,其中所述治疗还包括周期性地重复施用所述病毒载体或遗传工程化的细胞。
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