CN104152431B - 一种碱性蛋白酶稳定剂及其应用 - Google Patents

一种碱性蛋白酶稳定剂及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种碱性蛋白酶稳定剂及其应用。具体地本发明提供了一种蛋白酶抑制剂，其为至少5种芳香苯硼酸衍生物的混合物。本发明还提供了包含该酶抑制剂的酶稳定剂以及一种浓缩的液体酶添加剂。本发明的技术方案，高效的解决了制备、存储碱性蛋白酶过程中产生的沉淀、和酶活不稳定的问题，提高了储藏稳定性，延长了货架期。

Description

一种碱性蛋白酶稳定剂及其应用
技术领域
本发明属于酶工程领域，具体地说，本发明涉及一种碱性蛋白酶稳定剂及其应用。
背景技术
碱性蛋白酶是目前市场广泛使用的的洗涤添加剂，能大幅度提高洗涤去污能力，特别对血渍、汗渍、奶渍、油渍等蛋白类污垢，具有独特的洗涤效果。传统洗涤工业上以固体颗粒形式添加到洗衣粉中，以增强其洗涤去污能力。目前液体洗涤剂发展迅速，由于其使用方便，去污效果好而深受用户钟爱。在水含量较大的液体洗涤剂中，碱性蛋白酶通常不稳定，极性的溶剂、缓冲剂及其各种阴阳离子表面活性剂组分可能改变酶蛋白的高级结构，加速碱性蛋白酶的自溶。酶的不稳定性一直困扰着整个加酶液体洗涤剂产业的开发和生产，液体洗涤剂对酶的稳定性提出了新的要求。
一般的碱性蛋白酶是由选育的地衣芽孢杆菌发酵而得，是一种丝氨酸型内切酶，具有非常强大自溶水解能力。通常在含酶液体洗涤剂中添加碱性蛋白酶可逆抑制剂能够防止蛋白酶水解，起到稳定碱性蛋白酶的作用。但是含酶液体洗涤剂中的表面活性剂组成以及其pH范围、水含量等理化条件，都会在不同程度上影响蛋白酶抑制剂的稳定作用，常用的碱性蛋白酶可逆抑制剂包括甲基硼酸、乙基硼酸和丙二醇等。有机硼酸作用机理是其能够与蛋白酶的活性位点可逆结合，从而增强酶的活性稳定。然而动物毒理性试验表明甲基硼酸、乙基硼酸为第二类生殖毒性化合物，长期使用存在非常大的生殖毒性风险。此外，碱性蛋白酶生产和存储中，酶沉淀问题一直无法解决，在生产和/或存储过程中的酶损失率很高，急需开发一种能够避免蛋白酶形成沉淀的工艺。
发明内容
本发明的目的在于提供一种碱性蛋白酶的抑制剂及其应用。
本发明的第一方面，提供了一种蛋白酶抑制剂，所述蛋白酶抑制剂为至少5种芳香苯硼酸衍生物的混合物。
在另一优选例中，所述蛋白酶抑制剂包括至少5种选自下组的化合物：
4-氯苯硼酸、3-(叔丁氧基羰基)-苯硼酸、4-甲酰基苯硼酸、4-羟甲基苯硼酸、3-甲酰基苯硼酸、3-羧基苯硼酸和4-羧基苯硼酸。
在另一优选例中，所述酶抑制剂中各化合物的含量如下：
4-氯苯硼酸0.0002-0.7重量份；
3-(叔丁氧基羰基)-苯硼酸0.002-0.25重量份；
4-甲酰基苯硼酸0.0001-0.35重量份；
4-羟甲基苯硼酸0.0003-0.15重量份；
3-甲酰基苯硼酸0.0003-0.04重量份；
3-羧基苯硼酸0.0002-0.15重量份；和
4-羧基苯硼酸0.0003-0.5重量份。
在另一优选例中，所述酶抑制剂中各化合物的含量如下：
4-氯苯硼酸0.02-0.3重量份；
3-(叔丁氧基羰基)-苯硼酸0.02-0.1重量份；
4-甲酰基苯硼酸0.015-0.2重量份；
4-羟甲基苯硼酸0.03-0.1重量份；
3-甲酰基苯硼酸0.003-0.1重量份；
3-羧基苯硼酸0.05-0.1重量份；和
4-羧基苯硼酸0.06-0.3重量份。
在另一优选例中，所述蛋白酶为碱性蛋白酶。
在另一优选例中，所述所述碱性蛋白酶为地衣芽孢杆菌产生的碱性蛋白酶。
本发明的第二方面，提供了一种碱性蛋白稳定剂，所述碱性蛋白酶稳定剂含有本发明第一方面所述的蛋白酶抑制剂。
在另一优选例中，所述碱性蛋白稳定剂还包括硼酸；优选地，所述硼酸的含量(w/w)为0.1％-5％。
在另一优选例中，所述碱性蛋白稳定剂还包括山梨醇；优选地，所述山梨醇的含量(w/w)为0.01％-2％。
在另一优选例中，所述碱性蛋白稳定剂还包括组分II，所述组分II为葡萄糖酸钙和乳酸钙混合物。
在另一优选例中，所述葡萄糖酸钙和乳酸钙混合物的重量份数比为3-7：5；优选地，比例为5：5。
在另一优选例中，所述碱性蛋白稳定剂还包括组分III，所述组分III为甘油与1，2丙二醇的混合物
在另一优选例中，所述甘油和1，2丙二醇重量份数比为2-5：7；优选地，所述甘油和1，2丙二醇重量份数比为3：7。
本发明的第三方面，提供了一种浓缩的液体酶添加剂，所述添加剂中包括酶和表面活性剂。
在另一优选例中，所述酶为碱性蛋白酶。
在另一优选例中，所述液体酶添加剂的酶活力为100000u/ml-300000u/ml。
在另一优选例中，所述碱性蛋白酶为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)产生的碱性蛋白酶。
在另一优选例中，所述添加剂的pH为偏酸性。
在另一优选例中，所述添加剂的pH≤7.0。
在另一优选例中，所述添加剂的3.0≤pH≤7.0；优选地，3.5≤pH≤6.5；更优选地，4.0≤pH≤6.0。在具体地实施方式中，所述添加剂的pH可以为3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0。
在另一优选例中，所述添加剂还包括本发明第一方面所述的酶抑制剂。
在另一优选例中，所述添加剂还包括本发明第二方面所述的酶稳定剂。
在另一优选例中，所述酶抑制剂的含量在0.001％-2％。
在另一优选例中，所述酶抑制剂的添加量≤2％(w/w)；优选地，所述抑制剂的添加量为0.001％-2％；更优选地，所述抑制剂的添加量为0.01％-1.5％；最优选地，所述抑制剂的添加量为0.1％-1％。在具体地实施方式中，所述抑制剂的添加量可以为0.01％、0.05％、0.10％、0.15％、0.20％、0.25％、0.30％、0.35％、0.40％、0.45％、0.50％、0.55％、0.60％、0.65％、0.70％、0.75％、0.80％、0.85％、0.90％、0.95％、1.0％、1.5％。
在另一优选例中，所述表面活性剂选自下组中的一种或多种：月桂醇聚氧乙烯醚、10碳醇聚氧乙烯醚和烷基酚聚氧乙烯醚。
在另一优选例中，所述表面活性剂的含量为1％-10％。
在另一优选例中，所述添加剂中包括：
葡萄糖酸钙和乳酸钙混合物0.02％-4.5％、山梨醇0.01％-1.8％、硼酸0.2％-5％、甘油与1，2丙二醇混合物1％-15％、4-氯苯硼酸0.0002％-0.7％、3-(叔丁氧基羰基)-苯硼酸0.002％-0.25％、4-甲酰基苯硼酸0.0001％-0.35％、4-羟甲基苯硼酸0.0003％-0.15％、3-甲酰基苯硼酸0.0003％-0.04％、3-羧基苯硼酸0.0002％-0.15％、4-羧基苯硼酸0.0003％-0.5％。
在另一优选例中，所述添加剂中包括：
葡萄糖酸钙和乳酸钙混合物0.05％-2％、山梨醇0.02％-1.5％、硼酸0.6％-3％、甘油和1，2丙二醇混合物4％-8％、4-氯苯硼酸0.02％-0.3％、3-(叔丁氧基羰基)-苯硼酸0.02％-0.1％、4-甲酰基苯硼酸0.015％-0.2％、4-羟甲基苯硼酸0.03％-0.1％、3-甲酰基苯硼酸0.003％-0.1％、3-羧基苯硼酸0.05％-0.1％、4-羧基苯硼酸0.06％-0.3％。
在另一优选例中，所述葡萄糖酸钙和乳酸钙混合物的重量份数比为3-7：5；优选地，比例为5：5。
在另一优选例中，所述甘油和1，2丙二醇重量份数比为2-5：7；优选地，所述甘油和1，2丙二醇重量份数比为3：7。
本发明的第四方面，提供了一种防止酶浓缩液产生沉淀的方法，其特征在于，将所述酶浓缩液的pH调节为偏酸性。
在另一优选例中，调节所述酶浓缩液的pH≤7.0。
在另一优选例中，调节所述酶浓缩液的pH至3.0-7.0；优选地，调节所述酶浓缩液的pH至3.5-6.5；更优选地，调节所述酶浓缩液的pH至4.0-6.0。在具体地实施方式中，所述浓缩液的pH可以调节为3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0。
在另一优选例中，所述酶为碱性蛋白酶。
在另一优选例中，所述碱性蛋白酶为地衣芽孢杆菌产生的碱性蛋白酶。
在另一优选例中，所述方法还包括步骤向浓缩液中添加本发明第一方面所述的抑制剂或本发明第二方面所述的稳定剂。
在另一优选例中，所述抑制剂的添加量≤2％(w/w)；优选地，所述抑制剂的添加量为0.001％-2％；更优选地，所述抑制剂的添加量为0.01％-1.5％；最优选地，所述抑制剂的添加量为0.1％-1％。在具体地实施方式中，所述抑制剂的添加量可以为0.01％、0.05％、0.10％、0.15％、0.20％、0.25％、0.30％、0.35％、0.40％、0.45％、0.50％、0.55％、0.60％、0.65％、0.70％、0.75％、0.80％、0.85％、0.90％、0.95％、1.0％、1.5％。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了本发明的酶稳定剂对酶活保存率的影响。
具体实施方式
本发明人通过广泛而深入的研究，经过大量筛选，获得一种碱性蛋白酶抑制剂，该酶抑制剂为芳香苯硼酸衍生物的混合物，包括：4-氯苯硼酸、3-(叔丁氧基羰基)-苯硼酸、4-甲酰基苯硼酸、4-羟甲基苯硼酸、3-甲酰基苯硼酸、3-羧基苯硼酸和4-羧基苯硼酸。实验证明，使用上述酶抑制剂配制酶稳定剂用于存储蛋白酶，能够显著提高酶活保存率，而且长时间放置没有沉淀产生。在发明人的实验过程中意外的发现地衣芽孢杆菌来源的碱性蛋白酶，在偏酸性条件下酶活保存率较高，而本领域技术人员普遍认为碱性蛋白酶更适于在偏碱性条件下存储。
本发明提供的酶抑制剂是一种安全、有效、无毒的酶抑制剂(稳定剂)，避免了有机硼酸的生殖毒性问题，同时提高了液体碱性蛋白酶份儿储存稳定性并能够防止液体碱性蛋白酶生产加工过程中沉淀的产生。
碱性蛋白酶
本发明中的“碱性蛋白酶”是指，适宜于在pH9-11的碱性条件下使用的一类蛋白酶制剂，超出以上pH范围酶的活力有所下降。可以从地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌或、毕赤酵母菌发酵制得，其商业上可获得产品包括诺维信枯草芽孢杆菌发酵获得的Savinase、Alcalase、碱性蛋白酶2709(地衣芽孢杆菌发酵制得)等。
酶抑制剂
本发明的酶抑制剂能够防止制备和存储过程中的蛋白酶水解，起到稳定碱性蛋白酶的作用。本发明的酶抑制剂为芳香硼酸衍生物的混合物，在具体的实例中，抑制剂添加量一般不高于酶浓缩液的1％(w/w)，特殊情况下不高于2.5％(w/w)。在其它的实施方式中，添加量可以控制在5％(w/w)以内。
酶稳定剂
本发明提供的酶稳定剂包括上述的酶抑制剂及其它辅助成分。
在一优选的实施方式中，各成分含量如下：
葡萄糖酸钙和乳酸钙混合物0.02％-4.5％、山梨醇0.01％-1.8％、硼酸0.2％-5％、甘油与1，2丙二醇混合物1％-15％、4-氯苯硼酸0.0002％-0.7％、3-(叔丁氧基羰基)-苯硼酸0.002％-0.25％、4-甲酰基苯硼酸0.0001％-0.35％、4-羟甲基苯硼酸0.0003％-0.15％、3-甲酰基苯硼酸0.0003％-0.04％、3-羧基苯硼酸0.0002％-0.15％、4-羧基苯硼酸0.0003％-0.5％。
在另一优选地实施方式中，各成分含量如下：
葡萄糖酸钙和乳酸钙混合物0.05％-2％、山梨醇0.02％-1.5％、硼酸0.6％-3％、甘油与1，2丙二醇混合物4％-8％、4-氯苯硼酸0.02％-0.3％、3-(叔丁氧基羰基)-苯硼酸0.02％-0.1％、4-甲酰基苯硼酸0.015％-0.2％、4-羟甲基苯硼酸0.03％-0.1％、3-甲酰基苯硼酸0.003％-0.1％、3-羧基苯硼酸0.05％-0.1％、4-羧基苯硼酸0.06％-0.3％。
在上述方案中葡萄糖酸钙与乳酸钙混合物中葡萄糖酸钙：乳酸钙＝5：5，甘油与1，2丙二醇复合物中甘油：1，2丙二醇的重量比＝3：7，整个稳定剂体系pH为3-9；优选为3.5-8.5；更优选为4.0-5.5。
浓缩的液体酶添加剂
本发明的液体酶添加剂包括酶和表面活性剂。液体酶添加剂是待加入液体洗涤剂的浓缩产品。因此液体酶添加剂中所用的酶量比较大，极易产生沉淀，且酶活很不稳定。在本发明具体的实施方式中，存在于液体酶添加剂中的酶量是至少10000u/ml。在本发明更具体的实施方式中，酶量是至少50000u/ml。在本发明还更具体的实施方式中，存在的酶量是至少100000u/ml。在本发明最具体的实施方式中，存在的酶量是至少200000u/ml，如甚至高于350000u/ml。在本发明具体的实施方式中，酶量不超过700000u/ml。在本发明更具体的实施方式中，酶量不超过500000u/ml。在本发明最具体的实施方式中，存在于液体酶添加剂中的酶量少于400000u/ml。
本发明根据发酵浓缩酶配方的特点，设计酶抑制剂和小分子添加剂组成的复合稳定体系，通过多元醇提高组方中的有机相含量，这样碱性蛋白酶可逆抑制剂方能有效封闭蛋白酶活性区域。通过添加该组方，能明显降低生产加工和储存中形成的沉淀和延长液体碱性蛋白酶货架期。本发明人研究发现芳香硼酸类衍组合物组合物能够作为碱性蛋白酶抑制剂，由于这类化合物具有很好的生物降解度，因此解决了生殖毒性等问题。通过添加一定的稳定介质(稳定剂)抑制碱性蛋白酶活力，同时调节水和有机相比例提高液体碱性蛋白酶稳定性和减少加工制备过程和储存后期沉淀问题。
本发明的主要优点在于：
(1)高效的解决了制备、存储碱性蛋白酶过程中产生的沉淀、和酶活不稳定的问题，提高了储藏稳定性，延长了货架期。
(2)本发明意外地发现地衣芽孢杆菌来源的碱性蛋白酶，在偏酸性条件下存储更有利于酶活的保存并减少沉淀的产生。
(3)本发明的配方效果明显，制备容易，成本低廉，能高效持久的维持酶活性，防止生产加工储藏过程中产生沉淀。
(4)本发明给出了液体储存地衣芽孢杆菌来源的碱性蛋白酶的技术方案，采用本发明的酶稳定剂，并在偏酸性环境下储存地衣芽孢杆菌来源的碱性蛋白，酶活保存率高，货架期长，无浑浊现象。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
材料和方法
酶活检测方法、使用的试剂和仪器参考国标GBT23527-2009
地衣芽孢杆菌来源碱性蛋白酶2709(CAS:9014-01-1)可以购自宁夏夏盛实业集团有限公司。
1酶活力计算
X＝A×K×8/2×1/10×n×E＝2/5×A×K×n×E
式中：
X：样品的酶活力(u/g或u/ml)；
A：试样溶液的平均吸光度；
K：吸光常数；
8：反应试剂的总体积(ml)；
2：吸取酶液2.00ml，以ml计；
1/10：反应时间10min，以min计；
n：稀释倍数；
E：紫外法与福林法的换算系数(中性、碱性系数为0.50，酸性蛋白酶系数为0.77)所得结果表示至整数。
2酶活保存率
X＝E1/E×100％
X:样品的酶活力保存率％
E1：样品实测酶活力(u/g或u/ml)
E：样品标示(保存前)酶活力(u/g或u/ml)
实施例1酶稳定剂的配制
1.筛选酶抑制剂
为达到提高液体碱性蛋白酶储存性，解决生产加工中及其储存中的沉淀问题，提高产品品相，本发明人经过大量筛选，得到了一种能够提高液体碱性蛋白酶稳定性的碱性蛋白酶抑制剂。该酶抑制剂为芳香苯硼酸衍生物的混合物，包括：4-氯苯硼酸、3-(叔丁氧基羰基)-苯硼酸、4-甲酰基苯硼酸、4-羟甲基苯硼酸、3-甲酰基苯硼酸、3-羧基苯硼酸和4-羧基苯硼酸。
酶抑制剂中各化合物的重量份数如下：4-氯苯硼酸0.0002-0.7、3-(叔丁氧基羰基)-苯硼酸0.002-0.25、4-甲酰基苯硼酸0.0001-0.35、4-羟甲基苯硼酸0.0003-0.15、3-甲酰基苯硼酸0.0003-0.1、3-羧基苯硼酸0.0002-0.15、4-羧基苯硼酸0.0003-0.5。
在较佳的实施方式中，酶抑制剂中各化合物的含量如下：4-氯苯硼酸0.02-0.3、3-(叔丁氧基羰基)-苯硼酸0.02-0.1、4-甲酰基苯硼酸0.015-0.2、4-羟甲基苯硼酸0.03-0.1、3-甲酰基苯硼酸0.003-0.1、3-羧基苯硼酸0.05-0.1、4-羧基苯硼酸0.06-0.3。
2.配制酶稳定剂并检测保存效果
配制酶稳定剂，酶稳定剂中包括：组分I、组分II、组分III、硼酸、山梨醇，其中，组分I为芳香苯硼酸衍生物的混合物(酶抑制剂)，组分I中各化合物的重量份数配比如下表1所示。
组分II为葡萄糖酸钙和乳酸钙混合物，葡萄糖酸钙：乳酸钙＝5：5(w/w)；
组分III为甘油与1，2丙二醇混合物，甘油：1，2丙二醇＝3：7(w/w)。
表1
按照下表2配制酶稳定剂其中百分比为质量百分数，其中酶抑制剂(组分I)使用组分I-1的配方。
表2
酶稳定剂 组分I-1(％) 组分II(％) 组分III(％) 硼酸(％) 山梨醇(％)
A 0.8 0.5 8 0.6 1.5
B 0.4 0.5 8 0.6 1.5
C 0.2 0.5 8 0.6 1.5
D 0.1 0.5 8 0.6 1.5
E 0.05 0.5 8 0.6 1.5
F 0.01 0.5 8 0.6 1.5
G 1.0 0.5 8 0.6 1.5
对照(I) 0 0.5 8 0.6 1.5
调节以上各组酶稳定剂pH为4.5，并在上述各组酶稳定剂中，添加碱性蛋白酶200000u/ml(碱性蛋白酶2709，由地衣芽孢杆菌发酵制得，可以购自宁夏夏盛实业集团有限公司或上海西宝生物科技有限公司)，对照组中不添加酶抑制剂(组分I)，40℃保存4周后，检测酶活保存率。实验结果如图1所示，从图中可以看出，实验组A-G组的酶活保存率在90％-98％之间，对照组酶活保存率约为40％，从该结果可以看出，实验组中的酶抑制剂具有显著的保护酶活性的效果。
将表2(酶稳定剂配方A)中酶抑制剂分别替换为组分I-2、组分I-3、组分I-4、组分I-5、组分I-6、组分I-7，其它的组分不变，按照上述同样的方法检测酶活保存率。经检测，分别添加组分I-2、组分I-3、组分I-4、组分I-5、组分I-6、组分I-7的酶稳定剂，均能使酶活保存率维持在85％-99％之间，说明本发明的酶抑制剂具有很好的保护酶活性的效果。
对比例1-7
对比例1-7分别为去掉组分I-1中的7种化合物中的一种，仅保留余下的6种，采用实施例1中同样的方法配制酶稳定剂，并对酶活保存率进行检测，实验结果如下表3所示：
表3
对比例 酶抑制剂中去掉的化合物 酶活保存率％
1 4-氯苯硼酸 62％
2 3-(叔丁氧基羰基)-苯硼酸 71％
3 4-甲酰基苯硼酸 82％
4 4-羟甲基苯硼酸 76％
5 3-甲酰基苯硼酸 61％
6 3-羧基苯硼酸 76％
7 4-羧基苯硼酸 73％
从对比例1-7的检测结果中可以看出，去掉本发明的酶抑制中的一种化合物成分，会导致酶活保存率在一定程度上的降低。
近一步地，本发明人减掉了组分I-1的7种化合物中的任意2种，保留5种化合物作为酶抑制剂，采用实施例1中同样的方法配制酶稳定剂，并对酶活保存率进行检测，检测结果表明酶活保存率在55％-65％之间。
实施例2表面活性剂的优化
工业上较常用的表面活性剂大致也分聚氧乙烯型和多元醇型，二聚氧乙烯型又以烷基酚聚氧乙烯醚、高碳脂肪醇聚氧乙烯醚(AEO)、脂肪酸聚氧乙烯(AE)、聚氧乙烯胺、聚氧乙烯酰胺和聚丙二醇的环氧乙烷等类别，而多元醇型可细分为失水山梨醇酯、蔗糖酯和烷基酰胺型。本发明中优先选择多元醇类的表面活性剂。
在实施例1中的酶稳定剂(配方D)中添加不同种类的表面活性剂(添加量为5％)，按照实施例1中的方法，分别在常温或40℃下放置30天后观察产品品相，结果如下表4所示。
表4
澄清：未出现可见固体；比较澄清：容器底部少许可见固体；浑浊：出现明显固体沉淀。
表面活性剂1、2、3、4分别为月桂醇聚氧乙烯醚、10碳醇聚氧乙烯醚、烷基酚聚氧乙烯醚、脂肪酸聚氧乙烯酯。从表4的结果可以看出，在本发明的酶稳定剂中添加月桂醇聚氧乙烯醚、10碳醇聚氧乙烯醚或烷基酚聚氧乙烯醚，具有比较好的防止酶产生沉淀的效果，而脂肪酸聚氧乙烯酯的防沉淀的效果不够理想。
实施例3pH对酶稳定性的影响
在本领域中，一般认为蛋白酶的液体浓缩液在偏碱性条件下比较稳定。如中国专利CN101297025A中披露的那样，蛋白酶Savinase、Alcalase(枯草芽孢杆菌发酵制得)的浓缩添加剂中较佳的pH为8.5-10。
本发明人在实验中意外地发现，地衣芽孢杆菌产生的碱性蛋白酶在偏酸性的稳定体系中更不容易产生沉淀、酶活保存率更高。
本实施例中采用实施例1和2中的方法，酶抑制剂选用组分I-1，配制成酶稳定剂(配方D)后，调节不同的pH，检测酶活保存率。
表5
从上表可以看出，地衣芽孢杆菌蛋白酶在偏酸性条件下(pH3.5-7.5)酶活性保存的较好，在pH4.0-4.5时，酶活保存率最高，碱性条件下该蛋白酶极易自溶。而蛋白酶Savinase在pH8.0时酶活性保存的较好。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (4)

1.一种蛋白酶抑制剂，其特征在于，所述蛋白酶抑制剂包括：
4-氯苯硼酸、3-(叔丁氧基羰基)-苯硼酸、4-甲酰基苯硼酸、4-羟甲基苯硼酸、3-甲酰基苯硼酸、3-羧基苯硼酸和4-羧基苯硼酸；
其中，所述酶抑制剂中各化合物的含量如下：
4-氯苯硼酸0.02-0.3重量份；
3-(叔丁氧基羰基)-苯硼酸0.02-0.1重量份；
4-甲酰基苯硼酸0.015-0.2重量份；
4-羟甲基苯硼酸0.03-0.1重量份；
3-甲酰基苯硼酸0.003-0.1重量份；
3-羧基苯硼酸0.05-0.1重量份；和
4-羧基苯硼酸0.06-0.3重量份；
所述蛋白酶为碱性蛋白酶；并且所述碱性蛋白酶为地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)产生的碱性蛋白酶。
2.如权利要求1所述的蛋白酶抑制剂，其中，所述酶抑制剂中各化合物的含量如下：
4-氯苯硼酸0.7重量份；
3-(叔丁氧基羰基)-苯硼酸0.25重量份；
4-甲酰基苯硼酸0.35重量份；
4-羟甲基苯硼酸0.15重量份；
3-甲酰基苯硼酸0.04重量份；
3-羧基苯硼酸0.15重量份；和
4-羧基苯硼酸0.5重量份。
3.一种碱性蛋白稳定剂，其特征在于，所述碱性蛋白酶稳定剂含有0.01％-0.8％重量的权利要求1所述的蛋白酶抑制剂，0.6％重量的硼酸、1.5％重量的山梨醇、0.5％重量的组分II和8％重量的组分III；
其中，所述组分II为葡萄糖酸钙和乳酸钙混合物，葡萄糖酸钙：乳酸钙为5：5(w/w)；所述组分III为甘油与1，2丙二醇的混合物，甘油：1，2丙二醇为3：7(w/w)。
4.一种浓缩的液体酶添加剂，其特征在于，所述添加剂中包括酶和表面活性剂；
其中，所述添加剂的pH为3.5-6.5；所述酶为地衣芽孢杆菌产生的碱性蛋白酶；
并且，所述添加剂中还包括权利要求1所述的蛋白酶抑制剂或权利要求3所述的碱性蛋白稳定剂。
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