CN101215555B - 一种液体碱性蛋白酶复合稳定剂 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种液体碱性蛋白酶复合稳定剂，其构成组分及重量份数分别为：CaCl₂5～10；硼砂5～10；4-FPBA(4-甲酰苯基硼酸)0.05～0.1；甘油和丙二醇(3∶7)总量5～10；将上述各组分充分溶解、混合后，即可制得一种液体碱性蛋白酶复合稳定剂成品。本发明构成成分简单，配伍科学，制备方法容易，成本低廉，维持液体蛋白酶酶活高且稳定性强(在4℃保存3个月后相对酶活力仍保持在85％以上)，是一种优质高效的液体碱性蛋白酶稳定剂，对高活性、高稳定性碱性蛋白酶液体制剂的产业化发展具有重要意义。

Description

一种液体碱性蛋白酶复合稳定剂

技术领域

本发明属于生物工程领域的碱性蛋白酶，尤其是一种液体碱性蛋白酶复合稳定剂。

背景技术

碱性蛋白酶是最重要的工业酶之一，它在洗涤剂、医药、皮革制造和食品工业等领域发挥着巨大作用，目前国内外市场对碱性蛋白酶的需求量增长很快，对酶制剂的酶活力单位要求也越来越高。近几年，液体洗涤剂以其制造简单、品种多、污染小、节省能源、性能优异、使用方便等诸多优点，已倍受人们的青睐。我国洗涤用品工业仍以粉状合成洗涤剂生产为主，液体洗涤剂仅限于轻垢型产品，究其原因是由于液体产品在贮存过程中蛋白酶自身的水解作用和蛋白酶类对其他酶的水解作用造成酶的失活量随时间的延长而增加，稳定性极差。但由于酶活较高的液体蛋白酶稳定性差，室温储存一周酶活力即基本丧失，因而严重影响了液体浓缩蛋白酶制剂的广泛应用，影响了国内液体加酶洗涤剂的生产与开发。因此，研究开发一种优质高效且成本低廉的液体碱性蛋白酶稳定剂，对高活性、高稳定性碱性蛋白酶液体制剂的产业化发展具有重要意义。

发明内容

本发明目的是克服现有技术的不足，提供一种优质高效的液体碱性蛋白酶稳定剂。

本发明的目的是采用如下方案实现的：

一种液体碱性蛋白酶复合稳定剂，其构成组分及重量份数分别为：

CaCl₂               5～10

硼砂                5～10

4-FPBA              0.05～0.1

甘油与丙二醇混合物  5～10

将上述各组分充分溶解、混合后，即可制得一种液体碱性蛋白酶复合稳定剂成品。

而且，所述的构成组分的最优重量份数分别为：

CaCl₂     10

硼砂      5

4-FPBA    0.1

甘油与丙二醇混合物  10。

而且，所述的甘油与丙二醇混合物中甘油∶丙二醇的重量比＝3∶7。

本发明的优点和积极效果是：

1.本液体碱性蛋白酶复合稳定剂通过对影响碱性蛋白酶稳定性的不同活性保护剂进行考察，其酶稳定剂选用硼砂、丙二醇以及CaCl₂，微胶粒形成抑制剂选用4-甲酰苯基硼酸(4-FPBA)。

2.本液体碱性蛋白酶复合稳定剂配伍科学，稳定效果明显，成本低廉，稳定剂加入液体蛋白酶后可在4℃温度条件下保存3个月后其相对酶活力仍保持在85％以上。

3.本发明构成成分简单，制备方法容易，成本低廉，维持液体蛋白酶酶活高且稳定性强，是一种优质高效的液体碱性蛋白酶稳定剂，对高活性、高稳定性碱性蛋白酶液体制剂的产业化发展具有重要意义。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明进一步说明；下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。

首先叙述本发明复合稳定剂各组成物质的配伍释义：

1.Ca²⁺：发挥稳定作用是通过与酶蛋白的敏感部位(尤其是肽链的弯曲部位)相结合，使有活性的构象不致松开，同时Ca²⁺还能屏蔽酶蛋白表面多余的负电荷，消除带电基团对酶蛋白的不利影响。

2.酶稳定剂：硼砂是水混溶性溶剂，它能辅助溶解与蛋白酶液接触的其他物质，并避免或抑制微胶粒的形成，这协同的起到了“活性保护剂”作用。

3.多元醇(甘油)：代替水作溶剂对蛋白酶有稳定作用。酶蛋白受热变性时，分子中的氢键结构发生变形，溶剂水分子作为氢键的受体或供体，去和蛋白质分子骨架及侧链上的基团竞争形成氢键，最终导致蛋白质分子结构崩溃；而多元醇形成氢键的能力比水小，对蛋白质分子氢键结构的破坏力也较小。

4.新型蛋白酶活性抑制剂：4-甲酰苯基硼酸(4-FPBA)，在酶制剂储存时能有效抑制蛋白酶活力，防止蛋白酶被自身或其他酶水解，在使用时随着酶制剂的稀释，酶活力又能快速恢复。这种可逆蛋白酶抑制剂的化学结构与硼酸类似，在酶液中加入0.01％，可以显著降低传统蛋白酶稳定剂硼酸盐和丙二醇的用量，大大降低了成本。

实施例1：

取CaCl₂0.5g、硼砂0.5g、4-甲酰苯基硼酸(4-FPBA)0.005g、甘油：丙二醇混合物0.5g，其中，甘油与丙二醇混合物中甘油∶丙二醇的重量比＝3∶7，即：甘油为0.15g，丙二醇为0.35g。将CaCl₂、硼砂、4-FPBA充分溶解在甘油与丙二醇混合物中即形成复合稳定剂。

实施例2：

取CaCl₂1g、硼砂1g、4-甲酰苯基硼酸(4-FPBA)0.005g、甘油与丙二醇混合物1g，其中，甘油与丙二醇混合物中甘油∶丙二醇的重量比＝3∶7，即：甘油为0.3g，丙二醇为0.7g。将CaCl₂、硼砂、4-FPBA充分溶解在甘油与丙二醇混合物中即形成复合稳定剂。

实施例3：

取CaCl₂1g、硼砂0.5g、4-甲酰苯基硼酸(4-FPBA)0.01g、甘油与丙二醇混合物0.8g；其中，甘油与丙二醇混合物中甘油∶丙二醇的重量比＝3∶7，即：甘油为0.24g，丙二醇为0.56g。将CaCl₂、硼砂、4-FPBA充分溶解在甘油与丙二醇混合物中即形成复合稳定剂。

实施例四：

取CaCl₂1g，硼砂0.5g，4-甲酰苯基硼酸(4-FPBA)0.02g，甘油与丙二醇混合物1g，其中，甘油与丙二醇混合物中甘油∶丙二醇的重量比＝3∶7，即：甘油为0.3g，丙二醇为0.7g。将CaCl₂、硼砂、4-FPBA充分溶解在甘油与丙二醇混合物中即形成复合稳定剂。

将上述形成的复合稳定剂分别添加到100g液体碱性蛋白酶中，4℃保存，进行酶活力测定，测定的步骤如下：

1、材料准备

碱性蛋白酶发酵液(28000-30000 U/mL)：(由高产碱性蛋白酶菌株嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alcalophilus)ATCC21522所产酶液)。

硫酸铵，干酪素等试剂，均为AR级；缓冲溶液为硼砂缓冲液(pH＝10.5)。

2、测定方法

酶活的测定：Folin试剂显色法(轻工业部颁标准QB/T 1803-93)。

计算：X＝A×K×4/10×n＝0.4×A×K×n

X-样品的酶活力，U/mL

A-样品平行试验的平均吸光度

K-吸光常数

4-反应试剂的总体积，mL

n-稀释倍数

3、测定结果

经测定，实例中添加了稳定剂的液体蛋白酶相对酶活力比空白对照酶液相对活力高很多。进行极差分析得知影响碱性蛋白酶活力的几种成分作用效果主次为：4-甲酰苯基硼酸(4-FPBA)＞Ca²⁺＞甘油＞硼砂。复合稳定剂的最佳配比为：CaCl₂ 1g，硼砂0.5g，4-甲酰苯基硼酸0.01g，甘油和丙二醇(3∶7)总量1g，加入到100g液体碱性蛋白酶中，4℃保存3个月后，相对酶活力仍保持在85％以上。

Claims (2)

1.一种液体碱性蛋白酶复合稳定剂，其特征在于：

其构成组分及重量份数分别为：

CaCl₂           5～10

硼砂            5～10

4-FPBA          0.05～0.1

甘油与丙二醇混合物5～10

将上述各组分充分溶解、混合后，即可制得一种液体碱性蛋白酶复合稳定剂成品；

所述的甘油与丙二醇混合物中甘油：丙二醇的重量比＝3∶7。

2.根据权利要求1中所述的一种液体碱性蛋白酶复合稳定剂，其特征在于：所述的构成组分的最优重量份数分别为：

CaCl₂           10

硼砂            5

4-FPBA          0.1

甘油与丙二醇混合物10。