CN1041391A - 新抗生素拟鲥霉素的制备方法和农业园艺用杀菌剂 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种新抗生素拟鲥霉素(代号为SR-10)及其制备方法,还提供了一种有效成分为SR-10的农业园艺用杀菌剂。它既有强选择性,又有高度安全性,对施用人员毫无影响,并且无任何药害。本抗生素可通过培养链霉菌SP·SR-10(Streptomyces SP·SR-10)而制得。
Description
本发明是关于新抗生素拟鲥霉素(代号为SR-10)和其制备方法,以及一种有效成分为SR-10的农业园艺用杀菌剂。
以往,农业园艺用杀菌剂一直是使用如铜、汞、砷之类重金属化合物制剂和有机氯、有机磷药剂。但是这些药剂对动物和人体都有害,对土壤有污染作用,並且残留在自然界中的有害物质又长期地作用于动、植物。这样造成的环境污染已成了当今重大的社会问题,从而导致了目前这种被禁止或限制使用的局面。此外,随着选择性药剂的减少及抗药菌的出现,各种植物病害-尤其是水稻的主要病害有明显加重的趋势。为此,人们迫切希望能开发出一些既有强选择性效果,又有高度安全性的新型农药。
本发明的目的在于提供一种对各种植物病害均有效的新抗生素及其制备方法。而且本发明的目的还在于提供一种以上述抗生素为有效成份的农业园艺用杀菌剂。
本发明所述的抗生素SR-10为未见文献报道的新抗生素,其具有后述的理化性质。同时,在后述的喷撒试验中,对水稻的主要病害如水稻纹枯病、稻瘟病及其它如黄瓜灰霉病、黄瓜炭疽病、茄黑斑病、葡萄晚腐病等各种植物病害都显示了出色的防除效果,而且既无任何药害,又对施用人员毫无影响,是一种优良的农业园艺用杀菌剂。
以下、对本发明进行详细的说明。
抗生素SR-10的制备
使用的微生物
用来生产本发明所述抗生素SR-10的微生物是一种属于链霉菌属的菌种,其具有生产抗生素SR-10的能力。
链霉菌SP.SR-10(Streptomyces SP.SR-10)(中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号CGMCC-0136)(以下简称为“SR-10菌株”)就是其中一例。该菌株在与本申请相应的日本专利申请中被命名为“链霉菌SP.SR-10”。该微生物具有上述特性,适于生产本发明所述的抗生素SR-10,因而能有效地使用于本发明所述的制备方法中。
同时,上述SR-10菌株的自然及其人工变异菌株也均属于链霉菌属的菌种。凡具有生产后述抗生素SR-10能力的微生物均可应用本发明所述的方法。
上述“SR-10菌株”是从中国广西省的土壤中分离而得,其具有上述菌学性质。
1.形态特征:
在含有1%葡萄糖、1%酵母浸膏的菌体分析用培养基上培养本“SR-10菌株”,再用6N盐酸在110℃、加热水解18小时。水解物经薄层分析、可检出L、L-二氨基庚二酸,但未发现有M-二氨基庚二酸。
此外,用电子显微镜可观察到在琼脂平板上成长的气生菌丝呈螺旋状,孢子表面平滑、呈卵型,孢子锁在气生菌丝的前端形成众多的链状。
2.在各种培养基上的成长状态〔于27℃培养20天,颜色按照“颜色名称描述词典”(Descriptive Color Names Dictionary)记述。〕
1)淀粉·酵母琼脂培养基
生长:良好
气生菌丝:丰富
气生菌丝色调:2fe(钴灰)
基内色调:2gc(竹青)
可溶性色素:无
2)酵母膏·麦芽浸汁琼脂培养基
生长:良好
气生菌丝:丰富
气生菌丝色调:3cb+5fe(土灰)
基内色调:2ic(蜜黄)
可溶性色素:无
3)麦片琼脂培养基
生长:良好
气生菌丝:少量
气生菌丝色调:C(浅灰)
基内色调:b(牡蛎灰白)
可溶性色素:无
4)淀粉·无机盐琼脂培养基
生长:不良
气生菌丝:少量
气生菌丝色调:2ec(燕麦色)
基内色调:2gc(竹青)
可溶性色素:无
5)酪氨酸琼脂培养基
生长:良好
气生菌丝:丰富
气生菌丝色调:3dc(自然)
基内色调:3gc(灰白)
可溶性色素:无
6)蔗糖硝酸盐琼脂培养基
生长:普通
气生菌丝:普通
气生菌丝色调:3cb(土灰)
基内色调:3dc(自然)
可溶性色素:无
7)葡萄糖·天冬酰胺琼脂培养基
生长:不良
气生菌丝:少量
气生菌丝色调:2cb(灰象牙)
基内色调:2dc(自然)
可溶性色素:无
8)甘油·天冬酰胺琼脂培养基
生长:不良
气生菌丝:少量
气生菌丝色调:2cb(暗象牙)
基内色调:2dc(自然)
可溶性色素:无
9)营养琼脂培养基
生长:不良
气生菌丝:少量
气生菌丝色调:2cb(暗象牙)
基内色调:2dc(自然)
可溶性色素:无
10)蛋白胨·酵母膏·铁琼脂培养基
生长:良好
气生菌丝:无
气生菌丝色调:一
基内色调:2gc(竹青)
可溶性色素:无
3.糖的利用
D-葡萄糖 成长良好
肌醇 成长良好
D-甘露醇 成长良好
D-乳糖 成长良好
麦芽糖 成长良好
D-果糖 成长一般
山梨糖醇 成长一般
D-木糖 成长
L-阿拉伯糖 不成长
蔗糖 不成长
鼠李糖 不成长
棉子糖 不成长
乳糖 不成长
蜜二糖 不成长
山梨糖 不成长
4.其它生理性质
本菌株对淀粉水解、脱脂乳的凝固化和液化及嘌呤的利用反应呈阳性,对明胶的液化、硝酸盐的还原、纤维素的水解及黑色素的形成反应呈阴性。
从上可知本菌株属于链霉菌属,上述性质通过对柏氏细菌学鉴定手册(Bergey′s Manual of Determinative Bacteriorogy)及国际细菌分类学杂志(International Journal of Systematic Bacteriology)的检索,发现与其最近缘的菌种为Streptomyces Iividans,依此可检定本菌株当属该菌种。
培养方法及精制方法
本发明所述的抗生素SR-10可采用常规的方法,通过培养上述链霉菌属的生产菌而制得。培养方法既可为液体培养、也可为固体培养。但为了有利于工业性生产,宜将上述生产菌的孢子悬浮液或培养液接种到培养基上,並通过通气搅拌来加以培养。
培养基中的营养源並无特殊的规定,可采用常用的碳源、氮源及其它营养源。其中,碳源可为淀粉、糊精、甘油、葡萄糖、蔗糖、肌醇、乳糖、甘露醇等。氮源可为胨、大豆粉、肉膏、米糠、麦皮、尿素、玉米浆、铵盐、硝酸盐,以及其它有机或无机含氮化合物。至于其它营养源,可适当添加一些无机盐类,例如食盐、磷酸盐类及钾、钙、锌、锰、铁之类的金属盐,必要时也可添加些动、植、矿物油作为消泡剂。
对培养的温度、时间等条件並无严格的限制,以适于使用菌的成长为准,並选择SR-10产量最高的条件为好。例如,培养基的PH范围可为4~9,而以接近中性更好;培养温度宜在25~35℃之间。当然,培养温度、搅拌条件等均应根据所使用菌株的外部条件而进行适当的调节,以获得最好的效果。
由上述所得的培养物出发,通过一些适当的方法就能制得SR-10。这是些常用于提取代谢产物的常规方法。例如,可利用SR-10与不纯物在溶解度、离子结合力、吸附亲和力及分子量等方面的差别,进行单独、组合或反复提取。具体地讲,SR-10大部分存在于培养滤液之中,该培养滤液通过各种离子交换层析、凝胶层析、吸附层析、液相层析、纤维素层析等组合精制后,即可获得含有SR-10及其它活性成分的组份。该组份经冷冻干燥,所得粉末再通过高速液相色谱(例如:High-carbon ODS、以0.02%甲酸-水为展开剂)进一步精制,即可得到白色粉末状的SR-10精制品。
如此所得的新抗生素SR-10具有下述理化性质及生物性质。
抗生素SR-10的理化性质及生物性质。
分解点:230~232℃
元素分析:碳40.43% 氢5.45%
氮12.82% 硫3.32%
比旋度:〔α〕20=+9.2°(C=0.5% H2O)
紫外吸收光谱:λmaxH20=262(E1% 1cm=55.5)
λmax0.05NHCl=262(E1% 1cm=58.7)
λmax0.05NNaOH=218(E1% 1cm=94.5)
285(E1% 1cm=52.1)
红外吸收光谱:3350、2900、1650、1570、1530、1380、1210、1130、1070、760、540-1cm
溶解性:易溶于水,难溶于甲醇、丙酮、不溶于氯仿、苯和乙酸乙酯
分子量:822(SIMS质谱)(分子式:C29H42N8O18S)
呈色反应:与茚满三酮、高锰酸钾、来登·史密斯试剂、过碘酸联苯胺呈阳性反应;与蒽酮、三氯化铁呈阴性反应。
物质的颜色:白色粉末
薄层色谱:美国Merck公司制造的0.25mm硅胶薄层板
溶剂 丁醇∶吡啶∶醋酸∶水=10∶10∶3∶12
Rf值 0.29
溶剂 丁醇∶甲醇∶水=2∶1∶2
Rf值 0.29
抗菌谱:采用通常琼脂平板上的抑制圈检定法来表示。
抑制圈直径(30μg/disc)
黄瓜灰霉病菌 40mm
(Botrytis cinerea)
黄瓜炭疽病 20mm
(Colletotrichum lagenarium)
水稻稻瘟病 0
(Pyricularia oryzae)
格链孢菌 0
(Alternaria mali)
水稻黄单胞菌 0
(Xanthomonas oryzae)
大肠埃希氏菌 0
(Eschia coli)
金色葡萄球菌 0
(Staphylococcus aureus)
白色念珠菌 0
(Candida albicans)
酸性水解:以5.7NHCI、110℃、加热20小时后,进行氨基酸分析,可检出丝氨酸和丙氨酸。
与其它物质的比较
在紫外光谱中,中酸性时,在262nm处;碱性时,在285nm处有吸取峰的已知抗生素为具有尿嘧啶环核的核苷类抗生素。特别是鲥霉素(Ezomycin)B、C、D和SR-10的UV吸取峰相一致。但是是,在HPLC中与鲥霉素B1、B2、C1、C2、D1、D2进行比较时,可发现SR-10与这些鲥霉素並不一致。此外,作为氨基酸来说,鲥霉素只含有丙氨酸,而SR-10却含有丙氨素和丝氨酸。在已知核苷类抗性素中,並不存在同时具有这两种氨基酸的物质,故而可以推定SR-10为一种新抗生素。
有效成分为SR-10的农业园艺用杀菌剂
本发明所述的有效成分用作农业园艺用杀菌剂时,可同样使用该技术领域中已知农药所通用的固相载体、液相载体及乳化分散剂等制剂。並能配制成颗粒剂、粉剂、乳化剂、可湿性粉剂、片剂、油剂、喷雾剂等任意的剂型。这些载体中固相载体可以是粘土、高岭土、皂土、酸性白土、硅藻土、碳酸钙、硝化纤维素、淀粉、阿拉伯胶等;液相载体可以是甲醇、乙醇、丙酮、二甲基甲酰胺、乙二醇等。同时,在制剂中一般可适当添加些补助剂,如高级醇的硫酸酯、聚氧化乙烯、烷基烯丙基醚、烷基烯丙基聚乙二醇醚、烷基烯丙基无水山梨糖醇月桂酸酯、烷基烯丙基磺酸盐、季胺盐、聚烯化氧等。
一般而言,各制剂中有效成分的配比,在乳剂及可湿性粉剂中为10~90%;在粉剂及油剂中为0.1~10%。当然,也可根据不同的使用目的而适当增减。
此外,本发明的制剂还可与其它杀菌剂、除草剂、杀虫剂、肥料物质、土壤改良剂等配合使用。
以下,就本发明的制造、实施、试验事例作具体的说明,但这並不意味着对本发明有所限定。
其中:〔%〕、〔比〕分别表示重量%、重量比。
制造例
以葡萄糖2%、可溶性淀粉1%、肉汁浸膏0.1%、干酵母0.4%、大豆粉2.5%、食盐0.2%、磷酸二氢钾0.005%的配比制成36l的培养基,将上述“SR-10菌株”接种于该培养基中,並置于27℃振动培养66小时。取其培养滤液27l通过Dowel柱(7.5×70cm)以吸着活性物质。以15l水洗后,用6l1N醋酸溶出活性物质。溶出液用吡啶中和后浓缩、吸着于IRC-50柱(5.7×30cm)以水溶出。溶出液经收集活性区、浓缩后,再吸着于Diaion HP-20柱(5.7×35cm)以水溶出。溶出液经收集活性区、浓缩、干燥、即得本物质的粗粉末14g。
取上述粗粉末5g溶解于少量由丁醇∶甲醇∶水=2∶1∶2组成的溶液中,使其吸着于纤维素柱的上部,再以同样的溶剂区分溶出。活性区为18ml、No.88-140,经浓缩、冷冻干燥得415mg粉末。该粉末通过高压液相色谱得到进一步的精制。柱:Nucleosil High-Carbon ODS(直径20mm、长25cm)、溶剂:0.02%甲酸一水、流速:9.0ml/min、压力:180kg/cm2、展开时间:16~18分钟。活性区经反复分离后,浓缩、冷冻干燥即可得60mg纯粹的白色粉末。
实施例1 可湿性粉剂
将10份SR-10与5份十二烷基磺酸钠、2份二苯甲烷-二磺酸钠-甲醛聚合物及83份陶土混合、粉碎,即得100份制剂。
实施例2 乳剂
将8份SR-10与10份乙二醇、20份二甲基甲酰胺、10份烷基-二甲基苄基氯化铵及52份甲醇混合、溶解,即得100份乳剂。
实施例3 粉剂
将0.2份SR-10与0.5份硬脂酸钙、50份滑石粉及49.3份陶土混合、粉碎,即得100份粉剂。
实施例4颗粒剂
将10份SR-10与15份淀粉、72份皂土粉及3份十二烷基硫酸钠混合、粉碎、即得100份制剂。
试验例
对黄瓜灰霉病的防治试验
将按实施例1所制成的可湿性粉剂稀释到所定的浓度,然后喷到播种后成长15天的黄瓜(品种:相横半白)幼苗上,並进行风干。将黄瓜灰霉病菌(Botorytis cinerea)置于土豆、葡萄糖琼脂培养基上培养,用BLB光进行照射使孢子诱发。将诱发后的孢子悬浮于10%葡萄糖和1%的酵母抽提溶液中。药液干燥后,将黄瓜移至接种箱,用喷雾器将上述悬浮液进行喷雾接种,每10棵黄瓜幼苗约喷药10CC。接种后的黄瓜置于恒温度多湿的地方,4天后检查发病的情况。
防治效果按下述方法进行计算
发病指数 发病程度
0 不发病
1 仅有病斑
2 发病面积占10%以下
3 发病面积占10%以上至20%以下
4 发病面积占20%以上至30%以下
5 发病面积占30%以上至40%以下
6 发病面积占40%以上
防治效果(%)=(1- (理区发病指数之和)/(对照区发病指数之和) )×100
其结果如表1所示
表1:
试验化合物 喷 浓度(ppm) 防治效果(%) 药害
SR-10 50 96 无
25 94 无
12.5 87 无
6.25 77 无
苯莱特*250 92
对照 - 0 -
*1-(丁基氨基甲酰)-2-苯并咪唑氨基甲酸甲酯
根据以上试验的结果可以证明,本发明所述的SR-10提供了一种新的农业园艺用杀菌剂。这种杀菌剂在低浓度下对植物病害也具有极高的防治效果。而且具有高度的安全性,並无任何药害。
附图的简单说明
图1为本发明所述的抗生素SR-10的紫外吸收光谱图;图2为本发明所述的抗生素SR-10的红外吸收光谱图。
Claims (3)
1、一种新抗生素SR-10的制备方法,其特征在于培养属于链霉菌(Streptomyces)属的抗生素SR-10的生产菌,再从这些培养物中分离提取新抗生素SR-10。
2、按权利要求1所述的制备方法,其特征在于所述的抗生素SR-10的生产菌为链霉菌sp.SR-10(Streptomyces sp.SR-10)。
3、一种农业园艺用杀菌剂,其特征在于所含的有效成分为新抗生素SR-10。
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