CN104136609A - 辅助性t细胞诱导多肽的修饰 - Google Patents

Abstract

本发明提供了能够实现有效抗原呈递的肿瘤抗原特异性的Th诱导多肽和使用它们的抗肿瘤剂。

Description

辅助性T细胞诱导多肽的修饰

技术领域

本发明涉及辅助性T细胞(Th)诱导多肽的修饰分子和含有修饰分子的抗肿瘤剂等。

背景技术

在针对肿瘤的免疫中，CD8⁺细胞毒性T淋巴细胞(CTL)作为杀死肿瘤细胞的效应物起关键作用。另外，已经报道，CD4⁺ 辅助性T (Th)细胞，特别是Th1型Th细胞，是诱导有效的抗肿瘤免疫活性所必需的(非专利文献1 - 4)。迄今为止，关于Th细胞在抗肿瘤免疫方面的作用已经做出多篇报道；并且CTL的分化和生长的诱导(非专利文献5)、提供能够直接活化CTL的抗原呈递细胞(APC)并通过抗原向APC的交叉呈递来活化CTL (非专利文献6、7)、对CTL和APC的抗细胞凋亡效应(非专利文献8、9)、帮助记忆CD8 T细胞生长的功能以及外周库的保持和繁殖(非专利文献10、11)、CTL向肿瘤组织中渗入的诱导(非专利文献12, 13)等是已知的。

关于使用抗肿瘤免疫来治疗恶性肿瘤的方法已经做出许多研究。例如，在使用结合HLA (人白细胞抗原；下述的人MHC将被称作HLA) I类的、诱导CTL的肿瘤抗原特异性多肽的免疫疗法中，将所述多肽单独施用或者与非甲基化的脱氧CpG、Toll-样受体配体或佐剂（诸如Flt3）一起施用。但是，通过这样的方法，CTL可以生长，但难以活化至足以作为效应物的水平，并且临床应答是有限的。作为一种新的抗肿瘤免疫疗法，还考虑这样的免疫疗法，其使用结合HLA I类的、诱导CTL的肿瘤抗原多肽和结合HLA II类的、诱导Th细胞的肿瘤抗原多肽。但是，这样的方法不一定活化肿瘤抗原特异性的Th细胞，而是相反，可能诱导抑制针对肿瘤抗原的调节性T细胞(T_reg)，由此导致抗肿瘤免疫可能被抑制(非专利文献14)。具体地，在抗肿瘤免疫中，由于靶抗原是在个体自己体内在生理学上产生的肿瘤抗原，免疫系统会将肿瘤抗原视作它自己的组分，通常不会表现出侵袭性应答。这是因为，阻止T细胞的自体反应性的“自体耐受性”的固有系统会造成识别自体抗原并与其强烈反应的未成熟T细胞的细胞死亡，并在功能上抑制与自体抗原温和地或较弱地反应的剩余T细胞。因此，肿瘤抗原的粗心施用非常可能诱导T_reg和抑制针对肿瘤的免疫应答。为了排除这种可能性，发明人曾经通过包括以下步骤的方法成功地诱导了抗肿瘤免疫：使用非肿瘤抗原百日咳疫苗（其含有结合HLA I类的、诱导CTL的肿瘤抗原多肽）作为佐剂来诱导针对第三方抗原百日咳博德特氏菌（Bordetella pertussis）的Th细胞，并用Th细胞培养肿瘤抗原特异性的CTL (专利文献1)。具体地，由于在该方法中使用百日咳博德特氏菌全细胞疫苗，可以有效地诱导表现出高CTL诱导活性的Th1型Th细胞。但是，关于肿瘤抗原特异性的Th1细胞的诱导，由于上述的调节性T细胞的问题，尚不存在确定的诱导方法。

[文件列表]

[专利文献]

专利文献1: WO2008/096831

[非专利文献]

非专利文献1: Fallarino等人, J Immunol 165, 5495-5501, 2000

非专利文献2: Jin等人, Int J Cancer 111, 558-567, 2004

非专利文献3: Nishimura等人, J Exp Med 190, 617-627, 1999

非专利文献4: Xie等人, J Exp Med 207, 651-667, 2010

非专利文献5: Keene和Forman, J Exp Med 155, 768-782, 1982

非专利文献6: Bennett等人, Nature 393, 478-480, 1998

非专利文献7: Ridge等人, Nature 393, 474-478, 1998

非专利文献8: Kennedy和Celis, J Immunol 177, 2862-2872, 2006

非专利文献9: Mueller等人, J Immunol 176, 7379-7384, 2006

非专利文献10: Janssen等人, Nature 852-856, 2003

非专利文献11: Shedlock和Shen, Science 300, 337-339, 2003

非专利文献12: Marzo等人, J Immunol Methods 165, 6047-6055, 2000

非专利文献13: Wong等人, J Immunol 3112-3131, 2008

非专利文献14: Yamazaki等人, Blood 110, 4293-4302, 2010。

发明内容

本发明要解决的问题

本发明的一个目的是，提供肿瘤抗原特异性的Th诱导多肽的修饰分子和使用它们的抗肿瘤剂。

解决问题的方式

发明人注意到包括免疫接种MHC (主要组织相容性复合物) I类结合肽来诱导CTL的常规免疫接种方案的一个严重问题是不能实现足够抗肿瘤活性，即使当肿瘤特异性的CTL存在时，因为它不会充分地渗入肿瘤组织中。因此，发明人研究了肿瘤特异性的T细胞渗入进肿瘤组织中的机制，并注意到，体内实体瘤消退通常不仅与肿瘤组织中的CTL有关，而且与Th细胞的渗入有关。以前的报道在这点上是达成共识的。通常，由于T细胞(Th和CTL)在血液中循环遍及全身，它们被血管内皮细胞阻止，不可直接接触肿瘤组织。发明人首次发现，血管内皮细胞会摄取在附近的细胞凋亡性肿瘤细胞，并将肿瘤抗原衍生的多肽呈现给血管内皮细胞的MHC II类，以将肿瘤特异性的Th细胞招引进肿瘤组织中。发明人还观察到，侵入肿瘤组织中的Th会分泌IFN-γ，并且IFN-γ诱导趋化因子(I-TAC、IP-10、Mig)在血管内皮细胞中的表达，由此促进高度表达CXCR-3（其为这些IFN-γ依赖性的趋化因子的受体）的CTL在肿瘤中的渗入，从而使实体瘤消退。因此，就该活性而言，肿瘤特异性的Th细胞理想地是Th1型Th。该发现已经使得下述方面显而易见：开发一种用于有效地诱导肿瘤抗原特异性的Th细胞的方法是开发造成实体瘤消退的免疫接种方案的关键技术。在本申请中，注意向这些多肽添加修饰，所述修饰会赋予对酶的抗性，所述酶降解结合MHC II类的多肽、诱导Th对这些多肽的消化。所以，如下所述，可以使Th诱导效率增加数百倍。已经澄清，该效应是非常有利的（特别当用肿瘤抗原多肽在体内免疫活体时），并且是诱导针对肿瘤抗原（其为通常难以诱导Th细胞的自身抗原）的Th细胞所必需的修饰。也就是说，证实了通过根据Th细胞的多肽识别效率给结合MHC II类的多肽添加修饰，可以显著增加诱导效率。基于这些想法，发明人进行了许多研究并完成了本发明。

因此，本发明提供了

[1]分离的多肽的修饰分子，其源自肿瘤特异性的抗原且结合MHC II类分子；

[2] [1]的修饰分子，其中所述修饰是向分离的多肽的C端侧和/或N端侧添加几个氨基酸；

[3] [2]的修饰分子，其中要添加至分离的多肽的C端侧的氨基酸是由下式(I)表示的氨基酸序列：

X1-X2-X3-X4 (I)

其中

(1) X1表示生物素化的Lys，X2表示几个氨基酸或单键，X3表示一个氨基酸或单键，且X4表示一个氨基酸或羧基(条件是，当X3是Pro时，那么X4表示一个氨基酸)，

(2) X1表示一个除了生物素化的Lys以外的氨基酸或单键，X2表示几个氨基酸或单键，X3表示Pro，且X4表示一个氨基酸，或

(3) X1表示一个除了生物素化的Lys以外的氨基酸或单键，X2表示几个氨基酸或单键，X3表示一个除了Pro以外的氨基酸或单键，且X4表示β-Ala)；

[4] [3]的修饰分子，其中要添加至分离的多肽的C端侧的氨基酸是由式(I)表示的氨基酸序列，其中

(1) X1表示生物素化的Lys，X2表示一个氨基酸或单键，X3表示一个氨基酸或单键，且X4表示一个氨基酸或羧基(条件是，当X3是Pro时，那么X4表示一个氨基酸)，或

(2) X1表示单键，X2表示单键，X3表示Pro，且X4表示一个氨基酸；

[5] [4]的修饰分子，其中要添加至分离的多肽的C端侧的氨基酸是由式(I)表示的氨基酸序列，其中

X1表示生物素化的Lys，X2表示单键，X3表示单键，且X4表示Gly或羧基，

X1表示单键，X2表示单键，X3表示Pro，且X4表示Ala或β-Ala，或

X1表示生物素化的Lys，X2表示单键，X3表示Pro，且X4表示β-Ala；

[6] [2]-[5]中的任一项的修饰分子，其中要添加至分离的多肽的N端侧的氨基酸是由下式(II)表示的氨基酸序列：

Y1-Y2-Y3 (II)

其中

(1) Y1表示Pro，Y2表示几个氨基酸或单键，且Y3表示一个氨基酸或单键，或

(2) Y1表示一个除了Pro以外的氨基酸或氨基，Y2表示几个氨基酸或单键，且Y3表示生物素化的Lys

(条件是，不包括其中从N端计的第二个氨基酸是Pro的氨基酸序列)；

[7] [6]的修饰分子，其中要添加至分离的多肽的N端侧的氨基酸是由式(II)表示的氨基酸序列，其中

(1) Y1表示Pro，Y2表示一个氨基酸或单键，且Y3表示一个氨基酸或单键，或

(2) Y1表示一个除了Pro以外的氨基酸或氨基，Y2表示一个氨基酸或单键，且Y3表示生物素化的Lys

(条件是，不包括其中从N端计的第二个氨基酸是Pro的氨基酸序列)；

[8] [7]的修饰分子，其中要添加至分离的多肽的N端侧的氨基酸是由式(II)表示的氨基酸序列，其中

Y1表示Pro，Y2表示Ser，Y3表示单键，

Y1表示氨基，Y2表示Ser，且Y3表示生物素化的Lys，或

Y1表示Pro，Y2表示Ser，且Y3表示生物素化的Lys；

[9] [1]-[8]中的任一项的修饰分子，其中所述分离的多肽包含源自WT1、PSA、MAGE-3、存活素、CEA、酪氨酸酶、丙型肝炎病毒或EB病毒的氨基酸序列，且结合MHC II类分子；

[10] [9]的修饰分子，其中所述分离的多肽包含源自WT1的氨基酸序列且结合MHC II类分子；

[11] 分离的多肽，其包含由SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 38或SEQ ID NO: 40显示的氨基酸序列；

[12] 抗肿瘤剂，其包含[1]-[10]中的任一项的修饰分子或[11]的分离的多肽；

[13] [12]的抗肿瘤剂，所述抗肿瘤剂还包含分离的多肽，所述多肽源自肿瘤特异性抗原且结合MHC I类分子；

[14] [12]或[13]的抗肿瘤剂，所述抗肿瘤剂还包含佐剂；

[15] [14]的抗肿瘤剂，其中所述佐剂是百日咳疫苗；

[16] 治疗肿瘤的方法，所述方法包括：给患者施用有效量的[12]-[15]中的任一项的抗肿瘤剂；

[17] 用于治疗肿瘤的组合物，其包含[1]-[10]中的任一项的修饰分子或[11]的分离的多肽、源自肿瘤特异性抗原且结合MHC I类分子的分离的多肽和佐剂；

[18] [1]-[10]中的任一项的修饰分子或[11]的分离的多肽在生产抗肿瘤剂中的用途；

[19] 一种检查试验对象是否具有结合在修饰分子中所含的分离多肽的MHC II类分子的方法，所述方法包括：培养从试验对象衍生出的抗原呈递细胞群体和[1]-[10]中的任一项的修饰分子，和证实所述抗原呈递细胞群体和所述修饰分子的结合；

[20] 一种检查肽是否可以结合抗原呈递细胞的方法，所述方法包括：培养抗原呈递细胞，所述细胞表达特定MHC II类分子和具有经修饰的N端和/或C端的任意肽，和证实所述抗原呈递细胞和所述肽的结合；等。

本发明的效果

使用本发明的肿瘤抗原特异性的Th诱导多肽的修饰分子，可以比以前显著更有效地将肿瘤特异性抗原呈递在抗原呈递细胞的MHC II类分子上，并且可以更有效地诱导肿瘤抗原特异性的Th细胞。所以，肿瘤抗原特异性的Th细胞可以渗入肿瘤组织中。此外，假如该Th细胞已经渗入肿瘤组织中，CTL会引导渗入肿瘤组织中并杀死肿瘤细胞。

附图说明

图1，上图显示了渗入实体瘤(EL4肿瘤和E.G7 (表达OVA基因的EL4)肿瘤)中的PKH-标记的DO11.10的数目。下图显示了脾中的PKH阳性细胞的数目。KO显示了MHC II类(I-A_β ^b) KO小鼠; KO→F1显示了用MHC II类KO小鼠的骨髓移植的CBF1小鼠；且F1→KO显示了作为其反转的骨髓嵌合小鼠。

图2显示了在将F2-IA^d细胞（其已经摄入每个肿瘤细胞2天）或OVAII脉冲的F2-IA^d细胞和DO11.10细胞温育24小时以后，DO11.10细胞中的CD69阳性细胞的比例。

图3显示了在将F2-IA^d细胞（在有或没有氯喹存在下与OVA一起呈递抗原3天）和DO11.10细胞温育24小时以后，DO11.10细胞中的CD69阳性细胞的比例。

图4显示了在将F2-IA^d细胞（在有或没有氯喹存在下已经摄入每个肿瘤细胞2天）或OVAII脉冲的F2-IA^d细胞和DO11.10细胞温育24小时以后，DO11.10细胞中的CD69阳性细胞的比例的对比。

图5显示了迁移穿过用不同浓度的OVAII脉冲的F2-IA^d细胞层的DO11.10细胞的数目，和识别类似地处理的F2-IA^d细胞且变成CD69阳性的DO11.10细胞的数目的比例。

图6是已经吞噬EL4-EGFP细胞或EG7-EGFP细胞的内皮细胞的显微照片。黑色箭头显示了含有在细胞内发射绿色EGFP荧光肿瘤细胞碎片的内皮细胞。白色箭头显示了尚未包含在细胞内发射绿色EGFP荧光的肿瘤细胞的内皮细胞。

图7的图显示了在内皮细胞下面蠕动的DO11.10细胞的数目。用n显示了计数的内皮细胞的总数。垂直条显示了标准差(SD)的范围。用星号标记这样的组合：其通过Student氏t-检验显示出测量的数目的P<0.05的统计显著差异。

图8显示了用活化Th或CTL的OVA衍生多肽免疫的小鼠中的抗肿瘤作用。EL4是移植给每只免疫小鼠的EL4肿瘤；EG7是移植给相同小鼠的EG7肿瘤；OVA-I是CTL诱导肽；OVA-II是Th诱导肽；且λ是第三方抗原肽。

图9显示了渗入CBF1小鼠的EL4或E.G7-OVA (EG7)肿瘤的、PKH-标记的OT-1的数目。CXCR3^- 是CXCR3基因缺陷型CTL；且IFN-γ^- 是IFN-γ基因缺陷型Th细胞。

图10显示了当用Th或CTL或二者过继免疫具有肿瘤块的小鼠时的抗肿瘤作用。用于评价的小鼠的数目是：7（对于PBS注射组），7（对于DO11.10单独转移组），8（对于OT-1单独转移组），和8（对于用DO11.10和OT-1转移的组）。

图11显示了识别每种OVII的修饰分子的DO11.10细胞的增殖。

图12显示了当使用含有未经热灭活的FCS的培养基时，识别每种OVII的修饰分子的DO11.10细胞的增殖。

图13显示了当使用含有热灭活的FCS的培养基时，识别每种OVII的修饰分子的DO11.10细胞的增殖。

图14显示了当使用不含卡托普利的培养基时，每种OVII的修饰分子对DO11.10细胞的增殖。

图15显示了当使用含有卡托普利的培养基时，每种OVII的修饰分子对DO11.10细胞的增殖。

图16显示了当使用无血清培养基时，每种OVII的修饰分子对DO11.10细胞的增殖。

图17显示了每个生物素化的OVII的修饰分子对在CH1-IA^d细胞上表达的I-A^d分子的结合能力。

图18显示了每个生物素化的OVII的修饰分子对DO11.10细胞的增殖。

图19显示了每个生物素化的OVII的修饰分子对DO11.10细胞的增殖。

图20显示了每个生物素化的或非生物素化的OVII的修饰分子对DO11.10细胞的增殖。

图21显示了每种OVII的修饰分子对血清肽酶的消化抗性。在a.-d.中，使用小鼠血清作为血清，在e.中，使用人血清作为血清，且在f.中，使用MCC肽作为核心肽来替代OVII肽。

图22显示了OVII肽的消化实验，其中使用含有卡托普利的缓冲液。

图23显示了OVII肽的消化实验，其中使用含有邻菲咯啉的缓冲液。

图24显示了OVII肽的消化实验，其中使用含有苯丁抑制素的缓冲液。

图25显示了底物肽的消化实验，其中使用抗原呈递细胞的ACE活性的抑制剂。水平轴显示了底物添加以后的温育时间，垂直轴显示了荧光单位。

图26显示了使用每种OVII的修饰分子体内免疫接种时，CD69阳性的DO11.10细胞的比率。

图27显示了使用WA36的修饰分子体内免疫接种时，IFN-γ阳性的Th细胞的比率。

图28显示了使用W332的修饰分子，具有HLA-DR15的人外周血单核细胞(PBMC)中的、体外W332反应性的Th细胞诱导活性。进行细胞内IFNγ染色和CD4染色，通过流式细胞计进行分析，并显示了CD4阳性细胞中的细胞内IFNγ阳性细胞的比率。

图29表明，A: PbW332bPβ结合表达HLA-DR分子的CH1-DR4细胞，和B:C―F各自显示了5只小鼠的平均肿瘤生长曲线。在垂直轴上显示了肿瘤的长直径和与其垂直的最大短直径的乘积。垂直条显示了标准差(SD)的范围。C：该图显示了FBL3红白血病细胞的肿瘤生长曲线，所述FBL3红白血病细胞接种给用单独的百日咳博德特氏菌全细胞疫苗(Wc)（其为佐剂）免疫的CBF1小鼠。D：该图显示了用W332肽免疫的小鼠中的FBL3肿瘤的生长曲线，所述W332肽诱导Wc和WT1肿瘤抗原特异性的Th细胞。E：该图显示了用Db126肽免疫的小鼠中的FBL3肿瘤的生长曲线，所述Db126肽诱导识别Wc和WT1肿瘤抗原的CTL。F：该图显示了用Wc和W332和Db126免疫的小鼠中的FBL3肿瘤的生长曲线。

图30显示了肽与活抗原呈递细胞上的MHC II类分子的结合活性的竞争测定。

图31显示了肽与活抗原呈递细胞上的HLA-DR4分子的结合活性的竞争测定。

具体实施方式

本发明的发明人已经首次发现，肿瘤特异性的Th细胞会识别在血管内皮细胞的MHC II类分子上呈递的肿瘤特异性抗原衍生的多肽并迁移至肿瘤组织。为了在生理条件下活化识别活生物体中的特定肿瘤抗原的Th细胞，需要将肿瘤特异性的抗原蛋白包含抗原呈递细胞(APC)中并使由其消化产生的多肽呈递至抗原呈递细胞的HLA II类分子。也可能通过直接添加合成肽来绕过消化步骤并将多肽呈递至HLA II类分子APC。但是，当将肿瘤特异性抗原衍生的多肽施用给靶标时，得到的结果提示以下可能性：所述多肽被存在于血液中或抗原呈递细胞表面上的蛋白(肽)降解酶降解，并且不会充分地呈递在MHC II类分子上。为了将肿瘤特异性抗原衍生的多肽有效地呈递在抗原呈递细胞上，本发明提供了源自肿瘤特异性抗原且结合MHC II类分子的分离的多肽(在下文中有时被称作本发明的抗原肽)的修饰分子(有时被称作本发明的修饰分子)。

在本说明书的肽和蛋白中，根据肽标记中的常规实践，左端是N端(氨基端)，右端是C端(羧基端)。

在本说明书中，肿瘤的例子包括：恶性实体瘤诸如肾癌、肺癌、食管癌（包括胃肠癌）、卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、脑肿瘤、头和颈肿瘤、肉瘤等，白血病和血液产生的恶性肿瘤。在这些中，可以特别地提及表达肿瘤特异性抗原的肿瘤。这些肿瘤可以是在晚期。所述肿瘤特异性抗原可以不仅包括在正常组织或正常细胞中不表达、但是在肿瘤组织或肿瘤细胞中表达的抗原，而且包括与正常组织或正常细胞的表达水平相比在肿瘤组织或肿瘤细胞中显示出显著高表达水平的抗原。这样的肿瘤特异性抗原的例子包括具有诱导免疫反应（诸如抗体产生、细胞免疫等）的活性的蛋白(肽)。在这些中，更优选的是这样的肿瘤特异性抗原：通过加工和片段化从其得到被MHC II类分子识别的多肽，以诱导刺激细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的T细胞(Th1细胞)。使用具有约7-20个氨基酸、更优选约9-17个氨基酸、进一步优选约9-15个氨基酸的长度的多肽，作为源自肿瘤特异性抗原且结合MHC II类分子的分离多肽。由MHC II类分子加工和识别的肿瘤特异性抗原的例子包括WT1 (威尔曼瘤-1)、PSA (前列腺特异性的抗原)、MAGE-3、CEA、存活素、酪氨酸酶等，优选WT1。可替换地，由MHC II类分子识别的另一种肿瘤特异性抗原可以是源自病毒的蛋白，所述病毒在感染人（包括哺乳动物）时造成前述肿瘤。这样的抗原表示源自与恶性肿瘤的发展密切相关的病毒集合的蛋白，例如，源自与恶性肿瘤的发展密切相关的病毒集合（诸如丙型肝炎病毒和EB病毒）的蛋白或含有其氨基酸序列的一部分的肽。所述肿瘤特异性抗原衍生的多肽可以是全长蛋白或部分肽，只要它具有作为抗原的免疫原性。具体地，可以优选地使用在WO00/06602、WO00/26249、WO2006/030770等中描述的那些作为这样的肿瘤特异性抗原（在WT1的情况下）。更具体地，可以提及W332 (KRYFKLSHLQMHSRKH; SEQ ID NO: 1)、WA36 (PVLDFAPPGASAYGS; SEQ ID NO: 2)等作为WT1抗原衍生的多肽。可以优选地使用PSA221-240 (GVLQGITSWGSEPCALPERP; SEQ ID NO: 3)作为PSA衍生的多肽，可以优选地使用243-258 (KKLLTQHFVQENYLEY; SEQ ID NO: 4)作为MAGE-3衍生的多肽，可以优选地使用321-333 (LWWVNNQSLPVSP; SEQ ID NO: 5)和653-667 (YACFVSNLATGRNNS; SEQ ID NO: 6)作为CEA衍生的多肽，可以优选地使用97-111 (TLGEFLKLDRERAKN; SEQ ID NO: 7)作为存活素衍生的多肽，可以优选地使用175-185 (EIWRDIDFAHE; SEQ ID NO: 8)作为酪氨酸酶衍生的多肽，更具体地，可以优选地使用在WO 2005/105993等中描述的SEQ ID NO: 184的氨基酸No. 789-797 (ALYGVWPLL; SEQ ID NO: 9)、氨基酸No. 111-130 (DPRRRSRNLGKVIDTFTCGL; SEQ ID NO: 10)、氨基酸No. 161-180 (SVNYATGNLPGCSFSIFLLA; SEQ ID NO: 11) 作为丙型肝炎病毒肽。可以优选地使用LMP-1 159-175 (YLQQNWWTLLVDLLWLL; SEQ ID NO: 12)作为EB病毒肽。

本发明的修饰分子是结合MHC II类分子的分离的多肽，其被修饰成，当将本发明的抗原肽在体内施用或在体外添加时，不会被蛋白(肽)降解酶降解或不会被蛋白(肽)降解酶容易地降解。在这里，所述肽降解酶的例子包括：血管紧张素I转换酶(ACE)、二肽基肽酶IV (DPPIV; CD26)、氨肽酶N (CD13)、氨肽酶P等。尽管ACE具有从肽链的C端释放二肽的活性，它不可释放由Pro-X组成的二肽。DPPIV具有从二肽释放含有脯氨酸残基的二肽(X-Pro)的活性，所述二肽具有在肽链的N端的第二个位置处的脯氨酸残基。尽管CD13具有从肽链的N端释放氨基酸的活性，它不可切割X-Pro。氨基肽酶P具有从肽链的N端释放氨基酸的活性并且也切割X-Pro。应用于本发明的抗原肽的修饰没有特别限制，只要所述修饰分子对蛋白(肽)降解酶具有抗性，与抗原一起被MHC II类分子呈递，并且MHC II类分子-本发明的修饰分子(或本发明的抗原肽)的复合物会被Th细胞的TCR识别。其例子包括：从本发明的抗原肽删除几个氨基酸，向本发明的抗原肽添加几个氨基酸，在本发明的抗原肽中插入几个氨基酸，将本发明的抗原肽的几个氨基酸置换为其它氨基酸，和它们的组合，优选向本发明的抗原肽添加几个氨基酸。在这里，几个意味着1个或多个(1个至约30个，优选1个至约10个，更优选几个(1个至5个))氨基酸。

当将几个氨基酸添加至、插入或置换本发明的抗原肽时，要添加、插入或置换的氨基酸可以是20种天然氨基酸(Gly、Ala、Leu、Ile、Val、Arg、Lys、Glu、Gln、Asp、Asn、Cys、Met、His、Pro、Phe、Tyr、Thr、Ser、Trp)或修饰的或非天然的氨基酸(例如，生物素化的氨基酸(例如，生物素化的Lys (其中生物素与ε氨基共价地键合的Lys)、N^α-生物素化的氨基酸、乙酰化的氨基酸(其中N端氨基被乙酰化的氨基酸)、2-氨基己二酸、3-氨基己二酸、β-Ala、2-氨基丁酸、4-氨基丁酸、6-氨基己酸、2-氨基庚酸、2,3-二氨基丙酸、N-乙基甘氨酸、N-乙基天冬酰胺、羟赖氨酸、正缬氨酸、正亮氨酸、鸟氨酸等)。另外，它还可以含有天然存在的20种α-氨基酸、β-氨基酸(例如，β-Ala)、γ-氨基酸等。尽管这些氨基酸可以是疏水的或亲水的，亲水的氨基酸是优选的。在这里，疏水的氨基酸是指Ile、Leu、Val、Ala、Phe、Pro、Met、Trp、Tyr和Gly，且碱性的氨基酸是指Arg、Lys和His，酸性的氨基酸是指Asp、Glu，且亲水的中性氨基酸是指Asn、Gln、Ser、Thr和Cys。在这些氨基酸中，α-氨基酸可以是L形式或D形式或这些的混合物，优选L形式。当将氨基酸添加至抗原肽时，添加的位置没有特别限制，只要它对肽降解酶的降解和MHC II类分子呈递的抗原具有抗性。它通常是本发明的抗原肽的N端和/或C端。

此外，要添加的几个氨基酸(肽)可以是直链肽或支链(树枝状聚合物类型)肽。例如，当本发明的修饰分子含有在侧链中具有氨基的氨基酸诸如Arg、Lys等时，支链可以通过结合肽的氨基和其它氨基酸或羧基而形成。另外，当本发明的修饰分子含有在侧链中具有羧基的氨基酸诸如Glu、Asp等时，支链可以通过结合肽的羧基和其它氨基酸或氨基而形成。此外，当本发明的修饰分子含有Cys时，支链还可以经由与其它Cys或含有其它Cys的肽的二硫键而形成。

可以添加至本发明的抗原肽的C端侧的氨基酸是前述氨基酸，优选由下式(I)表示的氨基酸序列：

X1-X2-X3-X4 (I)

其中

(1) X1表示生物素化的Lys，X2表示几个氨基酸或单键，X3表示一个氨基酸或单键，且X4表示一个氨基酸或羧基(条件是，当X3是Pro时，那么X4表示一个氨基酸)，

(2) X1表示一个除了生物素化的Lys以外的氨基酸或单键，X2表示几个氨基酸或单键，X3表示Pro，且X4表示一个氨基酸，或

(3) X1表示一个除了生物素化的Lys以外的氨基酸或单键，X2表示几个氨基酸或单键，X3表示一个除了Pro以外的氨基酸或单键，且X4表示β-Ala)。

在本说明书中，Xn是单键意味着，在Xn中基本上不存在氨基酸，并且与X(n-1)的氨基酸的不对称碳原子键合的羧基和与X(n+1)的氨基酸的不对称碳原子键合的氨基通过肽键的单键而连接。因此，例如，式(I)的氨基酸序列（其中X1表示生物素化的Lys，X2表示单键，X3表示Pro，且X4表示β-Ala）是由生物素化的Lys-Pro-β-Ala表示的氨基酸序列。

更优选地，可以添加至本发明的抗原肽的C端侧的氨基酸是由式(I)表示的氨基酸序列，其中

(1) X1表示生物素化的Lys，X2表示一个氨基酸或单键，X3表示一个氨基酸或单键，且X4表示一个氨基酸或羧基(条件是，当X3是Pro时，那么X4表示一个氨基酸)，或

(2) X1表示单键，X2表示单键，X3表示Pro，且X4表示一个氨基酸。

进一步优选地，可以添加至本发明的抗原肽的C端侧的氨基酸是由式(I)表示的氨基酸序列，其中

X1表示生物素化的Lys，X2表示单键，X3表示单键，且X4表示Gly或羧基，

X1表示单键，X2表示单键，X3表示Pro，且X4表示Ala或β-Ala，或

X1表示生物素化的Lys，X2表示单键，X3表示Pro，且X4表示β-Ala等。

最优选地，可以添加至本发明的抗原肽的C端侧的氨基酸是由式(I)表示的氨基酸序列，其中

X1表示生物素化的Lys，X2表示单键，X3表示Pro，且X4表示β-Ala。

此外，可以添加至本发明的抗原肽的N端侧的氨基酸是前述氨基酸，优选由式(II)表示的氨基酸序列：

Y1-Y2-Y3 (II)

其中

(1) Y1表示Pro，Y2表示几个氨基酸或单键，且Y3表示一个氨基酸或单键，或

(2) Y1表示一个除了Pro以外的氨基酸或氨基，Y2表示几个氨基酸或单键，且Y3表示生物素化的Lys

(条件是，不包括其中从N端计的第二个氨基酸是Pro的氨基酸序列)。

在本说明书中，Yn是单键意味着与上述Xn是单键相同的情况。

更优选地，可以添加至本发明的抗原肽的N端侧的氨基酸是由式(II)表示的氨基酸序列: 其中

(1) Y1表示Pro，Y2表示一个氨基酸或单键，且Y3表示一个氨基酸或单键，或

(2) Y1表示一个除了Pro以外的氨基酸或氨基，Y2表示一个氨基酸或单键，且Y3表示生物素化的Lys

(条件是，不包括其中从N端计的第二个氨基酸是Pro的氨基酸序列)。

进一步优选地，可以添加至本发明的抗原肽的N端侧的氨基酸是由式(II)表示的氨基酸序列: 其中

Y1表示Pro，Y2表示Ser，Y3表示单键，

Y1表示氨基，Y2表示Ser，且Y3表示生物素化的Lys，或

Y1表示Pro，Y2表示Ser，且Y3表示生物素化的Lys。

最优选地，可以添加至本发明的抗原肽的N端侧的氨基酸是由式(II)表示的氨基酸序列，其中Y1表示Pro，Y2表示Ser，且Y3表示生物素化的Lys。

通过将如上所述的氨基酸序列添加至源自前述WT1抗原的抗原肽(W332、WA36)的N端和/或C端，得到本发明的修饰分子的一个实施方案。具体地，可以提及含有SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 38或SEQ ID NO: 40所示的氨基酸序列的分离多肽作为本发明的修饰分子。

本发明的修饰分子的C端可以是羧基(-COOH)、羧酸酯(-COO^-)、酰胺(-CONH₂)和酯(-COOR)中的任一个。

作为酯中的R，使用C_1-6烷基诸如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基等；C_3-8环烷基诸如环戊基、环己基等；C_6-12芳基诸如苯基、α-萘基等；苯基-C_1-2烷基诸如苯甲基、苯乙基等；C_7-14芳烷基诸如α-萘基-C_1-2烷基(例如，α-萘基甲基等)等；新戊酰氧基甲基等。

当本发明的修饰分子具有在C端以外的位置处的羧基(或羧酸酯)时，可以在本发明的修饰分子中将羧基酰胺化或酯化。在该情况下，使用在C端等处的上述酯作为酯。

此外，本发明的修饰分子还包括：其中N端氨基酸残基(例如，甲硫氨酸残基)的氨基被保护基(例如，C_1-6酰基诸如C_1-6烷酰基(例如，甲酰基、乙酰基等)等或生物素化等)保护的分子，其中通过体内裂解产生的N端谷氨酰胺残基是焦谷氨酸的分子，其中在分子的氨基酸侧链上的取代基(例如，-OH、-SH、氨基、咪唑基、吲哚基、胍基基等)被合适保护基(例如，C_1-6酰基诸如C_1-6烷酰基(例如，甲酰基, 乙酰基等)等等)保护的分子，和其中糖链发生键合的分子，或者所谓的复合多肽诸如糖肽等等。

本发明的修饰分子可以是游离形式或盐形式。作为本发明的修饰分子的盐，可以提及与酸或碱形成的生理上可接受的盐，且生理上可接受的酸加成盐是特别优选的。这样的盐的例子包括与无机酸(例如，氢氯酸、磷酸、氢溴酸、硫酸)形成的盐，与有机酸(例如，醋酸、甲酸、丙酸、富马酸、马来酸、琥珀酸、酒石酸、柠檬酸、苹果酸、草酸、苯甲酸、甲磺酸、苯磺酸)形成的盐，等。

根据已知的肽合成方法，可以生产本发明的修饰分子。

肽合成方法可以是例如固相合成方法和液相合成方法中的任一种。可以如下生产修饰分子：将能够构成本发明的修饰分子的部分肽或氨基酸与其余部分缩合，并除去得到的产物可能具有的任意保护基。

在这里，根据本身已知的方法，例如，在下面(i) - (v)中指出的方法，进行缩合和保护基除去：

i) M. Bodanszky和M.A. Ondetti: Peptide Synthesis, Interscience Publishers, New York (1966)

ii) Schroeder和Luebke: The Peptide, Academic Press, New York (1965)

iii) Nobuo Izumiya, 等人: Peptide Gosei-no-Kiso to Jikken (Basics and experiments of peptide synthesis), Maruzen Co. 出版(1975)

iv) Haruaki Yajima和Shunpei Sakakibara: Seikagaku Jikken Koza (Biochemical Experiment) 1, Tanpakushitsu no Kagaku (Chemistry of Proteins) IV, 205 (1977)

v) Haruaki Yajima, 编: Zoku Iyakuhin no Kaihatsu (A sequel to Development of Pharmaceuticals), 第14卷, Peptide Synthesis, Hirokawa Shoten出版。

通过公开已知的纯化方法，可以纯化和分离如此得到的修饰分子。在这里，作为纯化方法的例子，可以提及溶剂萃取、蒸馏、柱色谱法、液相色谱法、重结晶、它们的组合等。

当通过上述方法得到的修饰分子是游离形式时，通过公开已知的方法或以此为基础的方法，可以将它转化成适当的盐；相反，当以盐的形式得到修饰分子时，通过公开已知的方法或以此为基础的方法可以将盐转化成游离形式或另一种盐。

为了合成本发明的修饰分子，可以使用用于蛋白合成的普通商购可得的树脂。作为这样的树脂的例子，可以提及氯甲基树脂、羟基甲基树脂、二苯甲基胺树脂、氨基甲基树脂、4-苄氧基苯甲醇树脂、4-甲基二苯甲基胺树脂、PAM树脂、4-羟基甲基甲基苯基乙酰氨基甲基树脂、聚丙烯酰胺树脂、4-(2’,4’-二甲氧基苯基-羟基甲基)苯氧基树脂、4-(2’,4’-二甲氧基苯基-Fmoc-氨基乙基)苯氧基树脂、PEG-Wang树脂等。使用这样的树脂，根据各种本身已知的缩合方法，根据期望的修饰分子的序列，将具有α-氨基和适当地保护的侧链官能团的氨基酸缩合在所述树脂上。在反应结束时，从树脂切离本发明的修饰分子，并同时除去各种保护基，从而得到期望的本发明的修饰分子。

就受保护的氨基酸的上述缩合而言，可以使用可用于蛋白合成的各种活化试剂，且优选地使用碳二亚胺。使用DCC、N, N’-二异丙基碳二亚胺、N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺等作为碳二亚胺。就使用这些碳二亚胺的活化而言，可以将受保护的氨基酸与抑制消旋的添加剂(例如，HOBt、HOOBt)一起直接加入到树脂中，或者可以预先将受保护的氨基酸活化为对称的酸酐或HOBt酯或HOOBt酯，然后加入到树脂中。

用于活化受保护的氨基酸及其与树脂的缩合的溶剂可以适当地选自已知可用于蛋白缩合反应的溶剂。作为有用溶剂的例子，可以提及酸酰胺类诸如N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺和N-甲基吡咯烷酮；卤代烃类诸如二氯甲烷和氯仿；醇类诸如三氟乙醇；亚砜类诸如二甲亚砜；胺类诸如吡啶；醚类诸如二噁烷和四氢呋喃；腈类诸如乙腈和丙腈；酯类诸如乙酸甲酯和乙酸乙酯；它们的合适混合物；等。反应温度适当地选自已知可用于蛋白结合反应的范围，且通常选自约-20℃至约50℃的范围。通常使用1.5-4倍过量的活化的氨基酸衍生物。当使用茚三酮反应的试验揭示缩合不充分时，通过在不消除保护基的情况下重复缩合反应，可以进行充分缩合。如果即使重复反应缩合仍不充分，使用乙酸酐或乙酰基咪唑可以将未反应的氨基酸乙酰化。

用于不应当参与原料反应的官能团的保护方法和保护基，除去保护基的方法，活化参与反应的官能团的方法等，可以适当地选自公开已知的基团或公开已知的方式。

作为原料的氨基的保护基的例子，可以使用Z、Boc、叔戊氧基羰基、异冰片基氧基羰基、4-甲氧基苄氧基羰基、C1-Z、Br-Z、金刚烷氧基羰基、三氟乙酰基、邻苯二甲酰基、甲酰基、2-硝基苯基次磺酰基、二苯基硫代膦基、Fmoc等。

通过例如烷基酯化(例如，用甲基、乙基、丙基、丁基、叔丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基、2-金刚烷基等进行直链、支链或环状烷基酯化)、芳烷基酯化(例如，苄基酯化、4-硝基苄基酯化、4-甲氧基苄基酯化、4-氯苄基酯化、二苯甲基酯化)、苯酰基酯化、苄氧基羰基酰肼化、叔丁氧基羰基酰肼化、三苯甲基酰肼化等，可以保护羧基。

通过例如酯化或醚化，可以保护丝氨酸的羟基。作为适合于该酯化的基团的例子，使用低级烷酰基诸如乙酰基、芳酰基诸如苯甲酰基、和从碳酸衍生出的基团诸如苄氧基羰基和乙氧基羰基等。另外，作为适合于醚化的基团的例子，可以提及苄基、四氢吡喃基、叔丁基等。

作为酪氨酸的酚羟基的保护基的例子，可以使用Bzl、Cl₂-Bzl、2-硝基苄基、Br-Z、叔丁基等。

作为组氨酸咪唑的保护基的例子，使用Tos、4-甲氧基-2,3,6-三甲基苯磺酰基、DNP、苄氧基甲基、Bum、Boc、Trt、Fmoc等。

作为除去(消除)保护基的方法的例子，使用：在有催化剂（诸如Pd-黑或Pd-碳）存在下在氢气流中的催化还原；借助于无水氟化氢、甲磺酸、三氟甲烷-磺酸、三氟乙酸或其混合物溶液进行的酸处理；借助于二异丙基乙胺、三乙胺、哌啶、哌嗪等进行的碱处理；和用钠在液氨中的还原等。通过上述的酸处理实现的消除反应通常在约-20℃至约40℃的温度进行；通过加入阳离子清除剂，例如，茴香醚、苯酚、苯甲硫醚、间甲酚、对甲酚、二甲硫醚、1,4-丁二硫醇和1,2-乙二硫醇，有效地进行酸处理。并且，通过硫代苯酚处理除去用作组氨酸的咪唑的保护基的2,4-二硝基苯基；通过在有1,2-乙二硫醇、1,4-丁二硫醇等存在下的酸处理，以及通过使用稀氢氧化钠溶液、稀氨等的碱处理，进行去保护，从而除去用作色氨酸的吲哚的保护基的甲酰基。

作为通过活化原料中的羧基而得到的那些化合物的例子，使用对应的酸酐、叠氮化物、活化的酯[与醇(例如，五氯苯酚、2,4,5-三氯苯酚、2,4-二硝基苯酚、氰基甲醇、对硝基苯酚、HONB、N-羟基琥珀酰亚胺、N-羟基邻苯二甲酰亚胺、或HOBt)形成的酯]等。作为通过活化原料中的氨基而得到的那些化合物的例子，使用对应的磷酰胺。

在另一种制备修饰分子的酰胺的方法中，例如，首先将羧基端氨基酸的α-羧基酰胺化并因此进行保护，并将肽(蛋白)链向氨基侧延伸至期望的链长度，此后制备仅除去了肽链的N端α-氨基的保护基的蛋白等和仅除去了C端羧基的保护基的蛋白等，并在上述的混合溶剂中缩合这两种蛋白等。关于缩合反应的细节，与上面相同的内容适用。在纯化通过缩合得到的受保护的修饰分子以后，可以通过上述方法除去所有保护基，以产生期望的粗制的修饰分子。通过使用各种公开已知的纯化方式纯化该粗制的修饰分子并冷冻干燥主要级分，可以制备期望的修饰分子的酰胺。

为了得到修饰分子的酯，可以制备期望的修饰分子的酯，例如，通过将羧基端氨基酸的α-羧基与期望的醇缩合以产生氨基酸酯，然后以与修饰分子的酰胺相同的方式处理所述酯。

通过例如在下述实施例中描述的方法，可以证实如此得到的修饰分子具有MHC II类分子结合能力，或者还可以使用其它已知方法。

本发明的修饰分子对蛋白(肽)降解酶的降解具有抗性，且因此，抗原呈递细胞可以有效地呈递修饰分子(或抗原肽)。因此，本发明也提供了一种抗肿瘤剂，其含有分离的多肽的修饰分子(本发明的修饰分子)，所述修饰分子源自肿瘤特异性抗原且结合MHC II类分子。

作为本发明的抗肿瘤剂的治疗靶标的肿瘤是，表达在所述抗肿瘤剂中含有的本发明抗原肽的肿瘤。肿瘤的例子包括：恶性实体瘤诸如肾癌、肺癌、胃肠癌（包括食管癌）、卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、脑肿瘤、头和颈肿瘤、肉瘤等，白血病，和血液产生的恶性肿瘤。

作为本发明的抗肿瘤剂的施用对象的动物是，具有免疫机制的哺乳动物，即，人类和除了人类以外的哺乳动物。除了人类以外的哺乳动物的例子包括猴、牛、马、猪、绵羊、兔、狗、猫、小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠等。在这些中，人类是优选的施用对象。

含有本发明的修饰分子的抗肿瘤剂是低毒性的，且可以作为液体或药物组合物以合适的剂型口服地、透粘膜地(滴注、喷在鼻粘膜层上、吸入气雾剂等)、透皮地或胃肠外地(例如，血管内施用、皮下施用、真皮内施用等)直接施用给人。

用于施用的药物组合物可以含有本发明的修饰分子、药理学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂、表面活性剂等。这样的药物组合物被提供为适合于口服、透粘膜、透皮或胃肠外施用的剂型。此外，为了赋予持续释放能力，可以将它吸附至或嵌入在底物中。

使用注射剂、栓剂等作为用于胃肠外施用的组合物，且所述注射剂可以包括静脉内注射剂、皮下注射剂、真皮内注射剂、肌肉注射剂、滴注剂等的剂型。这样的注射剂可以根据已知方法来制备。注射剂的制备方法包括：将上述本发明的修饰分子溶解、悬浮或乳化在通常用于注射的无菌水溶液或油溶液中。作为用于注射的水溶液，使用盐水，即含有葡萄糖、其它助剂等的等渗溶液，并且它们可以与合适的增溶剂诸如醇(例如，乙醇)、多元醇(例如，丙二醇、聚乙二醇)、非离子型表面活性剂[例如，聚山梨酯80、HCO-50 (氢化蓖麻油的聚氧乙烯(50 mol)加成化合物)]等联合使用。使用芝麻油、大豆油等作为油性液体，并且苯甲酸苄酯、苯甲醇等可以联合用作增溶剂。优选地将制备的注射剂填充在合适的安瓿中。通过将上述修饰分子与一般栓剂基质混合，也可以制备用于直肠施用的栓剂。

用于口服施用的组合物的例子包括固体或液体剂型，其具体地为片剂(包括糖包衣片剂、膜包衣片剂)、丸剂、颗粒剂、散剂、胶囊剂(包括软胶囊剂)、糖浆剂、乳剂、混悬液等。这样的组合物可以根据已知方法来制备，且可以含有在药学领域中常用的载体、稀释剂或赋形剂。使用乳糖、淀粉、蔗糖和硬脂酸镁作为用于片剂的载体和赋形剂。

方便地以适合于活性成分剂量的药物单位剂型的方式制备上述胃肠外或口服药物组合物。这样的药物单位剂型的例子包括片剂、丸剂、胶囊剂、注射剂(安瓿)和栓剂。优选地，修饰分子的含量通常是每个单位剂型1 - 3 mg上述修饰分子。

尽管含有本发明修饰分子的抗肿瘤剂的剂量随施用的对象、靶癌症的类型、症状、施用途径等而变化，例如，通过静脉内注射将通常约0.001 mg - 10 g本发明的修饰分子的单剂量方便地施用给成年人每天约1 - 5次、优选约1–3次。在其它胃肠外施用和口服施用的情况下，还可以施用与此相符的量。当症状特别严重时，可以根据症状来增加剂量。

前述抗肿瘤剂可以含有一种或多种其它活性成分，只要它当与本发明的修饰分子掺合时不会造成非优选的相互作用。例如，本发明的抗肿瘤剂可以与其它药物联合使用，例如，烷化剂(例如，环磷酰胺、异环磷酰胺等)、代谢拮抗剂(例如，甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶等)、抗肿瘤抗生素(例如，丝裂霉素、阿霉素等)、植物衍生的抗肿瘤剂(例如，长春新碱、长春地辛、泰素等)、顺铂、卡铂、依托泊苷、伊立替康等。可以将本发明的抗肿瘤剂和上述药物同时地或以错开的方式施用给患者。

另外，本发明的抗肿瘤剂可以进一步含有源自肿瘤特异性抗原且结合MHC I类分子的分离多肽。当含有结合MHC I类分子的肿瘤特异性抗原衍生的多肽时，可以同时地诱导Th细胞和CTL。在这里，结合MHC I类分子的肿瘤特异性抗原可以是这样的肿瘤特异性抗原：通过加工和片段化从其得到被MHC II类分子识别的多肽。这样的抗原的例子包括HER-2/neu、MART-1、NY-ESO-1、Gp-100、MUC-1、p53、前列腺特异性的抗原(PSA)、hTERT、WT1、存活素、CEA、MAGE-3、从一组与恶性肿瘤发生密切相关的病毒衍生出的蛋白等。在这些中，源自与本发明的抗原肽相同的来源肿瘤的特定抗原是优选的，且例如可以提及WT1。尽管肿瘤特异性抗原衍生的多肽可以是全长蛋白，但是它可以是部分肽，只要它具有作为抗原的免疫原性。WT1抗原衍生的多肽的具体例子包括W10 (ALLPAVPSL; SEQ ID NO: 13)、W302 (RVPGVAPTL; SEQ ID NO: 14)、W292 (GVFRGIQDV; SEQ ID NO: 15)等。

尽管本发明的分离的多肽（其源自肿瘤特异性抗原且结合MHC I类分子）的氨基酸序列的长度没有特别限制，只要它可以被MHC I类分子呈递即可，但是它通常是约8个至约11个氨基酸，优选约9个氨基酸。

此外，分离的多肽（其源自肿瘤特异性的抗原且结合MHC I类分子）可以是被修饰成避免被肽降解酶降解的修饰分子，象本发明的修饰分子一样。修饰的实施方案可以与上面提及的本发明的修饰分子的实施方案相同，并且还可以根据关于本发明的修饰分子描述的前述合成方法和分离方法进行修饰分子的合成和分离。

另外，本发明的抗肿瘤剂可以进一步含有佐剂。佐剂的例子包括百日咳疫苗、结核分枝杆菌细胞壁骨架(BCG-CWS)、非甲基化的脱氧CpG、咪喹莫特、聚-IC、LPS、肽聚糖、Toll-样受体配体、Flt3、αGal-Cer、矿物油、植物油、明矾、铝化合物、皂粘土、二氧化硅、胞壁酰二肽衍生物、胸腺素、白介素等。作为“百日咳疫苗”，可以提及：包含甲醛处理过的或热处理过的百日咳博德特氏菌的细胞壁级分的全细胞百日咳疫苗，包含从百日咳博德特氏菌半纯化或纯化的组分(例如，百日咳毒素、纤维血凝素等)的无细胞百日咳疫苗等。关于如何制备百日咳疫苗，可以使用但不限于公开已知的方法。可以使用百日咳疫苗的市售产品，其可得自例如，Bio Farma (印度尼西亚)等。

此外，本发明的修饰分子可以用于试验试验对象的抗原呈递细胞是否表达在所述修饰分子中含有的本发明抗原肽可以结合的MHC II类分子。该方法使得能够判断试验对象是否可以成为含有本发明的修饰分子的本发明抗肿瘤剂的施用对象。因此，本发明也提供了一种检查试验对象是否具有可结合本发明抗原肽的MHC II类分子的方法，所述方法包括：培养源自所述试验对象和本发明的修饰分子的抗原呈递细胞群体，和证实所述抗原呈递细胞群体和所述修饰分子的结合。

接受本发明的试验方法的试验对象包括：要成为用前述抗肿瘤剂治疗的对象的肿瘤患者，和疑似具有这样的肿瘤的那些。

用于本发明的试验方法的抗原呈递细胞群体没有特别限制，只要它收集自上述试验对象。这样的抗原呈递细胞群体的例子包括体液诸如全血、淋巴液、脑脊髓液等和它们的级分等。特别优选的是血液、淋巴液等，因为它们可以快速地和方便地回收，且对试验对象具有较低侵袭性等。尽管最优选的抗原呈递细胞群体是新鲜和活的细胞，可以将它与0.1-1%低聚甲醛等轻微混合。作为要用作对照的细胞群体，可以使用表达不同基因型的MHC II类分子的细胞和不表达MHC II类分子的细胞群体。

可以如下测量本发明的修饰分子是否结合抗原呈递细胞群体：例如，混合二者，将它们培养几小时至过夜，除去游离肽，进一步使荧光标记的抗生物素蛋白试剂结合生物素肽（其结合至细胞表面上的MHC II类分子），和通过流式细胞计量术测量与细胞结合的荧光的量。

使用施加于本发明抗原肽的N端和/或C端的修饰，可以检查施加所述修饰的任意肽是否可以结合表达特定MHC II类分子的抗原呈递细胞。因此，本发明也提供了一种检查肽是否可以结合抗原呈递细胞的方法，所述方法包括：培养抗原呈递细胞，所述细胞表达特定MHC II类分子和具有经修饰的N端和/或C端的任意肽，和证实所述抗原呈递细胞和所述肽的结合。

可以从哺乳动物(优选人)等或建立的细胞系回收抗原呈递细胞，只要它表达特定MHC II类分子。尽管最优选的抗原呈递细胞是新鲜和活的细胞，可以将它与0.1-1%低聚甲醛等轻微混合。

使用具有约7-20个氨基酸、更优选约9-17个氨基酸、进一步优选约9-15个氨基酸的长度的肽作为任意肽。所述肽具有经修饰的N端和/或C端，并且要施加的修饰是上述修饰。

也就是说，可以添加至所述肽的C端侧的氨基酸优选地是由下式(I)表示的氨基酸序列：

X1-X2-X3-X4 (I)

其中

(1) X1表示生物素化的Lys，X2表示几个氨基酸或单键，X3表示一个氨基酸或单键，且X4表示一个氨基酸或羧基(条件是，当X3是Pro时，那么X4表示一个氨基酸)，

(2) X1表示一个除了生物素化的Lys以外的氨基酸或单键，X2表示几个氨基酸或单键，X3表示Pro，且X4表示一个氨基酸，或

(3) X1表示一个除了生物素化的Lys以外的氨基酸或单键，X2表示几个氨基酸或单键，X3表示一个除了Pro以外的氨基酸或单键，且X4表示β-Ala)。

更优选地，可以添加至本发明肽的C端侧的氨基酸是由式(I)表示的氨基酸序列，其中

(1) X1表示生物素化的Lys，X2表示一个氨基酸或单键，X3表示一个氨基酸或单键，且X4表示一个氨基酸或羧基(条件是，当X3是Pro时，那么X4表示一个氨基酸)，或

(2) X1表示单键，X2表示单键，X3表示Pro，且X4表示一个氨基酸。

进一步优选地，可以添加至本发明肽的C端侧的氨基酸是由式(I)表示的氨基酸序列，其中

X1表示生物素化的Lys，X2表示单键，X3表示单键，且X4表示Gly或羧基，

X1表示单键，X2表示单键，X3表示Pro，且X4表示Ala或β-Ala，或

X1表示生物素化的Lys，X2表示单键，X3表示Pro，且X4表示β-Ala等。

最优选地，可以添加至本发明肽的C端侧的氨基酸是由式(I)表示的氨基酸序列，其中

X1表示生物素化的Lys，X2表示单键，X3表示Pro，且X4表示β-Ala。

此外，可以添加至所述肽的N端侧的氨基酸是前述氨基酸，优选由式(II)表示的氨基酸序列：

Y1-Y2-Y3 (II)

其中

(1) Y1表示Pro，Y2表示几个氨基酸或单键，且Y3表示一个氨基酸或单键，或

(2) Y1表示一个除了Pro以外的氨基酸或氨基，Y2表示几个氨基酸或单键，且Y3表示生物素化的Lys

(条件是，不包括其中从N端计的第二个氨基酸是Pro的氨基酸序列)。

更优选地，可以添加至所述肽的N端侧的氨基酸是由式(II)表示的氨基酸序列: 其中

(1) Y1表示Pro，Y2表示一个氨基酸或单键，且Y3表示一个氨基酸或单键，或

(2) Y1表示一个除了Pro以外的氨基酸或氨基，Y2表示一个氨基酸或单键，且Y3表示生物素化的Lys

(条件是，不包括其中从N端计的第二个氨基酸是Pro的氨基酸序列)。

进一步优选地，可以添加至所述肽的N端侧的氨基酸是由式(II)表示的氨基酸序列: 其中

Y1表示Pro，Y2表示Ser，Y3表示单键，

Y1表示一个氨基，Y2表示Ser，且Y3表示生物素化的Lys，或

Y1表示Pro，Y2表示Ser，且Y3表示生物素化的Lys。

最优选地，可以添加至所述肽的N端侧的氨基酸是由式(II)表示的氨基酸序列，其中Y1表示Pro，Y2表示Ser，且Y3表示生物素化的Lys。

抗原呈递细胞和任意修饰肽的接触方法和培养方法可以遵循在前述试验方法中描述的方法。也就是说，将本发明中的修饰施加于任意肽以赋予对消化酶的抗性和生物素修饰，所述肽作为指示肽结合至抗原呈递细胞，例如，荧光标记的链霉亲和素与其结合，并可以定量所述指示肽的结合量。此外，将具有消化抗性、但是没有生物素修饰的修饰肽加入到该结合测量系统中，以观察指示肽的结合的竞争性抑制，由此可以定量任意氨基酸序列的修饰肽对MHC II类分子的结合活性进行对比。

在本说明书中，在通过它们的代码来表示碱基、氨基酸等的情况下，它们是基于根据IUPAC-IUB生化命名委员会（Commission on Biochemical Nomenclature）的常规代码，或按照本领域中的普通代码，其例子显示在下面。对于可能具有光学异构体的氨基酸，呈现L形式，除非另外指出。

DNA: 脱氧核糖核酸

cDNA: 互补的脱氧核糖核酸

A: 腺嘌呤

T: 胸腺嘧啶

G: 鸟嘌呤

C: 胞嘧啶

RNA: 核糖核酸

mRNA: 信使核糖核酸

dATP: 脱氧腺苷三磷酸

dTTP: 脱氧胸苷三磷酸

dGTP: 脱氧鸟苷三磷酸

dCTP: 脱氧胞苷三磷酸

ATP: 腺苷三磷酸

EDTA: 乙二胺四乙酸

SDS: 十二烷基硫酸钠

Gly: 甘氨酸

Ala: 丙氨酸

Val: 缬氨酸

Leu: 亮氨酸

Ile: 异亮氨酸

Ser: 丝氨酸

Thr: 苏氨酸

Cys: 半胱氨酸

Met: 甲硫氨酸

Glu: 谷氨酸

Asp: 天冬氨酸

Lys: 赖氨酸

Arg: 精氨酸

His: 组氨酸

Phe: 苯丙氨酸

Tyr: 酪氨酸

Trp: 色氨酸

Pro: 脯氨酸

Asn: 天冬酰胺

Gln: 谷氨酰胺

pGlu: 焦谷氨酸

Sec: 硒代半胱氨酸

β-Ala: β-丙氨酸。

实施例

在下面通过对实施例和参考实施例的参照来更详细地解释本发明，所述实施例不应解释为限制性的。

(细胞和小鼠)

使用由H. N. Eisen博士提供的EL4和E.G7-OVA (EG7)（已经通过将OVA基因引入EL4中使其表达OVA蛋白）作为肿瘤细胞。使用DO11.10细胞，其为CD4 T细胞克隆，源自DO11.10 TCR转基因小鼠(DO11.10tg) (Murphy, K. 等人, Science 250: 1720-1723, 1990)。将DO11.10细胞每周刺激1次，并与温育的BALB/c衍生的脾细胞一起在含有2%大鼠ConA上清液(RCS)的10%FCS DMEM 中培养，所述脾细胞用辐射和0.75 μM OVAII肽(ISQAVHAAHAEINEAGR)处理过。另外，由Nakano博士分配AND TCRtg，其识别与I-A^k结合的MCC肽。CH1细胞购自ATCC，并维持在10%FCS-Iscove氏MDM (IMDM)中。使用pMX (由Kitamura博士分配)作为表达载体，通过逆转录病毒转导来制备CH1-IA^d和CH1-IA^b细胞。将这些都以该串联次序插入I-A_β和I-A_α链的cDNA中，IRES序列位于它们之间。F-2♀(F2)细胞（作为CBF1小鼠衍生的UV转化的细胞系）购自Riken BioResource Center (Tsukuba)。以与上述CH1-IA^d细胞相同的方式建立F2-IA^d细胞。

(肽)

OVII (ISQAVHAAHAEINEA; SEQ ID NO: 17)是从已经报告的卵白蛋白衍生的I-A^d结合表位OVAII 323-339 (ISQAVHAAHAEINEAGR; SEQ ID NO: 16) (Shimonkevitz, R. 等人, J Immunol 133: 2067-2074, 1984)中抽取第323个至第337个氨基酸序列得到的肽。MCC (NERADLIAYLKQATK; SEQ ID NO: 42)是细胞色素C肽的I-A^k-结合部分的第89个至第103个氨基酸序列(Buus, S. 等人, Science 235: 1353-1358, 1987)。根据Fmoc方法手工地合成所述肽，并使用C18柱通过反相HPLC纯化至不小于95%的纯度。使用BSA作为标准品，通过MicroBCA测定(Pierce, Rockford, IL)确定肽浓度。使用Fmoc-Lys(Biot)-OH，合成生物素化的肽。合成的肽显示在表1中。

表1

用氨基酸的单个字母来表示每种氨基酸。在序列中，acetyl -是乙酰基，K^bio是生物素化的Lys，_βA是 β-Ala。加下划线的部分显示了与表位肽OVII、MCC、WA36 和W332重叠的氨基酸。

(血管内皮细胞的抗原呈递)

首先用RGD肽调理EL4细胞。接着，通过渗透压负载，将5 mg/ml OVA蛋白加载到细胞质上。充分洗涤以后，将2×10⁶个EL4细胞加入24-孔板上的F2-IA^d细胞的汇合培养物中(预先在有500U/ml rmIFN-γ存在下培养2天)。作为对照，以相同方式用RGD修饰用PBS假装载的EL4和EG7，并使用。将EL4和其它靶细胞加给F2-IA^d，并将细胞混合物培养24小时。对于其中给F2-IA^d细胞直接加载OVAII肽的对照孔，在培养结束时将所述细胞用肽脉冲2小时。除去非粘附细胞和死细胞的碎片以后，充分洗涤附着的F2-IA^d细胞的表面。在使用氯喹的抗原呈递抑制实验中，在加入EL4之前30 min加入100 μM氯喹，给EL4加载OVA或0.25 mg/ml OVA蛋白。此外，在氯喹连续存在下，将F2-IA^d细胞培养3天。

(抗原呈递标志物的检测)

通过监测DO11.10细胞对CD69的表达，评价F2-IA^d细胞是否在细胞表面上呈递靶抗原多肽。将呈递抗原的F2-IA^d细胞和DO11.10细胞混合并离心以使细胞彼此接触。6小时和24小时以后，用生物素标记的抗CD69 mAb (H1.2F3, BD Biosciences)将细胞染色，并通过流式细胞计量术检测DO11.10细胞对CD69的表达(用FITC-标记的KJ1.26 (抗克隆型TCR mAb)染色阳性)。

(细胞迁移试验)

在Transwell板(BD Labware, Billerica, CA)的插入物上，将F2-IA^d细胞培养至汇合。对于培养的最后3天，将细胞在有500U/ml rmIFN-γ存在下培养。另外，对于培养的最后2小时，用不同浓度的OVAII肽脉冲处理F2-IA^d细胞。培养以后，洗涤F2-IA^d细胞，并通过阴性选择(Dynal小鼠CD4阴性分离试剂盒(Invitrogen))从DO11.10转基因脾细胞分离出CD4⁺ 细胞至不小于95%纯度，将其以4×10⁶个细胞/孔加入。将细胞在37℃温育，并计数在室下在6小时中迁移的DO11.10的数目。

(肽-结合测定)

将CH1-IA^d或CH1-IA^b细胞悬浮于2%BSA IMDM中，达到2x10⁶个细胞/ml。将细胞混悬液(100 μl)添加到用无血清IMDM连续稀释的肽(100 μl)。在37℃温育2小时、6小时或16小时以后，将细胞洗涤并用FITC-链霉亲和素染色。通过流式细胞计量术，测量与细胞结合的肽的量。

(CD4 T细胞的生长)

将具有用含有2%RCS的10%FCS-DMEM连续稀释形成的浓度梯度的每种OVII修饰肽和1x10⁵个细胞/孔的DO11.10tg或ANDtg衍生的脾细胞置于96-孔U-板并在其温育，并测量脾细胞的生长。将细胞在37℃温育72小时，加入³H-胸苷，并在24小时以后回收细胞用于闪烁计数。在具体地描述的实验中，将FCS在56℃热灭活30 min。在具体地描述的实验中，将卡托普利加入到培养基中。在有些实验中，使用AIM-V (Invitrogen, Carlsbad, CA)培养基。在那些实验中，用每种OVII修饰肽刺激3x10⁵个DO11.10脾细胞/孔。

(肽的降解)

用含有10%新鲜小鼠血清或新鲜人血清的TBS消化肽。在37℃温育给定的时间以后，加入1%三氟酸，以通过沉淀除去各种血清蛋白。短暂离心以后，使用C18分析柱通过反相HPLC分析可溶性级分。为了标准化为每次HPLC加载的肽总量的变化，将血清中含有的非蛋白组分（其在220 nm波长处吸收）的峰用作内部对照。通过Chromatopac C-R8A (Shimadzu Corp., Kyoto, 日本)定量地监测未消化的肽的峰面积，并计算剩余肽的量。

(ACE活性的测量)

通过在Sabatini, R. 等人, Anal Biochem 363: 255-262, 2007中描述的方法的改进方法，测量细胞表面的ACE活性。

(使用Th细胞诱导肽的体内免疫接种)

用脾细胞的LPS爆炸（blast）和结合K^b的OVA-I肽（其为CTL诱导肽）来免疫CBF1小鼠，所述脾细胞用λ阻遏肽(LEDARRLKAIYEKKK; SEQ ID NO: 39)或OVAII肽作为Th表位肽脉冲处理过。将从一个脾衍生出的LPS爆炸（blast）用肽脉冲处理，并腹膜内地注射以免疫2只小鼠。第三次免疫接种的次日，将9×10⁶个EL4细胞和1.2×10⁷个EG7细胞真皮内地移植进小鼠背部皮肤上的一对位置。每隔一天测量肿瘤大小。从肿瘤移植起2周，再次进行免疫接种。

(使用修饰肽的体内免疫接种)

将溶解在PBS中的肽和1x10⁷个热灭活的百日咳博德特氏菌全细胞疫苗在即将免疫接种之前混合，并皮下地注射至BALB/c小鼠的脚垫。次日(24小时后)，分离腘和腹股沟淋巴结，并通过流式细胞计量术测量CD69⁺ (H1.2F3, BD Pharmingen)阳性的DO11.10 (克隆型抗-TCR mAb KJ1.26⁺)细胞。

实施例1：肿瘤特异性的Th细胞向植入骨髓嵌合小鼠中的肿瘤的渗入

从1.5x10⁷骨髓移植前1天至移植后14天，将1.5%土霉素(DENKASEIKEN)加入到CBF1小鼠（10 Gyγ-辐照以后）、I-A_β ^bKO小鼠（9.5 Gyγ-辐照以后）或骨髓嵌合小鼠(通过将I-A_β ^b KO骨髓移植至CBF1小鼠所得到的骨髓嵌合小鼠，通过将CBF1小鼠骨髓移植至I-A_β ^b KO小鼠所得到的骨髓嵌合小鼠)的饮用水中。在骨髓移植后进行所述Th转移实验至少28天。通过用抗-L^d mAb (30-5-7S)、抗-K^b mAb (Y3)、抗-I-A^d mAb (39-10-8)和抗-I-A^b mAb (25.9-3)对外周血单核细胞染色，证实供体衍生的骨髓衍生的细胞的完全替换。在第6天，当肿瘤直径生长至约5-7 mm时，将PKH-标记的DO11.10 (2x10⁷)从肿瘤细胞(4x10⁶ EL4和3x10⁶ EG7)的真皮内(左和右)移植物转移至每一只CBF1小鼠的背部。2天后，分离肿瘤，并制备5 μm厚切片。为了防止细胞的重复计数，每3个连续切片取样，并计数PKH-阳性细胞的数目(图1)。对10个切片计数在400倍荧光显微图像的20个视野内观察到的PKH-阳性细胞的数目，并累加。

实施例2：血管内皮细胞的抗原呈递的验证

发明人验证了包含细胞凋亡性肿瘤细胞的血管内皮细胞(EC)是否可以分解肿瘤细胞中的细胞质抗原，使作为降解产物的多肽结合MHC II类分子和呈递所述多肽。通过监测CD69（其为反应性的DO11.10细胞上的早期活化标志物）的表达，检查F2-IA^d细胞的抗原呈递水平。如在图2中所示，用OVAII肽脉冲处理的内皮细胞可以刺激DO11.10细胞。当将F2-IA^d细胞与调理的EL4或EG7一起温育时，约30%的细胞包含细胞凋亡性肿瘤细胞。但是，即使在尝试几次时，调理的EG7也没有诱导DO11.10细胞中的CD69的表达。认为这部分地归因于EG7细胞中的低OVA蛋白浓度的可能性。用0.1 μM OVAII脉冲处理的F2-IA^d细胞将DO11.10细胞中的CD69表达诱导至与当包含加载OVA的EL4时相同的水平。尽管仅相当小部分的F2-IA^d细胞包含加载OVA的EL4，抗原呈递足以诱导DO11.10细胞中的CD69表达。作为通过阴性选择从脾细胞分离出并在该实施例中使用的DO11.10细胞的纯度，85%或更高是KJ1.26 (对DO11.10的克隆型TCR特异性的mAb)-阳性的，且所有CD4细胞中的95%或更高是KJ1.26-阳性的。

实施例3: 抑制内皮细胞的抗原呈递非固有途径对抗原呈递的影响

由于MHC II类分子呈递包含的肿瘤细胞加工的肿瘤抗原，假定经由非固有途径的抗原加工。因此，发明人验证了抗原呈递是否对氯喹敏感，所述氯喹是经由核内体的抗原呈递的抑制剂。如在图3和4中所示，当用氯喹处理F2-IA^d细胞时，已知也以非固有途径呈递的OVA蛋白的呈递减少。加载OVA的EL4的抗原呈递也对氯喹敏感。因此，提出F2-IA^d对存在于EL4细胞中的OVA蛋白的抗原呈递主要是经由非固有途径。

实施例4：血管内皮细胞是否诱导Th细胞的迁移的考虑

发明人验证了内皮细胞的抗原呈递是否可以诱导DO11.10 CD4 T细胞的迁移活性以穿过内皮细胞层。在与DO11.10细胞接触之前，预先将F2-IA^d细胞铺板在平板的穿透孔（transwell）上，并用OVAII肽脉冲处理。如在图5中所示，当脉冲的OVAII肽的浓度较高时，DO11.10细胞强烈附着于F2-IA^d细胞，被立即活化，且不会通过穿透F2-IA^d细胞层来迁移。当脉冲的OVAII肽的浓度较低(0.1 μM或更低)时，DO11.10细胞活跃地迁移，并穿透F2-IA^d细胞层。在低浓度OVAII肽的该范围内，几乎不能证实CD69表达的诱导。如上面所检查的，包含加载OVA的EL4的内皮细胞的抗原呈递会造成特定水平的CD69诱导的表达(图2)，并且与其相当的CD69表达的诱导由于用0.1 μM OVAII肽脉冲处理的内皮细胞的抗原呈递而发生。因此，假定，在包含加载OVA的EL4的内皮细胞中，以与用0.1 μM OVAII肽脉冲处理的内皮细胞相当的密度呈递抗原。由于DO11.10显示出高迁移活性（关于识别以这样的密度水平呈递抗原的内皮细胞），假定也已经在包含加载OVA的EL4的内皮细胞中诱导相同水平的DO11.10迁移活性。

实施例5：在分离自实体瘤的内皮细胞下面的Th细胞的蠕动试验

将EL4-EGFP或EG7-EGFP细胞接种给CBF1小鼠。收集生长的实体瘤，并用溶解在20%FCS HBSS (GIBCO, Carlsbad, CA)中的2.5 mg/ml胶原酶D (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN)在37℃消化3小时。用包被了抗-CD45小鼠抗体30-F11 (Biolegend, SanDiego, CA)的Dynabeads M-280 (Invitrogen, Carlsbad, CA)除去CD45阳性细胞2次。在胶原I型包被的基础盘(AGC Techno Glass Co. Ltd., Chiba, 日本)上培养单细胞混悬液，并将附着的细胞用于显微镜观察。以20 μg/ml加入DiI-标记的乙酰化的LDL (Invitrogen)，并在37℃进行向内皮细胞中的胞吞作用4-5小时。洗掉乙酰化的LDL以后，用生物素化的30-F11和Alexa 647-标记的链霉亲和素(Molecular Probes, Carlsbad, CA)对细胞染色。内皮细胞包含DiI-标记的LDL并呈现红色。在内皮细胞中，包含肿瘤细胞的那些含有肿瘤细胞的碎片（其在细胞中发射EGFP的绿色荧光），且可以被鉴别(黑色箭头)为在品红中没有染色的细胞(CD45阳性细胞)。没有包含肿瘤细胞的内皮细胞用白色箭头显示。加入DO11.10细胞，并在共焦激光显微镜FV1000D IX81 (Olympus, Tokyo, 日本)下观察DO11.10细胞的体内运动，在37℃每15秒拍摄荧光图像持续1小时。显微图像显示在图6中。另外，在内皮细胞下面蠕动的DO11.10细胞的数目显示在图7中。

实施例6：通过体内肿瘤抗原多肽免疫接种对比抗肿瘤活性

为了验证在体内诱导肿瘤特异性的Th细胞的抗肿瘤作用，发明人对比了诱导以下靶标的免疫接种方案：1. 单独的CTL，2. CTL和第三方抗原特异性的Th细胞，和3. CTL和肿瘤特异性的Th细胞。作为抗原呈递细胞，使用脾细胞的LPS爆炸（blast），并且将加载了单独的每种肽或每种肽的混合物的APC腹膜内地注射3次(每周1次)。在第三次免疫接种当天，将9x10⁶个EL4和1.2x10⁷个EG7肿瘤接种在背的相对侧，并从第4天开始测量肿瘤直径。如在图8中所示，通过用OVA-I肽诱导单独的肿瘤抗原特异性的CTL，肿瘤对照仅可能达到有限的程度。另外，与CTL单独诱导相比，与CTL、Th细胞特异性的第三方抗原、λ肽（通过使用λ肽）一起诱导的免疫接种方案可以延迟肿瘤生长，但是小鼠最后死亡。另一方面，用替代肿瘤抗原OVAII肽与OVA-I一起免疫接种小鼠，会实现肿瘤的更好控制。在一部分小鼠中的肿瘤完全消失。

实施例7：评价促进的CTL向肿瘤中的渗入

以与在实施例1中相同的方式，将EL4或EG7分别植入CBF1小鼠背部的右侧和左侧，在第7天将PKH-标记的OT-1 (CD8阳性的细胞毒性的T细胞(CTL) (2x10⁷)，其克隆自表达TCR的转基因小鼠，所述TCR识别与K^b结合的OVA肽257-264)单独地或与DO11.10一起静脉内地注射，并在2天后分离肿瘤。制备冷冻样本，并计数5 μm-厚切片中的PKH阳性细胞的数目。加入用DAPI进行的核染色。为了防止重复计数，将3个连续切片中的仅一个切片用作样本。在接受DO11.10 (1x10⁶)的静脉内注射的小鼠中，表现出OT-1向EG7中的显著渗入(图9)。在接受DO11.10 (2x10⁷)的小鼠中，OT-1向EL4肿瘤中的非特异性渗入倾向于增加，向EG7中的渗入却减少。当转移IFN-γ基因缺陷型DO11.10时，没有观察到DO11.10依赖性的OT-1向肿瘤中的渗入的增加。另一方面，当转移CXCR3基因缺陷型OT-1时，向肿瘤中的渗入数目减少，并且DO11.10的转移几乎没有导致其增加。当转移VSV8（其显示不同抗原特异性，且是识别与K^b结合的VSV8肽的、CD8阳性的CTL克隆）时，向EL4和EG7肿瘤中的渗入的数目没有变化，但是观察到DO11.10对CTL向EG7中的渗入的促进效应，尽管该水平低于OT-1的水平。

实施例8：评价过继转移的Th或CTL或二者的抗肿瘤作用

将4x10⁶个EL4和3x10⁶个EG7肿瘤植入CBF1小鼠的背部的右侧和左侧，并在6天后当直径变为5-7 mm时，开始DO11.10或OT-1的过继转移。首先静脉内地注射1x10⁶个DO11.10，并在次日静脉内地注射2x10⁶个OT-1。每2天测量肿瘤直径。在第一次注射以后，每5天分别重复DO11.10和OT-1的过继转移(图10)。

实施例9：使用OVA表位肽设计修饰肽

发明人从上述实施例1 - 8认为，Th渗入肿瘤组织中并分泌IFN-γ，所述IFN-γ促进CTL的渗入，所述CTL将CXCR-3（即IFN-γ依赖性的趋化因子的受体）高度表达进肿瘤中以造成实体瘤的消退。基于这样的机制，发明人对增强Th诱导效率和有效地活化抗肿瘤免疫的策略具有想法：通过修饰结合MHC II类的、诱导Th的多肽，以获取对降解酶的消化抗性。

基于被DO11.10 CD4 T细胞识别的、结合I-A^d的卵白蛋白(OVA)肽，发明人研究了N端或C端的修饰（其会提供对蛋白酶的抗性）。OVII (323-337)是这样的肽：其含有通过从原始OVAII肽(323-339)除去2个氨基酸而得到的表位。考虑到容易合成，将OVII用作野生型肽。已经报道，血管紧张素I转换酶(ACE)是血清中的主要蛋白酶，且参与MHC I类结合肽的前体肽的加工(Sherman, L. 等人, J Exp Med 175: 1221-1226, 1992; Kozlowski, S. 等人, J Exp Med 175: 1417-1422, 1992)。由于ACE是二肽基羧基肽酶(Bersanetti, P. 等人, Biochemistry 43: 15729-15736, 2004)，发明人设计了这样的肽：其具有在OVII的C-端处的氨基酸，特别是在从其C-端计第二个位置处的Pro，以抑制ACE酶的降解(表1)。此外，由于尚未在哺乳动物具有的酶中鉴别出具有对N端Pro的裂解特异性的氨肽酶(Vanhoof, G. 等人, FASEB J 9: 736-744, 1995)，将Pro-Ser二肽添加至N端(表1)。由于Ser是水溶性的且具有较小的侧链，假定它具有在物理上阻止Th的抗原识别和作为间隔物插入的微小可能性。已经报道，2类二肽基肽酶IV和氨肽酶P在免疫细胞上表达为脯氨酸特异性的氨肽酶并降解作为底物的N端X-Pro (Vanhoof, G. 等人, FASEB J 9: 736-744, 1995; Yu, D. 等人, FEBS J 277: 1126-1144, 2010)。借助于识别与I-A^d结合的OVA表位的DO11.10细胞的增殖曲线，测量每种修饰肽的致敏活性。

如在图11中所示，具有在N端引入的Pro的肽(POVII)表现出比OVII增加了约5倍的致敏活性。具有修饰的C-端的肽实现了致敏活性的大幅增加。ACE抗性的OVIIPA表现出与OVII相比几乎100倍的致敏活性增加。具有被β-Ala修饰的C端的肽类似于OVIIPA，但是仅表现出稍微更低的活性。N端的乙酰化(ac-OVII)几乎没有显示出对致敏活性的影响。N端和C端的修饰都没有进一步增加致敏活性。为了研究这些修饰的效应是否可归因于对血清中的肽酶的抗性，将FCS热灭活。但是，滴定曲线根本不受影响(图12、13)。

实施例10：使用ACE抑制剂研究肽修饰

关于酶活性的热灭活，已经报道，仅ACE的C-端结构域是敏感的(Voronov, S. 等人, FEBS Lett 522: 77-82, 2002)，发明人使用卡托普利进行了抑制试验，所述卡托普利对ACE的N端结构域和C端结构域两者均具有强特异性抑制作用(Dalkas, G. 等人, J Pept Sci 16: 91-97, 2009)。如在图14、15中所示，2.5 mM卡托普利的添加会将OVII的致敏活性提高至接近具有受保护的C端的OVIIPA肽的致敏活性水平。由于DO11.10细胞在有5mM卡托普利存在下不可存活，没有进行使用更高卡托普利浓度的试验。最初已经报道，ACE作为结合膜的细胞外酶CD143而产生，并由蛋白酶释放。尽管内皮细胞强烈地表达ACE，但是也已知许多其它细胞类型会表达ACE (Coates, D. Int J Biochem Cell Biol 35: 769-773, 2003)。因此，发明人预测，抗原呈递细胞(APC)也包括在细胞表面上表达ACE的细胞。在免疫细胞中，已经报道人树突细胞会表达ACE (Lapteva, N. 等人, Biochem Biophys Res Commun 296: 194-200, 2002)；但是，没有关于它是否参与抗原呈递的报道。还已经报道，单核细胞和淋巴细胞仅以可忽略的水平表达ACE (Danilov, S. 等人, Exp Hematol 31: 1301-1309, 2003)。

实施例11：在无血清培养基中研究肽修饰

为了消除血清的蛋白酶活性，在无血清AIM-V培养基中试验了肽的Th诱导活性。由于DO11.10脾细胞是脆弱的且倾向于在AIM-V培养基中附着至试验孔的壁，细胞-细胞接触难以发生，因此增殖较差且结果是不一致的。因此，在该实施例中，每个孔使用3倍过量的DO11.10细胞，这会产生更一致的结果。如在图16中所示，血清中的蛋白酶的除去会使OVII的滴定曲线迁移至与仅具有N端修饰的POVII的滴定曲线重叠。但是，其它修饰分子肽仍然表现出高诱导活性。这提示，在血清中的蛋白酶(可能是ACE)对肽的呈递产生某种水平的影响，但是修饰肽的大部分活性与抗原呈递细胞(APC)或Th细胞直接相关。并且，生物素化的变体PbOVIIbPβ表现出最高活性。在下述实施例中进一步研究了生物素化的肽。

实施例12：生物素化的OVII肽的高致敏活性

在该实施例中，为了标记目的，发明人将生物素化的Lys (K^bio)引入在肽的N端和/或C端的内部。意外地，所述生物素化的肽表现出高致敏活性，诱导了Th细胞的显著增殖。为了找到其原因，发明人设计了不同的生物素化的肽(表1)，并进一步研究了它们。由于生物素化的肽倾向于通常表现出低溶解度，使用OVII+ （其中将Arg添加至OVII的C端）作为设计的基础。Arg的添加没有影响与I-A^d分子的结合活性(图17)。如在图18、19中所示，生物素化的肽表现出非常高的活性，无论Pro或β-Ala是否存在于末端，从而澄清了K^bio本身具有增强致敏活性的作用。仅仅通过将K^bio引入从N端计的第二个氨基酸的位置(bOVII+)，致敏活性增加了3倍。与具有修饰（具有从C端计的第二个位置处的Pro和/或在C端处的β-Ala）的肽相比(OVIIβ, OVIIPA, 图11)，K^bio向C端侧中的引入(bOVII+b)会提供更大的作用，并使致敏活性增加100倍。Pro-β-Ala向C端的进一步添加没有提供作用。另一方面，Pro向N端的添加进一步使活性增加了5倍。当在无血清条件下培养DO11.10细胞时，也观察到如上所述的生物素化引起的活性的变化(图16)。具有修饰（具有在两端的K^bio、在N端侧的Pro和在C端侧的Pro-β-Ala）的PbOVIIbPβ表现出最高活性。由于K^bio赋予除了PbOVIIbPβ的N端Pro以外的额外活性，K^bio可能已经由于蛋白酶抗性以外的一些原因而促进致敏活性的增加。PbOVIIbPβ也在AIM-V无血清培养基中表现出比POVIIPβ高5倍的活性(图16)。

另外，发明人还验证了生物素化的OVII肽的致敏活性是否由赖氨酸的作用造成。所以，与OVII+相比，KOVII+和KOVII+K（其中将赖氨酸添加至OVII+的N端或两端）没有表现出致敏活性的差异。另一方面，分别与KOVII+和KOVII+K相比，bOVII+ （其中将生物素化的赖氨酸添加至OVII+的N端）和bOVII+b（其中将生物素化的赖氨酸添加至两端）表现出诱导DO11.10 Th细胞增殖的高活性，其为前者的约2倍和后者的约10倍(图20)。

实施例13：肽对血清肽酶的消化抗性

考虑上述实施例的结果，修饰非常可能给肽赋予肽酶抗性。因此，发明人在10%新鲜小鼠血清中体外检查了肽的消化抗性。通过HPLC定量剩余的未消化的肽的量。如在图21中所示，40%的OVII在2小时内被消化，且未消化的肽在6小时以后没有剩下。发现β-Ala向C-端中的引入(OVIIβ)或Pro向从C端计第二个位置的引入(OVIIPA)会保护大约一半的肽（其将在4小时内被消化）免于消化。当C-端是包括二者的Pro-β-Ala (OVIIPβ)时，会进一步增强保护效应，并且在16小时以后剩余的肽的量增加。N端的乙酰化(ac-OVII)会提供比用Pro-X或β-Ala对C端侧的上述单一修饰更高的保护效应。当N端是Pro时，观察到非常强的酶抗性(POVII)，并且几乎70%甚至在16小时以后保持未被消化。与作为C端的Pro-β-Ala相比，针对N端Pro的消化的保护活性更强，并且具有N、C端修饰的肽表现出其它额外保护作用(POVIIPβ)。这样的结果显得稍微不同于图11中所示的Th的生长诱导活性。例如，ac-OVII表现出比OVIIPA和OVIIPβ更高的消化抗性，但是与OVII相比没有显示出Th诱导活性的差异。在OVIIPA和OVIIPβ的消化实验中，注意到主要降解产物的峰的出现。通过质谱法分析这些峰，以发现它们展示这样的肽：其从N端缺少Ile且维持表位。在图21a中用虚线显示了残余表位的量，其为这些峰和未消化的肽的峰的总和。由此可以解释由C端保护的肽表现出的高Th生长诱导活性的原因。尽管POVII在血清中表现出高消化抗性，它在Th增殖测定中表现出低活性。具有受保护的N端的ac-OVII和POVII二者表现出低Th诱导活性、但是在C端处的保护具有显著Th诱导活性的原因之一可能是，因为DO11.10是主要识别C端侧上的表位的T细胞(Robertson, J. 等人, J Immunol 164: 4706-4712, 2000)。这些结果提示，血清的肽酶活性会影响向Th的抗原呈递效率，而肽酶活性（可能伴随抗原呈递细胞而不是血清）会极大地影响肽的抗原呈递。

发明人接下来检查了生物素化的肽的消化抗性。在小鼠血清中类似地温育以后，发现具有添加至C端侧上的K^bio的修饰分子会赋予对消化的抗性，如在图21b中所示。仅在N端侧上具有K^bio的bOVII+ 显得没有表现出消化抗性。但是，象前述分析一样，主要降解产物长时间保留。当通过质谱法分析其峰时，它是这样的降解产物：其中从两端除去了1或2个氨基酸，但是核心表位保持完整。在所有生物素化的肽中共同地看到缺失一个生物素的产物。通过使用离子阱质谱法进行分析，发现它主要是已经丧失在N端侧上的生物素分子的产物，至少在PbOVII+bPβ的情况下。除了以上产物以外，主要观察到缺少bOVII+中的C端Arg的产物、缺少bOVIIbPβ和OVII+bG中的N端Ser的产物、和缺少bOVII+b中的C端RK^bio的产物。当将这些主要降解产物的峰与未消化的肽的峰组合时，表位的残余量如在图21c、d中用虚线所示。这些表位的残余量与图18、19中的Th诱导活性较好地对应。在肽的降解中，C端K^bio通常表现出对肽酶的更强保护效应。此外，给以下修饰分子赋予了针对消化的累加抗性：具有生物素化的N端和生物素化的C端的修饰分子，和携带前述N端Pro和C端Pro-β-Ala的组合的修饰分子。但是，以下现象的原因有待解释：具有K^bio的PbOVIIbPβ的Th诱导活性比图16中的POVIIPb高5倍，与无血清培养基中的Th诱导活性一样，尽管血清中剩余的表位的水平对于两种肽而言是几乎相同的。可能是由于与APC结合的肽酶，或消化抗性以外的活性对抗原呈递的促进。

还在人血清中得到了类似的结果(图21e)。对于其中用MCC替换核心肽的肽，也观察到类似的保护效应(图21f)。

实施例14：肽酶抑制剂对肽消化的影响

鉴于上述实施例，发明人检查了肽酶抑制剂对肽消化的影响，以鉴别血清中的肽酶。将卡托普利（其为ACE的特异性抑制剂）加入到使用小鼠血清的OVII肽的消化实验中，以浓度依赖性的方式抑制肽的消化，如在图22中所示。作为抑制活性在较低浓度受限的原因，怀疑是由于对ACE的C-端活性部位的ACE的更高敏感性（与N-端活性部位相比）(Dalkas, G. 等人, J Pept Sci 16: 91-97, 2009)。此外，当加入邻菲咯啉（其为金属肽酶的抑制剂，血清中的ACE和氨肽酶都属于金属肽酶）时，以浓度依赖性的方式几乎完全地抑制肽酶活性(图23)。接着，加入苯丁抑制素，其为M1家族中的氨肽酶的选择性抑制剂。结果，以浓度依赖性的方式抑制约一半的肽酶活性(图24)。由此已经澄清，血清中的肽酶活性可归因于氨肽酶和ACE。

实施例15：抑制剂对抗原呈递细胞的ACE活性的影响

将CH1-IA^d细胞悬浮于PBS中，并预先在有2.5 mM邻菲咯啉或卡托普利存在下在37℃温育20 min。加入10 μM Abz-FRK(Dnp)P-OH (Sigma, St. Louis)，并将细胞在37℃温育给定的时间。通过将它们放在冰上来淬灭反应。离心后，在320 nm的激发波长和420 nm的发射波长，测量上清液中的荧光(图25)。由此证实与活细胞有关的肽降解酶活性。此外，发现邻菲咯啉会抑制其活性，所述邻菲咯啉是金属肽酶的抑制剂，卡托普利（其是ACE的特异性抑制剂）和ACE属于所述金属肽酶。

实施例16：用于体内免疫接种的肽修饰的影响

发明人考虑了修饰肽在体内免疫接种中的Th诱导活性。如在图26中所示，发现肽酶抗性的POVIIPβ与OVII相比会在体内免疫接种中有效地诱导DO11.10 Th细胞的活化。PbOVIIbPβ（其为添加了K^bio的POVIIPβ）更有效地诱导活化。此外，即使当用WT1衍生的WA36肽（其为天然肿瘤抗原）免疫时，用WA36自身非常难以诱导Th细胞。但是，当使用生物素化的末端修饰肽时，可以诱导针对肿瘤抗原的Th细胞，尽管程度较弱(图27)。

实施例17：得自人外周血单核细胞的肿瘤抗原肽诱导活性

在含有10%AB血清的DMEM培养基中，用每种浓度的W332肽或PbW332bPβ肽刺激具有HLA-DR15的人衍生的外周血单核细胞(PBMC)。所述培养基含有20U/ml的重组人IL-2和0.1 μg/ml的植物凝集素(PHA)。1周后，将肽加给相同对象的PBMC。通过使用与肽结合的抗原呈递细胞，用抗原刺激上述细胞第二次。4天后，再次在每种浓度加入上述各种肽，将细胞在培养物中刺激4小时。加入布雷菲德菌素A，并将混合物进一步培养1小时，进行细胞内IFNγ染色和CD4染色，并通过流式细胞计分析细胞。显示了CD4阳性细胞中的细胞内IFNγ阳性细胞的比率(图28)。

实施例18：用MHC I类肽和MHC II类肽免疫的、携带癌症的小鼠的体内抗肿瘤活性

发明人通过诱导识别威尔曼瘤1（WT1，其为天然肿瘤抗原）的Th细胞，检查了体内抗肿瘤活性。针对天然肿瘤抗原的Th细胞的诱导需要小心注意。这是因为，针对天然肿瘤抗原的Th细胞的诱导可能导致调节性T细胞(Treg)的诱导，所述调节性T细胞可能相反地减弱抗肿瘤活性。因此，在该实施例中，将具有高免疫刺激活性的百日咳博德特氏菌全细胞疫苗(Wc)用于免疫接种以促进Th1细胞的诱导。

迄今为止尚未鉴别出从WT1衍生出的、结合小鼠的MHC II类分子的肽。因而，发明人从检索这样的肽开始。人WT1肿瘤抗原衍生的W332肽会结合HLA-DRB1^*04:05分子，且已知会诱导人Th细胞。此后，报道了W332也通常结合人HLA-DRB1^*15:01、HLA-DRB1^*15:02和HLA-DPB1^*09:01。另外，W332的氨基酸序列与对应的小鼠WT1肿瘤抗原的序列相同。已经澄清，I-A基因（其为小鼠MHC II类基因之一）是人HLA-DR基因的直系同源物。因此，作为通常结合多种人MHC II类分子的肽，W332也可以结合小鼠I-A分子，并进行了结合实验。将PbW332bPβ加给CH1-IA^d细胞，并将所述细胞培养5小时。用FITC-链霉亲和素将细胞染色，并通过流式细胞计量术进行分析。发现PbW332bPβ（其为一种生物素化的W332肽）会结合表达HLA-DR分子的CH1-DR4细胞(图29A)。

在使用小鼠的免疫接种实验中，用PbW332bPβ肽（作为Th诱导肽）和Db126肽（作为CTL诱导肽）免疫小鼠。使用高度表达天然WT1肿瘤抗原的FBL3红白血病细胞，作为要接种给小鼠的肿瘤。FBL3是用弗兰德白血病病毒感染的细胞系，且具有也表达病毒抗原的高可能性。实际上，当将2x10⁷个FBL3细胞真皮内地注射到小鼠的背部时，它们生长成实体瘤。但是，所述肿瘤在已经达到最大尺寸以后具有天然地收缩的趋势。但是，令人感兴趣的是，所述肿瘤收缩，但是不会被完全排斥，在肿瘤接种后至少1个月剩下小实体瘤。在长期观察中，肿瘤有时随时间开始快速生长。

通过将50 nmol的单独Db126肽、或Db126肽和50 nmol的W332肽皮下注射至顶部、底部、背部的左和右的4个部位，预先免疫CBF1小鼠。将5x10⁷百日咳博德特氏菌全细胞疫苗作为佐剂加给所有免疫接种组，包括对照PBS接种组。将小鼠免疫3次(每周1次)，然后将2x10⁷个FBL3细胞皮下地接种至背部。

使用W332和Db126肽的免疫接种表现出比Db126单独肽免疫接种更强的抗肿瘤活性。令人感兴趣的是，在单独Wc或Db126、或W332单独免疫接种组中长期保留的肿瘤，在用W332和Db126肽两者免疫的小鼠组中倾向于收缩(图29B-F)。由此提议，肿瘤特异性的Th细胞与CTL一起的诱导会提供更有效的体内抗肿瘤活性。

实施例19：测量与MHC II类分子的结合能力的定量测定的开发

为了测量MHC II类分子结合肽的结合活性，可以利用这样的方法，所述方法包括将未标记的肽添加至活细胞上的MHC II类分子上，以诱导生物素化的指示肽与MHC II类分子的竞争性结合。但是，该想法不允许在竞争试验中测量结合，这是因为，由于活抗原呈递细胞的肽酶活性，未标记的肽被快速地消化，但是生物素化指示肽难以消化。因而，发明人如下检查了竞争性结合测定是否变得可能：将赋予肽酶抗性的修饰添加至要竞争的未标记肽的末端。将5 μM生物素化的指示肽PbOVIIbPβ和连续稀释的POVIIPβ肽各自加给CH1-IA^d细胞，并将混合物温育过夜。将细胞用PE-链霉亲和素染色，并用流式细胞计测量。结果，可以证实生物素化的指示肽（其依赖于加入的POVIIPβ肽的浓度）的结合的减少(图30A)。当图示PE-链霉亲和素的平均荧光强度(MFI)时，半数最大抑制发生在30 μM的浓度(图30B)。

实施例20：肽与HLA-DR4分子(人MHC II类分子)的结合能力的定量测量方法

本实施例表明，测量肽与活抗原呈递细胞上的MHC II类分子的结合活性的方法不仅可以用于在实施例19中所示的I-Ad分子（其为小鼠MHC II类分子），而且可以用于人MHC II类分子, 类似形式的MHC II类。在该实施例中，加入对氯苯酚(PCP)以使得能够通过温育4小时来测量肽结合活性。

将CH1-DRB1^*04:05细胞(CH1-DR4细胞)以2x10⁶/ml悬浮于20%FCS IMDM (Iscove氏最低基础培养基)中，使得50 μl可以在96孔U板中提供1x10⁵个细胞/孔。然后，以100 μl/孔加入20 μM bTR174 (PSK^bioREFKLSKVWRDQK^bioP_βA: SEQ ID NO: 41) (生物素化指示肽)，并以50 μl/孔进一步加入含有8 mM PCP的IMDM，最后，以50 μl (1x10⁵/孔)加入CH1-DR4细胞，并将混合物在37℃温育4小时。通过离心除去游离肽，并用FITC-链霉亲和素将细胞染色，并用流式细胞计测量。发现生物素标记的bTR174肽以PCP浓度依赖性的方式替代内源性地结合HLA-DR4分子的肽，并且可以定量地测量结合的生物素标记的bTR174肽的量(图31)。通过将竞争肽（其通过将肽酶抗性序列添加至未标记肽的末端而产生）加入到该实验系统中，可以定量地测量未标记肽的结合活性。

工业适用性

使用本发明的结合MHC II类分子的、肿瘤特异性抗原衍生的多肽的修饰分子，可以比以前显著更有效地将肿瘤特异性抗原呈递至抗原呈递细胞的MHC II类分子，并且可以更有效地诱导肿瘤抗原特异性的Th细胞。

本申请是基于在日本提交的专利申请号2011-273922(提交日期: 2011年12月14日)，其内容全部并入本文中。

序列表

<110> National University Corporation Kochi University

<120> 辅助性T细胞诱导多肽的修饰

<130> 091965

<150> JP 2011-273922

<151> 2011-12-14

<160> 41

<170> PatentIn 3.3版

<210> 1

<211> 16

<212> PRT

<213> 智人

<400> 1

Lys Arg Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg Lys His

1 5 10 15

<210> 2

<211> 15

<212> PRT

<213> 智人

<400> 2

Pro Val Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly Ala Ser Ala Tyr Gly Ser

1 5 10 15

<210> 3

<211> 20

<212> PRT

<213> 智人

<400> 3

Gly Val Leu Gln Gly Ile Thr Ser Trp Gly Ser Glu Pro Cys Ala Leu

1 5 10 15

Pro Glu Arg Pro

20

<210> 4

<211> 16

<212> PRT

<213> 智人

<400> 4

Lys Lys Leu Leu Thr Gln His Phe Val Gln Glu Asn Tyr Leu Glu Tyr

1 5 10 15

<210> 5

<211> 13

<212> PRT

<213> 智人

<400> 5

Leu Trp Trp Val Asn Asn Gln Ser Leu Pro Val Ser Pro

1 5 10

<210> 6

<211> 15

<212> PRT

<213> 智人

<400> 6

Tyr Ala Cys Phe Val Ser Asn Leu Ala Thr Gly Arg Asn Asn Ser

1 5 10 15

<210> 7

<211> 15

<212> PRT

<213> 智人

<400> 7

Thr Leu Gly Glu Phe Leu Lys Leu Asp Arg Glu Arg Ala Lys Asn

1 5 10 15

<210> 8

<211> 11

<212> PRT

<213> 智人

<400> 8

Glu Ile Trp Arg Asp Ile Asp Phe Ala His Glu

1 5 10

<210> 9

<211> 9

<212> PRT

<213> 丙型肝炎病毒

<400> 9

Ala Leu Tyr Gly Val Trp Pro Leu Leu

1 5

<210> 10

<211> 20

<212> PRT

<213> 丙型肝炎病毒

<400> 10

Asp Pro Arg Arg Arg Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Ile Asp Thr Phe

1 5 10 15

Thr Cys Gly Leu

20

<210> 11

<211> 20

<212> PRT

<213> 丙型肝炎病毒

<400> 11

Ser Val Asn Tyr Ala Thr Gly Asn Leu Pro Gly Cys Ser Phe Ser Ile

1 5 10 15

Phe Leu Leu Ala

20

<210> 12

<211> 17

<212> PRT

<213> EB病毒

<400> 12

Tyr Leu Gln Gln Asn Trp Trp Thr Leu Leu Val Asp Leu Leu Trp Leu

1 5 10 15

Leu

<210> 13

<211> 9

<212> PRT

<213> 智人

<400> 13

Ala Leu Leu Pro Ala Val Pro Ser Leu

1 5

<210> 14

<211> 9

<212> PRT

<213> 智人

<400> 14

Arg Val Pro Gly Val Ala Pro Thr Leu

1 5

<210> 15

<211> 9

<212> PRT

<213> 智人

<400> 15

Gly Val Phe Arg Gly Ile Gln Asp Val

1 5

<210> 16

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 诱导Th的肽

<400> 16

Ile Ser Gln Ala Val His Ala Ala His Ala Glu Ile Asn Glu Ala Gly

1 5 10 15

Arg

<210> 17

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 诱导Th的肽

<400> 17

Ile Ser Gln Ala Val His Ala Ala His Ala Glu Ile Asn Glu Ala

1 5 10 15

<210> 18

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 诱导Th的肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> (1)..(1)

<223> 乙酰化

<400> 18

Ile Ser Gln Ala Val His Ala Ala His Ala Glu Ile Asn Glu Ala

1 5 10 15

<210> 19

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 诱导Th的肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> (17)..(17)

<223> bAla

<400> 19

Ile Ser Gln Ala Val His Ala Ala His Ala Glu Ile Asn Glu Ala Gly

1 5 10 15

Xaa

<210> 20

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 诱导Th的肽

<400> 20

Ile Ser Gln Ala Val His Ala Ala His Ala Glu Ile Asn Glu Ala Pro

1 5 10 15

Ala

<210> 21

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 诱导Th的肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> (17)..(17)

<223> bAla

<400> 21

Ile Ser Gln Ala Val His Ala Ala His Ala Glu Ile Asn Glu Ala Pro

1 5 10 15

Xaa

<210> 22

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 诱导Th的肽

<400> 22

Pro Ser Ile Ser Gln Ala Val His Ala Ala His Ala Glu Ile Asn Glu

1 5 10 15

Ala

<210> 23

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 诱导Th的肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> (19)..(19)

<223> bAla

<400> 23

Pro Ser Ile Ser Gln Ala Val His Ala Ala His Ala Glu Ile Asn Glu

1 5 10 15

Ala Pro Xaa

<210> 24

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 诱导Th的肽

<400> 24

Ile Ser Gln Ala Val His Ala Ala His Ala Glu Ile Asn Glu Ala Arg

1 5 10 15

<210> 25

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 诱导Th的肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> (2)..(2)

<223> Lys被生物素化

<400> 25

Ser Lys Ile Ser Gln Ala Val His Ala Ala His Ala Glu Ile Asn Glu

1 5 10 15

Ala Arg

<210> 26

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 诱导Th的肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> (19)..(19)

<223> Lys被生物素化

<400> 26

Ser Lys Ile Ser Gln Ala Val His Ala Ala His Ala Glu Ile Asn Glu

1 5 10 15

Ala Arg Lys Gly

20

<210> 27

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 诱导Th的肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> (2)..(2)

<223> Lys被生物素化

<220>

<221> MOD_RES

<222> (19)..(19)

<223> Lys被生物素化

<400> 27

Ser Lys Ile Ser Gln Ala Val His Ala Ala His Ala Glu Ile Asn Glu

1 5 10 15

Ala Arg Lys

<210> 28

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 诱导Th的肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> (2)..(2)

<223> Lys被生物素化

<220>

<221> MOD_RES

<222> (18)..(18)

<223> Lys被生物素化

<400> 28

Ser Lys Ile Ser Gln Ala Val His Ala Ala His Ala Glu Ile Asn Glu

1 5 10 15

Ala Lys Gly

<210> 29

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 诱导Th的肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> (2)..(2)

<223> Lys被生物素化

<220>

<221> MOD_RES

<222> (19)..(19)

<223> Lys被生物素化

<400> 29

Ser Lys Ile Ser Gln Ala Val His Ala Ala His Ala Glu Ile Asn Glu

1 5 10 15

Ala Arg Lys Gly

20

<210> 30

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 诱导Th的肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> (2)..(2)

<223> Lys被生物素化

<220>

<221> MOD_RES

<222> (19)..(19)

<223> Lys被生物素化

<220>

<221> MOD_RES

<222> (21)..(21)

<223> bAla

<400> 30

Ser Lys Ile Ser Gln Ala Val His Ala Ala His Ala Glu Ile Asn Glu

1 5 10 15

Ala Arg Lys Pro Xaa

20

<210> 31

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 诱导Th的肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> (3)..(3)

<223> Lys被生物素化

<220>

<221> MOD_RES

<222> (19)..(19)

<223> Lys被生物素化

<220>

<221> MOD_RES

<222> (21)..(21)

<223> bAla

<400> 31

Pro Ser Lys Ile Ser Gln Ala Val His Ala Ala His Ala Glu Ile Asn

1 5 10 15

Glu Ala Lys Pro Xaa

20

<210> 32

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 诱导Th的肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> (3)..(3)

<223> Lys被生物素化

<220>

<221> MOD_RES

<222> (20)..(20)

<223> Lys被生物素化

<220>

<221> MOD_RES

<222> (22)..(22)

<223> bAla

<400> 32

Pro Ser Lys Ile Ser Gln Ala Val His Ala Ala His Ala Glu Ile Asn

1 5 10 15

Glu Ala Arg Lys Pro Xaa

20

<210> 33

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 诱导Th的肽

<400> 33

Ser Lys Ile Ser Gln Ala Val His Ala Ala His Ala Glu Ile Asn Glu

1 5 10 15

Ala Arg

<210> 34

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 诱导Th的肽

<400> 34

Ser Lys Ile Ser Gln Ala Val His Ala Ala His Ala Glu Ile Asn Glu

1 5 10 15

Ala Arg Lys

<210> 35

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 诱导Th的肽

<400> 35

Asn Glu Arg Ala Asp Leu Ile Ala Tyr Leu Lys Gln Ala Thr Lys

1 5 10 15

<210> 36

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 诱导Th的肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> (3)..(3)

<223> Lys被生物素化

<220>

<221> MOD_RES

<222> (19)..(19)

<223> Lys被生物素化

<220>

<221> MOD_RES

<222> (21)..(21)

<223> bAla

<400> 36

Pro Ser Lys Asn Glu Arg Ala Asp Leu Ile Ala Tyr Leu Lys Gln Ala

1 5 10 15

Thr Lys Lys Pro Xaa

20

<210> 37

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 诱导Th的肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> (3)..(3)

<223> Lys被生物素化

<220>

<221> MOD_RES

<222> (19)..(19)

<223> Lys被生物素化

<220>

<221> MOD_RES

<222> (21)..(21)

<223> bAla

<400> 37

Pro Ser Lys Pro Val Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly Ala Ser Ala Tyr

1 5 10 15

Gly Ser Lys Pro Xaa

20

<210> 38

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 诱导Th的肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> (3)..(3)

<223> Lys被生物素化

<220>

<221> MOD_RES

<222> (20)..(20)

<223> Lys被生物素化

<220>

<221> MOD_RES

<222> (22)..(22)

<223> bAla

<400> 38

Pro Ser Lys Lys Arg Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu Gln Met His Ser

1 5 10 15

Arg Lys His Lys Pro Xaa

20

<210> 39

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 诱导Th的肽

<400> 39

Leu Glu Asp Ala Arg Arg Leu Lys Ala Ile Tyr Glu Lys Lys Lys

1 5 10 15

<210> 40

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 诱导Th的肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> (20)..(20)

<223> bAla

<400> 40

Pro Ser Lys Arg Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg

1 5 10 15

Lys His Pro Xaa

20

<210> 41

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 诱导Th的肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> (3)..(3)

<223> Lys被生物素化

<220>

<221> MOD_RES

<222> (16)..(16)

<223> Lys被生物素化

<220>

<221> MOD_RES

<222> (18)..(18)

<223> bAla

<400> 41

Pro Ser Lys Arg Glu Phe Lys Leu Ser Lys Val Trp Arg Asp Gln Lys

1 5 10 15

Pro Xaa

Claims (20)

1.分离的多肽的修饰分子，其源自肿瘤特异性的抗原且结合MHC II类分子。

2.根据权利要求1所述的修饰分子，其中所述修饰是将几个氨基酸添加至分离的多肽的C端侧和/或N端侧。

3.根据权利要求2所述的修饰分子，其中要添加至分离的多肽的C端侧的氨基酸是由下式(I)表示的氨基酸序列：

X1-X2-X3-X4 (I)

其中

(1) X1表示生物素化的Lys，X2表示几个氨基酸或单键，X3表示一个氨基酸或单键，且X4表示一个氨基酸或羧基(条件是，当X3是Pro时，那么X4表示一个氨基酸)，

(2) X1表示一个除了生物素化的Lys以外的氨基酸或单键，X2表示几个氨基酸或单键，X3表示Pro，且X4表示一个氨基酸，或

(3) X1表示一个除了生物素化的Lys以外的氨基酸或单键，X2表示几个氨基酸或单键，X3表示一个除了Pro以外的氨基酸或单键，且X4表示β-Ala)。

4.根据权利要求3所述的修饰分子，其中要添加至分离的多肽的C端侧的氨基酸是由式(I)表示的氨基酸序列，其中

(1) X1表示生物素化的Lys，X2表示一个氨基酸或单键，X3表示一个氨基酸或单键，且X4表示一个氨基酸或羧基(条件是，当X3是Pro时，那么X4表示一个氨基酸)，或

(2) X1表示单键，X2表示单键，X3表示Pro，且X4表示一个氨基酸。

5.根据权利要求4所述的修饰分子，其中要添加至分离的多肽的C端侧的氨基酸是由式(I)表示的氨基酸序列，其中

X1表示生物素化的Lys，X2表示单键，X3表示单键，且X4表示Gly或羧基，

X1表示单键，X2表示单键，X3表示Pro，且X4表示Ala或β-Ala，或

X1表示生物素化的Lys，X2表示单键，X3表示Pro，且X4表示β-Ala。

6.根据权利要求2-5中的任一项所述的修饰分子，其中要添加至分离的多肽的N端侧的氨基酸是由下式(II)表示的氨基酸序列：

Y1-Y2-Y3 (II)

其中

(1) Y1表示Pro，Y2表示几个氨基酸或单键，且Y3表示一个氨基酸或单键，或

(2) Y1表示一个除了Pro以外的氨基酸或氨基，Y2表示几个氨基酸或单键，且Y3表示生物素化的Lys

(条件是，不包括其中从N端计的第二个氨基酸是Pro的氨基酸序列)。

7.根据权利要求6所述的修饰分子，其中要添加至分离的多肽的N端侧的氨基酸是由式(II)表示的氨基酸序列，其中

(1) Y1表示Pro，Y2表示一个氨基酸或单键，且Y3表示一个氨基酸或单键，或

(2) Y1表示一个除了Pro以外的氨基酸或氨基，Y2表示一个氨基酸或单键，且Y3表示生物素化的Lys

(条件是，不包括其中从N端计的第二个氨基酸是Pro的氨基酸序列)。

8.根据权利要求7所述的修饰分子，其中要添加至分离的多肽的N端侧的氨基酸是由式(II)表示的氨基酸序列，其中

Y1表示Pro，Y2表示Ser，Y3表示单键，

Y1表示氨基，Y2表示Ser，且Y3表示生物素化的Lys，或

Y1表示Pro，Y2表示Ser，且Y3表示生物素化的Lys。

9.根据权利要求1-8中的任一项所述的修饰分子，其中所述分离的多肽包含源自WT1、PSA、MAGE-3、存活素、CEA、酪氨酸酶、丙型肝炎病毒或EB病毒的氨基酸序列，且结合MHC II类分子。

10.根据权利要求9所述的修饰分子，其中所述分离的多肽包含源自WT1的氨基酸序列且结合MHC II类分子。

11.分离的多肽，其包含由SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 38或SEQ ID NO: 40显示的氨基酸序列。

12.抗肿瘤剂，其包含根据权利要求1-10中的任一项所述的修饰分子或根据权利要求11所述的分离的多肽。

13.根据权利要求12所述的抗肿瘤剂，所述抗肿瘤剂还包含源自肿瘤特异性抗原且结合MHC I类分子的分离多肽。

14.根据权利要求12或13所述的抗肿瘤剂，所述抗肿瘤剂还包含佐剂。

15.根据权利要求14所述的抗肿瘤剂，其中所述佐剂是百日咳疫苗。

16.治疗肿瘤的方法，所述方法包括：给患者施用有效量的根据权利要求12-15中的任一项所述的抗肿瘤剂。

17.用于治疗肿瘤的组合物，其包含根据权利要求1-10中的任一项所述的修饰分子或根据权利要求11所述的分离的多肽、源自肿瘤特异性抗原且结合MHC I类分子的分离多肽、和佐剂。

18.根据权利要求1-10中的任一项所述的修饰分子或根据权利要求11所述的分离的多肽在生产抗肿瘤剂中的用途。

19.检查试验对象是否具有结合在修饰分子中所含的分离多肽的MHC II类分子的方法，所述方法包括：培养从试验对象衍生出的抗原呈递细胞群体和根据权利要求1-10中的任一项所述的修饰分子，和证实所述抗原呈递细胞群体和所述修饰分子的结合。

20.检查肽是否可以结合抗原呈递细胞的方法，所述方法包括：培养抗原呈递细胞，所述细胞表达特定MHC II类分子和具有经修饰的N端和/或C端的任意肽，和证实所述抗原呈递细胞和所述肽的结合。