CN104126012A - 用于生产尼龙-7、尼龙-7,7和聚酯的生物转化工艺 - Google Patents

用于生产尼龙-7、尼龙-7,7和聚酯的生物转化工艺 Download PDF

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Abstract

本发明实施方案涉及用于在存在分离的酶或存在表达那些酶的重组宿主细胞的情况下生物合成双官能或三官能C7链烷的方法。所述双官能或三官能C7链烷可用作生产尼龙-7、尼龙-7,x、尼龙-x,7和聚酯的中间物。

Description

用于生产尼龙-7、尼龙-7,7和聚酯的生物转化工艺
对相关申请的交叉引用
本申请要求2011年6月30日提交的美国临时申请流水号61/503,043和均为2011年12月21日提交的美国临时申请流水号61/578,265；61/578,272；和61/578,289；以及2012年6月29日提交的国际申请PCT/US2012/44984的权益，其完整内容均通过提述并入本文，如在本文中完整列出一样。
发明领域
本发明的实施方案涉及用于在存在一种或多种分离的酶或存在表达一种或多种酶的重组宿主细胞的情况下生物合成产生双官能或三官能C7链烷的方法。所述双官能或三官能C7链烷可用作生产例如尼龙-7、尼龙-7,x和/或尼龙-x,7的中间物。
发明背景
化学工业对可持续实践的推动聚焦于降低能量使用、再生原材料和减少货物生产期间产生的副产物。然而，化学工业极其依赖于将石油和天然气作为基础给料。鉴于与主要石油化学品工艺有关的优化状态，将需要在给料使用和制造设计中的重大转变以将能量、散发和成本降低至其目前水平之下。生物技术提供了一种用于从可再生糖类如植物源的糖或其他可再生给料如脂肪酸生产工业化学中间物和终产物的新办法。另外，生物技术还提供了一种利用废物或低价值流如来自生物柴油生产的甘油，或在比现有化学工艺更有益于环境的生物工艺中将基于石油化学品的给料如苯、甲苯和多环芳香烃(PAH)转化成可用产物的方式。
US2010/0203600和WO2011/031147通过提述完整并入本文。本领域中需要对尼龙-7、尼龙-7,x、尼龙-x,7和聚酯的化学中间物和终产物尼龙-7、尼龙-7,x、尼龙-x,7和聚酯的经济的生物合成途径，尤其是从多种可再生和不可再生给料进行。
发明概述
本公开至少部分基于用于生物合成二或三官能C7链烷(alkanes)的酶系统和重组宿主的开发，所述二或三官能C7链烷是用于生产尼龙-7、尼龙-x,7、尼龙-7,x和聚酯的可用中间物(单体)。具体地，如本文中描述的，可用于生产尼龙-7和尼龙-7,x、尼龙-x,7和聚酯的中间物可从可再生给料如植物源的糖和甘油，或从基于石油化学品的给料如苯或环己烷羧酸酯生物合成产生。在一些实施方案中，二官能或三官能C7链烷的产生最终经由一种常见的中间体庚二酸半醛(pimelic acid semialdehyde)(亦称为7-氧庚酸(7-oxoheptanoate))进行，尽管有许多可使用的不同给料和许多产生庚二酸半醛的方式。图1是描绘了庚二酸半醛到各种双官能C7链烷的生物转化的示意图。
例如，庚二酸半醛可源自庚二酰-辅酶A(pimeloyl-coenzyme A,CoA)、庚二酰-[酰基载体蛋白(acp)](pimeloyl-[acyl carrier protein(acp)])、庚二酸(亦称为庚烷1,7-二酸(heptane 1,7-dioate))、或α-酮辛二酸酯(α-ketosuberate)。如本文中描述的，庚二酰-CoA、庚二酰-[acp]和庚二酸半醛可源自许多来源，包括许多不同的天然存在的代谢途径，其形成庚二酰-CoA、庚二酰-[acp]或庚二酸半醛作为天然存在的代谢途径中的中间物。
另外，庚二酰-CoA和庚二酸还可源自相应的烯酸(enoate)2-庚烯-二元酸(2-heptene-dioic acid)或其相应的CoA酯2-庚烯二元基-CoA(2-heptenedioyl-CoA)。在一些实施方案中，这些C72-烯酸源自D,L-二氨基庚二酸盐(D,L-diaminopimelate)或2-氧庚二酸(2-oxopimelate)。在一些实施方案中，双官能C7链烷(例如7氨基庚酸)的产生经由α-酮辛二酸或α-氨基辛二酸(可源自D,L-二氨基庚二酸)进行。在其他实施方案中，α-酮辛二酸或α-氨基辛二酸源自α-酮庚二酸。
更具体地，本发明提供多种转化化合物以产生可用于制造尼龙-7、尼龙-7,7和聚酯的中间物的方法。不需要实施任一种方法的所有可能步骤，且当获得期望的化合物时，可终止任一种方法。如此，在产生例如庚二酸(pimelicacid)、7-氨基-庚酸(7-amino-heptanoic acid)、庚内酰胺(enantholactam)、1,7-二氨基庚烷(1,7-diaminoheptane)、或7-羟基-庚酸(7-hydroxy-heptanoic acid)后，可终止任一种方法。
转化化合物的第一种方法可包括使选自2,6二氨基庚二酸盐(2,6diaminopimelate,2,6DAP)和α-氨基-庚二酸盐(α-amino-pimelate,AAP)的化合物与催化2,6DAP到6-氨基-2-庚烯二酸(6-amino-2-heptenedioic acid,6A2HA)的还原性脱氨基化或AAP到2-庚烯二酸(2-heptene dioic acid,2HDA)的还原性脱氨基化(reductive deamination)的酶接触，从而产生6A2HA或2HDA。
所述化合物可以是2,6DAP且所述第一种方法还可包括使6A2HA与催化6A2HA到AAP的烯酸还原的酶接触，从而产生AAP。
所述AAP可与催化AAP到2HDA的还原性脱氨基化的酶接触，从而产生2HDA。
所述2HDA可与催化2HDA到庚二酸(PA)的烯酸还原的酶接触，从而产生PA。
所述PA可与催化PA到庚二酸半醛(PAS)的羧酸还原的酶接触，从而产生PAS。
所述PAS可与催化PAS到7-氨基-庚酸(7-amino-heptanoic acid,7AHA)的半醛氨基化的酶接触，从而产生7AHA。
所述7AHA可与催化7AHA到庚内酰胺(enantholactam,ENTL)的酰胺水解的酶接触，从而产生ENTL。
转化化合物的第二种方法可包括，在实施第一种方法的所有步骤直至产生7AHA后，使7AHA与催化7AHA到7-氨基-庚醛(7-amino-heptanal,7AHT)的醛脱氢的酶接触，从而产生AHT。
所述7AHT可与催化氨基基团到7AHT转移以产生1,7-二氨基庚烷(1,7-diaminoheptane,1,7DAH)的酶接触，从而产生1,7DAH。
转化化合物的第三种方法可包括，在实施第一种方法的所有步骤直至产生2HDA后，使所述2HDA与催化辅酶A(CoA)到2HDA转移以产生2-庚烯二酸-CoA(2-heptene diacid-CoA,2HDA-CoA)的酶接触，从而产生2HDA-CoA。
所述2HDA-CoA可与催化2HDA-CoA到庚二酰-CoA(PCoA)的烯酸还原的酶接触，从而产生PCoA。
所述PcoA可与催化PCoA到PA的硫酯水解的酶接触，从而产生PA。
所述PA可与催化PA到PAS的羧酸还原的酶接触，从而产生PAS。
所述PAS可与催化PAS到7AHA的半醛氨基化的酶接触，从而产生7AHA。
所述7AHA可与催化7AHA到ENTL的酰胺水解的酶接触，从而产生ENTL。
转化化合物的第四种方法可包括，在实施第三种方法的所有步骤直至产生7AHA后，使所述7AHA与催化7AHA到7AHT的醛脱氢的酶接触，从而产生7AHT。
所述7AHT可与催化氨基基团到7AHT转移以产生1,7DAH的酶接触，从而产生1,7DAH。
转化化合物的第五种方法可包括，在实施第一种方法的所有步骤直至产生AAP后，使所述AAP与催化氨基基团到AAP转移以产生α-酮-庚二酸盐(AKP)的酶接触，从而产生AKP。
所述AKP可与催化AKP到α-羟基-庚二酸盐(AHP)的酮还原的一种或多种酶接触，从而产生AHP。
所述AHP可与催化CoA到AHP转移以产生α-羟基-庚二酸盐-CoA(AHP-CoA)的酶接触，从而产生AHP-CoA。
所述AHP-CoA可与催化AHP-CoA到2HDA-CoA的脱水的酶接触，从而产生2HDA-CoA。
所述2HDA-CoA可与催化2HDA-CoA到PCoA的烯酸还原的酶接触，从而产生PCoA。
所述PcoA可与催化PCoA到PA的硫酯水解的酶接触，从而产生PA。
所述PA可与催化PA到PAS的羧酸还原的酶接触，从而产生PAS。
所述PAS可与催化PAS到7AHA的半醛氨基化的酶接触，从而产生7AHA。
所述7AHA可与催化7AHA到ENTL的酰胺水解的酶接触，从而产生ENTL。
转化化合物的第六种方法可包括，在实施第五种方法的所有步骤直至产生7AHA后，使所述7AHA与催化7AHA到7AHT的醛脱氢的酶接触，从而产生7AHT。
所述7AHT可与催化氨基基团到7AHT转移以产生1,7DAH的酶接触，从而产生1,7DAH。
转化化合物的第七种方法可包括，在实施第五种方法的所有步骤直至产生AHP后，使AHP与催化AHP到2HDA的脱水的酶接触，从而产生2HDA。
所述2HDA可与催化2HDA到庚二酸(PA)的烯酸还原的酶接触，从而产生PA。
所述PA可与催化PA到PAS的羧酸还原的酶接触，从而产生PAS。
所述PAS可与催化PAS到7AHA的半醛氨基化的酶接触，从而产生7AHA。
所述7AHA可与催化7AHA到ENTL的酰胺水解的酶接触，从而产生ENTL。
转化化合物的第八种方法可包括，在实施第五种方法的所有步骤直至产生7AHA后，使所述7AHA与催化7AHA到7AHT的醛脱氢的酶接触，从而产生7AHT。
所述7AHT与催化氨基基团到7AHT转移以产生1,7DAH的酶接触，从而产生1,7DAH。
转化化合物的第九种方法可包括，在实施第七种方法的所有步骤直至产生2HDA后，使2HDA与催化CoA到2HDA转移以产生2HDA-CoA的酶接触，从而产生2HDA-CoA。
所述2HDA-CoA与催化2HDA-CoA到PCoA的烯酸还原的酶接触，从而产生PCoA。
所述PcoA可与催化PCoA到PA的硫酯水解的酶接触，从而产生PA。
所述PA可与催化PA到PAS的羧酸还原的酶接触，从而产生PAS。
所述PAS可与催化PAS到7AHA的半醛氨基化的酶接触，从而产生7AHA。
所述7AHA可与催化7AHA到ENTL的酰胺水解的酶接触，从而产生ENTL。
转化化合物的第十种方法可包括，在实施第九种方法的所有步骤直至产生7AHA后，使7AHA与催化7AHA到7AHT的醛脱氢的酶接触，从而产生7AHT。
所述7AHT可与催化氨基基团到7AHT转移以产生1,7DAH的酶接触，从而产生1,7DAH。
转化化合物的第十一种方法可包括，在实施第五种方法的所有步骤直至产生AKP后，使AKP与催化AKP到α-酮-辛二酸盐(AKS)的α-酮酸链延伸的酶接触，从而产生AKS。
所述AKS可与催化氨基基团到AKS转移以产生α-氨基辛二酸盐(AAS)的酶接触，从而产生AAS。所述AAS可与催化AAS到7AHA的α-氨基酸脱羧的酶接触，从而产生7AHA。
所述7AHA可与催化7AHA到ENTL的酰胺水解的酶接触，从而产生ENTL。
转化化合物的第十二种方法可包括，在实施第十一种方法的所有步骤直至产生7AHA后，使7AHA与催化7AHA到7AHT的醛脱氢的酶接触，从而产生7AHT。
所述7AHT可与催化氨基基团到7AHT转移以产生1,7DAH的酶接触，从而产生1,7DAH。
转化化合物的第十三种方法可包括，在实施第十一种方法的所有步骤直至产生AKS后，使AKS与催化AKS到PAS的α-酮酸脱羧的酶接触，从而产生PAS。
所述PAS可与催化PAS到7AHA的半醛氨基化的酶接触，从而产生7AHA。
所述7AHA可与催化7AHA到ENTL的酰胺水解的酶接触，从而产生ENTL。
转化化合物的第十四种方法可包括，在实施第十三种方法的所有步骤直至产生7AHA后，使所述7AHA与催化7AHA到7AHT的醛脱氢的酶接触，从而产生7AHT。
所述7AHT可与催化氨基基团到7AHT转移以产生1,7DAH的酶接触，从而产生1,7DAH。
转化化合物的第十五种方法可包括，在实施第五种方法的所有步骤直至产生PCoA后，使所述PCoA与催化PCoA到PAS的还原的酶接触，从而产生PAS。
所述PAS可与催化PAS到7AHA的半醛氨基化的酶接触，从而产生7AHA。
所述7AHA可与催化7AHA到ENTL的酰胺水解的酶接触，从而产生ENTL。
转化化合物的第十六种方法可包括，在实施第十五种方法的所有步骤直至产生7AHA后，使所述7AHA与催化7AHA到7AHT的醛脱氢的酶接触，从而产生7AHT。
所述7AHT可与催化氨基基团到7AHT转移以产生1,7DAH的酶接触，从而产生1,7DAH。
转化化合物的第十七种方法可包括，在实施第九种方法的所有步骤直至产生PCoA后，使所述PCoA与催化PCoA到PAS的还原的酶接触，从而产生PAS。
所述PAS可与催化PAS到7AHA的半醛氨基化的酶接触，从而产生7AHA。
所述7AHA可与催化7AHA到ENTL的酰胺水解的酶接触，从而产生ENTL。
转化化合物的第十八种方法可包括，在实施第十七种方法的所有步骤直至产生7AHA后，使所述7AHT与催化7AHA到7AHT的醛脱氢的酶接触，从而产生7AHT。
所述7AHT可与催化氨基基团到7AHT转移以产生1,7DAH的酶接触，从而产生1,7DAH。
转化化合物的第十九种方法可包括使选自6A2HA和2HDA的化合物与催化6A2HA到AAP的烯酸还原或2HDA到PA的烯酸还原的酶接触，从而产生AAP或PA。应当理解，在产生AAP或PA后，可实施在上文第一至第十八种方法中描述的产生AAP或PA之后的任意步骤。
转化化合物的第二十种方法可包括使选自PCoA和庚二酰[acp](PACP)的化合物与催化PCoA或PACP到PA的硫酯酶水解的酶接触，从而产生PA。
所述PA可与催化PA到PAS的羧酸还原的酶接触，从而产生PAS。
所述PAS可与催化PAS到7AHA的半醛氨基化的酶接触，从而产生7AHA。
所述7AHA可与催化7AHA到ENTL的酰胺水解的酶接触，从而产生ENTL。
转化化合物的第二十一种方法可包括，在实施第二十种方法的所有步骤直至产生7AHA后，使所述7AHA与催化7AHA到7AHT的醛脱氢的酶接触，从而产生7AHT。
所述7AHT可与催化氨基基团到7AHT转移以产生1,7DAH的酶接触，从而产生1,7DAH。
转化化合物的第二十二种方法可包括，使AKP与催化AKP到AHP的酮还原的一种或多种酶接触，从而产生AHP。AKP可通过α-酮己二酸或α-酮戊二酸的链延伸产生。然后，AHP可转化成PA或PcoA。理解在产生PA或PCoA后，可实施在上文第一至第十八种方法中描述的产生PA或PCoA之后的任意步骤。
转化化合物的第二十三种方法可包括通过α-酮酸链延伸将AKP转化成AKS。AKP可通过α-酮己二酸或α-酮戊二酸的链延伸产生。理解在产生AKS后，可实施在上文第一至第十八种方法中描述的产生AKS之后的任意步骤。
转化化合物的第二十四种方法可包括使PAS与催化PAS到7AHA的半醛氨基化的酶接触，从而产生7AHA。PAS可通过从2,6DAP、AKG、PCoA、或PACP转化获得。理解在产生AHA后，可实施在上文第一至第十八种方法中描述的产生AHA之后的任意步骤。
转化化合物的第二十五种方法可包括使选自PCoA和PACP的化合物与催化该化合物到PAS还原的酶接触，从而产生PAS。理解在产生PAS后，可实施在上文第一至第十八种方法中描述的产生PAS之后的任意步骤。此外，上文第一至第十八种方法和第二十二种方法中描述的导致PcoA产生的任意步骤可在第二十五种方法之前实施。
转化化合物的第二十六种方法可包括使PAS与催化PAS到7-羟基-庚酸(7HHA)的醇脱氢的酶接触，从而产生7HHA。理解上文第一至第十八种方法和第二十、二十二、二十三和二十五种方法中描述的导致PAS产生的任意步骤可在第二十六种方法之前实施。
在所述任一种方法中，所述酶可以纯化形式使用。或者，所述酶可以细胞裂解物或部分纯化的细胞裂解物的形式使用。另外，所述酶可在重组表达其的细胞中。
在所述方法中，催化还原性脱氨基化的酶可包括氨裂合酶。所述氨裂合酶可以是EC 4.3.1中的，例如EC 4.3.1.1；EC 4.3.1.2；EC 4.3.1.3；EC 4.3.1.9；EC 4.3.1.12；EC 4.3.1.13；EC 4.3.1.14、EC 4.3.1.23或EC 4.3.1.24。
在所述方法中，催化2-烯酸还原的酶可包括烯酸还原酶。所述烯酸还原酶可以是EC 1.3.1中的，例如EC 1.3.1.8；EC 1.3.1.9；EC 1.3.1.10，如FabI的基因产物；EC 1.3.1.31；EC 1.3.1.38；EC 1.3.1.39；EC 1.3.1.44如ter或tdter的基因产物(Nishimaki等,J.Biochem.,1984,95,1315–1321；Shen等,Appl.Environ.Microbiol.,2011,77(9),2905-2915；Bond-Watts等,Biochemistry,2012,51,6827-6837)；或EC 1.3.1.62中的庚二酰-CoA脱氢酶如PimC/PimD或ThnJ/ThnK。所述烯酸还原酶还可以在EC 1.3中，如EC 1.3.8.1；EC 1.3.99.3；EC 1.3.99.B10或Syntrophus aciditrophicus 2,3-二脱氢庚二酰-CoA还原酶及其同源物。所述烯酸还原酶可以作用于反式-2-烯酰-二羧酸，或二羧酸的硫酯如2-庚烯二元酸-CoA(反式-2,3-二脱氢庚二酰-CoA)或2-庚烯二元酸-[acp](反式-2,3-二脱氢庚二酰-[acp])。
在所述方法中，催化羧酸还原的酶可包括羧酸还原酶。所述羧酸还原酶可以是EC 1.2.99中的，例如EC 1.2.99.6。所述羧酸还原酶还可以属于NAD依赖性非酰化醛脱氢酶，如鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)或贪铜菌属(Cupriavidus)物种中的ThnG。
在所述方法中，催化半醛氨基化的酶可包括ω转氨酶。所述ω-转氨酶可以是EC 2.6.1中的，例如EC 2.6.1.18；EC 2.6.1.19；EC 2.6.1.11EC 2.6.1.13；EC 2.6.1.39；EC 2.6.1.48；或EC 2.6.1.62。
在所述方法中，催化CoA硫酯的硫酯水解的酶可包括硫酯酶、酸-硫醇连接酶或CoA转移酶。所述硫酯酶可以是EC 3.1.2中的，例如如YciA、tesB或Acot13的基因产物；EC 3.1.2.2；EC 3.1.2.18；EC 3.1.2.19；或EC 3.1.2.20。所述酸-硫醇连接酶/CoA合成酶可以是EC 6.2.1中的，例如EC 6.2.1.3；EC6.2.1.5、EC 6.2.1.14；或EC 6.2.1.23。所述CoA转移酶可以是EC 2.8.3中的，例如EC 2.8.3.12；EC 2.8.3.13或EC 2.8.3.14，或催化CoA到庚二酸的可逆转移的ThnH的基因产物。
在所述方法中，催化酰基-载体-蛋白([ACP])硫酯的硫酯水解的酶可以包括来自EC 3.1.2，例如EC 3.1.2.14或EC 3.1.2.21的酰基-[ACP]硫酯酶，来自EC6.2.1，例如EC 6.2.1.14的酰基-[ACP]-合成酶(synthtase)，如BioW；和EC6.2.1.20。
在所述方法中，催化α-氨基基团转移的酶可包括氨基酸氨基转移酶。所述氨基酸氨基转移酶可以是EC 2.6.1，例如EC 2.6.1.39；EC 2.6.1.42或EC2.6.1.21中的L-或D-选择性氨基转移酶，或来自EC 2.6.1.67的2-氨基己酸氨基转移酶。催化α-氨基基团转移的酶还可以是来自EC 1.4.1.-类的脱氢酶，如谷氨酸脱氢酶，其根据使用的辅因子属于EC 1.4.1.2；EC 1.4.1.3；或EC1.4.1.4，或来自EC 1.4.1.16的二氨基庚二酸脱氢酶。
在所述方法中，催化酮还原的酶可以是EC 1.1.1.-或1.1.99中的羰基还原酶。所述羰基还原酶可包括EC 1.1.1.184；EC 1.1.1.79；EC 1.1.1.B3；EC1.1.1.B4或来自EC 1.1.99.2.或EC 1.1.99.6的2-羟基戊二酰脱氢酶/alpha酮戊二酸还原酶。
在所述方法中，催化α-酮酸脱羧的酶可以是EC 4.1.1，例如4.1.1.1；4.1.1.7；4.1.1.72中的α-酮酸脱羧酶，或EC 2.2.1.6或EC 2.2.2.6类中的乙酰乳酸合酶。
在所述方法中，催化α-氨基酸脱羧的酶可以使来自EC 4.1.1.-类的α-氨基酸脱羧酶。所述α-氨基酸脱羧酶可报考EC 4.1.1.11；EC 4.1.1.15；EC 4.1.1.16；EC 4.1.1.18；EC 4.1.1.20、EC 4.1.1.45；和EC 4.1.1.86。
在所述方法中，催化二羧酸的CoA酯到相应半醛的还原(例如，PcoA到PAS)的酶可以是脂肪-酰基-CoA还原酶。所述脂肪-酰基-CoA还原酶可以是EC 1.2.1.-，例如EC 1.2.1.3；EC 1.2.1.10；EC 1.2.1.22；EC 1.2.1.50；EC 1.2.1.57和EC 1.2.1.76中的。
在所述方法中，催化[ACP]硫酯的CoA酯到相应半醛的还原(例如，PACP到PAS)的酶可以是作用于上文描述的CoA酯和[ACP]酯的脂肪-酰基-CoA还原酶，或来自例如EC 1.2.1.80的酰基-酰基-载体蛋白还原酶。
在所述方法中，催化醛脱氢到羧酸的酶可以是醛脱氢酶或醛氧化酶。所述醛脱氢酶可以是EC 1.2.1中的，例如EC 1.2.1.3；EC 1.2.1.4或EC 1.2.1.63。所述醛脱氢酶/羧酸还原酶还可以是EC 1.2.99，例如EC 1.2.99.6中的。所述羧酸还原酶还可以属于NAD依赖性非酰化醛脱氢酶，如鞘氨醇单胞菌属和贪铜菌属物种中的ThnG。所述醛氧化酶可以是EC 1.2.3，例如1.2.3.1中的。
在所述方法中，催化7-氨基庚酸到庚内酰胺(enantholactam)的环闭合的酶可以是EC 3.5.2，例如3.5.2.11的酰胺水解酶。
在所述方法中，催化脱水(例如，AHP或AHP-CoA)的酶可以是水裂合酶(hydro-lyase)。所述水裂合酶可以是EC 4.2.1中的，例如EC 4.2.1.2；EC4.2.1.59；4.2.1.61；4.2.1.17或4.2.1.18。脱水酶还可以是梭菌(clostridia)和梭杆菌(fusobacteria)中描述的与其激活剂(HgdCAB)一起表达的2-羟基戊二酰-CoA脱水酶，尚未对其分配EC号，或厌氧性细菌的2-羟基酰基CoA脱水酶。
在所述方法中，催化α-酮酸链延伸的酶可包括包含以下的酶组中的一种或多种：AksA、AksD、AksE和AksF。所述AksA可以是EC 2.3.3中的，例如EC 2.3.3.13或2.3.3.14。所述AksD可以是EC 4.2.1中的，例如EC 4.2.1.36。所述AksF可以是EC 1.1.1中的，例如EC 1.1.1.87。1种或多种(例如2种或更多种、3种或更多种、4种或更多种、5种或更多种、6种或更多种、7种或更多种、8种或更多种、9种或更多种、10种或更多种、12种或更多种、14种或更多种、18种或更多种、或20种或更多种)α-酮酸链延伸酶可来自产甲烷菌细菌。
在所述方法中，催化醇脱氢的酶可包括醇脱氢酶。所述醇脱氢酶可包括EC.1.1.1.1或EC 1.1.1.2或1.1.1.21。它还可以是例如，来自运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)的adhA、来自运动发酵单胞菌的adhB、来自丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)的丁醇脱氢酶、酵母属ADHIV、和来自酿酒酵母(S.cerevisiae)的ADH6。在所述方法中，催化醇脱氢的酶可以是醇氧化酶。所述醇氧化酶可以是在EC 1.1.3.13类中。
用在本文方法中的PCoA或PACP可源自乙酰-CoA或苯甲酰-CoA，或任何代谢途径如生物素生物合成、苯甲酸降解、环己烷羧酸酯途径、或丙二酰-CoA的缩合或脂肪酸ω-氧化。乙酰-CoA可源自可再生给料，其包括纤维素给料、糖、甘油或脂肪酸。此外，乙酰-CoA可源自合成气、甲烷或甲醇。苯甲酰-CoA可源自多环芳香烃。除了源自PCoA或PACP或PA外，PAS还可源自萘满降解途径。
用在本文方法中的2,6DAP可由缺乏二氨基庚二酸脱羧酶的产赖氨酸生物体产生。2,6DAP源自任何可发酵碳源，包括糖、甘油、脂肪酸、合成气、甲烷或甲醇。
本文特征为生物衍生的尼龙-7、尼龙-7,x、尼龙-x,7和聚酯。它还包括通过包括聚合7AHA的工艺产生的尼龙-7，其中所述7AHA源自PAS或AAS。本文还提供通过包括聚合PA和1,7DHA的工艺产生的尼龙-7,7，其中所述PA源自PCoA；PACP；或2HDA而1,7DHA源自7AHA。本文还包括通过包括聚合7AHA的工艺产生的尼龙-7，其中7AHA由上述任一种导致7AHA产生的方法制备。本发明的另一个方面是通过包括聚合1,7DHA和PA的工艺产生的尼龙7,7，其中1,7DHA由上述任一种导致1,7DHA产生的方法制备，而PA由上述任一种导致PA产生的方法制备。
本文还提供一种基本纯的宿主细胞培养物，大量所述宿主细胞包含并表达一种或多种编码涉及生物合成选自以下的一种或多种聚合物单体的一种或多种酶的外源核酸：7AHA；PA；1,7DAH；ENTL；和7HHA。这些酶包括脂肪-酰基-CoA还原酶、酰基-[acp]还原酶、硫酯水解酶、氨裂合酶、烯酸还原酶、氨基酸氨基转移酶、CoA转移酶、酸-硫醇连接酶、水裂合酶、羰基还原酶、羧酸还原酶、ω-转氨酶、α-酮酸脱羧酶、醛脱氢酶、脱氨基脱氢酶、醇脱氢酶、醛氧化酶、醇氧化酶、酰胺水解酶、脱羧乙酰乳酸合酶(fatty-acyl-CoA reductases,acyl-[acp]reductases,thioester hydrolases,ammonialyases,enoate reductases,amino acid aminotransferases,CoAtransferases,,acid-thiol ligases,hydro-lyases,carbonyl reductases,carboxylicacid reductases,ω-transaminases,α-keto acid decarboxylases,aldehydedehydrogenases,deaminating dehydrogenases,alcohol dehydrogenases,aldehydeoxidases,alcohol oxidases,amidohydrolases,decarboxylating acetolactatesynthases)和催化α-酮酸链延伸的酶如AksA、AksD、AksE和AksF。如本文中使用的，“大量”为培养物中至少10％(例如至少：20％；30％；40％；50％；60％；70％；75％；80％；85％；90％；95％；97％；98％；99％；或甚至100％)的细胞。
所述培养物的细胞可以是原核细胞，如且无限制地，埃希氏菌属(Escherichia)如物种大肠杆菌(Escherichia coli)；梭菌属(Clostridia)如物种杨氏梭菌(Clostridium ljungdahlii)、自产乙醇梭菌(Clostridium autoethanogenum)或克氏梭菌(Clostridium kluyveri)；棒状杆菌属(Corynebacteria)如物种谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)；贪铜菌属如物种钩虫贪铜菌(Cupriavidus necator)或耐金属贪铜菌(Cupriavidus metallidurans)；假单胞菌属(Pseudomonas)如物种荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)或食油假单胞菌(Pseudomonas oleavorans)；代尔夫特菌属(Delftia)如物种食酸代尔夫特菌(Delftia acidovorans)；芽孢杆菌属(Bacillus)如物种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtillis)；乳杆菌属(Lactobacillus)如物种德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)；和乳球菌属(Lactococcus)如物种乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)。
或者，所述培养物的细胞可以是真核细胞，例如真菌细胞如酵母细胞。酵母细胞可以是酵母或真菌的，如且无限制地，曲霉属(Aspergillus)如物种黑曲霉(Aspergillus niger)；酵母属(Saccharomyces)如物种酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)；假丝酵母属(Candida)如物种热带假丝酵母(C.tropicalis)、白色假丝酵母(C.albicans)、C.cloacae、C.guillermondii、中型假丝酵母(C.intermedia)、麦芽糖假丝酵母(C.maltosa)、近平滑假丝酵母(C.parapsilosis)或C.zeylenoides；毕赤酵母属(Pichia)如物种巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)；耶氏酵母属(Yarrowia)如物种解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)；伊萨酵母属(Issatchenka)如物种Issathenkia orientalis；德巴利酵母属(Debaryomyces)如物种汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)；Arxula属如物种Arxula adenoinivorans；克鲁维酵母属(Kluyveromyces)如物种乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)；外瓶霉属(Exophiala)；毛霉属(Mucor)；木霉属(Trichoderma)；枝孢属(Cladosporium)；平革菌属(Phanerochaete)；Cladophialophora属；拟青霉属(Paecilomyces)；Scedosporium属和Ophiostoma属。
可由所述细胞表达的外源酶如下。所述氨裂合酶可包括EC 4.3.1中的氨裂合酶，例如EC 4.3.1.1；EC 4.3.1.2；EC 4.3.1.3；EC 4.3.1.9；EC 4.3.1.12；EC 4.3.1.13；EC 4.3.1.14、EC 4.3.1.23或EC 4.3.1.24。所述烯酸还原酶可包括EC 1.3.1，例如EC 1.3.1.8；EC 1.3.1.9；EC 1.3.1.10、EC 1.3.1.31；EC 1.3.1.38；EC 1.3.1.39；EC 1.3.1.44中的烯酸还原酶，或EC 1.3.1.62中的庚二酰-CoA脱氢酶如PimC/PimD或ThnJ/ThnK。所述烯酸还原酶还可以是在EC 1.3，如EC1.3.8.1或EC 1.3.99.3；EC 1.3.99.B10中，或Syntrophus aciditrophicus 2,3-二脱氢pimelyl-CoA还原酶及其同源物。所述羧酸还原酶包括EC 1.2.99中的羧酸还原酶，例如EC 1.2.99.6。所述羧酸还原酶还可以属于NAD依赖性非酰化醛脱氢酶，如鞘氨醇单胞菌属或贪铜菌属物种中的ThnG。所述ω-转氨酶可包括EC 2.6.1中的转氨酶，例如EC 2.6.1.18；EC 2.6.1.19；2.6.1.11；EC 2.6.1.13；EC 2.6.1.39；EC 2.6.1.48或EC 2.6.1.62。所述硫酯酶可包括EC 3.1.2中的硫酯酶，例如如YciA、tesB或Acot13的基因产物；EC 3.1.2.2；EC 3.1.2.18；EC3.1.2.19；或EC 3.1.2.20。作用于酰基-[acp]硫酯的硫酯酶包括EC 3.1.2.14，如FatA、FatB；和EC 3.1.2.21。所述酸-硫醇连接酶或CoA synthtase可包括EC6.2.1中的酸-硫醇连接酶，例如EC 6.2.1.3；EC 6.2.1.5；EC 6.2.1.14；或EC6.2.1.23。所述CoA转移酶可包括EC 2.8.3中的CoA转移酶，例如EC 2.8.3.12；EC 2.8.3.13或EC 2.8.3.14，或催化CoA到庚二酸的可逆转移的ThnH的基因产物。
所述酰基-[acp]-硫酯酶包括EC 3.1.2，例如3.1.2.14和EC 3.1.2.21中的硫酯酶。所述酰基-[acp]合成酶可包括EC 6.2.1中的酸-硫醇连接酶，例如EC6.2.1.14中的，如BioW；和EC 6.2.1.20中的。所述氨基酸氨基转移酶可包括EC 2.6.1中的氨基转移酶，例如EC 2.6.1.39；EC 2.6.1.21；EC 2.6.1.42；和EC2.6.1.67。所述脱氨基脱氢酶可包括来自EC 1.4.1的脱氢酶，例如1.4.1.2；EC1.4.1.3；EC 1.4.1.4；和EC 1.4.1.16。所述羰基还原酶可包括EC.1.1.1.184EC1.1.1.79、EC 1.1.1.B3；EC 1.1.1.B4中的还原酶，或来自EC 1.1.99.2.或EC1.1.99.6的2-羟基戊二酰脱氢酶/alpha酮戊二酸还原酶。
所述α-酮酸脱羧酶可包括EC 4.1.1，例如4.1.1.1；4.1.1.7；4.1.1.72中的α-酮酸脱羧酶；或EC 2.2.1.6类中的乙酰乳酸合酶。所述α-氨基酸脱羧酶可包括EC 4.1.1.11；EC 4.1.1.15；EC 4.1.1.16；EC 4.1.1.18；EC 4.1.1.20、EC 4.1.1.45；和EC 4.1.1.86
所述脂肪-酰基-CoA还原酶可包括EC 1.2.1中的脂肪-酰基-CoA还原酶，例如EC 1.2.1.3；EC 1.2.1.10；EC 1.2.1.22；EC 1.2.1.50；和EC 1.2.1.76。所述酰基-[acp]-还原酶可包括来自例如EC 1.2.1.80的酰基-酰基-载体蛋白还原酶。
所述醛脱氢酶可包括EC 1.2.1中的醛脱氢酶，例如EC 1.2.1.3；EC 1.2.1.4或EC 1.2.1.63。所述醛脱氢酶/羧酸还原酶还可以是在EC 1.2.99，例如EC1.2.99.6中的。所述羧酸还原酶还可以属于NAD依赖性非酰化醛脱氢酶，如鞘氨醇单胞菌属或贪铜菌属物种中的ThnG。所述醛脱氢酶/羧酸还原酶还可以属于NAD依赖性非酰化醛脱氢酶，如鞘氨醇单胞菌属或贪铜菌属物种中的ThnG。所述醛氧化酶可以是EC 1.2.3，例如1.2.3.1中的。所述酰胺水解酶可以是来自EC 3.5.2例如3.5.2.11的酰胺水解酶。
所述水裂合酶包括EC 4.2.1中的水裂合酶，例如EC 4.2.1.2；EC 4.2.1.59；4.2.1.61；4.1.2.17或4.1.2.18。脱水酶还可以是梭菌和梭杆菌中描述的与其激活剂(HgdCAB)一起表达的2-羟基戊二酰-CoA脱水酶，尚未对其分配EC号，或厌氧性细菌的2-羟基酰基CoA脱水酶。
所述催化α-酮酸链延伸的酶可包括包含AksA、AksD、AksE和AksF酶的组中的一种或多种酶。所述AksA可包括EC 2.3.3中的AksA酶，例如EC2.3.3.13或2.3.3.14。所述AksD可包括EC 4.2.1中的AksD酶，例如EC 4.2.1.36。所述AksF可包括EC 1.1.1中的AksF酶，例如EC 1.1.1.87。所述醇脱氢酶可包括，例如EC.1.1.1.1或EC 1.1.1.2或EC 1.1.1.21。另外，所述醇脱氢酶可包括例如，来自运动发酵单胞菌的adhA、来自运动发酵单胞菌的adhB、来自丙酮丁醇梭菌的丁醇脱氢酶、酵母属ADHIV和来自酿酒酵母的ADH6。所述醇氧化酶还可以是EC 1.1.3.13类中的。
本文的另一个方面是分离的宿主细胞，其包含并表达一种或多种编码涉及选自7AHA；PA；1,7DAH；ENTL；和7HHA的一种或多种聚合物单体的生物合成的一种或多种酶的外源核酸。所述酶包括氨裂合酶、烯酸还原酶、羧酸还原酶、ω-转氨酶、硫酯酶、酸-硫醇连接酶或CoA合成酶(synthtase)、CoA转移酶、酰基-[acp]硫酯酶、酰基-[acp]合成酶、氨基酸氨基转移酶、脱氨基脱氢酶、羰基还原酶、α-酮酸脱羧酶、乙酰乳酸合酶、α-氨基酸脱羧酶、脂肪-酰基-CoA还原酶、酰基-[acp]-还原酶、醛脱氢酶、醛氧化酶、酰胺水解酶、水裂合酶、和催化α-酮酸链延伸的酶。。所述细胞和酶可以是上文对基本纯的宿主细胞培养物所描述的那些中的任一种。
从本文中列出的下文详细说明考虑，其他目标和优点对于本领域技术人员将是明显的。
附图简述
图1是显示庚二酸半醛到可用于尼龙7、尼龙7,7和尼龙7,x生产以及聚酯的各种双官能C7链烷的生物转化的示意图。
图2是从庚二酰-CoA、庚二酰-[acp]或α-酮辛二酸(均为如指示的天然存在途径中的且来自萘满降解的中间物)形成庚二酸半醛的示意图。
图3是α-酮酸链延伸中的系列反应的示意图。链延伸牵涉3种基本反应：α-酮二酸与乙酰-CoA之间缩合以形成柠檬酸同源物，柠檬酸同源物异构化为异柠檬酸同系物，和异柠檬酸同系物氧化脱羧为α-酮二酸，其含有另外的亚甲基基团[Howell98:Howell DM,Harich K,Xu H,White RH(1998).Alpha-keto acid chain elongation reactions involved in the biosynthesis ofcoenzyme B(7-mercaptoheptanoyl threonine phosphate)in methanogenicArchaea."Biochemistry,37(28)；10108-17]。从α-酮戊二酸到α-酮辛二酸的连续轮的链延伸之后是α-酮酸脱羧为庚二酸半醛。这些反应类似于在TCA循环I(原核)循环中由柠檬酸合酶、顺乌头酸酶(aconitase)和异柠檬酸脱氢酶催化的反应，以及在赖氨酸生物合成V中由(R)-高柠檬酸合酶、高顺乌头酸酶(homoaconitase)和(-)-苏型-异高柠檬酸脱氢酶催化的反应[Howell,1998，见上]。
图4是经由3个丙二酰-CoA的缩合形成庚二酰-CoA的示意图。
图5是庚二酸形成的示意图，其通过由来自枯草芽孢杆菌的BioI对长链脂肪酸的[acp]硫酯的氧化性切割。庚二酸或其CoA或[acp]硫酯是生物素生物合成途径II中7-酮-8-氨基壬酸酯生物合成中的前体。7-酮-8-氨基壬酸酯是生物素生物合成的关键中间物。庚二酰-CoA在宿主生物中的降解可由BioF的缺失或失活阻止，该基因编码7-酮-8-氨基壬酸合成酶(E.C.2.3.1.47)。
图6是生物素生物合成途径I中7-酮-8-氨基壬酸生物合成中庚二酰-[acp]或其甲基酯形成的示意图。生物素生物合成中的关键中间物。庚二酸或庚二酸半醛可从这些前体制备，其通过aaaS(酰基ACP合成酶)、FatA(脂肪酰基ACP硫酯酶A)、FatB(脂肪酰基ACP硫酯酶B)或酰基-[acp]还原酶的作用，如粗体显示的。
图7是显示从苯甲酸形成庚二酰-CoA或环己烷羧酸降解的示意图。
图8是显示鞘氨醇单胞菌和棒状杆菌物种中萘满降解途径中庚二选半醛形成的示意图。
图9是显示通过产甲烷菌在环己烷羧酸途径中从巴豆酸酯形成庚二酰-CoA的示意图。参见Mouttaki等,Applied and Environmental Microbiology,930-938页(2001)。
图10A是显示从作为起点的D,L-二氨基庚二酸经由2-氨基庚二酸到庚二酸半醛和7-氨基庚酸的工程化途径例子的示意图。从2-氨基庚二酸到庚二酸半醛有两条路径，经由通过氨裂合酶的还原性脱氨基化到2-庚烯二酸，或经由α-酮酸的形成，其可随后转化成庚二酸或其CoA酯。或者，源自2-氨基庚二酸的α-酮-庚二酸可进行一轮链延伸为α-酮-辛二酸，其可脱羧以形成庚二酸半醛或转化成α-氨基辛二酸，α-氨基辛二酸在脱羧时直接产生7-氨基庚酸。α-酮-庚二酸还可源自α-酮-己二酸，其相应地可源自α-酮-戊二酸，经由两轮连续的α-酮酸链延伸。
图10B是显示α-羟基庚二酸或其CoA酯通过水裂合酶分别到2-庚烯二酸或其相应CoA酯α-羟基庚二酰-CoA的转化的示意图。类似地，2-庚烯二酸或其相应CoA酯可通过烯酸还原酶分别被还原为庚二酸或庚二酰-CoA，该烯酸还原酶作用于游离酸或CoA活化的硫酯。以类似的方式，α-羟基庚二酸或2-庚烯二酸的活化可能不是对CoA硫酯，而是通过酰基-[acp]-合成酶对[acp]硫酯。所述水裂合酶可以催化水从α-羟基庚二酰-[acp]的消除，而烯酸还原酶可以还原2-庚烯二酸-[acp]的双键。庚二酰-CoA或庚二酰-[acp]可随后被转移酶或酸-硫醇连接酶水解，以用于CoA或[acp]的循环，或通过硫酯酶以产生庚二酸。
图11A显示对来自无丙二酸柠檬酸杆菌(Citrobacter amalonaticus)氨裂合酶蛋白表达的可溶和不可溶级分的SDS-PAGE分析。
图11B显示对来自假破伤风梭菌(Clostridium tetanomorphum)(I5)和米曲霉(Aspergillus oryzae)(I6)氨裂合酶蛋白表达的可溶和不可溶级分的SDS-PAGE分析。
图12显示对来自诺卡氏菌属物种羧酸还原酶基因表达的可溶和不可溶级分的SDS-PAGE分析。
图13显示由于通过诺卡氏菌CAR还原酶活性庚二酸、己二酸和苯甲酸到庚二酸半醛、己二酸半醛和苯醛的还原在吸光度中随时间的变化。苯甲酸被用作阳性对照，而具有携带空载体的生物催化剂的反应混合物为阴性对照。
图14显示对来自流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)YciA硫酯酶蛋白(I8)表达的可溶和不可溶级分的SDS-PAGE分析。
图15显示对氨基转移酶IlvE-Omega Vf融合物(pING2022)和IlvE-Ad优化的omega融合物(pING2030)蛋白的SDS-PAGE分析。
图16显示丙酮酸钠和7-氨基庚酸生物转化的结果，连同7-氨基庚酸底物和L-丙氨酸产物的测量浓度。
图17显示在48和96小时后6种生物转化中L-和D-2-氨基辛二酸对映异构体浓度的HPLC结果汇总。
图18显示对来自大肠杆菌GadA(I29)、大肠杆菌LysA(I30)、大肠杆菌GadA ilvE(I31)和大肠杆菌LysA ilvE(I32)蛋白表达的珠裂解的可溶和不可溶级分的SDS-PAGE分析。
图19显示来自2-氨基辛二酸脱羧的7-氨基庚酸的形成。
图20显示使用ClustalW算法的蛋白质比对，其显示MJ0277与comD(SEQID 41)/comE(SEQ ID 42)蛋白之间的显著同源性。
图21显示MJ0277对来自乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)的LACLA乙酰乳酸合酶(SEQ ID 43)的同源性。
图22显示对LACLA乙酰乳酸合酶、来自Methanocella paludicola的comD/comE和假定的乙酰乳酸合酶MJ0277中功能域的分析显示其均具有含硫胺磷酸结合位点的类似结构。
图23绘出pING2022载体图谱，其含有IlvE-Omega Vf融合基因。
图24绘出pING2030载体图谱，其含有IlvE-Ad优化的omega融合基因。
图25列出SEQ.ID 1-40。
图26描绘了通过Thermococcus kodakaraensis(41/42)的酸硫醇连接酶(EC6.2.1.5)、Acidominococcus fermentans(43/44)的CoA转移酶(EC 2.8.3.12)和来自门多萨假单胞菌(Pseudomonas mendocina(45))的酸-硫醇连接酶(EC6.2.1.14)从庚二酰-CoA形成庚二酸的条形图。
图27描绘了通过选定的烯酸还原酶从反式-2-己烯二酸(A)形成己二酸和从反式-2,3-二脱氢己二酰-CoA形成己二酰-CoA。
发明详述
一般地，本公开涉及用于生物合成性产生双官能或三官能C7链烷的方法和材料，所述双官能或三官能C7链烷可用作生产尼龙-7、尼龙-7,x和尼龙-x,7以及生产聚酯中的中间物。
在一些实施方案中，1种或多种(例如2种或更多种、3种或更多种、4种或更多种、5种或更多种、6种或更多种、7种或更多种、8种或更多种、9种或更多种、10种或更多种、11种或更多种、12种或更多种、13种或更多种、14种或更多种、15种或更多种、16种或更多种、17种或更多种、18种或更多种、19种或更多种、或20种或更多种)分离的酶(例如氨裂合酶、烯酸还原酶、氨基转移酶、CoA转移酶、硫酯酯酶(thioestesterase)、酸-硫醇连接酶、水裂合酶、羰基还原酶、硫酯酶、羧酸还原酶、脂肪-酰基CoA还原酶、ω-转氨酶、α-酮酸脱羧酶、催化α-酮酸链延伸的酶、酰基ACP合成酶、FatA(脂肪酰基ACP硫酯酶A)、FatB(脂肪酰基ACP硫酯酶B)、或酰基-[acp]还原酶)可用于生物合成性产生所述双官能或三官能C7链烷。这类酶可自表达编码所述酶的外源核酸的重组细胞或天然表达所述酶的非重组细胞分离。
在一些实施方案中，包含1种或多种(例如2种或更多种、3种或更多种、4种或更多种、5种或更多种、6种或更多种、7种或更多种、8种或更多种、9种或更多种、10种或更多种、11种或更多种、12种或更多种、13种或更多种、14种或更多种、15种或更多种、16种或更多种、17种或更多种、18种或更多种、19种或更多种、或20种或更多种；或甚至更多种)编码1种或多种(例如2种或更多种、3种或更多种、4种或更多种、5种或更多种、6种或更多种、7种或更多种、8种或更多种、9种或更多种、10种或更多种、11种或更多种、12种或更多种、13种或更多种、14种或更多种、15种或更多种、16种或更多种、17种或更多种、18种或更多种、19种或更多种、或20种或更多种；或甚至更多种)酶(例如一种或多种(如上文)的氨裂合酶、烯酸还原酶、氨基转移酶、CoA转移酶、硫酯酯酶(thioestesterase)、酸-硫醇连接酶、水裂合酶、羰基还原酶、硫酯酶、羧酸还原酶、ThnG、脂肪-酰基CoA还原酶、ω-转氨酶、α-酮酸脱羧酶、α-氨基酸脱羧酶、乙酰乳酸合酶、氨基水解酶、催化α-酮酸链延伸的酶、酰基-[acp]硫酯酶、酰基-ACP合成酶、BioW、醇脱氢酶、醇氧化酶、醛脱氢酶、醛氧化酶、FatA、FatB、或酰基-[acp]还原酶)的外源核酸的重组宿主，或从这类重组宿主或天然表达所述酶的非重组细胞制备的裂解物可用于生物合成性产生双官能或三官能C7链烷。重组宿主还可在一种或多种内源性酶中具有缺陷以使代谢中间物转向双官能或三官能C7链烷的产生。
如本文中描述的，生物合成性产生的双官能或三官能C7链烷可用于生产尼龙-7、尼龙-7,x、或尼龙-x,7、以及聚酯。术语“尼龙-7”是通过单体7-氨基庚酸的聚合作用或通过庚内酰胺的开环缩合产生的聚酰胺。尼龙-7也称为“聚庚酰胺(polyenanthamide)”或“聚庚酰胺(polyheptanamide)”。
术语“尼龙-x,7”指通过庚烷-1,7-二元酸(亦称为庚二酸或庚二酸酯)与二胺的聚合作用产生的聚酰胺家族。整数x指示庚烷-1,7-二元酸与之反应的二胺中的碳原子数。在一些实施方案中，整数x是大于3的整数，例如大于5、大于7、或大于9。例如，尼龙-5,7通过将庚烷-1,7-二元酸与1,5-戊二胺反应产生。尼龙7,7通过将庚烷-1,7-二元酸与1,7二氨基庚烷反应产生。
术语“尼龙-7,x”指通过七亚甲基二胺与二羧酸的聚合反应产生的聚酰胺家族。整数x指示七亚甲基二胺与之反应的二羧酸中的碳原子数。例如，尼龙-7,5通过七亚甲基二胺(亦称为1,7-二氨基庚烷或1,7-庚二胺)与戊烷-l,5-二元酸的反应产生。在一些实施方案中，整数x是大于3的整数，例如大于5、大于7、或大于9。
术语“聚酯”指在其主链中含有酯官能团的聚合物种类。聚酯可以是同型聚合物，例如通过己内酯的开环缩合产生的聚己内酯。共聚物聚酯通过多官能醇和酸的酯化缩合形成。例如，己二酸和乙二醇用于产生聚乙烯己二酸。庚二酸在这类共聚物中可替换己二酸使用。或者，7-羟基庚酸可用于产生聚庚醇内酯(polyenantholactone)。
现将以更多关于本文中描述的所述方案的细节来描述本发明的前述方面和其他方面。应领会本发明可以不同形式实施且不应解释为限制本文中列出的实施方案。更确切地，这些实施方案的提供使得本公开为全面且完整的，并将向本领域技术人员告知本发明的范围。
1.1 定义
本文发明描述中使用的术语学仅出于描述具体实施方案的目的，且不意图限制本发明。如在本发明实施方案的描述和所附权利要求中使用的，除非上下文另外清楚地指示，单数形式“一/一个/一种”和“该”还意图包括复数形式。而且，如本文中使用的，“和/或”意指并涵盖一种或多种所列关联项的任意和所有可能组合。除非另外定义，描述中使用的所有术语，包括技术和科学术语具有与本发明所属领域中普通技术人员普遍理解的相同的含义。
如本文中使用的，术语“酶”指能够催化反应的蛋白质催化剂。本文中该术语不仅指分离的酶，而且还包括表达该酶的宿主细胞。因此，通过酶C的A到B的转化还应理解为涵盖通过表达酶C的宿主细胞的A到B的转化。
如本文中使用的，术语“双官能C7链烷”指直链或支链、饱和或不饱和的具有7个碳原子和两个官能团的烃。所述官能团可置于沿烃链的任何点。在一些实施方案中，所述官能团位于烃链的末端(例如在每个末端各一个官能团)。该术语还意图涵盖环状化合物如庚内酰胺。例示性双官能C7链烷包括但不限于，庚二酰-CoA、庚二酰-[acp]、庚烷-l,7-二元酸(庚二酸或庚二酸盐)、7-氨基庚酸、7-羟基庚酸、七亚甲基二胺、1,7-庚二醇、7-氨基庚醇、7-氨基庚醛、庚内酰胺、庚二酸半醛(亦称为7-氧庚酸)、2-庚烯二酸和2-庚烯二酸-CoA。
如本文中使用的，术语“-酸酯(-oate)”和“-酸(-oic acid)”例如庚酸酯和庚酸可交换使用。此外，应理解“盐/酯(-ate)”、“-酸酯(-oate)”和“-酸(-oic acid)”可贯穿交换使用以指示处于其中性或离子化形式和所谓的“两性离子”形式中任一种的化合物。
如本文中使用的，术语“三官能C7链烷”指直链或支链、饱和或不饱和的具有7个碳原子和三个官能团的烃。所述官能团可置于沿烃链的任何点。在一些实施方案中，3个官能团中有两个位于烃的末端(例如在每个末端各一个官能团)。例示性三官能C7链烷包括但不限于，2-氧庚二酸盐(α-酮庚二酸盐)、2-氨基庚二酸盐(α-氨基庚二酸盐)、2-羟基庚二酸盐(α-羟基庚二酸盐)和2-羟基庚二酸盐-CoA(α-羟基庚二酸盐-CoA)。
如本文中使用的，术语“官能团”指胺基团、羧酸基团、醛基团、醇基团、辅酶A基团或酮基团。术语“胺基团”指-NH2基。术语“羧酸基团”指-COOH基。术语“醛基团”指-C(O)H基。术语“醇基团”指-OH基。术语“酮基团”指C(O)基。
术语“辅酶A基团”指有机辅因子或辅基(酶的非蛋白部分)，其存在是形成活性酶系统的许多酶(脱辅基酶蛋白)的活性所需要的。辅酶A在特定浓缩酶中有功能，作用于乙酰或其他酰基基团转移和脂肪酸合成和氧化、丙酮酸氧化和其他乙酰化。
术语“acp”或“酰基载体蛋白”指从乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A挑出乙酰和丙二酰基团且通过缩合将其连接以形成β-酮酸酰基载体蛋白，并释放二氧化碳和该酰基载体蛋白的巯基形式的蛋白质(其通常在脂肪酸合成中有活性)。
双官能或三官能C7链烷上的官能团可以是相同或不同的：例如，在双官能C7链烷的一些实施方案中，两个官能团可以均为胺基团，两个官能团可以均为羧酸基团，或两个官能团可以均为醇基团。
在一些实施方案中，双官能C7链烷上的一个官能团是胺基团而另一个是羧酸基团。在一些实施方案中，双官能C7链烷上的一个官能团是醇基团而另一个是羧酸基团。在一些实施方案中，双官能C7链烷上的一个官能团是醇基团而另一个是胺基团。
在三官能C7链烷的一些实施方案中，两个官能团是羧酸基团而一个官能团是酮基团或羟基基团或氨基基团。
术语“异源”用于本文指并非源自与宿主细胞相同物种的细胞的任何核酸或多肽。因此，如本文中使用的，“同源”核酸或蛋白质是那些存在于与宿主细胞相同物种的细胞中或由其产生的核酸或蛋白质。
如本文中关于核酸和具体宿主细胞使用的，术语“外源”指不像自然界中发现的存在于具体细胞中(且不能从中获得)的任何核酸。如此，非天然存在的核酸一旦导入宿主细胞即视为对该宿主细胞外源的。重要的是注意非天然存在的核酸可含有在自然界中发现的核酸序列的核酸子序列或片段，只要该核酸作为整体不存在于自然界中。例如，表达载体内含有基因组DNA序列的核酸分子是非天然存在的核酸，如此一旦导入宿主细胞即视为对该宿主细胞为外源的，因为该核酸分子作为整体(基因组DNA加载体DNA)不存在于自然界中。如此，作为整体不存在于自然界中的任何载体、自主复制的质粒或病毒(例如逆转录病毒、腺病毒、或疱疹病毒)视为非天然存在的核酸。由此通过PCR或限制内切酶处理产生的基因组DNA片段以及cDNA也视为非天然存在的核酸，因为它们作为未见于自然界的分开的分子存在。亦由此任何以未见于自然界中的排布含有启动子序列和多肽编码序列(例如cDNA或基因组DNA)的核酸分子也是非天然存在的核酸。天然存在的核酸可以是对具体细胞外源性的。例如，从酵母x的细胞分离的完整染色体一旦将该染色体导入酵母y的细胞中时即为酵母y细胞的外源性核酸。
从上文来看，“外源性”核酸可以是“同源”或“异源”核酸将是清楚的。相反，如本文中关于核酸或基因(或由核酸或基因编码的蛋白质)和具体细胞使用的术语“内源性”指如在自然界中发现的确实存在于具体细胞中(且可从中获得)的任何核酸或基因。
如本文中使用的，术语“重组宿主”指其基因组已通过至少外源性核酸序列扩大的宿主。这类核酸序列包括但不限于，不天然存在于宿主中的核酸(即异源核酸)、不正常转录成RNA或翻译成蛋白质(“表达”)的DNA序列、和期望导入非重组宿主中的其他核酸序列(例如改变具体核酸序列表达的调节区)。会领会本文中描述的重组宿主的基因组通常经由一种或多种外源核酸的稳定导入得到扩大。一般地，所述外源核酸原始不存在于作为DNA受体的宿主中(即它是异源核酸)，但从给定宿主分离核酸然后将该核酸的一个或多个额外拷贝导入相同宿主中，例如以增强编码产物的产生或改变核酸的表达模式，是在本发明范围内的。在一些情况下，外源核酸将修改或甚至替换内源基因或DNA序列，其通过例如同源重组或定点诱变。内源基因的修改或替换可导致特定编码产物例如酶的缺陷。合适的重组宿主记载于下文。重组宿主还可含有不包含在宿主细胞基因组中但附加存在(并复制，优选地)于细胞中的核酸。
如本文中使用的，“启动子”指使得基因能转录的DNA序列。启动子被RNA聚合酶识别，然后该酶启动转录。如此，启动子含有由RNA聚合酶直接结合或涉及RNA聚合酶招募的DNA序列。启动子序列还可包含“增强子区”，其为可由蛋白质(即反式作用因子，很大程度上像一组转录因子)结合以增强基因簇中基因转录水平(得名由来)的一个或多个DNA区。通常在编码区5’端的增强子也可与启动子序列分开，且可以例如位于基因的内含子区中或在基因编码区的3’。
如本文中使用的，“可操作连接”意指掺入遗传构建体中从而使得表达控制序列有效控制感兴趣编码序列的表达。
1.2 给料
多种不同给料可用于产生二或三官能链烷。在一些实施方案中，使重组宿主细胞或从细胞(例如重组宿主细胞)制备的裂解物与可再生给料接触以产生双官能或三官能C7链烷如7-氨基庚酸。可用作碳源的可再生给料的例子包括但不限于，纤维素给料、植物源的糖类和脂肪酸。在一些实施方案中，重组宿主细胞接触的给料是葡萄糖、蔗糖、木糖、脂肪酸或甘油。
除了可再生给料(如上文所列的)以外，可将重组宿主细胞修饰为在作为碳源的合成气(亦称为SynGas)上生长。在这一具体的实施方案中，将本发明的重组宿主细胞工程化以提供用于利用合成气或其他气体碳源来产生双官能或三官能C7链烷的有效代谢途径。
另外，可以使本文中描述的重组宿主或从重组宿主细胞制备的裂解物与芳香烃给料接触。芳香烃给料代替可再生给料的使用提供了一种将这类石油源材料转化成对环境更有益的化合物的方式，从而降低环境影响。合适的芳香烃给料的例子包括但不限于，甲苯、苯、苯酸和莽草酸(shikimate)。
1.3. 包括酶催化步骤的到双官能C7链烷的路径
如上所述，本发明的实施方案涉及用于在存在一种或多种分离的酶、存在表达该酶/那些酶的重组宿主细胞、或存在表达该酶的细胞(例如重组细胞)的细胞裂解物(或部分纯化的裂解物)的情况下产生双官能或三官能C7链烷的方法。在一些实施方案中，双官能或三官能C7链烷的产生开始于庚二酸盐或庚二酰-CoA或庚二酰-[acp]，且经由通用中间物即庚二酸半醛进行。具体地，在一些实施方案中，本发明涉及一种产生双官能C7链烷7-氨基庚酸的方法，其通过使用催化庚二酸半醛到7-氨基庚酸的半醛氨基化的酶。见图1。可以使用半醛氨基转移酶如ω-转氨酶。例示性ω-转氨酶包括但不限于分类在EC 2.6.1下的转氨酶，如EC 2.6.1.18；EC 2.6.1.19；2.6.1.1；EC 2.6.1.13；EC 2.6.1.48；和EC 2.6.1.62。在一些实施方案中，所述氨基转移酶是分类在EC 2.6.1.18中的β-丙氨酸氨基转移酶，其来自V.fluvialis、B.weihenstephanensis、铜绿假单胞菌(P.aureginosa)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、或丁香假单胞菌(P.syringae)。参见WO2011/031147，其通过提述完整并入本文。
在一些实施方案中，7-氨基庚醛可使用催化7-氨基庚酸到7-氨基庚醛的醛脱氢的酶产生。见图1。可使用分类在EC 1.2.1下的醛脱氢酶，如EC 1.2.1.4或EC 1.2.1.63从7-氨基庚酸产生7-氨基庚醛。所述醛脱氢酶/羧酸还原酶还可以是EC 1.2.99例如EC 1.2.99.6中的。所述羧酸还原酶也可以属于NAD依赖性非酰化醛脱氢酶，如鞘氨醇单胞菌属或贪铜菌属(Cupriavidus)物种的ThnG。
在一些实施方案中，七亚甲基二胺(亦称为1,7-二氨基庚烷)可从7-氨基庚醛产生，其使用催化氨基基团转移的酶。见图1。合适的氨基转移酶包括但不限于，EC 2.6.1中的氨基转移酶如EC 2.6.1.18；EC 2.6.1.19；EC 2.6.1.11；EC2.6.1.13；EC 2.6.1.39；EC 2.6.1.48；和EC 2.6.1.62。在一些实施方案中，所述氨基转移酶是分类在EC 2.6.1.18中的β-丙氨酸氨基转移酶，其来自V.fluvialis、B.weihenstephanensis、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、或丁香假单胞菌。参见WO2011/031147，其通过提述完整并入本文。
在一些实施方案中，庚内酰胺可使用催化7-氨基庚酸的酰胺水解的酶从7-氨基庚酸产生。见图1。可使用合适的酰胺水解酶包括分类在EC 3.5.2如EC3.5.2.12或EC 3.5.2.11下的酰胺转移酶。
在一些实施方案中，7-羟基庚酸自庚二酸半醛产生或7-氨基庚醇自7-氨基庚醛产生，其使用催化醛还原的酶。见图1。例如，可使用分类在EC 1.1.1如EC 1.1.1.2或EC 1.1.1.21下的醇脱氢酶。本领域中技术人员会理解存在非常多的具有广泛底物范围的醇脱氢酶，且来自EC 1.1.1.-如1.1.1.B3或EC1.1.1.B4或1.1.1.79，或在EC 1.1.99如1.1.99.2或EC 1.1.99.6中的其他脱氢酶也可以用于将醛还原成相应的醇。或者，可以使用醇氧化酶。所述醇氧化酶可以在EC 1.1.3.13类中。
在一些实施方案中，1,7庚二醇可自7-羟基庚酸产生，其使用醛脱氢酶和醇脱氢酶。合适的醛脱氢酶可以使分类在EC 1.2.1(例如EC 1.2.1.4或EC1.2.1.63或EC 1.1.1.21)下的。见图1。合适的醇脱氢酶可以是分类在E.C.1.1.1.如EC 1.1.1.1或EC 1.1.1.2下的。本领域中技术人员会理解存在非常多的具有广泛底物范围的醇脱氢酶，且来自EC 1.1.1.-如1.1.1.B3或EC 1.1.1.B4，或1.1.1.79，或在EC 1.1.99如1.1.99.2或EC 1.1.99.6中的其他脱氢酶也可以用于将醛还原成相应的醇。或者，可以使用醇氧化酶。所述醇氧化酶可以在EC1.1.3.13类中。类似地，存在非常多数量的具有广泛底物特异性的醛脱氢酶或羧酸还原酶。适宜的醛脱氢酶包括EC 1.2.1.3:EC 1.2.1.4；和EC 1.2.1.63。所述醛脱氢酶/羧酸还原酶还可以在EC 1.2.99例如EC 1.2.99.6中。所述醛脱氢酶/羧酸还原酶还可以属于NAD依赖性非酰化醛脱氢酶，如鞘氨醇单胞菌属或贪铜菌属物种的ThnG。或者，可以使用醛氧化酶，如来自EC 1.2.3.1的醛氧化酶。
在其中C7二或三官能烷可能对宿主有毒性(例如半醛如7-氧庚酸或7-氨基庚醛)的实施方案中，对毒性化合物的转化可以在体外实施，其使用分离的酶或来自重组宿主的裂解物。在一些实施方案中，毒性化合物由宿主产生，然后转化(使用分离的酶、表达酶的重组宿主、或化学转化)成庚内酰胺。
1.5 庚二酸和/或庚二酰-CoA的生物合成途径
庚二酸和/或庚二酰-CoA可经由许多不同的方式获得，包括：(i)从α-酮酸链延伸途径产生的α-酮辛二酸，或(ii)生物素生物合成途径I；(iii)生物素生物合成途径II；(iv)三个丙二酰-CoA分子到单个庚二酰-CoA分子的缩合；(v)苯甲酸降解途径；(vi)环己烷羧酸酯途径，(vi)D,L-二氨基庚二酸途径；和(vii)其中起始碳源是巴豆酸酯(crotonate)的生物合成途径。见图2。这些到庚二酸和/或庚二酰-CoA的途径在下文以更多细节描述。
在其中任一种途径中，庚二酸可从庚二酰-CoA产生，其使用催化硫酯水解的酶。例如，能水解硫酯的酶包括但不限于，硫酯酶、酸-硫醇连接酶和CoA转移酶。合适的硫酯酶包括分类在EC 3.1.2中的硫酯酶，如YciA,tesB或Acot13；EC 3.1.2.2的基因产物；EC 3.1.2.18；EC 3.1.2.19；或EC 3.1.2.20。作用于酰基-[acp]硫酯的硫酯酶包括EC 3.1.2.14，如FatA、FatB；和EC 3.1.2.21。例如，可使用以下一种酶：分类在EC 3.1.2中的硫酯水解酶/酰基-CoA硫酯酶如EC 3.1.2.19和3.1.2.18中的ADP依赖性中等链酰基-CoA水解酶、EC 3.1.2.20中的酰基CoA水解酶；或YciA,tesB或Acot13的基因产物；EC 3.1.2.14中的油酰-[酰基载体蛋白]水解酶。合适的酸-硫醇连接酶包括分类在EC 6.2.1中的酸-硫醇连接酶，如EC 6.2.1.3；EC 6.2.1.14；和EC 6.2.1.23。合适的CoA转移酶包括分类在EC 2.8.3下的CoA转移酶如EC 2.8.3.6、EC 2.8.3.8、EC 2.8.3.12；EC2.8.3.13或EC 2.8.3.14，或ThnH的基因产物，其催化CoA到庚二酸的可逆转移。
庚烷-1,7-二元酸可从庚二酰-[acp]获得，其通过使用作用于[acp]-硫酯的酶，如EC 3.1.2.14中的酰基-[acp]硫酯酶，如fatA和fatB或EC 3.1.2.21。或者，可以使用作用于[acp]硫酯的酸-硫醇连接酶，如EC 6.2.1.14和EC 6.2.1.20。
或者，庚二酸可从庚二酰-[acp]甲基酯获得，其通过由AaasaS(酰基-ACP合成酶)水解酯键，接着通过脂肪酶/酯酶除去甲基基团。
庚二酸可转化成庚二酸半醛，其使用催化羧酸还原的酶。合适的还原酶包括但不限于，分类在EC 1.2.99中的羧酸还原酶；该羧酸还原酶还可以属于NAD依赖性非酰化醛脱氢酶，如鞘氨醇单胞菌属或贪铜菌属物种中的ThnG；或分类在EC 1.2.1如EC 1.2.1.3；EC 1.2.1.10；EC 1.2.1.22；EC 1.2.1.50；EC1.2.1.57；和EC 1.2.1.76中的脂肪酰基CoA还原酶。在一些实施方案中，脂肪-酰基-CoA还原酶可直接将庚二酰-CoA或庚二酰-[acp]转化成庚二酸半醛。EC 1.2.99中的例示性羰基还原酶包括但不限于来自诺卡氏菌物种(Aimin等,Appl.Environ.Microbiol.70:1874-1881(2004)，通过提述并入)或灰色链霉菌(S.griseus)(Suzuki等,J.Antibiot.(Tokyo)60:380-387(2007)，通过提述并入)的EC1.2.99.6。EC 1.2.1中的例示性脂肪-酰基CoA还原酶包括但不限于来自例如C.aurantiacus(Hugler,M,等,J.Bacteriology 184:2404-2410(2002)，通过提述并入)、M.sedula(Kockelkorn,D.和Fuchs,G.,J.Bacteriology 191:6352-6362(2009)，通过提述并入)、或S.tokodai(Alber,B.等,J.Bacteriology 188:8551-8559(2006)，通过提述并入)的EC 1.2.1.75；和来自以下的1.2.1.50：例如不动杆菌属物种A.platyrhynchos(Ishige,T.,等,Appl.Envtl Microbiology 68:1192-1195(2002)，通过提述并入)、拟南芥(A.thaliana)(Doan,T.T.,等,JournalPlant Physiology 166:787-796(2009)和Hooks,M.A.,等,Plant J.20:1-13(1999)，两者均通过提述并入)；人(Homo sapiens)(McAndrew,R.P.等,J.Biol.Chem.283:9435-9443(2008)，通过提述并入)、小家鼠(M.Musculis)、P.leiognathi、明亮发光杆菌(P.phosphoreum)、豌豆(P.sativum)、或S.chinesis的1.2.1.50。EC1.2.1中的例示性酰基-[acp]还原酶包括EC 1.2.1.80，来自例如Synecoccuselongates(Shirmer,A.等,(2010).Microbila biosynthesis of alkanes.Science,329(5991:559-562)。
1.5.1  α-酮酸链延伸
二官能链烷可从α-酮戊二酸产生，其经由本领域中已知的到α-酮己二酸、α-酮庚二酸或α-酮辛二酸的连续链延伸反应。参见例如图3和WO2010/068944。α-酮二元酸(Cn，n＝5-8)或相应2-氨基二元酸的脱羧然后提供Cn-1例如C4-7的α,ω-双官能烷的前体。这些连续的alpha-酮酸链延伸反应发生在辅酶B生物合成途径中，如在产甲烷细菌如詹氏甲烷球菌(Methanocaldococcus jannaschii)、沃氏甲烷球菌(Methanococcus voltae)和嗜热甲烷八叠球菌(Methanosarcina thermophila)中阐明的。
从α-酮戊二酸(C5)到α-酮辛二酸的3轮连续的链延伸由在底物上作用3次的3个相同酶催化(且在EC 4.2.1.114(AksD(3-异丙基苹果酸脱水酶大亚基)/AksE(3-异丙基苹果酸脱水酶小亚基))的情况中6次)，每次增加链长度。见图3。这些酶包括但不限于：EC 2.3.3.14：高柠檬酸合酶/AksA(alpha-异丙基苹果酸合酶)，其作用于α-酮戊二酸、α-酮己二酸和α-酮庚二酸；EC4.2.1.114：高顺乌头酸酶或AksD/AksE，其催化(R)-高柠檬酸、二高柠檬酸和三高柠檬酸的脱水反应，以及顺式-高乌头酸、顺式-(高)2乌头酸和顺式-(高)3乌头酸的水合反应；和EC 1.1.1.87：高异柠檬酸脱氢酶或AksF(多功能3-异丙基苹果酸脱氢酶/D-苹果酸脱氢酶)，其催化高异柠檬酸、苏型-异(高)2柠檬酸和苏型-异(高)3柠檬酸的NAD(P)+依赖性氧化性脱羧。
例示性AksA酶包括但不限于，EC 2.3.3中的那些，如EC 2.3.13或2.3.3.14。例示性AksD酶包括EC 4.2.1中的那些，如EC 4.2.1.36。例示性AksF酶包括但不限于EC 1.1.1中的酶，如EC 1.1.1.87。
在一些实施方案中，所述链延伸酶是AksA MTH1630、AksD MTH1631、AksE MTH0829或AksF MTH1388。参见，例如WO2010/104391，其通过提述并入本文。
该途径的优点在于其仅需要这3种异源蛋白质在宿主中的重组表达。从α-酮戊二酸到α-酮己二酸的链延伸还发生在古细菌，包括Aeropyrum pernix、Deinococcus radiodurans、Pyrococcus abyssi、Pyrococcus horikoshii、硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobus solfataricus)、Sulfolobus tokodaii和嗜热栖热菌(Thermusthermophilus)的赖氨酸生物合成V途径中；以及酵母和真菌包括Euglenagracilis、曲霉属、产黄青霉(Penicillium chrysogenum)和酿酒酵母的赖氨酸生物合成IV途径中。
在赖氨酸生物合成IV和V途径中，从α-酮戊二酸到α-酮己二酸的反应由4种酶的连续作用催化，即：EC 2.3.3.14：高柠檬酸合酶(hcs/LYS20/LYS21/nifV)；EC 4.2.1.114：产甲烷菌HACN；EC 4.2.1.36：高顺乌头酸酶水合酶；和EC 1.1.1.87-高异柠檬酸脱氢酶(hicDH或LYS12)。
1.5.3  丙二酰-CoA缩合途径
在一些实施方案中，丙二酰-CoA可用作庚二酰-CoA的来源，因为某些生物能将3个丙二酰-CoA分子缩合成单个庚二酰-CoA分子。见图4。亦参见Lin,S.和Cronan,J.E.,Molecular Biosystems 7:1811-21(2011)，其通过提述并入本文。因此，可产生一种其中从丙二酰-CoA生成庚二酰-CoA的重组宿主。在一些实施方案中，宿主细胞是无色杆菌属(Achromobacter)以外的生物体。在一些实施方案中，庚二酰-CoA可随后转化成庚二酸或其他双官能C7链烷。
1.5.4  生物素生物合成途径I(革兰氏阴性细菌)和II(革兰氏阳性细菌)
在一个实施方案中，重组宿主细胞从源自甘油和/或脂肪酸的乙酰-CoA产生庚二酸和/或庚二酰-[acp]或庚二酰-CoA。参见，例如Lin,S.,Nature Chem.Biol.6:682-688(2010)；和Cronan,J.E.和Lin,S.,Current Opinion in Chem.Biology 15:1-7(2011)，两者均通过提述并入本文。图5显示通过枯草芽孢杆菌中的BioI经由对长链脂肪酸-[acp]硫酯的氧化性切割形成庚二酰-[acp]，其被转化成作为生物素生物合成II(革兰氏阳性细菌)中前体的庚二酸或庚二酰-CoA。图6显示在生物素生物合成I(革兰氏阴性细菌)中形成庚二酰-[acp]或其甲基酯。图6还显示用于将庚二酰-[acp]甲基酯转化成庚二酸单甲基酯的途径。然后，庚二酸单甲基酯在存在例如EC 3.1.1.中的脂肪酶的情况下转化成庚二酸(庚烷-1,7-二元酸)。图6还显示在存在酯酶(例如EC 3.1.1如EC 3.1.1.85中的酶，BioH)的情况下庚二酰-[acp]甲基酯到庚二酰-[acp]的转化。庚二酰-[acp]然后在存在酰基-[acp]-硫酯酶，例如EC 3.1.2.14中的酶如FatA或FatB的情况下被转化成庚二酸(庚烷-1,7-二元酸)。在一些实施方案中，本发明涵盖能产生庚二酸(庚烷-1,7-二元酸)的重组宿主细胞，其包含图6中显示的一种或所有酶。在一些实施方案中，所述重组宿主细胞在7-酮-8-氨基壬酸合成酶中确实具有缺陷，该酶是一种能将6-羧基己酰基-CoA(庚二酰-CoA)转化成7-酮-8-氨基壬酸(KAPA)的酶，且由具有天然生物素生物合成途径的宿主生物中的BioF基因编码，从而使得庚二酰-CoA不能穿梭到生物素生物合成中。
庚二酰-[acp]甲基酯还可作为长链酰基-[acp]和/或游离脂肪酸通过BioI(例如来自枯草芽孢杆菌的BioI)的代谢的结果产生。
1.5.5  真核生物素生物合成途径
庚二酸和/或庚二酰-CoA还可从真核的生物素生物合成途径获得。参见，例如Roje,S.,Phytochemistry 68:1904-1921(2007)；和Charles R.Hall,TheContribution of Horizontal Gene Transfer to the Evolution of Fungi(May 10,2007)(未公开出版的博士论文，Duke University)(存档在Duke UniversityLibraries)，两者均通过提述并入本文。在真核途径中，乙酰-CoA被生物转化成乙酰乙酰CoA，其使用分类在EC 2.3.1.9下的酶；乙酰乙酰-CoA被生物转化成(S)-3-羟基丁酰-CoA，其使用分类在E.C.1.1.1.157下的酶；(S)-3-羟基丁酰-CoA被生物转化成巴豆酰-CoA，其使用分类在EC 4.2.1.17下的酶；巴豆酰-CoA被生物转化成戊烯二酰-l-CoA，其使用分类在EC 4.1.1.70下的酶；戊烯二酰-l-CoA被生物转化成戊二酰-CoA，其使用分类在EC 1.3.99.7下的酶；戊二酰-CoA被生物转化成3-酮庚二酰-CoA，其使用分类在EC 2.3.1.43下的酶；3-酮庚二酰-CoA被生物转化成3-羟基庚二酰-CoA，其使用分类在EC1.1.1.4259下的酶；3-羟基庚二酰-CoA被生物转化成2,3-二脱氢-庚二酰-CoA，其使用分类在EC 4.2.1.-下的酶，而2,3-二脱氢-庚二酰-CoA被生物转化成庚二酰-CoA，其使用分类在EC 1.3.1.62下的酶。庚二酰-CoA随后转化成庚二酸。
如此，在一些实施方案中，本发明提供一种重组宿主细胞，其包含用于将乙酰CoA转化成庚烷-1,7-二元酸的酶。在一些实施方案中，所述重组宿主细胞在7-酮-8-氨基壬酸合成酶中具有缺陷，该酶是一种能将6-羧基己酰基-CoA(庚二酰-CoA)转化成7-酮-8-氨基壬酸(KAPA)的酶，且由宿主(如果宿主生物具有天然生物素生物合成途径)中的BioF基因编码，从而使得庚二酰-CoA或庚二酰-[acp]不能穿梭到生物素生物合成中。在一些实施方案中，将BioI过表达以增加经由脂肪酸-[acp]酯的氧化性切割形成的庚二酰-[acp]。在一些实施方案中，[acp]-转移酶/合成酶活化长链脂肪酸到其相应[acp]-硫酯以通过BioI切割在宿主细胞中过表达。本发明的实施方案还提供一种产生庚烷-1,7-二元酸的方法，其包括使用这类重组宿主细胞。
1.5.6  苯甲酰-CoA降解途径
本文中涵盖的庚二酰-CoA和/或庚二酸的一个另外的来源是图7中显示的苯甲酸降解途径。参见，例如Bernsteinb,J.R.,等,Metabolic Eng'g 10:131-140(2008)；Harwood,C.S.,等,FEMS Microbiology Reviews 22:439-458(1999)；和Harrison,F.H.和Harwood,C.S.,Microbiology 151:727-736(2005)，其均通过提述并入本文。许多转化例示在图7中，其中苯甲酸使用分类在EC6.2.1.25下的酶转化成苯甲酰-CoA，并最后转化成庚二酰-CoA。苯甲酰-CoA转化成环己-1,5-二烯羰基CoA，其使用分类在EC 1.3.99.15下的酶。在一些实施方案中，环己-l,5-二烯羰基CoA生物转化成6-羟基环己-l-烯-l-羧基-CoA，其使用分类在EC 4.2.1.100下的酶；6-羟基环己-l-烯-l-羧基-CoA生物转化成6-酮氧基环己-l-烯-l-羧基-CoA，其使用分类在EC 1.1.1-下的酶；6-酮氧基环己-l-烯-l-羧基-CoA生物转化成3-羟基庚二酰-CoA，其使用分类在EC 3.7.1.-下的酶；3-羟基庚二酰-CoA生物转化成6-羧基己-2-烯酰-CoA，其使用分类在EC4.2.1.-下的酶；3-羟基庚二酰-CoA生物转化成庚二酰-CoA，其使用分类在EC1.3.1.62下的酶。相应地，庚二酰-CoA转化成庚二酸(庚烷-1,7-二元酸)。在一些实施方案中，环己-l,5-二烯羰基CoA生物转化成环己-l-烯-l-羧基-CoA，环己-l-烯-l-羧基-CoA生物转化成2-羟基环己烷-l-羧基CoA，其使用分类在EC4.2.1.-下的酶；2-羟基环己烷-l-羧基CoA生物转化成2-酮环己烷-l-羧基-CoA，其使用分类在E.C.1.1.1.-下的酶，而2-酮环己烷羧基-CoA生物转化成庚二酰-CoA，其使用分类在EC 3.1.2.-下的酶(例如一种酮环己烷羧基-CoA水解酶Rp-badl，分类在EC 3.1.2.-下的酶)。
在一些实施方案中，所述能产生庚烷-1,7-二元酸的重组宿主细胞包含一种或多种在图7或本部分中列出的酶。
1.5.7  2,6-二氨基庚二酸途径
庚二酸的又一种来源是D,L二氨基庚二酸，亦称为2,6-二氨基庚二酸。D,L-二氨基庚二酸是赖氨酸产生中的中间物。在一些实施方案中，内源性赖氨酸途径可修改为优先产生庚二酸，其通过创造出在二氨基庚二酸脱羧酶中具有缺陷的重组宿主细胞。见例如图10。D,L二氨基庚二酸可生物转化成不饱和的单氨基庚二酸，其通过催化D,L二氨基庚二酸到6-氨基-2-庚烯二元酸的还原性脱氨基化的酶。催化D,L二氨基庚二酸的还原性脱氨基化的酶例子包括分类在EC 4.3.1中的氨裂合酶，如EC 4.3.1.1；EC 4.3.1.2；EC 4.3.1.3；EC 4.3.1.9；EC 4.3.1.12；EC 4.3.1.13；EC 4.3.1.14；EC 4.3.1.23；和EC 4.3.1.24。在一些实施方案中，所述氨裂合酶是分类在EC 4.3.1.2下的甲基天冬氨酸氨裂合酶，其来自无丙二酸柠檬酸杆菌、C.tetanomorphum或米曲霉(A.oryzae)。参见，例如Botting,Biochemistry 27:2953-2955(1988)；和Kato,Appl Microbiol.BiotechnoL 50:468-474(1998)，其通过提述完整并入本文。
6-氨基-2-庚烯二酸可生物转化成2-氨基-2-庚烯二酸，其使用催化6-氨基-2-庚烯二酸到2-氨基-2-庚二酸(亦称为2-氨基庚二酸或alpha氨基庚二酸盐)的烯酸还原的酶。催化6-氨基-2-庚烯二酸的烯酸还原的酶例子包括分类在EC1.3.1中的烯酸还原酶，如EC 1.3.1.8；EC 1.3.1.9；EC 1.3.1.10,EC 1.3.1.31；EC1.3.1.38；EC 1.3.1.39；EC 1.3.1.44，或EC 1.3.1.62中的庚二酰-CoA脱氢酶如PimC/PimD或ThnJ/ThnK。所述烯酸还原酶还可以在EC 1.3中，如EC 1.3.8.1或EC 1.3.99.3；EC 1.3.99.B10或Syntrophus aciditrophicus 2,3-二脱氢庚二酰-CoA还原酶及其同源物。在一些实施方案中，所述烯酸还原酶是EC 1.3.1.31中的YqjM或OPR1/3，其分别来自枯草芽孢杆菌或L.esculentum。参见，例如Stueckler,Org.Lett.9:5409-5411(2007)；Kitzing,J.Biol.Chem.280:27904-27913(2005)；Hall,Angew.Chem.Int.Ed.46:3934-3937(2007)；和Breithaupt,Proc.Natl.Acad.Sci USA 103:14337-14342(2006)，其通过提述完整并入本文。
2-氨基庚二酸可转化成相应的2-庚烯二酸(亦称为2,3-二脱氢庚二酸)，其通过催化2-氨基庚二酸的还原性脱氨基化的酶。催化2-氨基庚二酸的还原性脱氨基化的酶例子包括分类在EC 4.3.1中的氨裂合酶，如EC 4.3.1.1；EC4.3.1.2；EC 4.3.1.3；EC 4.3.1.9；EC 4.3.1.12；EC 4.3.1.13；EC 4.3.1.14；EC4.3.1.23；或EC 4.3.1.24，如上文描述的。
2-庚烯二酸可转化成2-庚烯二酸CoA，其使用CoA转移酶(例如，分类在EC2.8.3如EC 2.8.3.12或EC 2.8.3.13或EC 2.8.3.14中的CoA转移酶或催化CoA到庚二酸的可逆转移的ThnH的基因产物)和酸硫醇连接酶(例如分类在EC6.2.1如EC 6.2.1.3；EC 6.2.1.5；EC 6.2.1.14；或EC 6.2.1.23中的酸-硫醇连接酶)。
然后，将2-庚烯二酸CoA转化成庚二酸-CoA，其通过催化2-庚烯二酸的烯酸还原的酶，如分类在EC 1.3.1.中的烯酸还原酶。庚二酸-CoA可如上文所述转化成庚二酸或庚二酸半醛。
如图10和图3中显示的，α酮庚二酸还可进行1轮链延伸成为α-酮-辛二酸，其其使用链延伸酶如存在于产甲烷细菌(例如Methanobacteriumautotrophicum)中的那些。这类链延伸酶包括但不限于AksA、AksD和AksE或F，如上文论述的。例示性AksA酶包括但不限于EC 2.3.3.中的那些。EC 2.3.3中的例示性酶包括但不限于EC 2.3.13或2.3.3.14。例示性AksD酶包括EC4.2.1.中的那些。EC 4.2.1中的例示性酶包括但不限于EC 4.2.1.36。例示性AksF酶包括但不限于EC 1.1.1.中的酶。EC 1.1.1中的例示性酶包括但不限于EC1.1.1.87。而且在此情况下，第四组酶包括脱羧酶。例示性脱羧酶包括EC 4.1.1.中的那些。EC 4.1.1中的例示性脱羧酶包括但不限于EC 4.1.1.11；EC 4.1.1.15；EC 4.1.1.17；EC 4.1.1.18；EC 4.1.1.19；EC 4.1.1.20和EC 4.1.1.86。
在一些实施方案中，乙酰-CoA可供给到三羧酸(TCA)循环中，其中乙酰-CoA转化成琥珀酸(l,4-丁二酸)。然后，琥珀酸从TCA循环转移到用于合成庚二酸的途径中，其开始于2-氧戊二酸到2-羟基-l,2,4-丁烷三羧酸(高柠檬酸)(例如通过EC 2.3.3.14中的酶)的生物转化；高柠檬酸到高顺式乌头酸和高顺式乌头酸到高异柠檬酸的生物转化，其使用分类在EC 4.2.1.36下的酶；高异柠檬酸到草酰戊二酸的生物转化，其使用分类在EC 1.1.1.87下的酶；草酰戊二酸到2-氧己二酸的生物转化，其使用分类在EC 1.1.1.87下的酶；和2-氧己二酸到戊二酰-CoA的生物转化，其使用分类在EC 1.2.4.2下的酶。戊二酰-CoA可转化成庚二酰-CoA，如上文论述的。最后，高柠檬酸转化成庚二酰-CoA，然后转化成庚二酸，如本文中描述的。
α-酮-辛二酸可被α-酮酸脱羧酶脱羧以形成庚二酸半醛，或使用氨基酸转氨酶转化成α-氨基辛二酸，其在通过α-氨基酸脱羧酶脱羧时将直接产生7-氨基庚酸。或者，所述庚二酸半醛可使用ω-转氨酶转化成7-氨基庚酸。例示性α-酮酸脱羧酶包括EC 4.1.1中的那些，如EC 4.1.1.1；EC 4.1.1.7；和EC 4.1.1.72，或EC 2.2.1.6类中的乙酰乳酸合酶。
例示性α-氨基酸脱羧酶包括EC 4.1.1.11；EC 4.1.1.15；EC 4.1.1.17；EC4.1.1.18；EC 4.1.1.19；EC 4.1.1.20；EC 4.1.1.45和EC 4.1.1.86中的那些。在一些实施方案中，所述脱羧酶包括EC 4.1.1.1中的来自乳酸乳球菌的酮异戊酸脱羧酶kivD；EC4.1.1.7中的来自恶臭假单胞菌(P.putida)的苯甲酰甲酸脱羧酶mdIC A460I或BFD；EC 4.1.1.1中的来自酿酒酵母的丙酮酸脱羧酶同工酶1和2Pdcl；来自运动发酵单胞菌的丙酮酸脱羧酶Pdc(I472A)；或EC 4.1.1.72中的来自乳酸乳球菌的支链alpha-酮酸脱羧酶kdcA，如记载于WO2011/031147的，其通过提述完整并入本文。例示性氨基酸转氨酶包括EC2.6.1中的那些，如EC 2.6.1.21；EC 2.6.1.39；EC 2.6.1.42；和EC 2.6.1.67。例示性ω-转氨酶包括EC 2.6.1中的那些，如EC 2.6.1.11；EC 2.6.1.13；EC 2.6.1.18；EC 2.6.1.19；EC 2.6.1.48；和EC 2.6.1.62。
在一个实施方案中，可使α酮庚二酸与一种或多种催化到α羟基庚二酸的酮还原的酶(例如羰基还原酶如EC 1.1.1.184)接触，其相应地可使用催化CoA转移的酶(例如上述CoA转移酶)转化成α-羟基庚二酸CoA。α-羟基庚二酸CoA可转化成2-庚烯二酸CoA，其使用催化α-羟基庚二酸-CoA脱水的酶(例如分类在EC 4.2.1下的水裂合酶如EC 4.2.1.2、4.2.1.17；EC 4.2.1.18；EC EC 4.2.1.59和EC 4.2.1.61)。2-庚烯二酸CoA可转化成庚二酸CoA，其使用催化2-庚烯二酸CoA的烯酸还原的酶。在上文描述了合适的烯酸还原酶。
在一些实施方案中，本发明提供一种重组宿主细胞，其包含将D,L-二氨基庚二酸优先转化成庚二酸所需的一种或多种酶。
1.5.8 巴豆酸酯途径
庚二酰-CoA的来源以及最终庚二酸的来源是其中起始碳源是巴豆酸酯的生物合成途径。该生物合成途径例示于图9。参见，例如Mouttaki,H.,等,Applied Envtl.Microbiology 73:930-938(2001)。巴豆酸酯分解成乙酰-CoA。已报告图9所示生物合成途径中产生的2/3的乙酰-CoA被转化成乙酸。在一些实施方案中，本发明提供一种重组宿主细胞，其在会将乙酰-CoA转化成乙酸的酶(例如磷酸乙酰转移酶和乙酸激酶)中有缺陷，从而使得乙酰-CoA在图9所示许多代谢步骤中被转化成乙酰乙酰-CoA，然后转化成戊烯二酰-CoA。然后戊烯二酰-CoA被转化成戊二酰-CoA。戊二酰-CoA经过链延伸以形成3-氧庚二酰-CoA。在还原、脱水和第二次还原后，获得庚二酰-CoA。
在图9所示生物合成途径中，庚二酰-CoA最终被转化成环己烷羧酸。这类生物合成途径已在S.aciditrophicus中观察到。如此，在一些实施方案中，本发明提供一种重组宿主细胞，其中编码会将庚二酰-CoA转化成环己-1-烯-l-羧基-CoA并最终转化成环己烷羧酸的酶被“敲除”，从而使得代谢途径在庚二酰-CoA终止。
1.5.9  萘满(Tetralin)降解途径
在一些实施方案中，使用来自鞘氨醇单胞菌和棒状杆菌物种的萘满(苯环己烷)降解途径产生庚二酸半醛。7-氧庚酸作为Sphingomonas macrogolitabid中萘满降解途径的中间物产生。López-Sánchez,A.,等,Appl.Environ.Microbiol.76:110-118(2010)。萘满通过切割两个芳香环代谢，得到丙酮酸和庚二酸半醛。萘满(一种有机溶剂)是源自萘的复杂起始材料。萘目前自煤焦油产生，但已知用于萘合成的生物合成途径发生在白蚁、真菌和一些植物类型中。Chen,J.等,Nature 392:558-559(1998)；Daisy,B.H.,等,Microbiology 148:3737-3741(2002)；和Azuma,H.,等,Phytochemistry 42:999-1004(1996)。庚二酸半醛可转化成7-氨基庚酸或7-羟基庚酸，如上文论述的。
1.11 来自2-氧庚二酸的六亚甲基二胺
本发明的一些实施方案还提供一种从2-氧庚二酸产生六亚甲基二胺的方法，包括使用重组的宿主细胞。2-氧庚二酸是产甲烷古细菌中辅酶B生物合成途径中的已知中间物。
如此，本发明提供包含以下的重组宿主细胞：能将2-氧庚二酸转化成2-氨基庚二酸的酶(例如EC 2.6.1.67中的氨基转移酶)、能将2-氨基庚二酸转化成2-氨基-7-氧庚酸的酶(例如EC 1.4.1中的还原酶)、能将2-氨基-7-氧庚酸转化成2,7-二氨基庚酸的酶(例如EC 2.6.1中的1-氨基转移酶)、能将2,7-二氨基庚酸转化成六亚甲基二胺的酶(例如EC 4.1.1中的脱羧酶)。在一些实施方案中，所述能产生六亚甲基二胺的重组宿主细胞包含任意或所有的这些酶。本发明的实施方案还提供一种产生六亚甲基二胺的方法，其包括使用这些重组宿主细胞。
在一些实施方案中，本发明提供一种用于从可再生给料如糖、脂肪酸、甘油和合成气产生六亚甲基二胺的方法。在一些实施方案中，能产生六亚甲基二胺的非天然存在的宿主细胞包含将可再生给料转化成六亚甲基二胺所需的任意或所有酶。
2.2 重组宿主细胞
本公开特征是重组表达1种或多种(例如2种或更多种、3种或更多种、4种或更多种、5种或更多种、6种或更多种、7种或更多种、8种或更多种、9种或更多种、10种或更多种、11种或更多种、12种或更多种、13种或更多种、14种或更多种、15种或更多种、16种或更多种、17种或更多种、18种或更多种、19种或更多种、或20种或更多种、或甚至更多种)用于在本文所述的一种途径中产生化合物的酶的重组宿主细胞，以及使用这类宿主细胞来产生二和三官能C7链烷的方法。例如，宿主细胞可包含一种或多种(如上文)外源性核酸，其编码一种或多种(如上文)以下酶：催化D,L二氨基庚二酸或alpha-氨基庚二酸的还原性脱氨基化的酶；催化2-庚烯二酸到庚二酸的烯酸还原的酶；催化庚二酸到庚二酸半醛的羧酸还原的酶，催化庚二酸半醛到7-氨基庚酸的半醛氨基化的酶，催化7-氨基庚酸到庚内酰胺的酰胺水解的酶，催化7-氨基庚酸到7-氨基庚醛的醛脱氢的酶；催化氨基基团到7-氨基庚醛的转移以产生1,7-二氨基庚烷的酶；催化CoA到2-庚烯二酸转移以产生2-庚烯二酸-CoA的酶；催化2-庚烯二酸-CoA到庚二酰-CoA的烯酸还原的酶；催化庚二酰-CoA以产生庚二酸的硫酯水解的酶；催化庚二酸到庚二酸半醛的羧酸还原的酶；催化alpha氨基庚二酸的氨基基团转移以产生alpha酮庚二酸的酶；催化alpha酮庚二酸到alpha羟基庚二酸的羰基还原的酶；催化CoA到alpha羟基庚二酸转移以产生alpha羟基庚二酸CoA的酶；催化alpha羟基庚二酸到2-庚烯二酸的还原的酶；催化alpha酮庚二酸到alpha酮辛二酸的alpha酮酸链延伸的酶，催化氨基基团到alpha酮辛二酸转移以产生alpha-氨基辛二酸酯的酶，催化alpha氨基辛二酸到7-氨基庚酸的alpha酮酸脱羧的酶；催化alpha酮辛二酸的alpha酮酸脱羧以产生庚二酸半醛的脱羧的酶；催化6-氨基-2-庚烯二酸的烯酸还原以产生庚二酸的酶；或催化庚二酰[acp]到庚二酸的硫酯水解的酶。重组宿主细胞可含有由编码一种或多种上文所列酶的一种或多种(如上文)核酸组成的任意亚组。
使用的宿主细胞通常具有许多特性：它们可容易地进行遗传修饰、对本发明方法中使用的条件耐受、且生长至工业有用的细胞密度。
任选地，所述宿主细胞可以是单细胞微生物，或可以是细胞系的细胞。宿主细胞可以具有野生基因型。在此情况中，用于催化本发明方法中一个或多个步骤的酶天然存在于宿主细胞中且以在本发明方法中具有工业用途的水平表达。在一个备选方案中，宿主细胞已经过遗传修饰从而以在本发明实施方案的方法中具有工业用途的水平表达酶。所述酶可源自表达其的细胞。在一个备选方案中，所述酶源自不同的菌株或物种的细胞。
在一个备选方案中，所述宿主细胞是原核生物的。在另一个备选中，其为真核生物的。通常使用单细胞微生物。
术语原核细胞包括革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌。合适的革兰氏阴性细菌的例子包括：埃希氏菌属(Escherichia)如大肠杆菌(Escherichia coli)；梭菌属(Clostridia)如杨氏梭菌(Clostridium ljungdahlii)、自产乙醇梭菌(Clostridiumautoethanogenum)或克氏梭菌(Clostridium kluyveri)；棒状杆菌属(Corynebacteria)如谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)；贪铜菌属如钩虫贪铜菌(Cupriavidus necator)或耐金属贪铜菌(Cupriavidusmetallidurans)；假单胞菌属(Pseudomonas)如荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)或食油假单胞菌(Pseudomonas oleavorans)；代尔夫特菌属(Delftia)如食酸代尔夫特菌(Delftiaacidovorans)；芽孢杆菌属(Bacillus)如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtillis)；乳杆菌属(Lactobacillus)如德氏乳酸杆菌(Lactobacillus delbrueckii)；和乳球菌属(Lactococcus)如乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)。
真核宿主细胞包括来自酵母和其他真菌的那些细胞，以及例如昆虫、小鼠、大鼠、灵长类或人的细胞。合适的真核宿主细胞的例子包括来自以下属的酵母和真菌：曲霉属(Aspergillus)如黑曲霉(Aspergillus niger)；酵母属(Saccharomyces)如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)；假丝酵母属(Candida)如热带假丝酵母(C.tropicalis)、白色假丝酵母(C.albicans)、C.cloacae、C.guillermondii、中型假丝酵母(C.intermedia)、麦芽糖假丝酵母(C.maltosa)、近平滑假丝酵母(C.parapsilosis)和C.zeylenoides；毕赤酵母属(Pichia)如巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)；耶氏酵母属(Yarrowia)如解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)；伊萨酵母属(Issatchenka)如Issathenkia orientalis；德巴利酵母属(Debaryomyces)如汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)；Arxula属如Arxulaadenoinivorans；克鲁维酵母属(Kluyveromyces)如乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)；外瓶霉属(Exophiala)；毛霉属(Mucor)；木霉属(Trichoderma)；枝孢属(Cladosporium)；平革菌属(Phanerochaete)；Cladophialophora属；拟青霉属(Paecilomyces)；Scedosporium属和Ophiostoma属。
可以以多种不同形式提供宿主细胞。所述细胞可以是静息细胞。即，在培养物中生长细胞并在用作生物催化剂之前从培养基取出。所述细胞可在生长后直接使用，或者可在使用前将其储存。储存的典型方法包括冷冻。在一个备选方案中，所述细胞在使用前冻干。在一个别的备选方案中，所述细胞是生长的细胞。即，细胞在培养时实施其生物催化作用。如果特定生物催化反应的底物不能跨越细胞膜由宿主细胞转化，那么在一个备选方案中，可使用粗裂解物。粗裂解物是在裂解细胞后产生的细胞组分的初始悬液。细胞的裂解可通过任何手段实施，包括化学或机械手段。根据其一般知识和本文中教导，其他裂解方法对于技术人员来说将是明显的。在另一个备选方案中，可使用澄清的裂解物。澄清的裂解物可通过将粗裂解物离心以使未裂解细胞和其他细胞残片形成团粒来制备。
在一些实施方案中，提供基本纯的重组宿主细胞培养物。如本文中使用的，重组细胞的“基本纯的培养物”是其中低于约40％(即，低于约：35％；30％；25％；20％；15％；10％；5％；2％；1％；0.5％；0.25％；0.1％；0.01％；0.001％；0.0001％；或甚至更低)的培养物中活细胞总数是重组细胞(例如细菌、真菌(包括酵母)、支原体或原生动物细胞)以外的活细胞的细胞培养物。术语“约”在此背景中意指相关百分数可以在所指示百分数之上或之下15％。如此，例如，约20％可以是17％到23％。这类重组细胞的培养物包含细胞和生长、储存或运输培养基。培养基可以是液体、半固体(例如凝胶状介质)或冷冻的。培养物包括液体中或半固体培养基中/上生长或在储存或运输培养基(包括冷冻储存或运输培养基)中储存或运输的细胞。培养物在培养容器或储存容器或基质中(例如培养皿、烧瓶或管或储存小瓶或管)。
在一个实施方案中，本公开的重组细胞可从发酵工艺收获，其通过常规方法如过滤或离心，并在维持高活性的同时配制成干团粒或干粉末配制物。用于产生展现出本文中公开的一种或多种活性的干粉末全重组细胞组合物的工艺包括喷干、冻干、流化床干燥、真空转鼓干燥或团聚等。所述组合物可以是货架稳定的、干生物催化剂组合物，其适用于本文中描述的生物合成方法。干燥方法如冻干、流化床干燥或采用挤压(extrusion)/球团团粒化(spheronisationpelleting)继之以流化床干燥的方法可尤其有用。这些工艺的温度可为<100℃，但通常<70℃以维持高残余活性和立体选择性。干粉末配制物应具有0-10％w/w，通常2-5％w/w的水含量。可含有稳定化添加剂如盐(例如KCl)、糖、蛋白质等以改进重组细胞在干燥过程期间的热耐受性或改进干燥属性。
在一些实施方案中，可代替重组宿主或重组或非重组细胞的裂解物，或与其组合来使用部分或完全纯化的酶。完全或部分纯化的酶可以是本文所述任意重组细胞的或非重组细胞的完全或部分纯化的裂解物。纯化方法是本领域中公知的。部分或完全纯化具有的优点在于，感兴趣的酶与可能干扰(通过也与底物反应或通过将中间物或期望产物转化为不想要的化合物)由该酶催化的反应的其他细胞组分分开。纯化确实向任何生物催化剂制备加入了别的步骤，然而且因此并非在所有情况中均为合适的。对使用部分或完全纯化的酶的适宜性的确定将完全在遵循本文教导的技术人员的能力之内。
在一些实施方案中，本发明方法中的一种或多种转化将由生物催化剂在需氧条件下进行。在一个备选方案中，本发明方法中的一种或多种转化将在厌氧条件下进行。在一个别的备选方案中，本发明方法中的一些步骤将在需氧条件下进行而一些步骤将在厌氧条件下进行。
2.3 全细胞生物催化剂的修饰
本发明方法中使用的生物催化剂可以是未经修饰的物种宿主细胞，其中天然存在该酶。然而，通常需要遗传修饰宿主细胞以产生非天然存在(即重组或工程化)的宿主细胞。
2.4 宿主细胞基因组的染色体修饰
在一些实施方案中，已修饰了全细胞生物催化剂(即宿主细胞)的染色体。该修饰可以是染色体中核酸的插入、缺失或取代。对细胞染色体引起修饰的方法是公知的，例如转座子诱变、Cre-Lox介导的重组、lambda Red和RecET介导的重组。
稳定整合到核酸染色体中是有利的，因为其允许维持核酸而无需可选择标志物。
通过实施重复插入，可以将许多不同核酸稳定整合到宿主细胞生物催化剂的染色体中。稳定整合意指可将宿主细胞培养超过5代而不失去该改变。一般而言，稳定的遗传改变包括持续超过10代的修饰，特别稳定的修饰将持续超过约25代，且更特别稳定的遗传修饰将超过50代(包括无限期)。
2.5 对宿主细胞生物催化剂基因组的附加体修饰
在一些实施方案中，修改宿主细胞基因组的附加体组成。附加体意指任何自主复制元件，例如质粒(可为线性或环状)、粘粒、酵母人工染色体(YAC)等。附加体元件经常对其宿主细胞施加代谢负荷，且因此在缺乏确保附加体的至少一个拷贝在细胞分裂后存在于每个子细胞的任何活性划分机制的情况下，需要纳入可选择标志。
2.6 导入的核酸序列
导入细胞的核酸可包含一种或多种(例如2种或更多种、3种或更多种、4种或更多种、5种或更多种、6种或更多种、7种或更多种、8种或更多种、9种或更多种、10种或更多种、11种或更多种、12种或更多种、13种或更多种、14种或更多种、15种或更多种、16种或更多种、17种或更多种、18种或更多种、19种或更多种、或20种或更多种、或甚至更多)的许多元件。通常地，这些元件之一编码用于产生双官能或三官能C7链烷或这类分子前体的酶。在一些备选方案中，该核酸编码的蛋白质并非是在本发明方法中发挥功能的酶。
通常而言，启动子可操作地连接于核酸。启动子的选择将取决于意图的应用，且可容易地由技术人员确定。例如，如果酶催化的反应可能对特定宿主细胞有害，那么可以期望使用受调节的或可诱导的启动子，从而使得基因表达可在需要时打开或关闭。或者，可能优选的是使得表达受弱或强构成性启动子驱动以确保该酶在生长的所有阶段均表达。适用于真核细胞系统的例示性启动子包括SV40早期启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子、小鼠乳房肿瘤病毒(MMTV)类固醇可诱导的启动子、和Moloney鼠白血病病毒(MMLV)启动子。例示性酵母启动子包括3-磷酸甘油酸酯激酶启动子、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)启动子、半乳糖激酶(GAL1)启动子、半乳糖差向异构酶(galactoepimerase)启动子和醇脱氢酶(ADH)启动子。酵母中的其他合适的启动子是本领域中技术人员已知的。适用于细菌细胞系统的例示性启动子包括但不限于：T7、T3、SP6、lac和trp启动子。
如果需要确保表达，那么导入的核酸还可以可操作地连接以如需要的包含5’不翻译区(UTR)、3’UTR、增强子和/或终止子区。这类元件将是技术人员已知的。
2.7 多种酶在宿主细胞中的表达
在一些实施方案中，使用单一菌株的宿主细胞来表达超过一种(例如2种或更多种、3种或更多种、4种或更多种、5种或更多种、6种或更多种、7种或更多种、8种或更多种、9种或更多种、10种或更多种、11种或更多种、12种或更多种、13种或更多种、14种或更多种、15种或更多种、16种或更多种、17种或更多种、18种或更多种、19种或更多种、或20种或更多种、或甚至更多种)用在本发明方法中的酶。在此情况中，所述多种酶可由同一种导入核酸编码。在一个备选方案中，所述酶可编码在分开的导入核酸片段上。酶可均从单个启动子表达(例如通过将酶以操纵子的形式排布)。在一个备选方案中，酶可从多个分开的启动子表达。在一些情况中，可通过相同化学物诱导多个分开的启动子(例如，多种酶中每种可从酵母GAL启动子表达，如此意味着每个基因可用半乳糖诱导)。其他合适的启动子是本领域中已知的。在一个备选方案中，编码本发明方法中使用的酶的每个基因在不同启动子的控制下。如此，可经由不同诱导化合物的使用来分别诱导不同的酶。在另一个备选方案中，使用折中办法，其中许多酶在相同启动子的控制下，而许多酶在不同启动子的控制下。当已在宿主细胞中生成众多酶途径且期望协调途径的其他成员来控制途径的每个成员，但分开控制每个途径时，这一备选方案特别有利。
可对多种酶是从染色体还是从质粒表达进行其他考虑。在其中从质粒表达酶的情况下，有利地，每种质粒包含不同的起点和/或不同的可选择标志。
多种酶在单一细胞中表达是有利的，因为如果共表达的酶在反应途径中彼此承接直接作用，这确保上游酶反应的产物立即可受下游酶的作用。这避免了以下需要：(i)中间物的纯化和第二反应容器的设置以实施第二反应；或(ii)将产物从包含上游酶的细胞运输到其可受包含下游酶的细胞作用的培养基中。
2.8 伴侣蛋白系统
当细胞已工程化为在非自然条件下(例如，当某物种天然的蛋白质以高于自然水平的水平表达或者在一个备选方案中，当来自不同物种的蛋白质在宿主细胞中表达时)表达蛋白质时，在一些情况下该蛋白将不会以活性形式表达。相反它会不正确地折叠并累积为非功能性“包含体”聚集物。在此情况下，用于表达该蛋白质的细胞可进行遗传修饰以进一步表达伴侣蛋白，其能够阻止该蛋白质的错误折叠，或者能够将其从聚集状态重折叠。纳入这类伴侣蛋白是有利的，因为它增加每细胞的活性蛋白质的量，且因此增加本发明方法的总体效率。所表达的伴侣蛋白可以是宿主细胞的伴侣蛋白。在一个备选方案中，伴侣蛋白可来自与该蛋白质相同的物种/菌株。典型的用于表达的伴侣蛋白包括GroEL/GroES家族的成员和DnaJ/DnaK/GrpE家族的成员。原型大肠杆菌GroEL/GroES和DnaJ/DnaK/GrpE蛋白的同源物已在其他原核物种中鉴定出来(参见例如)，且真核同源物也是已知的(GroEL和GroES分别对应于真核蛋白Hsp60和Hsp10，而DnaJ、DnaK和GrpE分别对应于真核蛋白Hsp70、Hsp40和Hsp24)。这些蛋白质已在许多酵母物种(例如酿酒酵母)中鉴定出来。用于与用在本发明方法中的酶共表达的适宜伴侣蛋白的选择对于遵循本文中教导的技术人员来说将是明显的。
2.9 宿主细胞的代谢工程化
代谢工程化是优化宿主细胞中参数以增加细胞产生化合物能力的过程。任选地，本发明方法中使用的宿主细胞已经过工程化以优化上文论述的双官能C7链烷的输出。
增加细胞产生一种化合物能力的代谢工程化主要经由两种方法进行。第一种是优化途径中从起始材料产生期望产物的酶。在导致双官能C7链烷产生的多酶途径中(如附图所示和前面部分所述的)，可以使用技术人员已知的技术(例如，二维电泳、使用同位素标记的前体、和核磁共振(NMR)光谱学)来测定途径中每种中间物的浓度，并因此确定哪个酶转化是限速步骤，即反应方案中的哪个步骤最慢。这可以通过观察中间物的积累来确定，中间物的积累指示作用于此中间物的酶在限制转化的总体速率。在此情况中，因而应增加该中间物反应的速率。这可通过多种手段进行。首先，可提高限制性酶的表达水平。任选地，这可以通过将编码该酶的基因置于强启动子，例如T7启动子(如果该酶在大肠杆菌中表达)或TEF启动子(如果该酶在酵母中表达)的控制下来实现。第二种选择是提高编码存在于细胞的该酶的基因的拷贝数，例如通过将该基因置于多拷贝质粒上，或通过将基因的多拷贝纳入宿主细胞的染色体中(这些拷贝可掺入染色体的同一位置或在染色体的不同位置)。
提高双官能C7链烷的产生(如附图中显示和前述部分描述的)还可以通过使得任一种能将底物、任意中间物或产物转向到并非本方法目标的代谢途径中的酶的活性失活或降低。因此，可降低酶活性以增加双官能C7链烷的产率。如此，在一些实施方案中，本文中公开的重组宿主细胞可在能将本发明方法的起始材料或在产生双官能C7链烷的反应途径中产生的任意中间物转向成不同的、不想要的终产物的一种或多种酶中具有缺陷(例如通过缺失编码感兴趣酶的核酸或降低核酸的表达)。在一个备选方案中，所述酶未缺失，而是改变为使其以低于野生型酶的速率作用于底物、中间物或产物。在其中酶催化可逆反应的情况中，所述酶应改变为使其仅以期望的反应方向作用。
例如，在一些实施方案中，重组宿主细胞可在能将庚二酰-[acp]转化成7-酮-8-氨基壬酸(KAPA)或将6-羧基己酰基-CoA(庚二酰-CoA)转化成KAPA的酶中具有缺陷(例如BioF的缺失或失活，该基因编码7-酮-8-氨基壬酸合成酶(E.C.2.3.1.47))。
在一些实施方案中，重组宿主细胞可在二氨基庚二酸脱羧酶中具有缺陷，其创建赖氨酸营养缺陷型。赖氨酸营养缺陷型对于D,L二氨基庚二酸(赖氨酸的中间前体)的碳通量的去调节可尤其有用。赖氨酸营养缺陷型将需要补料分批发酵。
2.10生长的全细胞生物催化剂
在本发明的一些实施方案中，使用在实施本发明方法中转化时生长(即分裂)的宿主细胞。在这些实施方案中，所述细胞在优化期望双官能C7链烷产生的条件下培养。可培养本文中所述的任一种重组宿主细胞以产生和/或分泌本发明的生物合成产物。如本文中使用的，术语培养等同于发酵罐和生物反应器。
2.10.1 培养基
在一些情况中，用于生长的碳源将以营养液，例如Luria培养基或酵母提取培养基的形式提供。在其他情况中，可使用适于宿主细胞生长的限定培养基(即，其中每种组分浓度已知的培养基)。在一个备选方案中，生长培养基包含葡萄糖作为碳源。在另一个备选方案中，宿主细胞使用的培养基中的碳源是葡萄糖、蔗糖、木糖、脂肪酸和甘油。
2.10.2 多种菌株在相同培养物中的生长
在一些实施方案中，催化本发明方法中转化的酶存在于超过一种菌株/物种的细胞中，其中同时使用那些超过一种菌株/物种的细胞。在其中当实施本发明方法中的转化时多种菌株/物种在生长的情况中(即细胞在共培养)，选择的菌株/物种必须选择为使得一种菌株不与其他菌株竞争。这类关系可通过向共培养物引入人工共生获得。即，使用的两种菌株/物种对于必要但是不同的养分各自为营养缺陷的。此外，其他菌株应工程化为产生过量的该养分，从而使得两种菌株在培养物的生长培养基不包含这两种必要养分时能在培养物中一起存活。适宜的营养缺陷体的选择将完全在遵循本文教导的技术人员的能力以内。
2.10.3 发酵
本文所述培养条件可以扩大规模并连续生长用于制备庚烷-l,7-二元酸、7-氧庚酸、7-羟基庚酸、7-羟基庚醛、7-氨基庚酸、七亚甲基二胺、1,7-庚二醇、7-氨基庚醛、7-氨基庚醇或庚内酰胺。例示性的生长规程包括，例如补料分批发酵和分批分离；补料分批发酵和连续分离，或连续发酵和连续分离。所有这些工艺均为本领域中公知的。发酵规程对于商业量的二和三官能C7链烷的生物合成产生尤其有用。一般地且如同非连续培养规程地，前文描述的庚烷-1,7-二元酸、7-氧庚酸、7-羟基庚酸、7-羟基庚醛、7-氨基庚酸、七亚甲基二胺、1,7-庚二醇、7-氨基庚醛、7-氨基庚醇或庚内酰胺的连续和/或接近连续产生包括在充足的养分和培养基存在下培养产生本文所述庚烷-1,7-二元酸、7-氧庚酸、7-羟基庚酸、7-羟基庚醛、7-氨基庚酸、七亚甲基二胺、1,7-庚二醇、7-氨基庚醛、7-氨基庚醇或庚内酰胺的重组宿主细胞以维持和/或近乎维持指数期生长。在这类条件下的连续培养可包括例如，1天、2、3、4、5、6或7天或更长。另外，连续培养可包括1周、2、3、4或5周或更长并长达数个月。或者，如果适合特定应用的话，重组细胞可培养数小时。应理解连续和/或接近连续培养条件还可包括在这些例示性时段之间的所有时间间期。还理解培养本发明宿主细胞的时间是用于产生针对期望目的充足量的产物的充足时间段。
发酵规程是本领域中公知的。简言之，用于生物合成产生前文所述庚烷-l,7-二元酸、7-氧庚酸、7-羟基庚酸、7-羟基庚醛、7-氨基庚酸、七亚甲基二胺、1,7-庚二醇、7-氨基庚醛、7-氨基庚醇或庚内酰胺的发酵可以例如，补料分批发酵和分批分离；补料分批发酵和连续分离，或连续分离和连续发酵利用。分批和连续发酵规程的例子是本领域中公知的。
除了上文使用本文所述庚烷-1,7-二元酸、7-氧庚酸、7-羟基庚酸、7-羟基庚醛、7-氨基庚酸、七亚甲基二胺、1,7-庚二醇、7-氨基庚醛、7-氨基庚醇或庚内酰胺生产者来连续生产大量这些的发酵规程以外，庚烷-l,7-二元酸、7-氧庚酸、7-羟基庚酸、7-羟基庚醛、7-氨基庚酸、七亚甲基二胺、1,7-庚二醇、7-氨基庚醛、7-氨基庚醇或庚内酰胺生产者还可以例如，同时进行别的规程以将产物转化成其他化合物，或使产物可与发酵培养物分开并序贯进行化学或生物催化转化以如期望的将产物转化成其他化合物。
2.11 本发明的组合物
本发明还提供包含依照本发明的重组宿主细胞以及庚烷-l,7-二元酸、7-氧庚酸、7-羟基庚酸、7-羟基庚醛、7-氨基庚酸、七亚甲基二胺、1,7-庚二醇、7-氨基庚醛、7-氨基庚醇和庚内酰胺的组合物。本发明还提供包含依照本发明的重组宿主细胞和给料的组合物。在一些实施方案中，所述给料是可再生给料，例如其中所述给料选自下组：葡萄糖、蔗糖、木糖、脂肪酸和甘油。在一些实施方案中，所述给料是多芳香烃，例如苯、甲苯或莽草酸。
3.1 实施例
在一般性描述本发明后，通过对以下实施例的提述将会更容易地理解本发明，其通过例示提供且不意图为限制的。理解可对本文中公开的例示性实施方案进行各种修改和变化，而不背离本发明的精神和范围。
3.1.1 通过氨裂合酶(EC 4.3.1.-)的2,6-二氨基庚二酸酯到2-氨基-5,6-脱氢庚二酸(6-氨基-2-庚烯二元酸)和2-氨基庚二酸到2-庚烯二元酸的转化(见图10)
3.1.1.1 选择MAL酶基因靶物
在鉴定了涉及2,6-二氨基庚二酸到庚二酸(其用于产生尼龙7,7)的转化和庚二酸到7-氨基庚酸的转化的途径后，选择来自这些途径的基因靶物。具体地，选择来自包括甲基天冬氨酸氨裂合酶(MAL；EC 4.3.1.2)在内的氨裂合酶家族(EC 4.3.1)的酶靶物，该选择基于其广泛底物特异性、在一大批宿主中的存在、被克隆和外源表达的能力和用于合理设计蛋白质工程的可用晶体结构。选择来自无丙二酸柠檬酸杆菌(Citrobacter amalonaticus)、假破伤风梭菌(Clostridium tetanomorphum)和米曲霉的MAL基因。由无丙二酸柠檬酸杆菌(GeneBank AB005294；片段1641-2882878596..879060NM_NM)和假破伤风梭菌(GeneBank S48141；片段756-1997)编码的MAL酶具有显著的相异性(57％同一性)。米曲霉MAL基因(GeneBank XM 001827609)是进化趋异的(与无丙二酸柠檬酸杆菌MAL 44％同一性，与假破伤风梭菌MAL 39％同一性)，其可显示不同的催化特性和/或选择性。另一种不寻常的氨裂合酶(其为用于2,6-二氨基庚二酸酯和2-氨基庚二酸的还原性脱氨基化的潜在酶的)是来自荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)的D-葡糖氨酸氨裂合酶(EC 4.3.1.9)(登录号BAD69624)。这是一种催化α,β-消除的不寻常的氨裂合酶：
D-葡糖氨酸—>2-脱氢-3-脱氧-D-葡糖酸+NH3
3.1.1.2克隆含有基因靶物的表达载体
然后，使用inABLE技术将来自无丙二酸柠檬酸杆菌、假破伤风梭菌和米曲霉的选定的MAL基因靶物克隆到IPTG可诱导的pET21-a主链中以生成I4(pET21-a具有无丙二酸柠檬酸杆菌MAL基因)、I5(pET21-a具有假破伤风梭菌MAL基因)和I6(pET21-a具有米曲霉MAL基因)。首先，使用软件分析将该基因和载体DNA分裂成截短的部分。鉴定选定的MAL基因和pET21载体中潜在的限制酶例如EarI位点并通过引入突变破坏。破坏位于编码序列内的EarI限制位点，例如通过掺入沉默突变，从而避免改变编码的蛋白质序列。所得DNA没有EarI位点，并用作软件分析的输入序列以设计相应的由EarI侧接的截短部分(自DNA 2.0定购)、长和短接头寡核苷酸(自Sigma-Aldrich定购)、以及长和短部分(part)寡核苷酸(自Sigma-Aldrich定购)。将部分和接头寡核苷酸的5'端磷酸化，其通过将引物在存在T4激酶的情况下在合适的反应条件下(6μΜ寡聚体、1PNK缓冲液、1mM ATP、10U T4激酶、5mM DTT、5％(w/v)PEG8000)在37℃温育30分钟，然后在65℃将酶失活20分钟。
接着，将磷酸化的接头寡聚体与磷酸化的部分寡聚体退火，其通过混合等摩尔量的每种寡聚体(6μΜ50μL)，然后在热循环仪中将混合物加热至65℃，接着逐渐将温度降低至20℃以形成部分双链的部分寡聚体和部分双链的接头寡聚体，其具有特定的16bp悬突(熔解温度高于75℃)。然后，将所得的退火部分寡聚体(POA)和退火接头寡聚体(LOA)用TE缓冲液(Tris-EDTA)稀释成终浓度1μΜ。
然后，生成对应于所选基因(无丙二酸柠檬酸杆菌、假破伤风梭菌和米曲霉MAL)的部分/接头片段，其通过EarI消化克隆的截短部分接着连接其相应的退火部分寡聚体(POA28、POA29或POA30)、其截短部分(TP28、TP29或TP30)、及来自载体主链的退火接头寡聚体(LOA31)的连续循环。对应于载体主链的部分接头融合物通过连接其退火的部分寡聚体(POA31)、其截短部分(TP31)及来自任一基因的退火接头寡聚体(LOA28、LOA29或LOA30)来制备。在基因和载体反应中分别使用相比于截短部分10倍和20倍摩尔过量的LOA和POA以利于截短部分和寡核苷酸在每个EarI消化/连接循环期间的连接。反应以总体积50μL进行并在热循环仪(Eppendorf Mastercycler Gradient)中温育。通过在37℃至16℃(其分别对应于EarI消化和使用T4DNA连接酶连接的最适温度)之间变换温度来实现EarI消化/连接的循环。将样品加载到0.7％琼脂糖凝胶上，并通过琼脂糖凝胶分离和凝胶提取(QIAGEN QIAquickGel Extraction Kit)从剩余主链纯化部分接头。在琼脂糖凝胶电泳后，对部分接头片段的制备观察到预期大小片段。消化后片段与展现相容3bp悬突的退火寡核苷酸的连接导致不可切割部分/接头片段的形成。
然后，使用2部分装配将基因部分/接头融合物与其相应载体部分/接头融合物组合以构建大肠杆菌表达载体，其使用先前生成的部分接头。将基因和载体部分接头融合物以等摩尔量(各0.1pmol)混合在一起，由于在来自各部分的退火部分寡核苷酸和退火接头寡核苷酸中形成的特定互补悬突，这导致预期的DNA片段装配。将反应在室温温育30min，接着转化高效率化学感受态ΝΕΒ10β大肠杆菌细胞，其使用2μL装配反应液和10μL感受态细胞。将转化后的细胞铺板于LB-Amp-琼脂上并在37℃过夜温育。对每种装配获得500个克隆。然后，从每种装配挑取2个随机克隆并使用QIAGEN QIAprep Miniprep Kit分离相应的载体。
在先前分离的载体上进行限制性分析以确认正确装配的构建，例如将无丙二酸柠檬酸杆菌基因装配到pET21-a主链中。使用PvuI和BmgBI分析从无丙二酸柠檬酸杆菌基因到大肠杆菌表达载体中的装配所获得的克隆以鉴定出对插入阳性的克隆。使用PstI和AlwNI分析从假破伤风梭菌基因到大肠杆菌表达载体中的装配所获得的克隆(图30，表10)以鉴定出对插入阳性的克隆。使用SphI和EcoRV分析从米曲霉基因到大肠杆菌表达载体中的装配所获得的克隆以鉴定出对插入阳性的克隆。使用琼脂糖凝胶电泳分析来自每份样品的限制性产物。对于来自每种装配的两个克隆均观察到预期的条带模式，从而确认了携带无丙二酸柠檬酸杆菌、假破伤风梭菌和米曲霉MAL基因的大肠杆菌表达载体的构建。实施I7阴性对照载体(pET21-a对照)的装配，其使用部分/接头融合物pET21-a部分/pET21-a接头，作为阴性对照实施，并使用XmnI和AlwNI分析来自阴性对照无基因构建体生成的克隆。为了进一步确认表达载体的适宜装配，从每种装配的2个克隆之一对载体主链3’端和基因5’端之间以及基因3’端和载体主链5’端之间的部分交界处测序。
3.1.1.3 外源MAL基因在大肠杆菌中的表达
将前面获得的大肠杆菌构建体用于研究无丙二酸柠檬酸杆菌、假破伤风梭菌和米曲霉MAL基因在大肠杆菌中的表达。将载体(来自每种装配的10ngDNA)用于转化电感受态的BL21(DE3)大肠杆菌细胞，并将转化样品铺板于LB-Amp-Agar上。在37℃过夜温育后获得转化体。
从每种装配板挑取单个克隆，并用于接种作为起始培养物的5mlLB-Amp培养基。在37℃和250rpm过夜温育后测量OD600。将2mL的每种起始培养物(约4.5xl07-6.2xl07细胞)用于接种100mL的LB-Amp，并将培养物在37℃和250rpm在500mL带障板摇瓶中温育直至达到0.6到0.8的OD600。由pET21-a中T7启动子控制的蛋白质表达通过添加1mM IPTG(终浓度)诱导，且将培养物进一步在37℃和250rpm温育。在诱导前、诱导后4h、和诱导后24h取1mL的每份样品。通过测量OD600检查细胞生长。将诱导后温育24小时后留下的剩余培养物转移至50mL falcon管，通过在5000rpm离心10分钟收获并将细胞团粒储存于-20℃。
接着，将来自每种装配的按时间点样品加工用于SDS-PAGE分析。将样品在13000rpm离心2min，接着除去上清液并使用补充有溶菌酶(15mg/mL)和benzonase(3.4U/μL)的Bugbuster蛋白质提取试剂裂解细胞。然后，将裂解反应液在13000rpm离心2min，并将可溶级分转移至新管，将不溶性级分重悬于水。将20μL的每种级分与80μL的SDS-样品缓冲液(SDS-Loading缓冲液，9％DTT和水)混合，并将混合物在热块中在95℃加热5分钟。然后，将10μL的每份样品加载于SDS-PAGE 4-20％Tricene凝胶上以分析可溶和不可溶级分的蛋白质含量。在预期大小处(45kDa)的蛋白质条带清楚可见于IPTG诱导后的可溶级分。在阴性对照实验中未观察到相应蛋白质，表明预期的45kDa无丙二酸柠檬酸杆菌MAL蛋白和45kDa假破伤风梭菌MAL蛋白在大肠杆菌中从装配的表达载体构建体成功表达为可溶蛋白质。在诱导后任何样品的不溶性级分中均未观察到明显蛋白质。45kDa米曲霉MAL蛋白亦在大肠杆菌中从装配的表达载体构建体表达，但其被表达为不溶性蛋白质(在诱导后不溶性级分中可见一条45kDa条带)(见图11A和11B)。
为了改进米曲霉MAL蛋白的溶解性，降低了诱导温度和/或诱导物浓度，这在一些情况下显示为导致增加的蛋白质可溶性(由于蛋白质合成中的更低速率及因此蛋白质折叠的更高效率)。使用上文所述的同一表达和诱导规程来降低这些参数，但SDS-PAGE分析显示米曲霉MAL蛋白仍是不溶性的(在诱导后不溶性级分中可见一条45kDa条带)。含有米曲霉MAL蛋白的酵母表达载体可用于表达可溶形式的该蛋白。
将表达无丙二酸柠檬酸杆菌或假破伤风梭菌MAL基因的大肠杆菌培养物提升规模以增加用于酶测定法的可溶性蛋白质的产生。生长培养物，诱导并收获，如前文所述的。简言之，从先前制备的每个转化板挑取单个克隆，并将20ml的LB-Amp培养基接种作为起始培养物。在37℃和250rpm过夜温育后测量OD600。将16mL的每种起始培养物(约4.4x108细胞)用于接种800mL的LB-Amp，并将培养物在2L带障板摇瓶中在37℃和250rpm温育直至达到0.6到0.8的OD600。蛋白质表达通过添加1mM IPTG(终浓度)诱导，且将培养物进一步在37℃和250rpm温育。诱导后温育24小时后，将剩余培养物转移至50mL falcon管，通过在5000rpm重复离心10分钟(每管4轮离心；每轮50mL培养基)收获并将细胞团粒储存于-20℃。
使用玻璃珠裂解来破坏细胞以收集无丙二酸柠檬酸杆菌、假破伤风梭菌和米曲霉MAL蛋白。将来自诱导后24小时样品的细胞团粒重悬于珠裂解缓冲液，其由0.1mM Tris、1mg/ml Pepstatin A和200mM PMSF蛋白酶抑制剂组成。向每个管添加经酸洗涤的212-300μm玻璃珠(0.4g每1mL裂解缓冲液)，并在超声水浴中并行裂解。在超声处理前以及细胞裂解5分钟和10分钟后，从4个管中每一个取250μl样品。合并来自每时间点的250μl样品以产生1mL的总样品。通过在5000rpm离心10分钟并转移上清液至新管来制备无细胞提取物。在将超声处理10min后分离的细胞悬液用等体积水重悬后制备不溶性样品。将剩余团粒和上清液储存于-20℃。将20μl的每种合并级分与80μl SDS-样品缓冲液(SDS-加载缓冲液，9％DTT和水)混合，并将混合物在热块中在95℃加热5分钟。然后，将10μL的每份SDS-样品制备物加载于SDS-PAGE 4-20％Tricene凝胶上以分析可溶和不可溶级分的蛋白质含量。在从无丙二酸柠檬酸杆菌MAL和假破伤风梭菌MAL表达的样品中清楚检测到蛋白质条带。
3.1.1.4 外源表达的MAL的功能性
首先，使用I4、I5和I6菌株测定源自无丙二酸柠檬酸杆菌、假破伤风梭菌和米曲霉的甲基天冬氨酸氨裂合酶对beta-甲基天冬氨酸的活性。在本文所述的后续反应中，在不同底物背景，即2-氨基庚二酸、D,L-赖氨酸和最后的2,6-二氨基庚二酸中测定这些菌株的活性。还进行用I17对2-氨基庚二酸的阴性对照生物转化。
3.1.1.4.1 针对beta-甲基天冬氨酸生物转化筛选I4、I5和I6菌株
在I4、I5和I6裂合酶菌株的5g/L或20g/L全细胞当量准备6种生物转化。基于全细胞当量(其为离心后形成团粒的细胞质量(湿细胞重量)除以裂解期间用于重悬细胞的缓冲液体积)来计算酶浓度。生物转化在3ml体积中与10mMDL-苏型-beta甲基天冬氨酸进行。
将反应在回转式培养箱中在30℃温育并在1、5和18小时后取出样品用于通过HPLC分析。制备1ml等分试样用于分析，其通过热处理来除去热不稳定的蛋白质。其后，将样品在10,000rpm离心2分钟，并经由0.2微米滤器过滤。对样品的分析通过HPLC实施，其使用Phenomenex Rezex柱和5mM硫酸流动相，使用RID和UV检测。对裂合酶活性的确认通过检测样品中的甲基延胡索酸(mesaconic acid)来确定。在每个生物转化中形成的甲基延胡索酸的浓度通过测量来自Aldrich的外部标准甲基延胡索酸来测定。
在所有I4和I5菌株生物转化中均检测到甲基延胡索酸，从而确认了裂合酶的功能型表达存在于这些细胞提取物中。在I6菌株中未观察到活性，这与通过表达蛋白质的SDS PAGE分析所观察到的结果一致，表明蛋白质表达为不溶性形式。从I4和I5菌株分析的所有样品中甲基延胡索酸的产率为～5mM，这与对10mM DL-苏型-beta甲基天冬氨酸的预期活性一致，因为野生型酶是L-对应异构选择性(enantioselective)的。在I4和I5菌株中，在仅1小时温育后就观察到完全转化。
3.1.1.4.2 针对2-氨基庚二酸生物转化筛选I4和I5菌株
准备具有不同酶水平和底物浓度的8种生物转化(2变量、2水平统计设计)以检查I4和I5对2-氨基庚二酸的酶活性。生物转化在3ml体积中与如下指示的各种加载进行：
I4菌株5g/L；2-氨基庚二酸酯浓度5mM
I4菌株5g L；2-氨基庚二酸浓度10mM
I4菌株20g/L；2-氨基庚二酸浓度5mM
I4菌株20g/L；2-氨基庚二酸浓度10mM
I5菌株5g/L；2-氨基庚二酸浓度5mM
I5菌株5g/L；2-氨基庚二酸浓度10mM
I5菌株20g/L；2-氨基庚二酸浓度5mM
I5菌株20g/L；2-氨基庚二酸浓度10mM
将生物转化置于在30℃在摇动培养箱中的falcon管中。在7、14和21天后，从生物转化取出等分试样(1ml)。进行延长的温育以提供观察裂合酶活性的最佳可能机会。制备1ml等分试样用于分析，其通过热处理来除去热不稳定的蛋白质。然后，将样品在10,000rpm离心2分钟并经由0.2微米滤器过滤。对样品的分析通过HPLC进行，其使用柱前衍生(precolumn derivatisation)方法。该方法包括用Boc-半胱氨酸和邻苯二醛(ortho-phthaladehyde)试剂形成手性加合物以形成L-和D-2-氨基庚二酸衍生物的非对映异构体对。所述非对映异构体(代表2-氨基庚二酸的对映异构体)随后可通过HPLC分开，其使用C18柱和5mM磷酸钾缓冲液pH 7.0和338nm的乙腈梯度。记录每份样品中L-和D-2-氨基庚二酸信号的峰面积且L-2-氨基庚二酸标准中观察到的降低表示为％相对于D-2-氨基庚二酸。
数据显示L-2-氨基庚二酸在所有生物转化中均被降解。对映异构体过量中的增加与对这些裂合酶预期的天然L-对应异构选择性一致，所述裂合酶优先作用于L-beta-甲基天冬氨酸。更低的底物加载(5mM)还显示比更高底物加载更大的对应异构富集(即对可获底物的更高转化)，这与预期的裂合酶活性一致。
通过质谱确认了未反应的2-氨基庚二酸的存在。在样品中观察到等于176.09的M+H，且与C7H13NO4的模拟质谱匹配。在全扫描(全扫描)质谱上，未观察到烯酸产物(M+H＝159.06)。然而，当MS在20m/z宽质量分离累积离子达20秒时，观察到正确的产物信号并且与C7H10O4的模拟质谱匹配。
还分析了rac-2-氨基庚二酸起始材料的样品。使用在此标准上实施的相同MS方法清楚地显示2-氨基庚二酸的预期分子离子。然而，在20m/z宽质量分离重复MS离子累积达20秒(如已在之前的生物转化样品上实施的)揭示了烯酸产物作为质量片段的存在。
3.1.1.4.3 使用I17菌株对2-氨基庚二酸的阴性对照生物转化
准备具有不同细胞提取物和底物水平的4种生物转化以匹配在3.1.1.4.1中所述实验中使用的水平。生物转化在3ml反应体积中如下指示进行：
I7菌株5g/L；2-氨基庚二酸浓度5mM
I7菌株5g/L；2-氨基庚二酸浓度10mM
I7菌株20g/L；2-氨基庚二酸浓度5mM
I7菌株20g/L；2-氨基庚二酸浓度10mM
将生物转化在30℃在摇动培养箱中温育，并在8、13和21天后取样品。对反应的分析通过HPLC进行，其遵循上文3.1.1.4.1所述实验中描述的方法。
数据显示在I17菌株中L-对映异构体有一些损失。然而，L-对映异构体的相对降低低于用I4和I5菌株的等同生物转化，特别是在比较温育2周的第二时间点时。下文所绘出的趋势清楚地显示，在检查细胞提取物和底物加载的2x2统计设计实验中，I4和I5菌株在生物转化中相比于I17阴性对照菌株具有一贯更高的L-2-氨基庚二酸降解水平。
3.1.1.4.4 用DL-赖氨酸生物转化筛选I4和I5CFE
以与用于测试对2-氨基庚二酸的裂合酶活性类似的方式准备8种生物转化。在如下不同的细胞提取物和DL-赖氨酸底物浓度测试I4和I5裂合酶菌株：
I4菌株5g/L；DL-赖氨酸浓度5mM
I4菌株5g/L；DL-赖氨酸浓度10mM
I4菌株20g/L；DL-赖氨酸浓度5mM
I4菌株20g/L；DL-赖氨酸浓度10mM
I5菌株5g/L；DL-赖氨酸浓度5mM
I5菌株5g/L；DL-赖氨酸浓度10mM
I5菌株20g/L；DL-赖氨酸浓度5mM
I5菌株20g/L；DL-赖氨酸浓度10mM
将生物转化置于在30℃在摇动培养箱中的falcon管中。在7、14和21天后，从生物转化取等分试样(1ml)。进行延长的温育以提供观察裂合酶活性的最佳可能机会。制备1ml等分试样用于分析，其通过热处理来除去热不稳定的蛋白质。然后，将样品在10,000rpm离心2分钟并经由0.2微米滤器过滤。使用手性HPLC柱(Chirobiotic T2Astec)来分析DL-赖氨酸样品以监测对映异构体比率，从而测定裂合酶活性。在7、14和21天后，从生物转化取样品。
结果指示在所有使用5mM赖氨酸的生物转化中L-赖氨酸的损失。观察到对DL-赖氨酸的对应异构选择性作用中的一些变化，其中L-赖氨酸浓度超过D-赖氨酸浓度。由于HPLC层析中赖氨酸的不佳UV吸光度(检测器设为210nm)和低信噪比，不能从这些结果排除假阳性L-赖氨酸检测的可能性。然而，在8种生物转化中观察到L-赖氨酸从DL-赖氨酸的一般性降解，这与起因于在I4和I5菌株中发挥功能的裂合酶潜在裂解活性的预期立体选择性一致。
为了收集其他证据来证明裂合酶活性在这些生物转化中发挥功能，通过MS分析样品以试图检测样品中期望的烯酸产物。在样品中观察到对应于未反应赖氨酸的MS信号(M+H＝176.09)，并与C6Hi4N2O2的模拟的质谱匹配。
在全扫描质谱(full sweep mass spectrum)上，未观察到烯酸产物(M+H＝130.09)。然而，如同氨基-庚二酸反应的，当MS在20m/z宽质量分离累积离子达20秒时，观察到正确的产物信号并且与C6H11NO2的模拟质谱匹配。
还分析了DL-赖氨酸起始材料的样品。使用在此标准上实施的相同MS方法清楚地显示DL-赖氨酸的预期分子离子。然而，在20m/z宽质量分离重复MS离子累积达20秒(如已在之前的生物转化样品上实施的)揭示了烯酸产物作为质量片段的存在。
3.1.1.4.5 用内消旋-2,6-二氨基庚二酸(meso-2,6-diaminopimelic acid)生物转化筛选I4和I5CFE
准备6种生物转化来测试对内消旋-2,6-二氨基庚二酸的裂合酶活性。用5mM内消旋-2,6-二氨基庚二酸测试I4、I5和I7菌株，如下检查各种浓度的细胞提取物：
I4菌株5g/L；内消旋-2,6-二氨基庚二酸浓度5mM
I4菌株20g/L；内消旋-2,6-二氨基庚二酸浓度5mM
I5菌株5g/L；内消旋-2,6-二氨基庚二酸浓度5mM
I5菌株20g L；内消旋-2,6-二氨基庚二酸浓度5mM
I17菌株5g/L；内消旋-2,6-二氨基庚二酸浓度5mM
I17菌株20g/L；内消旋-2,6-二氨基庚二酸浓度5mM
将生物转化置于在30℃在摇动培养箱中的falcon管中。4天后从生物转化取等分试样(1ml)，其他样品获得在HPLC分析之前未定。
通过MS分析4天后获得的样品。该分析确认了内消旋-2,6-二氨基庚二酸的存在，其与C7Hi4N2O4的模拟质谱信号匹配。
在该生物转化样品中在此质谱中未观察到期望的烯酸信号。然而，当引入离子积累达0.5秒时，在样品中观察到相应的烯酸信号(M+H＝174.08)。
3.1.2  通过烯酸还原酶(EC 1.3.1.31)或烯酰-CoA脱氢酶(EC 1.3.1.62)的2-氨基-5,6-脱氢庚二酸(6-氨基-2-庚烯二酸)到2-氨基-庚二酸和2-庚烯二酸或其CoA酯到庚二酸或其CoA酯的转化(见图10A和10B)
3.1.2.1烯酸还原酶靶物的选择
在鉴定了涉及庚二酸的两种不饱和中间物(即2-氨基-5,6-脱氢庚二酸和2-庚烯二酸)到其相应饱和化合物2-氨基庚二酸和庚二酸的转化的途径后，从烯酸还原酶家族(EC 1.3.1)如EC1.3.1.31,EC 1.3.1.8；EC 1.3.1.9；EC 1.3.1.10,EC 1.3.1.31；EC 1.3.1.38；EC 1.3.1.39；EC 1.3.1.44，或EC 1.3.1.62中的庚二酰-CoA脱氢酶如PimC/PimD或ThnJ/ThnK。所述烯酸还原酶还可以在EC 1.3中，如EC 1.3.8.1或EC 1.3.99.3；EC 1.3.99.B10或Syntrophus aciditrophicus 2,3-二脱氢庚二酰-CoA还原酶及其同源物。选择酶靶物，该选择基于其对α,β-不饱和羧酸的不同底物特异性及其稳定性(Stereocomplementary bioreduction ofα,β-unsaturated dicarboxylic acids and dimethyl esters using enoate reductases-Enzyme-and substrate-based stereocontrol:Stueckler等Org.Lett.2007,9,5409-5411)。
具体地，选择来自枯草芽孢杆菌(YqjM)(GeneBank D84432；片段242791-243807)和番茄(Solanum lycopersicum)(OPR1和OPR3)(分别为GeneBank NM_001247852，片段108-1238和GeneBank NM_001246944，片段94-1284)的烯酸还原酶基因，因为其先前已克隆并在大肠杆菌中成功表达，报告了YqjM和OPR3酶的晶体结构，这使得能经由合理设计进行蛋白质工程(The 1.3A crystal structure of the flavoprotein YqjM reveals a novel class of oldyellow enzyme:Kitzing等J.Biol,Chem.2005,280,27904-27913；Asymmetricbioreduction of activated alkenes using cloned 12-oxophytodienoate reductaseisoenzymes OPR-l and OPR-3from Lycopersicon esculentum(Tomato):Astriking switch of stereopreference:Hall等Angew.Chem.Int.Ed.2007,46,3934-3937；Crystal structure of 12-oxophytodienoate reductase 3fromtomatoSelf inhibition by dimerization:Breithaupt等PNAS 2006,103,14337-14342)。另外，选择来自恶臭假单胞菌的XenA(EC 1.3.1.31)，来自Euglena gracilis的TER(EC 1.3.1.44)，来自人(Homo sapiens)的PECR和MECR，来自恶臭假单胞菌的acdA(EC 1.3.99.-)，来自牛(Bos Taurus)的ACADS(EC 1.3.99.-)和来自沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)的PimC/pimD(EC 1.3.1.62)以在大肠杆菌中表达并测试2-庚烯-二酸和2-庚烯二酸-CoA的还原。
作为用于还原2,3-双键的潜在候选物的其他烯酸还原酶是那些来自梭菌物种的，因为其具有广泛底物特异性(Chiral compounds synthesized bybiocatalytic reductions:Simon等Angew.Chem.Ed.Engl.1985,24,539-553；Properties and mechanistic aspects of newly found redox enzymes fromanaerobes suitable for bioconversions on preparatory scales:Simon等Pure&AppI.Chem.1992,64,1181-1186)。然而，由于那些酶对氧的高敏感性，未将其克隆并表达用于概念初始证据(Enoate reductases of Clostridia-Cloning,sequencing and expression:Rohdich等.J.Biol.Chem.2001,276,5779-5787)，但其可以是用于厌氧宿主中最终途径构建的有用催化剂。具体地，以下烯酸还原酶应可用于还原靶物2-烯酰C7化合物中的双键：
来自克氏梭菌(Clostridium kluyveri)的enr 2-烯酸还原酶(Y16137)EC1.3.1.31：发现克氏梭菌的全细胞在存在分子氢的情况下还原大范围的2-烯酸。底物为：惕各酸(tiglic acid)、丙烯酸、甲基丙烯酸、二甲基丙烯酸、(E)-戊烯酸、(E)-己烯酸、山梨酸、肉桂酸(cinnamic acid)[19]、(E)-2-丁烯酸和(E)-2-甲基-2-丁烯酸、(E)-和(Z)-3-甲基-2-戊烯酸、p-甲氧基-肉桂酸和p-硝基-肉桂酸[Buhler,M.,Giesel,H.,Tischer,W.和Simon,H.(1980)Occurrence and thepossible physiological role of 2-enoate reductases.FEBS Lett.109,244-246]。鉴定出编码所述酶的基因的部分序列[Rohdich,F.,Wiese,A.,Feicht,R.,Simon,H.和Bacher,A.(2001)Enoate reductases of Clostridia.Cloning,sequencing,andexpression.J.Biol.Chem.276,5779-5787]。由于已对克氏梭菌的基因组测序，我们发现了该基因的完整序列(YP_001394144.1，GeneBank)。
来自酪丁酸梭菌(C.tyrobutyricum)(先前的梭菌物种La 1)的enr 2-烯酸还原酶(Y09960)EC 1.3.1.31：在(E)-丁烯酸上生长的梭菌物种中发现2-烯酸还原酶并纯化至均质。它接受(E)-2-甲基丁烯酸和肉桂酸[Elshahed MS,Bhupathiraju VK,Wofford NQ,Nanny MA,Mclnerney MJ.(2001)Metabolism ofbenzoate,cyclohex-1-ene carboxylate,and cyclohexane carboxylate by"Syntrophus aciditrophicus"strain SB in syntrophic association with H(2)-usingmicroorganisms.Appl Environ Microbiol.67:1728-1738]、(E)-alpha-甲酸基氨基-肉桂酸和4-甲基-2-戊烯酸(pentenoate)[Bühler,M.,Giesel,H.,Tischer,W.和Simon,H.(19-80)Occurrence and the possible physiological role of 2-enoatereductases.FEBS Lett.109,244-246]。鉴定编码enr还原酶的基因并使该酶在厌氧条件下在大肠杆菌中过表达[Rohdich,F.,Wiese,A.,Feicht,R.,Simon,H.和Bacher,A.(2001)Enoate reductases of Clostridia.Cloning,sequencing,andexpression.J.Biol.Chem.276,5779-5787]。
来自热醋穆尔氏菌(Moorella thermoacetica)(先前的热醋梭菌(Clostridiumthermoaceticum))的enr 2-烯酸还原酶(Y16136)EC 1.3.1.31：针对来自酪丁酸梭菌的烯酸还原酶的抗血清与嗜热性热醋梭菌的一种蛋白质交叉反应。鉴定编码该还原酶的基因，并使该酶在大肠杆菌中成功过表达[Rohdich,2001]。
除了烯酸还原酶以外，庚二酰-CoA脱氢酶(EC 1.3.1.62)应催化2-庚烯二元酸和相应CoA酯中双键的还原。在用苯甲酸盐与脱硫弧菌属(Desulfovibrio)物种菌株G11的共培养物中，或用巴豆酸酯的纯培养物中生长的Syntrophusaciditrophicus的细胞培养物中发现庚二酰-CoA脱氢酶活性，且其牵涉苯甲酸降解途径(Elshahed MS,Bhupathiraju VK,Wofford NQ,Nanny MA,McInerneyMJ.(2001)Metabolism of benzoate,cyclohex-1-ene carboxylate,andcyclohexane carboxylate by"Syntrophus aciditrophicus"strain SB in syntrophicassociation with H(2)-using microorganisms.Appl Environ Microbiol.67:1728-1738)。认为用于从巴豆酸酯形成环己烷羧酸酯的途径牵涉戊烯二酰-CoA到戊二酰-CoA和2,3-二脱氢庚二酰-CoA到庚二酰-CoA的还原。尚未鉴定负责该活性的酶但一项使用杂食脱硫球菌(Desulfococcus multivorans)非脱羧戊二酰-CoA脱氢酶(EC 1.3.99.B10)作为查询序列的BLAST搜索鉴定出S.aciditrophicus中6条注释为酰基-CoA脱氢酶的序列：YP_462067.1(73％identity),YP_460269.1(39％),YP_461117.1(36％),YP_460428.1(34％),YP_460268.1(32％)，和YP_463031.1(28％)。Wischgoll等,(2009)比较了许多戊二酰(glutaryol)-辅酶A脱氢酶的序列，并鉴定了YP_462067.1和杂食脱硫球菌基因之间的一级结构相似性，其指示前者也是脱羧性的。尽管脱氢酶反应与所需要的相反，但提出的环己烷羧酸酯形成途径指示烯酰-CoA还原在该生物体中发生。其他在数据库中发现的假定的庚二酰-CoA脱氢酶包括来自Sphingomonas macrogolitabida的ThnJ(D9PTN0)和ThnK(D9PTM9)-其在用于经由beta-氧化途径的萘满降解的基因簇中发现，来自沼泽红假单胞菌的PimC(Q6N3I0)和PimD(Q6N3I1)和来自慢生根瘤菌(Bradyrhizobium)物种的PimC(A5ES10)和PimD(A5ES09)。在选择用于表达和生物转化以评估2-庚烯二酸及其CoA酯的还原中纳入PimC/PimD。
对本发明有用的其他脱氢酶包括来自杂食脱硫球菌(Desulfococcusmultivorans)的GDH戊二酰-辅酶A脱氢酶，一种非脱羧的戊烯二酰-辅酶A-形成性戊二酰-辅酶A脱氢酶，其在专性厌氧细菌杂食脱硫球菌中表征[Wischgoll S,Demmer U,Warkentin E,Günther R,Boll M,Ermler U.(2010)Structural basis forpromoting and preventing decarboxylation in glutaryl coenzyme A dehydrogenases.Biochemistry.49:5350-5357]。将该酶过表达并测定其晶体结构，这使其成为蛋白质工程化以催化其天然C5底物戊烯二酰(glutacolnyl)-CoA和戊二酰-CoA的C7等同物(2,3-二脱氢庚二酰-CoA和庚二酰-CoA)的可逆氧化和还原的可用靶物。
3.1.2.2 含基因靶物的克隆表达载体
然后，使用inABLE技术(如3.1.1.2部分详述地)将选定的来自枯草芽孢杆菌和番茄的YqjM、OPR1和OPR3基因靶物克隆到IPTG可诱导的pET21-a主链中以生成I1(枯草芽孢杆菌YqjM基因于pET21-a)、I2(番茄OPR1基因于pET21-a)和I3(番茄OPR3基因于pET21-a)。
简言之，破坏选定的基因和载体主链中的潜在EarI位点以阻止对涉及EarI消化/连接循环的部分/接头融合物制备的干扰。在枯草芽孢杆菌YqjM烯酸还原酶基因中未观察到EarI位点，但在番茄OPR1和OPR3基因中分别检测到一个和两个EarI位点，其通过在限制性位点中掺入沉默突变受到破坏。对番茄OPR3基因序列中EarI位点1和2的破坏导致创建无意的EarI位点，其仅在序列合成后才发现。使用来自Strategene的Quikchange单定点诱变试剂盒除去剩余EarI位点。前向和反向引物设计为破坏剩余EarI位点，并将引物如3.1.1.2部分中描述的在Quikchange反应之前磷酸化。如下准备Quikchange和阴性对照反应：
反应在热循环仪中运行(95℃0.5分钟；95℃0.5分钟35循环，55℃1分钟，68℃10分钟；68℃1分钟，4℃保持)，然后在37℃用DpnI(1μL)处理来消化甲基化的亲本DNA达2小时。将消化反应液(3μL)用于转化TOP10电感受态大肠杆菌细胞，并将转化样品(100μl)铺板至LB-Kan-Agar上。在37℃过夜温育后，在Quikchange反应板上获得约100个克隆，相比之下在阴性对照板上为0。从板挑取10个克隆，纯化相应的质粒，并通过EarI消化分析。琼脂糖凝胶上300bp条带的缺失指示位于OPR3基因中的EarI位点缺失。EarI消化显示几个克隆对于剩余EarI位点的消除是阳性的。DNA测序确认了克隆的序列。
使用来自克隆3(对EarI消除阳性的克隆)的载体去转化电感受态TOP 10大肠杆菌细胞。使用QIAGEN Hi-Speed Plasmid Purification Midi Kit来从培养物制备大量DNA存库，然后使用QIAGEN PCR纯化试剂盒将DNA样品浓缩。样品的最终DNA浓度和体积为470.0ng/μl，120μl(DNA浓度199.8nM)。
在载体主链pET21-a中检测到3个EarI位点，其通过将限制性位点的最后一个鸟嘌呤(guanidine)碱基突变成胸腺嘧啶来破坏(对应于相反互补序列的第一个胞嘧啶到腺嘌呤)。
然后，将无EarI的序列用作部分设计软件的输入序列来设计由EarI位点侧接的截短部分，如3.1.1.2部分论述的。将合成的枯草芽孢杆菌YqjM(TP25)、番茄OPR1(TP26)和番茄OPR3(TP27)截短部分插入DNA2.0pJ201载体。pET21-a截短部分载体是完全合成的，其中引入包含氯霉素抗性基因的片段来生成载体TP31。
如3.1.1.2部分描述的实施inABLE寡核苷酸的磷酸化和随后的退火。
接着，通过将截短部分的5’端与其相应部分寡聚体退火的片段连接，以及截短部分的3’端与接头寡聚体退火的片段连接来制备部分接头融合物，如先前3.1.1.2部分描述的。制备对应于枯草芽孢杆菌YqjM、番茄OPR1和番茄OPR3基因的部分接头融合物，其通过连接它们相应的退火部分寡聚体、它们的截短部分和来自载体主链的退火的接头寡聚体。制备对应于载体主链的部分接头融合物，其通过连接它的退火部分寡聚体、它的截短部分和来自任一基因的退火接头寡聚体。还制备阴性对照无基因装配物，其通过连接载体主链退火的部分寡聚体、其截短部分和其退火接头寡聚体，从而导致载体主链的自身装配。
在基因和载体反应中使用比截短部分10倍和20倍摩尔过量的接头和部分寡聚体以利于截短部分和寡核苷酸在每个EarI消化/连接循环期间的连接。将50μL EarI消化/连接反应液在热循环仪(Eppendorf Mastercycler Gradient)中温育，在37℃至16℃之间变换温度。当完成循环后，将样品加载到0.7％琼脂糖凝胶上，且观察到针对以下的预期大小片段：部分接头融合物的制备，例如枯草芽孢杆菌YqjM部分/pET21-a接头和番茄OPRl部分/pET21-a接头以及3kb载体主链；或pET21-a部分/番茄OPR3接头-5.3kb和番茄OPR3部分/pET21-a接头-1.2kb以及对应于载体主链的1.8kb条带。然后，将正确大小的条带从凝胶切出，使用QIAGEN QIAquick Gel Extraction Kit凝胶提取DNA。在30μ1的总体积中，DNA浓度为从14.4ng/μl到49.6ng/μl(DNA浓度范围为5.4nM到35.6nM)。
然后，使用如3.1.1.2部分描述的2部分装配实施基因部分/接头融合物与其相应载体部分/接头融合物的组合。简言之，将基因部分接头和载体部分接头在室温温育30min，接着转化高效率OPR3化学感受态ΝΕΒ10β大肠杆菌细胞，其使用2μL装配反应液和10μL感受态细胞。将转化后的细胞铺板于LB-Amp-琼脂上并在37℃过夜温育。对于每种装配获得500个克隆。从每种装配挑取1个或2个随机克隆并使用QIAGEN QIAprep Miniprep Kit分离相应的载体。
实施限制来确认载体构建，如3.1.1.2部分描述的。简言之，使用PstI和HincII分析从装配I1获得的克隆以鉴定对于枯草芽孢杆菌YqjM基因插入到大肠杆菌pET21-l表达载体中为阳性的克隆，使用PvuI和PsiI分析从装配I2获得的克隆，且使用BglII和MluI分析从装配I3获得的克隆。将限制性产物运行在琼脂糖凝胶上，并对从每种装配测试的克隆观察预期的条带模式，从而确认携带枯草芽孢杆菌YqjM、番茄OPRl和番茄OPR3烯酸还原酶基因的大肠杆菌pET21-a表达载体的构建。另外，对载体主链3’端和基因5’端之间以及基因3’端和载体主链5’端之间的部分交界处测序以确认构建。
3.1.2.3 外源烯酸还原酶基因在大肠杆菌中的表达
最初，使用1mM IPTG和37℃诱导温度在大肠杆菌中表达克隆的烯酸还原酶基因，如上文3.1.1.3部分描述的。简言之，对于每种培养物诱导前和在诱导后各个时间点测量OD600。将诱导后24h温育后的剩余培养物转移至50mL falcon管，通过在5000rpm离心10分钟收获，并使用SDS-PAGE分析样品的蛋白质含量。在预期大小处(35kDa)的一条大蛋白条带清楚地可见于来自IPTG诱导后枯草芽孢杆菌YqjM烯酸还原酶表达研究的可溶级分。一条大条带可见于来自IPTG诱导后番茄OPR1烯酸还原酶表达的不可溶级分，表明从I2表达的预期的42kDa OPR1蛋白在大肠杆菌中不可溶。在来自IPTG诱导后番茄OPR3烯酸还原酶I3的可溶部分以及不可溶部分中均清楚地检测到在预期大小处(44kDa)的蛋白条带，表明预期的44kDa番茄OPR3烯酸还原酶蛋白在大肠杆菌中表达为部分可溶形式。
基于文献中优化的在大肠杆菌中番茄OPR1烯酸还原酶功能表达的报告，对IPTG浓度(范围为0.1-1mM IPTG)和诱导温度(范围为16-37℃)的条件进行优化以试图改进番茄OPR1烯酸还原酶在大肠杆菌中的可溶性(Strassner等.JBC 1999,274,p.35067-35073；Hall等.Angew.Chem.Int.Ed.2007,46,p.3934-3937)。将与3.1.1.3部分描述的相同的表达方案和相同的SDS-PAGE样品制备用于可溶性优化实验。
然后，对来自每种装配的时间点样品进行加工并使用SDS-PAGE进行分析，如3.1.1.3部分描述的，其显示将诱导温度降低至16℃和诱导物浓度降低至0.1mM有效使得在大肠杆菌中表达的番茄OPR1烯酸还原酶部分可溶。
将表达这3种烯酸还原酶的大肠杆菌菌株扩大规模至800ml培养并测定活性。
使用标准技术将其他烯酸还原酶XenA,TER,PECR,MECR,ACADS,PimC/PimD在大肠杆菌中表达，并在Histrap柱上纯化。
生物转化反应
评估C6(2-己烯二酸和2,3-二脱氢己二酰(adipolyl)-CoA)和C7底物(2-庚烯二酸和2,3-二脱氢庚二酰-CoA)两者的双键的还原
针对烯酰-CoA还原酶活性的酶测定法基于已公开的方法(Bergler H,等,(1993)。蛋白EnvM是大肠杆菌的NADH依赖性烯酰-ACP还原酶(FabI)。反应在磷酸盐缓冲液(100mM,pH7.5)中进行，其根据酶的辅因子需要含有300μMNADPH、NADH或FAD，和纯化的酶(25-55μg/ml)。反应通过添加底物2-庚烷二酸或2,3-二脱氢庚二酰-CoA开始。反应在30℃温育4小时，并由添加2MHCL(10％v/v)停止。产物通过LC-MS分析。对照由无底物的反应混合物和具有失活(煮沸5min)酶的反应混合物构成。
针对酰基-CoA脱氢酶活性的酶测定法基于已公开的方法(Le W,AbbasAS,Sprecher H,Vockley J和Schulz H(2000).Long-chain acyl-CoAdehydrogenase is a key enzyme in the mitochondrialβ-oxidation of unsaturatedfatty acids.Biochimica et Biophysica Acta.1485:121-128)。测定在1ml含有50mM磷酸钾、36μM二氯酚靛酚(dichlorophenolindophenol)、0.3mM N-乙基马来酰亚胺、1.5mM吩嗪硫酸甲酯、60μM酰基-CoA和酶(25-55μg/ml)的缓冲液(pH 7.6)中进行。反应通过添加吩嗪硫酸甲酯开始(Le等,2000)。
反应通过添加底物(2,3-二脱氢庚二酰-CoA或2-庚烯二酸)(60μM)开始。反应在30℃进行4小时，然后通过以10％终体积添加2M HCl停止。产物通过LC-MS分析。使用的对照是无底物的反应和具有煮沸酶的反应。
结果：ACADS,PimD,TER和XenA催化2-己烯二酸到己二酸的还原(见图27A)。MECR,PER,TER和XenA催化反式-2,3-二脱氢己二酰-CoA到己二酰-CoA的还原(见图27B)。在测试的反应条件下没有观察到通过这些酶的相应C7底物的形成，表明所述酶对于C72-烯基底物具有更低的活性且将需要酶工程化来改进要有用的酶的活性。
3.1.3  通过脂肪酰基CoA还原酶(形成醛的FAR)(EC 1.2.1.50)或酰基-[acp]还原酶(EC 1.2.1.80)的庚二酰-CoA和庚二酰-[acp]到庚二酸半醛的转化(见图2)。
3.1.3.1靶酶的选择
脂肪酰基CoA还原酶涉及植物和其他更高等真核生物中的蜡酯合成用于表皮蜡形成。在古细菌和细菌中，这些酶涉及长链烷生物合成，尽管其在这些生物体中的生理学功能并非总是清楚的。植物中蜡酯的形成开始于酰基CoA的延伸以形成长链脂肪酸(LFCA)(或脂肪酰基CoA)，然后其经由脱羰途径或酰基CoA还原途径还原(Cheesbrough和Kolattukudy,1984)。
经由脱羰途径形成烃。该途径由脂肪酰基CoA还原酶催化的反应启动以产生醛，接着通过醛脱羰基酶催化的脱羰作用得到[Cn-1]烷(Cheesbrough和Kolattukudy,1984)。
酰基CoA还原途径还由LCFA到醛的还原启动，接着是通过醛还原酶对醛的进一步还原以产生偶数链的伯醇(Millar等,1999)(Kolattukudy,1971)。认为类似的途径存在于原核生物中(Schirmer等,2010)。
两种途径均通过可逆反应中由脂肪酰基CoA还原酶(FAR；EC 1.2.1.50)催化的长链酰基CoA到醛的还原启动。在酰基CoA还原途径中，醛被进一步还原成醇。根据生物体的不同，这可在一个或两个步骤中实现。两步骤还原使用酰基-CoA还原酶催化的反应启动，其释放脂肪醛用于由脂肪醛还原酶催化的第二还原。一步骤还原由双功能酰基CoA还原酶催化，其将酰基CoA直接还原成醇，而不释放醛中间物。如此，脂肪酰基CoA还原酶可粗略成分成两种类型：(1)形成醇的酰基-CoA还原酶和(2)生成醛的酰基-CoA还原酶。在原核和真核生物中有两种类型的例子。由于靶物是庚二酰半醛，因此生成醛的脂肪酰基CoA还原酶是用于还原庚二酰CoA的最有希望的候选物。
初步文献和数据库搜索揭示，通过序列同源性研究或鉴定的绝大部分酰基-CoA还原酶是真核和原核生物中的形成醇的FAR。然而，生成醛还原酶的一个较早例子来自乙酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)-Acrl。因此，将该酶的一级序列用于数据库搜索其他生成醛的酶。
酰基-CoA还原酶的一般性规则似乎是，较短的蛋白质(295-350aa)倾向于是生成醛的酶，而更长的多肽(500+aa)是醇生产者。然而，保存在数据库中的大多数较短酶具有推定或假设的注释而没有序列数据之外的别的信息，且因此不将其考虑在内。
使用下列标准来选择候选物：(l)酶必须仅生成醛或存在通过蛋白质工程消除醇形成的机会；(2)必须有存在蛋白质的证据，即已鉴定出蛋白质并在细胞级分中纯化或分离；(3)酶使用酰基CoA或酰基ACP底物测试过；(4)酶不能是多酶复合物的一部分，除非已显示活性独立于该复合物。一旦鉴定出候选物，就进行其他生物信息学和文献搜索以提供另外的数据来对选择分级。
表1显示针对已知形成醛的酶(Acrl)进行的数据库搜索的结果。已纯化每种候选物并在体外测定。对候选物分级并依照其适宜性分组。级别高的酶(1-3)视为用于进一步研究的最佳候选物，中等级别的酶(4和5)视为较好的候选物但可能需要进一步研究，而较低级别的酶(6)将需要更多努力以获得酶活性数据(因为没有蛋白质序列且缺少测过序的基因组)。
表1.来自各种生物体的候选的形成醛的酰基CoA还原酶.
*证据水平：酶活性意指已异源或同源纯化酶，或已在粗提取物或其他细胞级分中测量活性
乙酸钙不动杆菌Acrl(P94129)(Reiser,S.和Somerville,C.(1997):Isolation of mutants of Acinetobacter calcoaceticus deficient in wax estersynthesis and complementation of one mutation with a gene encoding a fatty acylcoenzyme A reductase.J Bacteriol 179,2969-2975)：已纯化了一种生成醛的酰基CoA还原酶，其含有295个氨基酸，分子量为32.5kDa。已在大肠杆菌中表达该酶，且无细胞提取物显示含有酰基CoA还原酶活性。测定长度从C12到C24的酰基CoA底物(但并非C-奇数底物)。除了C12底物以外，在所有情况中均生成相应的醛。值得进一步检查该酶的底物范围并测试其在更短长度酰基CoA上的活性。即使庚二酰CoA不是底物，也存在定向进化以扩展底物范围的余地。该酶已在一项关于增强脂肪酸衍生物产生的专利中直接提述(US20110256599)。
来自细长聚球蓝细菌PCC 7942的AAR(YP_400611)(Schirmer,A.,Rude,M.A.,Li,X.,Popova,E.和Del Cardayre,S.B.(2010).Microbial Biosynthesis ofAlkanes.Science 329,559-562)：该酰基ACP还原酶在蓝细菌细长聚球蓝细菌中且命名为AAR。认为该酶牵涉烷生物合成。已在大肠杆菌MG1655中表达并纯化该酶。CoA和ACP衍生物均为底物。如此，从油酰-CoA和油酰-ACP形成十八醛而无脂肪醇形成。然而，油酰-ACP是优选的底物，其具有8μΜ的KM，相比于油酰-CoA的130μΜ。该酶是NADPH依赖性的且需要镁用于活性。未测试其他底物。对醛形成的选择性和对CoA衍生物的活性使得该酶是测试庚二酰-CoA还原的较好的候选物。此外，在紧密相关的生物中有许多该基因的直系同源物(Schirmer等,2010)，不过AAR是研究得最好的。以下专利与(Schirmer等.,2010)的工作有关：WO 2009/140695和WO 2009/140696。
来自明亮发光杆菌的LuxC(BAF92773)(Boylan,M.,Miyamoto,C,Wall,L.,Graham,A.和Meighen,E.(1989).Lux C,D and E genes of the Vibriofischeri luminescence operon code for the reductase,transferase,and synthetaseenzymes involved in aldehyde biosynthesis.Photochemistry and photobiology 49,681-688；Lee,C.Y.和Meighen,E.A.(1997).Cysteine-286as the site of acylationof the Lux-specific fatty acy1-CoA reductase.Biochim Biophys Acta 1338,215-222；Wang,X.和Kolattukudy,P.E.(1995).Solubilization and purification ofaldehyde-generating fatty acyl-CoA reductase from green alga Botryococcusbraunii,FEBS Lett 370,15-18)：LuxC是由脂肪酰基CoA还原酶、脂肪酰基合成酶和脂肪酰基硫酯酶组成的多酶复合物(LuxCDE)的一部分，且涉及生物发光。LuxC是一种研究较多的酶，且已在大肠杆菌中克隆、表达和纯化。该酶对C14底物十四酰-CoA(肉豆蔻酰-CoA)展现出酰基CoA还原酶活性，将其还原成相应的醛十四醛。未测试其他底物。尽管LuxC在体内是多亚基复合物的部分，但已从野生型生物成功纯化出该酶，并且已从大肠杆菌表达并部分纯化。在两种情况中，LuxC的活性均独立于其他亚基。这使得LuxC成为将庚二酰-CoA转化成庚二酸半醛的较好的候选物。
来自Marinobacter aquaeolei VT8的FAcoAR(YP_959769.1)(Willis,R.M.,Wahlen,B.D.,Seefeldt,L.C.和Barney,B.M.(2011).Characterization of afatty acyl-CoA reductase from Marinobacter aquaeolei VT8:a bacterial enzymecatalyzing the reduction of fatty acyl-CoA to fatty alcohol.Biochemistry 50,10550-10558)：该脂肪酰基CoA还原酶(称为FAcoAR)是最近在γ变形菌门(gamma proteobacterium)Marinobacter aquaeolei VT8中发现的。它是双功能酰基CoA还原酶的第一个原核生物例子，其催化酰基CoA衍生物还原成醇。至关重要地是，它是唯一一种已用少于C12的底物测试的酶，且在体外对辛酰-CoA显示活性(Willis等.,2011)。尽管该酶从酰基CoA生成醇，但将其纳入的原因是有清楚的证据表明它具有范围从辛酰-CoA(C8)到花生四烯酰-CoA(C20)的广泛底物范围。此外，C末端显示对Acrl酶的高度序列同源性，因此N末端区域可能是形成醇的域。因而，值得去测试除去编码多肽N末端区域的基因的效果，目标是生成功能性的生成醛的酶。此办法的一个潜在问题是该酶可能是无活性的，或者可能不从截短的酶复合物释放醛。未测试该酶对酰基ACP衍生物的活性。
来自Marinobacter aquaeolei VT8的FAR(YP_959486)(Hofvander,P.,Doan,T.T.P.和Hamberg,M.(2011).A prokaryotic acyl-CoA reductaseperforming reduction of fatty acyl-CoA to fatty alcohol.FEBS Letters 585,3538-3543)：该脂肪酰基CoA还原酶(称为FAR)最初鉴定为脂肪醛还原酶(Wahlen,B.D.,Oswald,W.S.,Seefeldt,L.C.和Barney,B.M.(2009).Purification,characterization,and potential bacterial wax production role of anNADPH-dependent fatty aldehyde reductase from Marinobacter aquaeolei VT8.Appl Environ Microbiol 75,2758-2764)，但后来显示为具有酰基CoA还原酶活性(Hofvander,P.,Doan,T.T.P.和Hamberg,M.(2011).A prokaryotic acyl-CoAreductase performing reduction of fatty acyl-CoA to fatty alcohol.FEBS Letters585,3538-3543)。它与上述脂肪酰基CoA还原酶非常相似，但已知其还作用于酰基ACP衍生物。对C16-CoA到长达C20-CoA观察到活性，但还未用更短的底物测试。该酶为513个氨基酸长，且具有与Acrl相同的与醛生成有关的C末端域。可行的是，该酶还能被截短，这会意味着如先前描述的切去N末端区域。不清楚FAR和FacoR是否是完全不同的酶，因为有两个分开的(且在竞争的)研究组研究它们。
来自丛粒藻的生成醛的酰基CoA还原酶(AAB35106)(Wang,X.和Kolattukudy,P.E.(1995).Solubilization and purification of aldehyde-generatingfatty acyl-CoA reductase from green alga Botryococcus braunii.FEBS Lett 370,15-18)：该酶是一种来自微藻类(microalga)丛粒藻的生成醛的酰基CoA还原酶。已从野生型生物体纯化出该酶并使用经标记的活化脂肪酸[1-14C]-棕榈酰-CoA测定。显示该酶产生相应的醛并且是NADH依赖性的。还未研究底物范围，且这需要得到解决。此外，需要克隆该蛋白质，在大肠杆菌中表达并纯化。登录号AAB35106指来自该纯化酶的部分26个氨基酸的N末端序列。完整蛋白质序列未存放在UNIPROT、BRENDA或NCBI数据库上。对基因组的测序正在进行中(http://www.jgi.doe.gov/)。有使用针对N末端序列的引物来分离该基因的机会，但该酶信息的一般性缺乏可能会使其开发用于代谢工程复杂化。
如此，已鉴定出许多酰基CoA还原酶，其为用于测试将庚二酰-CoA还原成庚二酰半醛的适宜的候选物。来自乙酸钙不动杆菌的酶Acrl似乎是最佳的候选物，因为它是鉴定出的酶中表征最佳的，尽管没有关于对短链、C-奇数底物的信息。如果初始测试表现为阴性，那么该酶仍将是用于定向进化以获得庚二酰CoA还原的较好靶物。
来自细长聚球蓝细菌的AAR及其直系同源物以及LuxC也是有希望的候选物。尽管这些酶在相对长链的脂肪酰基CoA底物上操作，但还未针对短链底物测试它们。再一次地，如果初始测试为阴性，那么定向进化可提供一种获得期望的底物选择性的有希望的路径。
来自M.aquaeolei VT8的两种酶也可是有希望的，尽管可能需要一些蛋白质工程来阻止醛的氧化。这些酶是适宜的候选物，因为它们是鉴定的所有脂肪酰基CoA还原酶中已知作用于最短链脂肪酰基CoA的。还未鉴定编码来自丛粒藻的酶的基因。这使得其成为最难进行工作的酶，但如果其他选项不成功，也能对其进行研究。类似的酶在更高等植物(例如豌豆)中是已知的，且提供了测试的别的选项，但它们仍是未得到较好表征的。
如此，已选择了上述6种酶，因为存在已将其制备、在细胞级分中重组或天然地纯化(部分或全部)并在体外测定的文献报告。除了来自丛粒藻的酶以外，它们的核苷酸序列和一级氨基酸序列存放在主要蛋白质数据库BRENDA和UNIPROT上。已在同行评审的期刊中公开了研究的结果。测试的底物范围从辛酰-CoA(C8)至花生四烯酰-CoA(C20)，且在来自细长聚球蓝细菌的AAR的情况中还包括酰基ACP作为底物。形成相应的醛作为产物。然而，迄今为止，还未用庚二酰-CoA或任何其他C-奇数底物测试所述酶，推测起来是因为这些底物的代谢总是假定为遵循与C-偶数底物相同的模式，而且直到今天，也没有理由去针对这些底物测试它们。因此，高度可能的是，所述酶将催化庚二酰-CoA的还原。即使庚二酰CoA并非底物，但所述酶也会提供定向进化或靶向蛋白质工程的较好的起点。
用于将庚二酰-CoA转化成庚二酸半醛的EC 1.2.1.50中长脂肪酰基CoA还原酶中的其他候选物包括但不限于，来自以下生物的还原酶：豌豆(Vioque等.,1997.Resolution and purification of an aldehyde-generating and analcohol-generating fatty acyl-CoA reductase from Pea leaves(Pisum sativum L.),Archives of Biochemistry and Biophysics,340(1),64-72)；费氏弧菌(Vibrio fischeri)(P12748)(Boylan等.,1985.Functional identification of the fatty acid reductasecomponents encoded in the luminescence operon of Vibrio fischeri,Journal ofBacteriology,163(3),1186-1190)；甘蓝(Brassica oleracea)和油菜(B.napus)(Q39342)(Kolattukudy,1971.Enzymatic synthesis of fatty alcohols in Brassicaoleracea.Archives of Biochemistry and Biophysics,142(2),701-709)；丁酸梭菌(Clostridium butyricum)(Day等.,1978.Partial purification and properties ofacyl-CoA reductase from Clostridium butyricum,Archives of Biochemistry andBiophysics,190(1),322-331)；Anas platyrhynchos(Ishige,T.；Tani,A.；Takabe,K.；Kawasaki,K.；Sakai,Y.；Kato,N.Wax Ester Production from n-Alkanes byAcinetobacter sp.Strain M-1:Ultrastructure of Cellular Inclusions and Role of AcylCoenzyme A Reductase.Appl Environ Microbiol 2002,68,1192-1195)；拟南芥(Arabidopsis thaliana)(Doan,T.T.P.；Carlsson,A.S.；Hamberg,M.；Bülow,L.；Stymne,S.；Olsson,P.Functional expression of five Arabidopsis fatty acyl-CoAreductase genes in Escherichia coli.Journal of plant physiology 2009,166,787-796；Hooks,M.A.；Kellas,F.；Graham,I.A.Long-chain acyl-CoA oxidases ofArabidopsis.Plant J.1999,20,1-13)；人(R.P.；Wang,Y.；Mohsen,A.-W.；He,M.；Vockley,J.；Kim,J.-J.P.Structural basis for substrate fatty acyl chain specificity:crystal structure of human very-long-chain acyl-CoA)。
从上文描述的EC 1.2.1.50中的这些醛形成脱氢酶，选择LuxC-来自明亮发光杆菌的NADPH特异性酰基-CoA还原酶(登录号BAF92773.1)作为例子来显示庚二酸半醛从庚二酰-CoA的形成。其他有意思的脱氢酶可见于EC1.2.1.76和EC 1.2.1.10.，例如克氏梭菌DSM555具有CoA依赖性琥珀酸半醛脱氢酶(SucD,EC 1.2.1.76,登录号AAA92347.1)，以及2种其他可以用于将庚二酰-CoA转化成庚二酸半醛的醛脱氢酶(登录号EDK34221.1)和乙醛脱氢酶(EC 1.2.1.10,登录号EDK33116.1)。选择EC 1.2.1.10中的一种另外的酶PduB，其为来自费氏丙酸杆菌(Propionibacterium freudenreichii)亚种Shermanii的CoA依赖性丙醛脱氢酶(登录号D7GD28)。
使用标准技术将这5种选定的酶克隆到pET151/Topo载体中并在大肠杆菌BL21(DE3)或Rosetta2(DE3)中表达。活性通过在340nm监测以乙酰-CoA作为底物以及以己酰-CoA的反应中NADH或NADPH的消失来确认。在不溶性级分中获得来自克氏梭菌的SucD酶，且不能在可溶性级分中检测到活性，因此在随后的生物转化测定法中使用克氏梭菌的破裂细胞悬液。
在需氧条件下实施生物转化以测定所述酶对庚二酰-CoA的活性，纯化的(Histrap柱)酶在大肠杆菌中产生。在96孔板中准备250uL的总反应体积，由DTT(5mM),MgSO4(5mM),NADH(1.2mM),tris缓冲液(50mM,pH7.5)中己二酰-CoA或庚二酰-coA(1mM)构成。反应通过添加10至15uL在大肠杆菌中制备的蛋白质可溶级分开始。每种反应一式三份地完成。“对照”通过将酶制备物用Tris(50mM,pH7.5)替换来准备。该对照一式三份地准备。“对照酶”使用上文所述混合物制备，但是对于每种酶制备物将己酰-CoA用水替换。该对照一式三份地完成。
平行准备所有混合物(“测定”、“对照缓冲液”、“对照酶”)并在96孔板中在37或32℃于200rpm摇动下过夜温育，接着离心。将上清液添加到适宜的LC/MS 96孔板以通过LC/MS分析。
如下实施生物转化以测定使用克氏梭菌的酶级分的庚二酰-CoA到庚二酸半醛的还原：
克氏梭菌的培养和酶级分制备
将克氏梭菌的2种菌株(DSM555和DSM563)在烧瓶中的40mL经改良DSM-52培养基中的乙醇(20mL/L培养液)和琥珀酸盐(5g/L)上生长，该培养基含有：K2HPO4(0.31g/L),KH2PO4(0.23g/L),NH4Cl(0.25g/L),MgSO4x7H2O(0.20g/L)、微量元素溶液SL-10(1mL)(10mL HCl(25％,pH7.7M)/L溶液；1.5g/L FeCl2x4H2O；70mg/L ZnCl2；100mg/L MnCl2x4H2O；6mg/L H3BO3；190mg/L CoCl2x6H2O；2mg/L CuCl2x2H2O；24mg/LNiCl2x6H2O；36mg/L Na2MoO4x2H2O),亚烯酸-钨酸盐溶液(1mL)(0.5g/LNaOH,3mg/L Na2SeO3x5H2O；4mg/L Na2WO4x2H2O),酵母提取物(1g/L),刃天青(resazurin)90.5g/L),NaHCO3(2.5g/L),七维生素溶液(1mL)(100mg/L维生素B12；80mg/L对氨基苯甲酸；20mg/L D(+)-生物素；200mg/L烟碱酸；100mg/L泛酸钙；300mg/L盐酸吡哆醇；200mg/L硫胺-HClx2H2O),cysteine-HClxH2O(0.25g/L),Na2Sx9H2O(0.25g/L)。该培养基严格厌氧性制备。
在30℃生长4-5天后，收获培养物并对团粒称重。使用酵母提取试剂在1h内用氮气冲盈来裂解团粒。所有规程均在厌氧橱柜内实施。在例示反应中使用从克氏梭菌培养物获得的可溶性级分。
如下在厌氧橱柜内使用来自克氏梭菌菌株的酶级分实施生物转化反应：反应在Tris缓冲液(50mM,pH7.5),DTT(5mM),MgSO4(5至10mM),NADH(1mM),NADPH(1mM),己二酰辅酶A或庚二酰辅酶A(0.5至1mM)中以总体积200uL进行。反应通过添加15uL酶制备物(可溶或不可溶级分)开始。这些反应一式三份地完成。“对照缓冲液”通过将酶制备物用Tris(50mM,pH7.5)替换来制备。该对照一式三份地制备。平行准备所有混合物(“测定”、“对照缓冲液”)并在96孔板中在30℃(或对于明亮发光杆菌为22℃)于200rpm摇动下过夜温育，接着离心。将上清液添加到适宜的LC/MS 96孔板以通过LC/MS分析。
使用与1290Infinity LC和HTC/HTS自动取样器(Agilent)偶联的6538Accurate-mass Q-TOF来实施己二酸-(C6-)和庚二酸-(C7-)半醛的检测。将Synergi-2.5u FusionRP柱(Phenomenex,Ref:00B-4423-B0)用于分析。以负模式检测C6-和C7半醛的可信标准，其使用补充有0.1％(v/v)甲酸的超纯水和补充有5％(v/v)超纯水的乙腈作为运行缓冲液。将用于检测半醛可信标准的方法用于分析反应。
在大肠杆菌中表达且在可溶性级分中获得的在需氧条件下测定的酶中，所有酶均对乙酰-CoA和己酰-CoA展现可检测活性，如分光光度法测定的。然而，仅来自费氏丙酸杆菌亚种Shermanii的CoA依赖性丙醛脱氢酶(登录号D7GD28)从庚二酰-CoA产生庚二酸半醛(如通过LC-MS测定的)，尽管事实上仅在可溶性级分中获得一小部分的该酶。已知来自克氏梭菌的酶是氧敏感性的，因此对来自克氏梭菌的3种酶观察到的缺乏活性可能是由于测定条件。如此，将在厌氧条件下以琥珀酸盐作为培养基中的诱导物产生的、并在天然菌株中在厌氧条件下测定的克氏梭菌细胞级分用于测定SucD(EC 1.2.1.76)的活性。使用的克氏梭菌的两种菌株(DSM555&DSM563)的酶级分均从庚二酰-CoA产生可检测量的庚二酸半醛，如通过LC-MS分析的。
3.1.4  通过羧酸还原酶(EC 1.2.99.-)将庚二酸转化成庚二酸半醛
3.1.4.1 羧酸还原酶靶物的选择、克隆和表达
用于将庚二酸还原成庚二酸半醛的酶靶物选自羧酸还原酶家族(EC1.2.99.-，如EC 1.2.99.6)。具体地，诺卡氏菌羧酸还原酶是一种单体酶，其对芳香族底物展现出较大的底物特异性，并在大肠杆菌中成功克隆和表达(Nocardia sp.Carboxylicacid reductase:Cloning,expression,andcharacterization of a new aldehyde oxidoreductase family:He等.Appl.Environ.Microbiol.2004,70,1874-1881)。因此，该酶是用于监测庚二酸到庚二酸半醛转化的初始筛选的较好的候选物。
将诺卡氏菌属物种羧酸还原酶(CAR)基因(GeneBank AY495697)连同诺卡氏菌磷酸泛酰巯基乙胺(phosphopantetheine)转移酶(PPTase)一起在大肠杆菌BL 21中表达，并在细胞裂解和离心以除去不可溶级分后用作无细胞提取物。(参见Venkitasubramanian,P.；Daniels,L.；Rosazza,J.P.N.Reduction ofcarboxylic acids by Nocardia aldehyde oxidoreductase requires aphosphopantetheinylated enzyme.J Biol Chem 2007,282,478–485.)
然后使用标准条件(1mM IPTG，37℃诱导前和诱导后温度)启动表达研究，且依照先前报告的方案在IPTG诱导下在大肠杆菌中表达，并扩大规模以产生足够的蛋白质用于活性测定。
3.1.4.3 活性测定
活性测定基于对苯甲酸钠(作为阳性对照)和庚二酸钠的CAR活性的分光光度检测。测定的条件取自Applied and Environmental Microbiology 2004,70,pl874-1881。
每份测定包含从一份储液(200μl)加在一起的终浓度为50mM的底物(100μl)、100mM氯化镁(100μl)、50mM tris-盐酸、1mM乙二胺四乙酸、1mM二硫苏糖醇，10mM腺苷三磷酸(100μl)，1.5mM烟碱胺-二核苷酸磷酸水合物(还原的)(100μl)和生物催化剂，其作为无细胞提取物添加以产生终浓度为4.3g/L的全细胞当量。反应在环境温度(～20degC)在2mL小管中于pH 7.5进行。每次测定首先添加氯化镁(100μl)、50mM tris-盐酸、1mM乙二胺四乙酸、1mM二硫苏糖醇(200μl)、10mM腺苷三磷酸(100μl)和1.5mM烟碱胺-二核苷酸磷酸水合物(还原的)(100μl)，并从时间0(0s)至2分钟(120s)以30秒(30s)为时间间隔来记录吸光度测量。然后充满生物催化剂，并从时间0(0s)至2分钟(120s)以30秒(30s)为时间间隔来记录吸光度。最后，充满底物，并从时间0(0s)至3分钟(180s)以30秒(30s)为时间间隔来记录吸光度。
来自羧酸还原酶测定的结果
在图13中给出了对于上文每种测定测量随时间的NADPH消耗的分光光度计测定的结果。在校正NADPH消耗的背景速率时，(使用底物和携带空载体的生物催化剂的阴性对照实验，表2)，己二酸和庚二酸两者显然以比模式底物苯甲酸更高的速率还原。如此，成功地证明该羧酸还原酶消耗了NADPH且具有对苯甲酸钠、己二酸和庚二酸的活性。
表2
NADPH消耗(未校正) NADPH消耗(校正背景)
苯甲酸钠 -0.00172 -0.00091
己二酸 -0.00125 -0.00180
庚二酸 -0.00096 -0.00103
如此，来自诺卡氏菌属的CAR以>100％的对苯甲酸的活性催化庚二酸到庚二酸半醛的还原。其他适于还原庚二酸的来自EC 1.2.99.6的酶包括例如灰色链霉菌(Streptomyces griseus)的酶(Suzuki等.,2007.GriC and GriD constitutea carboxylic acid reductase involved in grixazone biosynthesis in Streptomycesgriseus.J Antibiot(Tokyo).Jun；60(6):380-7)。另外，ThnG，鞘氨醇单胞菌属和贪铜菌属物种中的一种非酰化醛脱氢酶，在萘满降解期间将庚二酸半醛转化为庚二酸(见图8)并且可以是可逆的。
3.1.5  通过硫酯水解酶(EC 3.1.2.-)、庚二酰-CoA连接酶(EC 6.2.1.-)或CoA转移酶(EC 2.8.3.-)的庚二酰-CoA和/或庚二酰-[acp]到庚二酸的转化
能够催化CoASH的水解或转移的酶包括来自EC 3.2.1.-的硫酯水解酶，如EC 3.1.2.2、EC 3.1.2.3、EC 3.1.2.18；3.1.2.19、3.1.2.20、EC 3.1.2.21，来自EC 6.2.1.-的酸-硫醇连接酶，如EC 6.2.1.3、EC 6.2.1.5；EC 6.2.1.14、EC6.2.1.20；EC 6.2.1.23，和来自EC 2.8.3.-的CoA转移酶，如EC 2.8.3.12和EC2.8.3.13，或催化CoA到庚二酸的可逆转移的ThnH的基因产物(AroaLópez-Sánchez,Belén Floriano,Eloisa Andújar,Maria JoséHernáez和EduardoSantero,2010.Tetralin-Induced and ThnR-Regulated Aldehyde Dehydrogenaseandβ-Oxidation Genes in Sphingomonas macrogolitabida Strain TFA.Appl.Environ Microbiol.76:110-118)。在那3个家族中，硫酯酶代表了用于水解庚二酰-CoA的最佳候选物，因为其有大量的表征过的酶及其就链长度(C-3到C-26)而言和官能团(二羧基-CoA底物)而言的广泛底物特异性。
3.1.5.1酸-硫醇连接酶(EC 6.2.1.-)和CoA转移酶(EC 2.8.3.-)
酸硫醇连接酶催化碳-硫键的形成和伴随的腺苷三磷酸的水解(ATP)。尚未严格或系统性地测试CoA连接酶的可逆性。没有可获的晶体结构，因而活性位点结构是未知的。因此，不清楚可逆反应是否需要AMP、焦磷酸盐或镁离子，且应当在这些辅因子组合的存在或缺乏下完成体外测定。当然，最终目的是获得全细胞中的可逆反应，而这可能是更具挑战性的。途径中的后续反应当然会使平衡朝向硫解方向。但是，这可能是一种难以逆转的反应，因为ATP水解和其后的焦磷酸水解使得前向反应放能。因此，重要的是在试图工程化细胞之前测量不同ATP:AMP比率对体外反应可逆性的影响。如果ATP:AMP比率是关键的，那么可能需要操纵细胞能量负荷以使得胞内ATP浓度低至足以允许反应进行。这相应地可能导致获得较好生产力的另外的困难，因为可能需要使用ATP合酶抑制剂或解偶联剂来实现足够低的ATP浓度。从原理上将，这些问题中没有不能克服的，但工程化生物催化剂的开发可能变得复杂化。酰基CoA的水解因此会需要在酸硫醇连接酶催化的反应期间ATP的生成，所述反应相比于逆反应是热力学不利的：
然而，如果发现可逆，这些酶仍然是有用的。已知几种CoA连接酶作用于庚二酰-CoA：
BioW(Uniprot:P22822)–来自Lysinibacillus sphaericus(球形芽孢杆菌)
使用无细胞提取物发现球形芽孢杆菌中的庚二酸CoA合酶(6-羧基己酸-CoA连接酶)。它涉及生物素生物合成途径。通过与7-酮-8-氨基壬酸合成酶偶联的反应和使用酿酒酵母的微生物测定法间接测定该酶活性[l]。与7-酮-8-氨基壬酸合成酶(bioF)一起鉴定出编码庚二酸CoA合酶(bioW)的基因，其通过用具有来自球形芽孢杆菌基因组序列的库对大肠杆菌突变体的互补研究[Gloeckler R,Ohsawa I,Speck D,Ledoux C,Bernard S,Zinsius M,Villeval D,Kisou T,Kamogawa K,Lemoine Y.(1990)Cloning and characterization of theBacillus sphaericus genes controlling the bioconversion of pimelate intodethiobiotin.Gene.87:63-70]。在大肠杆菌中过表达BioW并纯化至均质[PlouxO,Soularue P,Marquet A,Gloeckler R,Lemoine Y.(1992)Investigation of thefirst step of biotin biosynthesis in Bacillus sphaericus.Purification andcharacterization of the pime1oyl-CoA synthase,and uptake of pimelate.BiochemJ.287:685-690]。该酶在庚二酸二钠、ATP、CoASH和MgCl2的存在下有活性。反应产物为庚二酰-CoA和AMP，未检测到ADP。该酶仅对ATP和庚二酸盐为特异性的。不接受其他核苷酸(如GTP、AMP)和备选底物(琥珀酸、戊二酸、己二酸、辛二酸)。
来自门多萨假单胞菌35的PauA(GenBank:AJ012480.1)(EC 6.2.1.14)
分解代谢性庚二酰-CoA连接酶pauA牵涉门多萨假单胞菌35中二羧酸(C6-C10)的降解[Binieda A,Fuhrmann M,Lehner B,Rey-Berthod C,Frutiger-Hughes S,Hughes G,Shaw NM.(1999)Purification,characterization,DNA sequence and cloning of a pimeloyl-CoA synthetase from Pseudomonasmendocina 35.Biochem J.340:793-801]。该酶活化二羧酸，其然后经由beta-氧化途径代谢。将该酶纯化至均质并测定部分氨基酸序列。PauA显示比bioW更广的底物范围，且接受庚二酸(100％相对活性)、己二酸(72％)和壬二酸(18％)。该酶有比涉及生物素生物合成途径的bioW高1至2个数量级的活性。鉴定了基因pauA并在大肠杆菌中成功过表达该连接酶。来自门多萨假单胞菌的连接酶pauA由于其底物范围和比活性被选为来自该类的一个例子(优选的底物是庚二酸，Binieda等,1999.Purification,characterization,DNA sequenceand cloning of a pimeloyol-CoA synthetase from Pseudomonas mendocina 35.Biochem.J.340:793-801)。
一种备选可以是沼泽红假单胞菌pimA，其类似地已在大肠杆菌中表达并显示为具有连接酶活性和广泛的底物范围(C7-C14二羧酸)，尽管庚二酸并非是优选的底物(Harrison和Harwoo,2005.The pimFABCDE operon fromRhodopseudomonas palustris mediates dicarboxylic acid degradation andparticipates in anaerobic benzoate degradation.Microbiol.151:727-736)。因此，来自门多萨假单胞菌的pauA基因似乎是更好的选择且被选来例示。
来自Thermococcus kodakaraensis的SCS(Uniprot Q5JEN7)(EC 6.2.1.5)
来自超嗜热古生菌Thermococcus kodakaraensis(SCSTk)的琥珀酰-CoA合成酶是一种由TK1880(α-亚基)和TK0943(β-亚基)编码的异聚酶(α2β2)。SCS催化琥珀酰-CoA到琥珀酸和CoA的可逆转化，伴随ADP/GDP的底物水平磷酸化。SCSTk是相对特异性的，仅对几种酸展现相关活性水平。SCSTk对琥珀酸、异戊酸和3-甲基硫代丙酸的活性水平和动力学参数表明该酶牵涉Glu,Leu和Met的分解代谢。然而，考虑到ACS IITk也对后两种底物展现较高的活性水平，SCSTk的主要生理学作用最可能是从琥珀酰-CoA生成ATP。SCSTk是一种可逆酶且其对于己二酸展现59％的天然底物活性(Shikata等,2007.JBiol Chem,282:26963-26970)，因此似乎是一种合适的候选物。
来自巨大芽孢杆菌的庚二酰-CoA合成酶
将该酶纯化约34倍，连同79％的回收[Izumi Y,Morita H,Tani Y,Ogata K.(1974)The pimeloyl-CoA synthetase responsible for the first step in biotinbiosynthesis by microorganisms.Agr.Biol.Chem.38,2257-2262]。该反应需要庚二酸、ATP、CoASH和MgCl2。该酶仅对庚二酸是特异性的，且不接受其他二羧酸。有意思的是，ATP能用ADP替换，表明焦磷酸切割是非必要的。氨基酸和核苷酸序列未知。然而，从1974年起已公开了巨大芽孢杆菌的3种完整基因组。因此，进行了针对bioW同源物的BLAST搜索。不幸地是，没有显示任何匹配。
来自Lavandula vera L的植物庚二酰-CoA合酶
已描述了薰衣草(lavender)细胞培养物中的庚二酰-CoA合酶活性[6]。尽管发现[3H]-庚二酸是生物素生物合成中的前体，但没有关于该酶或基因的可获数据。
来自豌豆的植物可溶性酰基CoA合成酶
在豌豆蛋白提取物的可溶级分中发现活性[7]。该酶需要ATP/Mg2+和CoASH。通过western印记技术使用针对来自Lysinibacillus sphaericus的连接酶的多克隆抗体测定该连接酶的分子量。该酶接受庚二酸以及壬二酸，但不接受壬酸。可代替ATP使用GTP，但对ADP未观察到反应。未鉴定编码可溶性庚二酰-CoA合成酶的基因。
来自豌豆的植物过氧化物酶体酰基CoA合成酶
该酶位于过氧化物酶体蛋白级分中[GerblingH,AxiotisS,Douce R.(1994)A new acyl-CoA synthetase,located in higher plant cytosol.J Plant Physiol.143:561-564.]。将庚二酸活化成庚二酰-CoA，然后通过beta-氧化途径降解成乙酰-CoA和丙二酰-CoA。未测试该酶的底物范围。它显示比来自相同生物的可溶性酰基CoA合成酶更高的pH最适度。
来自褐家鼠(Rattus norvegicus)的二羧酸-CoA连接酶
通过来自大鼠肝的微粒体蛋白级分的二羧基-CoA合成酶将二羧酸(C5-C16)转化成其CoA酯[Vamecq J,de Hoffmann E,Van Hoof F.(1985)Themicrosomal dicarboxylyl-CoA synthetase.Biochem J.230:683-693.]。该酶使用ATP而非GTP。该反应受到其产物的抑制，且AMP比焦磷酸盐更具抑制性。该酶对C12底物显示最高活性。在二羧基-CoA合成酶的一些测定法中，CoA消耗的稳定高度之后是CoA释放。这是一项重要的观察结果，因为它表明该反应可能是可逆的。然而，应有点小心地对待这一提示，因为蛋白质样品可能已被CoA硫酯酶污染。该酶可能是有希望的，但对褐家鼠基因组序列的BLAST搜索未揭示任何bioW或pauA同源物。将需要一种备选的办法来鉴定该基因，所述方法例如酶纯化、N末端测序、引物设计和PCR扩增。
来自未鉴定细菌，LP-1菌株的庚二酰-CoA合成酶
在富集生长于硝酸钠和庚二酸盐的、来自活化淤泥的脱硝细菌环境培养物中发现该活性[Gallus C,Schink B.(1994)Anaerobic degradation of pimelateby newly isolated denitrifying bacteria.Microbiology.140:409-416.]。该酶在ATP和Mg2+的存在下有活性。反应产物为AMP而非ADP。该酶不接受苯甲酸。
CoA转移酶是不如硫酯酶有吸引力的候选物，因为它的较窄的底物特异性或缺少基因/蛋白质表征(如对于琥珀酸-羟基甲基戊二酸CoA转移酶(EC2.8.3.13))，尽管其显示对庚二酰-CoA、己二酰-CoA的C6衍生物的活性(EC2.8.3.13-Substrate specificity of a dicarboxyl-CoA:dicarboxylic acid coenzymeA transferase from rat liver mitochondria:Deana等.Biochem Int.1992,26,767-773)。已报告了仅一种琥珀酰-CoA:庚二酰-CoA转移酶，但未获得负责活性的基因且未鉴定出报告的生物体(Gallus和Schink(1994)Microbiol.10:409-416Anaerobic degradation of pimelate by newly isolated denitrifyingbacteria)。来自该家族的一些酶可能仍然是有用的，且以下酶被鉴定为潜在的候选物：
来自Acidaminococcus fermentans的戊烯二酸辅酶A-转移酶(Gct)(UniProt Q59111)
来自Acidaminococcus fermentans的戊烯二酸辅酶A-转移酶(Gct)是一种催化从乙酰-CoA和游离酸形成(R)-2-羟基戊二酰-CoA的酶。Gct被表征为由两种不同亚基(GctA,35725Da和GctB,29168Da)构成的异八聚体(α4β4)。两种亚基GctA和GctB均已在大肠杆菌中共表达并显示为作为戊烯二酸CoA-转移酶(EC 2.8.3.12)功能性的。Gct在不饱和和饱和以及羟基化的底物(2-羟基戊二酸)上也是活性的，但未对C7辅酶衍生物测试(Mack等,1994.Location of thetwo genes encoding glutaconate coenzyme A-transferase at the beginning of thehydroxyglutarate operon in Acidaminococcus fermentans.).Eur.J.Biochem,226:41-51)。这似乎是有希望的靶物，因为可以改变来自Acidaminococcusfermentans的酶戊烯二酸CoA转移酶从CoA转移酶到CoA酯酶的活性(GctAB；EC 2.8.3.12-Glutaconate CoA-transferase from Acidaminococcus fermentans:Buckel等,Eur.J.Biochem.1981,118,315-321)，其通过定点诱变(Mack M,Buckel W.(1997)Conversion of glutaconate CoA-transferase fromAcidaminococcus fermentans into an acyl-CoA hydrolase by site-directedmutagenesis.FEBS Lett.405:209-212)。在大肠杆菌中成功表达该酶并用于戊烯二酰-CoA、3-甲基戊烯二酰-CoA、butynedioyl-CoA、2-羟基adpioyl-CoA、草酰巴豆酰-CoA和muconyl-CoA的酶促生物合成(Parthasarthy A,Pierik A,Kahnt J,Zelder O,Buckel W.(2011)Substrate specificity of 2-hydroxyglutaryl-CoA dehydratase from Clostiridium symbiosum:Toward a bio-based productionof adipic acid.Biochemistry.50:3540-35500)。还公开了GctAB的晶体结构(Jacob U,Mack M,Clausen T,Huber R,Buckel W,Messerschmidt A.(1997)Glutaconate CoA-transferase from Acidaminococcus fermentans:the crystalstructure reveals homology with other CoA-transferases.Structure.5:415-426)。该转移酶经由几个氢键将末端羧酸阴离子结合至丝氨酸残基，其可调节成不同的链长度。
其他合适的CoA转移酶包括来自褐家鼠的CoA转移酶(琥珀酸-羟基甲基戊二酸CoA-转移酶EC 2.8.3.13)，因为它接受己二酰-CoA作为底物，具有比对琥珀酰-CoA、丙二酰-CoA、戊二酰-CoA观察到的更高的亲和力(Substratespecificity of a dicarboxyl-CoA:dicarboxylic acid coenzyme A transferase fromrat liver mitochondria(Deana Biochem Int.1992,26,767-773)。类似地，尚未测试来自Clostridium aminovalericum的乙酰-CoA:5-羟基戊酸CoA-转移酶(EC2.8.3.14)对C7底物的活性，但确实显示对C3-C5底物的活性，而且是特异于饱和底物的(Eikmanns和Buckel,1990.Properties of 5-hydroxyvalerateCoA-transferase from Clostridium aminovalericum.Biol.Chem.371:1077-1082)。未列出负责该活性的基因。
例示庚二酰-CoA通过酸-硫醇连接酶和CoA转移酶到庚二酸的可逆水解
将选自上文列表的以下酶选为示例：
如先前报告的将基因针对大肠杆菌密码子优化并在BL21(DE3)中表达(Binieda等(1999)Biochem.J.340:793-801；Shikata等(2007).A novelADP-forming succinyl-CoA synthetase in Thermococcus kodakaraensisstructurally related to the archaeal nucleoside diphosphate-forming acetyl-CoAsynthetases.J Biol Chem.282:26963-26970)。将带His标签的蛋白质在1mlHistrap柱上纯化。来自门多萨假单胞菌的酶完全不可溶且仅微量能够重折叠，因此仅将来自氨基酸球菌属(Acidaminococcus)和热球菌属(Thermococcus)的酶及其天然底物用在活性测定中。使用比色测定法确认两种酶的活性，其通过测量分别在520nm和405nm处的吸光度来监测其天然底物(E)-戊烯二酸和琥珀酸的CoA酯的形成。
测定己二酰-CoA和庚二酰-CoA的消失和己二酸或庚二酸的形成的生物转化反应在1ml反应中实施，其通过将30ul蛋白质溶液添加到包含在(每ml)如下文描述的反应混合物中的300ul反应混合物：
阴性对照含有代替酶溶液的30ul洗脱缓冲液。将反应混合物在70℃(41/42)或室温(43/44；45)温育5小时，用570ul水稀释并通过LC-MS测定。
所有3种酶均能将庚二酰-CoA水解为庚二酸(见图26)。尽管事实上仅能产生微量的PauA的可溶酶，但该酶从庚二酰-CoA形成庚二酸。这确认了EC6.2.1.14的酸-硫醇连接酶确实可逆，而且可用于从庚二酰-CoA制备庚二酸。此外，CoA转移酶可用于从庚二酰-CoA产生庚二酸。
3.1.5.3硫酯水解酶(EC 3.1.2.-).-)
3.1.5.3.1适宜酶的选择
硫酯酶是催化CoA或[acp]硫酯水解的水解酶：
硫酯酶是遍在于所有生物体的，其作用于CoA或[acp]活化的羧酸且属于EC 3.1.2，包括EC 3.1.2.2；EC 3.1.2.28；EC 3.1.2.19；EC 3.1.2.20(对于CoA酯水解酶)，而[acp]硫酯水解酶可见于EC 3.1.2.14和EC 3.1.2.21。仅测试了两种硫酯酶(ACOT8和ACOT4)对于二羧基-单-CoA酯如琥珀酰-CoA的活性。
来自小家鼠的ACOT8过氧化物酶体酰基CoA硫酯酶8(以前的PTE-2)
ACOT8是人PET1硫酯酶的同源物。将该酶在大肠杆菌中过表达为His-Tag融合蛋白并使用HisTrap柱层析纯化至均质[Westin MA,Hunt MC,Alexson SE.(2005)The identification of a succinyl-CoA thioesterase suggests anovel pathway for succinate production in peroxisomes.J Biol Chem.280:38125-38132]。活性对于长链酰基CoA在>5-10μΜ的底物浓度受到抑制，但BSA的添加阻止了抑制。使用饱和和不饱和直链酰基CoA(C2-C20)测试硫酯酶的底物范围。最高活性是针对C10-C18，胆汁酸(trihydroxycoprostanoyl-CoA)、胆酰-CoA和鹅脱氧胆酰(chenodeoxycholoyl)-CoA和支链酰基CoA。测试的大多数底物的Km值相当低，强烈表明ACOT8具有非常广的底物特异性且能接受它们的大多数。ACOT8受CoASH的强烈抑制，IC50为10-15μΜ。还测试ACOT8对二羧基-单-CoA衍生物的活性且其优先水解更长链的底物(活性随着从C3到C12的C链长度增加)[Hunt MC,Solaas K,Kase BF,Alexson SE.(2002)Characterizationof an acyl-coA thioesterase that functions as a major regulator of peroxisomallipid metabolism.J Biol Chem.277:1128-1138]。
来自小家鼠的ACOT3(先前的PTE-1a)
在大肠杆菌中表达ACOT3并纯化至均质[19]。该酶对从C8到C26的单羧酸酯显示活性，对更长链的底物(C16)具有最高活性。该酶不接受胆汁酸酯。用游离CoASH没有抑制。未测试二羧酸酯。
来自小家鼠的ACOT5(先前的PTE-1c)
在大肠杆菌中表达ACOT5并纯化至均质[Westin MA,Alexson SE,HuntMC.(2004)Molecular cloning and characterization of two mouse peroxisomeproliferator-activated receptor alpha(PPARalpha)-regulated peroxisomalacyl-CcA thioesterases.J Biol Chem.279:21841-21848]。该酶对从C6到C20的单羧酸酯显示活性，对中等链的底物(C10)具有最高的活性。该酶不接受胆汁酸酯。用游离CoASH没有抑制。未测试二羧酸酯。
来自小家鼠的ACOT4过氧化物酶体酰基CoA硫酯酶4(先前的PTE-1b)
在大肠杆菌中表达ACOT4并纯化至均质[18]。该酶显示较窄的底物范围，接受琥珀酰-CoA和戊二酰-CoA。反应不受浓度高达500μΜ的CoASH的抑制。
如此，ACOT8、ACOT5和ACOT3是用于水解二羧基-CoA和涉及庚二酸生物合成途径的其他酰基CoA的优秀的候选物。
3.1.5.3.2选定硫酯酶的克隆、表达和生物转化
选择来自小家鼠Acot8(WT mRNA序列GeneBank NM_133240；mRNA片段65-1027)和流感嗜血杆菌YciA(WT基因序列(GeneBank L42023片段878596-879060,EC 3.1.2.20)的硫酯酶作为用于将庚二酰-CoA转化成庚二酸的例子，这是由于其对二羧基-CoA底物的特异性(The identification of asuccinyl-CoA thioesterase suggests a novel pathway for succinate production inperoxisomes:Westin J.等.Biol.Chem 2005,280,38125-38132；Divergence offunction in the hot dog fold enzyme superfamily–the bacterial thioesterase YciA:Zhuang等.Biochemistry 2008,47,2789-2796)。两种基因均从起相应的宿主基因组鉴定并在大肠杆菌中成功克隆和表达(Characterization of an acyl-CoA thioesterasethat functions as a major regulator of peroxisomal lipid metabolism:Hunt等.J.Biol.Chem.277,1128-1138；Divergence of function in the hot dog fold enzymesuperfamily–the bacterial thioesterase YciA:Zhuang等.Biochemistry 2008,47,2789-2796)。
将两种基因选为野生型序列来构建相应的大肠杆菌表达载体并用于转化大肠杆菌BL21(DE3)。流感嗜血杆菌YciA硫酯酶的表达在大肠杆菌(图14h)中实现，但未实现小家鼠Acot8硫酯酶的表达。在IPTG诱导后的可溶级分(第2和3道)和不可溶级分(第6和7道)中清楚地检测到在预期大小处(17kDa)的蛋白质条带。在阴性对照实验(第4和8道)中未观察到相应的蛋白质，表明预期的17kDa流感嗜血杆菌YciA硫酯酶蛋白在大肠杆菌中从装配构建体I8成功表达。YciA蛋白的可溶表达似乎在诱导后4h至24h温育时随时间增加(第2和3道)，而不可溶表达似乎在同一时段内降低(第6和7道)。因此，24h可溶样品似乎是用于监测流感嗜血杆菌YciA硫酯酶活性的最佳候选物。
3.1.5.3.3 庚二酰-CoA的合成
将辅酶A钠盐(150mg,195μmol)悬于丙酮(22.5mL)和水(225μL)的混合物中。将悬浮液在冰上降温至0摄氏度并用200mM碳酸氢钠溶液调整为pH 8。将盐酸(586μmol,3eq)伴随搅动缓慢添加至悬液，并通过进一步添加碳酸氢钠溶液维持反应pH为8。允许反应混合物在0℃再搅拌1h。一旦消耗辅酶A，如通过HPLC反应监测确定的，那么就将反应混合物真空浓缩并将白色残余物重悬于水(20mL)，用5M磷酸调整为pH 3，并用二乙醚萃取(3x 20mL)。然后，使用由Phenomenex供应的Strata X 33μm聚合反相1g/20mL筒通过固相萃取(SPE)将剩余水性层纯化。
用甲醇灌注SPE筒并在使用前用10mM磷酸钠(pH4.2)缓冲液平衡。将含有粗酰基-CoA产物的水性层加载到筒上。实施10mM磷酸钠(pH4.2)缓冲液清洗(3x 5mL)，继之以使用5,10和20％MeOH/缓冲洗脱液(3x 5mL)的逐步梯度。收集每份级分并通过HPLC分析。将仅含有产物的级分合并并真空浓缩。将分离的产物不经进一步纯化直接用于生物转化。1H NMR或LCMS被用于表征产物。
3.1.5.3.4 庚二酰-CoA到庚二酸的生物转化
在终体积2mL中实施生物转化。该生物转化包含1mM底物、200mM KCl和50mM钾Hepes(pH 7.5)。阴性对照包含携带空载体的细胞。所述生物催化剂以无细胞提取物添加以产生终浓度为～15g/L的全细胞当量。反应在环境温度(20℃)在15mL falcon管中伴随搅拌进行。每份生物转化在1h,4h和24h后取样并通过Phenomenex Luna C18250x 4.6mm,5微米柱上的HPLC(Agilent1100)分析。在注射前，将每份样品加热至100℃达5分钟以停止反应，在14000rpm离心2分钟并经由0.2微米注射器滤器过滤。通过HPLC在260nm分析过滤物中庚二酰-CoA(Rt 12.39分钟)的消失和CoA的形成(Rt 7.98分钟)，两者在该波长处均极强地吸收，而通过UV在260nm处未检测到庚二酸。庚二酸形成由by LC-MS确认。
在阴性对照中观察到低水平的背景水解，这可以归因于在携带空载体的大肠杆菌中低水平的内源性硫酯酶活性。在反应1小时后观察到庚二酰-CoA到庚二酸和乙酰-CoA的完全水解。
3.1.6  通过ω-转氨酶(EC 2.6.1.-)的庚二酸半醛到7-氨基庚酸的转化和通过氨基酸氨基转移酶(EC 2.6.1.-)的α-酮辛二酸到α-氨基辛二酸的转化
转氨酶或氨基转移酶是催化氨基酸和酮酸之间反应的酶。该反应牵涉从氨基供体移除氨基基团，留下α-酮酸，并将氨基基团转移至受体α-酮酸，将其转化成氨基酸。它们是氨基酸合成中的重要酶且在自然界中是遍在的。这些酶中有许多含有吡哆醛磷酸(PLP)作为辅因子。这些酶属于覆盖广范围细胞功能的一个多样化的大家族，使用广范围的底物。
3.1.6.1 转氨酶的选择
通过文献搜索、BLAST搜索和蛋白质数据库搜索鉴定的许多候选物是适宜用于将庚二酸半醛转化成7-氨基庚酸的酶。
酶名称/EC 登录号 来源 基因可获 蛋白质
No. 纯化
EC 2.6.1.19 YP_001823341.1 灰色链霉菌 是 是
LysN Q72LL6 嗜热栖热菌 是 是
AADaT Q64602 褐家鼠 是 是
EC 2.6.1.19
来自灰色链霉菌的4-氨基丁酸转氨酶
该酶首先在1985年研究且发现其催化反应：
4-氨基丁酸+2-氧戊二酸→4-氧丁酸+谷氨酸。
该酶具有相对广泛的底物范围，包括6-氨基己酸和7-氨基庚酸，其使用2-氧戊二酸作为氨基受体，并形成相应的半醛(Yonaha,K.,K.Suzuki和S.Toyama,4-Aminobutyrate:2-oxoglutarate aminotransferase of Streptomycesgriseus:purification and properties.Eur J Biochem,1985.146(1):p.101-6)。尽管这是非常有希望的，但尚未测试这些反应的可逆性。因此，体外测试逆反应，其使用谷氨酸作为氨基供体，因为这会从7-氧庚酸提供7-氨基庚酸。该酶在灰色链霉菌IFO 3102(灰色链霉菌灰色亚种)中纯化并发现为100kDa，其由两个等同的亚基(各为约50kDa)组成。辅因子是吡哆醛5'-磷酸。一种蛋白质存放于Pubmed数据库(表1)。编码其的基因(SGR_1829)(注释为假定的4-氨基转移酶)存在于与IFO 3102紧密相关的灰色链霉菌IFO 13350的基因组序列中。尽管还不清楚，但很可能该蛋白是描述和研究过的酶的紧密同源物(Yonaha,K.,K.Suzuki和S.Toyama,4-Aminobutyrate:2-oxoglutarate aminotransferase ofStreptomyces griseus:purification and properties.Eur J Biochem,1985.146(1):p.101-6)。根据可获的底物范围数据，该蛋白是用于作为适宜氨基转移酶来测试的非常好的候选物。
EC 2.6.1.39
来自嗜热栖热菌的氨基己二酸转氨酶(Q72LL6)
这是一种与来自哺乳动物的alpha-氨基己二酸氨基转移酶(AAAAT)具有同源性的酶，且被认为涉及细菌嗜热栖热菌HB27中的赖氨酸合成[2，3]。针对底物如2-氧己二酸、2-氧异己酸、alpha-氨基己二酸和甚至芳香族氨基酸的动力学数据是可获的[3]。该蛋白已在大肠杆菌中表达并纯化，且发现其在体外主要作为同二聚体存在，每个亚基大小约44kDa(Miyazaki,T.,等,alpha-Aminoadipate aminotransferase from an extremely thermophilic bacterium,Thermus thermophilus.Microbiology,2004.150(Pt 7):p.2327-34)。广泛的底物特异性、其原核起源和编码基因的可获性表明它可以是用于1测试的较好的候选物。它是一种确立的酶且其晶体结构可获(PDB ID:2ZP7)，这提供了对底物特异性的机械性洞察(Ouchi,T.,等.,Dual roles of a conserved pair,Arg23and Ser20,in recognition of multiple substrates in alpha-aminoadipateaminotransferase from Thermus thermophilus.Biochem Biophys Res Commun,2009.388(1):p.21-7；Tomita,T.,等.,Mechanism for multiple-substratesrecognition of alpha-aminoadipate aminotransferase from Thermus thermophilus.Proteins,2009.75(2):p.348-59)。
来自褐家鼠的氨基己二酸氨基转移酶(Q64602)
该酶与先前描述的来自嗜热栖热菌的酶类似。它被注释为犬尿素(kynurenine)/氨基己二酸氨基转移酶，尽管有一些证据表明有两种不同的蛋白实施这些反应(Mawal,M.R.和D.R.Deshmukh,Alpha-aminoadipate andkynurenine aminotransferase activities from rat kidney.Evidence for separateidentity.J Biol Chem,1991.266(4):p.2573-5)。已从大鼠肾纯化该蛋白并在人胚胎肾成纤维细胞中表达，而且发现大小为约100kDa。该酶可接受2-氧己二酸作为底物。早期研究(推测对同一酶)指示它能在明显可逆的反应中将DL-2-氨基庚二酸用作氨基供体，2-氧戊二酸作为受体(Deshmukh,D.R.和S.M.Mungre,Purification and properties of 2-aminoadipate:2-oxoglutarateaminotransferase from bovine kidney.Biochem J,1989.261(3):p.761-8)。同一论文指示庚二酸可能是活性抑制剂，在存在庚二酸的情况下活性中有30％降低。
上文3种酶应适用于最终转氨基化以得到7-氨基庚酸。来自灰色链霉菌的酶是一种较好的候选物，且克隆、表达和纯化的过程不会特别困难。对于来自嗜热栖热菌的LysN也是如此，其似乎具有广泛的底物范围。来自褐家鼠的酶会更具挑战性但活性数据表明该酶可能能够使用需要的特定底物。
5-氨基戊酸转氨酶(EC 2.6.1.48)
来自EC 2.6.1.48的二氨基氨基转移酶如5-氨基戊酸转氨酶也是适用于从庚二酸半醛制备7-氨基庚酸的催化剂。
3.1.6.2 选定的氨基转移酶的表达
选择2种基因来将庚二酸半醛转化成7-氨基庚酸和将α-酮辛二酸转化成α-氨基辛二酸：(1)IlvE-Omega Vf融合物(SEQ ID 1和2)和(2)IlvE-Ad优化的omega融合物(SEQ ID 3和4)。这些基因在包含omega氨基转移酶与支链氨基转移酶IlvE(其先前在大肠杆菌中显示高表达水平)的5’端的融合物的质粒中制备(见图23和图24)。证明IlvE片段的引入显著增加了该氨基转移酶基因的表达。在活性测定法中还测试了另一种含有支链氨基转移酶基因和IlvE片段的热诱导质粒(ING66)。
选择了另外的5种基因(韦氏芽孢杆菌(Bacillus weihenstephanensis)KBAB4、铜绿假单胞菌(gi9951072)、枯草芽孢杆菌(gi16078032)、丁香假单胞菌III类、类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)III类)(DSM专利(Preparation of6-aminocaproic acid from 5-formyl valeric acid:DSM-US2011-0171699Al专利)。这些酶在α-酮庚二酸到α-氨基庚二酸的转化中显示一些活性，且还可在庚二酸半醛到7-氨基庚酸的转化中具有活性(见SEQ ID 5-14)。
如前文对在大肠杆菌BL21中表达的IlvE-Omega Vf融合物(pING2022)(图23)和IlvE-Ad优化的omega融合物(pING2030)(图24)蛋白进行SDS-PAGE分析。在IlvE-Omega Vf融合物(pING2022)(图15，第5和6道)和IlvE-Ad优化的omega融合物(pING2030)(图15，第8和9道)蛋白中均观察到具有预期大小的清楚条带。在阴性对照中没有相应条带，从而确认了IlvE-Omega Vf融合物和IlvE-Ad优化的omega融合物蛋白的表达。
对IlvE-Omega Vf融合物(pING2022)和IlvE-Ad优化的omega融合物 (pING2030)氨基转移酶蛋白的活性测定
使用重组Vf氨基转移酶来测定在7-氨基庚酸上的活性。准备3种生物转化来检测酶加载对7-氨基庚酸和丙酮酸钠到L-丙氨酸转化的影响。生物转化中L-丙氨酸的检测将提供在7-氨基庚酸上的期望氨基转移酶特异性的阳性证据。绘出7-氨基庚酸到庚二酸半醛的氨基转移酶转化的反应方案在下面显示：
所述3种生物转化(3ml体积)含有50mM丙酮酸钠和10mM 7-氨基庚酸。将反应保持在30℃回转式培养箱中并从生物转化定时取出等分试样用于分析。
样品ID 丙酮酸钠/mM 7-氨基庚酸/mM 酶加载v/v％
rc0212-40-1 50 10 0.33
rc0212-40-2 50 10 0.66
rc0212-40-3 50 10 1.67
从生物转化取出等分试样(1ml)并加热至95℃达5分钟以使可溶性蛋白沉淀。随后将样品离心并在HPLC分析之前使上清液过滤通过0.2微米滤器。HPLC分析使用一种柱前衍生方法，其基于用beta-巯基乙醇和邻苯二醛的化学加合物形成。使用L-丙氨酸和7-氨基庚酸的外部标准来测定生物转化中7-氨基庚酸和L-丙氨酸的浓度。
结果(图16)清楚地显示，L-丙氨酸在生物转化中的形成提供了Vf氨基转移酶的氨基转移酶活性和特异性的有力证据。7-氨基庚酸浓度随时间降低，这与预期的氨基转移酶活性一致。7-氨基庚酸速率随着增加的酶浓度增加，这再次与预期的转氨酶活性一致。形成的L-丙氨酸的量不与消耗的7-氨基庚酸匹配，这可能是由形成的L-丙氨酸通过存在于大肠杆菌提取物的其他非氨基转移酶的备选生化降解所导致的。
实施对氨基转移酶的进一步检查以评估对2-氨基辛二酸的活性。
L-2-氨基辛二酸到2-酮辛二酸的氨基转移酶转化提供了调控生物转化的机会。
实施6种生物转化来检查pING 2022、pING2030和ING66(Ilve支链氨基转移酶，E.C.2.6.1.42，构建体已在菌株收集中)。每种生物转化含有10mM DL-2-氨基辛二酸、50mM丙酮酸钠和高或低加载量的如指示的无细胞提取物(CFE)，将N.B.ING 66用作全细胞：
将6种生物转化(3ml体积)保持在30℃回转式培养箱中并从生物转化定时取出等分试样用于分析。从生物转化取出等分试样(1ml)并加热至95℃达5分钟以使可溶性蛋白沉淀。随后将样品离心并在HPLC分析之前使上清液过滤通过0.2微米滤器。HPLC分析使用一种柱前衍生化方法，其基于用Boc-半胱氨酸和邻苯二醛的化学加合物形成。使用DL-2-氨基辛二酸和L-丙氨酸的外部标准来测定2-氨基辛二酸对映异构体的保留时间。
结果指示所有6种生物转化中L-2-氨基辛二酸浓度的降低和D-2-氨基辛二酸的对映异构富集。该影响与氨基转移酶对L-对映异构体的作用一致，因为已知此处测试的氨基转移酶展现L-立体选择性。未通过HPLC观察到应从丙酮酸的转氨基化产生的可测量的L-丙氨酸，然而很可能是形成的L-丙氨酸已由生物转化中存在的其他宿主蛋白质进一步降解，如先前在7-氨基庚酸反应中观察到的。
ING66生物转化(rc0212-46-1和-2)显示比pING2022和pING2030氨基转移酶显著更高的L-2-氨基辛二酸降解水平。已知ING 66支链氨基酸氨基转移酶展现对作为L-2-氨基辛二酸的更短(C5)同源物的L-2-氨基戊二酸(L-谷氨酸)的优秀的选择性，因此ING 66的这一活性中的偏好是未预料到的。
从庚二酸半醛产生7-氨基庚酸
基于观察到的河流弧菌(Vibrio fluvialis)ω-氨基转移酶(登录号HQ418483.1(WT基因序列：片段325-1686))对7-氨基庚酸的活性，以相反方向实施反应，即庚二酸半醛转化为7-氨基庚酸。评估河流弧菌ω-氨基酸转氨酶以及N-ter-His-Tag纯化的韦氏芽孢杆菌。使用标准技术表达并纯化韦氏芽孢杆菌ω-氨基酸转氨酶(登录号JA114119.1)。用己二酸半醛和庚二酸半醛实施反应，通过HPLC(Agilent 1200,GraceSmart RP C18柱)确认产物形成(6-氨基己酸和7-氨基庚酸)。
合成己二酸半醛和庚二酸半醛的一般规程：
基于公开的方法(Synthetic communications,21(8&9),1075-1081(1991)，依照以下一般反应设计来实施C6&C7半醛的合成：
6-羟基己酸甲酯制备(2a)
将ε-己内酯1a(50g,0.425mol,1eq)溶解于甲醇(500mL)。注入浓缩的硫酸(1mL)并将溶液加热以过夜回流。通过GC-MS测定到2a的完全转化。允许反应降温至RT并注入水(700mL)。将产物萃取到二乙醚(3x 200mL)中，经硫酸镁干燥并浓缩以提供清澈无色的液体(40.7g)。将粗产物在高真空(b.p.＝120℃,7mbar)下蒸馏以提供无色油2a(32.9g)，其直接用于下一阶段。
7-羟基庚酸甲酯制备(2b)
将浓缩的硫酸(1mL)、水(120mL)和甲醇在冰上降温至15摄氏度。伴随搅拌缓慢添加过硫酸钾(365.6g,1.34mol,3eq)。在甲醇(150mL)中于45分钟内逐滴添加环庚酮1b(50g,0.447mmol,1eq)。允许反应升温至RT过夜搅拌。通过GC-MS测定到2b的完全转化。此时跟踪对于2a描述的工作试验产物(work-upproduct)。
羟基酯2a/b的PCC氧化以制备酯醛3a/3b的一般规程
将氯铬酸吡啶(Pyridinium chlorochromate,PCC)(60g)和硅胶(60g)与二氯甲烷(200mL)一起加入1L RB烧瓶。将悬液浓缩至干燥以获得细粉末。与分子筛(70g)一起加入二氯甲烷(500mL)。将悬液在冰上降温至0摄氏度。
将每种羟基酯(2a 32.6g,2b 37g)溶解于二氯甲烷(30mL)并在30分钟内逐滴添加到PCC/硅胶悬液。在再搅拌30分钟后，通过GC-MS观察到酯醛3a/b的完全转化。将粗反应混合物经由硅藻盘(celite pad)过滤。进行二乙醚清洗(5x 200mL)以确保所有产物都清洗到清澈的、深棕色的滤液中。然后使滤液通过硅土盘以除去带色杂质。进行硅土盘的进一步的二乙醚清洗(3x100mL)。将合并的滤液真空浓缩以提供淡黄绿色的液体(3a 24.5g,3b 7.9g)。通过短途高真空蒸馏(3a b.p.＝98degC,8mbar,3b b.p＝106degC,7mbar)纯化粗产物以提供清澈的无色馏出物(3a 16.9g,3b 4.9g)。产物通过1H和13C NMR分析表征。
使用固定化的来自南极假丝酵母(Candida antartica)的脂肪酶丙烯酸树脂水解3a/b以制备C6/C7酸半醛4a/b的一般规程
将每种酯醛3a/b(1g,6.9mmol,1eq)悬于50mM磷酸钠缓冲液(pH 8)(20mL)中。加入固定化的脂肪酶树脂(100mg)并将悬液加热至50摄氏度，搅拌45分钟。此后，GC-MS指示已消耗酯醛开始材料3a/b。将悬液降温至RT，过滤脂肪酶珠，并真空浓缩所得过滤物以提供磷酸盐缓冲液中的粗C6/C7半醛4a/4b。产物通过1H NMR表征。
使用固定化的来自南极假丝酵母的脂肪酶丙烯酸树脂水解3a/b以制备C6/C7酸半醛4a/b的一般规程
将每种酯醛3a/b(1g,6.9mmol,1eq)悬于50mM磷酸钠缓冲液(pH 8)(20mL)中。注入固定化的脂肪酶树脂(100mg)并将悬液加热至50摄氏度，搅拌45分钟。此后，GC-MS指示已消耗酯醛开始材料3a/b。将悬液降温至RT，过滤脂肪酶珠，并真空浓缩所得过滤物以提供磷酸盐缓冲液中的粗C6/C7半醛4a/4b。产物通过1H NMR表征。
河流弧菌(V.f.)ω-氨基酸转氨酶生物转化条件
*术语全细胞当量(WCE)是用于估测细胞裂解后存在于无细胞提取物中的生物催化剂的量的术语。这是通过将已知重量的湿全细胞重悬于限定的裂解缓冲液体积来计算的。例如，如果将1g离心的湿全细胞团粒重悬于10mL裂解缓冲液，那么WCE浓度是100g/L。我们通常以此方式制备生物催化剂的储备悬液并在需要时稀释该储液以在每次生物转化中获得期望的生物催化剂浓度。
生物转化中使用的C6/C7半醛底物的原位制备的方案
在测试前制备C6和C7半醛的10mM储液。使用以下方案来制备这些储液：将10mM甲基酯醛悬于50mM磷酸钠(pH 7)(50mL)。注入来自南极假丝酵母的固定化的脂肪酶丙烯酸树脂(10mg)。将悬液加热至50摄氏度并搅拌1h。TLC分析指示此后起始材料的完全消耗。将反应降温至RT，过滤珠，并将含有～10mM半醛的滤液直接用于每次生物转化。
河流弧菌ω氨基酸转氨酶生物转化方案
然后实施6份生物转化，每份均在5mL的终体积中。每份生物转化包含5mM半醛、100mM L-谷氨酸单钠和生物催化剂，其以无细胞提取物添加以得到终浓度为15g/L全细胞当量。反应在30摄氏度在15mL falcon管中伴随搅拌在pH 7进行。对每份生物转化定时取样并通过HPLC分析。在注射前，将每份样品加热至100摄氏度达5分钟以停止反应，在14000rpm离心2分钟并经由0.2微米注射器滤器过滤。
实施的河流弧菌ω氨基酸转氨酶生物转化的列表
来自河流弧菌ω氨基酸转氨酶生物转化的结果
成功地证明河流弧菌ω-氨基酸转氨酶对6-氧己酸和7-氧庚酸有活性。通过HPLC测量相应的6-氨基己酸和7-氨基庚酸产物的形成。产物峰的鉴定通过关联其相应外部参照标准的保留时间来确定。
观察到在这些条件下生成显著更多的6-氨基己酸，提供了该转氨酶对于6-氧己酸比对7-氧庚酸有更高活性的有力证据。
在两种情况中，在使用空载体的阴性对照实验，即不表达靶转氨酶的大肠杆菌菌株中也观察到显著量的每种产物。我们预测这些结果是由宿主无细胞提取物中的背景转氨酶活性所致。然而，HPLC结果清楚地显示，对于两种底物，在相比于阴性对照含有具有过表达的转氨酶的细胞的实验中形成更高水平的产物。在使用水作为无细胞提取物替换物的阴性对照实验中未观察到产物形成。
韦氏芽孢杆菌(B.W.)ω-氨基酸转氨酶(N-ter-His-Tag)生物转化条件
韦氏芽孢杆菌ω-氨基酸转氨酶(N-ter-His-Tag)生物转化方案
然后在1mL的终体积中实施14份生物转化。每份生物转化包含10mM半醛、100mM L-谷氨酸单钠和一定范围的纯化的酶等分试样体积(100,10和1μL)。这是为了评估在不同蛋白质浓度的转氨酶活性。每份生物转化在pH 7进行并置于30degC摇动的培养箱中(250rpm)。定时取样并通过HPLC分析。在注射前，将每份样品加热至100摄氏度达5分钟，在14000rpm离心2分钟并经由0.2微米注射器滤器过滤。
韦氏芽孢杆菌ω-氨基酸转氨酶(N-ter-His-Tag)生物转化实验的列表
来自韦氏芽孢杆菌ω-氨基酸转氨酶生物转化的结果
证明纯化的N-ter-His-Tag韦氏芽孢杆菌ω-氨基酸转氨酶对6-氧己酸和7-氧庚酸具有低活性。HPLC结果显示在其中注入100μL纯化酶的实验中形成期望的氨基酸产物。
在C6和C7底物特异性之间似乎没有显著差异，如在每次实验中测量的产物水平是可比的。然而，在两种情况下，形成的产物水平非常低。
为了确保正确的鉴定相关层析图中的低水平产物峰，使用适宜的外部参照标准实施一系列样品添加(sample spike)。在每种情况中，观察到产物峰大小中的明显升高。外部参照标准添加体积与观察到的峰幅度中的增加成比例。
HPLC分析条件
仪器：Agilent 1200；柱：GraceSmart RP C18150x 4.6mm,5微米；柱温度：40degC。流速：1mL/min；检测：UV 338nm；注射体积：14uL
流动相：线A：5mM磷酸钠pH 7；线B：乙腈
梯度：
时间(分钟) ％B
0 5
4 25
6 80
8 80
8.5 5
12 5
对于所取的每份样品如下实施非手性HPLC柱前衍生化：
制备5mL溶液，其含有β-巯基乙醇(50μL)、o-酞二醛(50mg)、400mM硼酸钾缓冲液pH10(4.5mL)和甲醇(0.5mL)。使用以下注射器程序在HPLC的自动取样器中完成衍生化：将2μL样品，6μL衍生化混合物，6μL硼酸钾缓冲液pH10在注射器环中混合并在注射前保持4分钟。
参照标准浓度：
10mM 6-氨基己酸
10mM 7-氨基己酸
50mM L-谷氨酸单钠
结论：通过HPLC测量己二酸半醛和庚二酸半醛到相应6-氨基己酸和7-氨基庚酸的转化。化学制备半醛甲基酯，合成的最后阶段是使用固定化的脂肪酶的适宜甲基酯的水解，其产生不进一步纯化而使用的半醛溶液。使用来自河流弧菌和韦氏芽孢杆菌的omega氨基转移酶，对C6和C7半醛均观察到产物(ω-氨基酸)形成。河流弧菌酶具有稍微更高的活性。
用于产生D-和L-2-氨基辛二酸(D-或L-特异性脱羧酶的底物以产生7-氨 基庚酸)的D-和L-特异性氨基酸氨基转移酶
将来自大肠杆菌的IlvE L-AAAT(WT基因：X02413.1(片段301..1230)；WT蛋白：1104250A)选作L-选择性氨基转移酶而球形芽孢杆菌D-AAAT(WT基因：U26732.1(片段427..1278)WT蛋白：P54693.1)作为D-选择性alpha氨基酸氨基转移酶的例子来显示α-酮辛二酸到α-氨基辛二酸的转化。
制备2-氧酸底物的一般规程
文献参考：J.Org.Chem.1986,51,2389-2391和Organic syntheses,Coll.Vol.3,p510,1955
二乙酯制备(2)
将含有纯乙醇(880mL)的RB烧瓶降温至0degC。在1h内逐滴添加乙酰氯(124mL,1.71mol,7eq)。注入dioc acid(1)(0.245mol,1eq)并允许所得悬液升温至RT。一旦反应进行到完成，如通过薄层层析测定的，就注入水(300mL)并通过蒸发除去乙醇。将剩余水性溶液用sat碳酸氢钠溶液中和至pH 7。将产物用甲基叔丁基醚(3x 250mL)萃取，经硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩以供应粗二乙酯(2)作为70％分离产率的无色油。在下一阶段前，二乙酯通过高真空蒸馏纯化。
三乙基草酰中间物制备(3)
对含有无水二乙醚(161mL)的烧干烧瓶(flame dried flask)在氮气环境下加入钾金属块(8g,206mmol,1eq)。在30分钟内逐滴加入无水乙醇(32mL,536mmol,2.6eq)。一旦钾金属完全溶解(需要温和加热至30degC)，观察到淡黄色溶液。伴随较好搅拌快速加入二乙基草酸盐(27.5mL,206mmol,1eq)。此时，在10分钟内加入在二乙醚(50mL)中的二乙酯中间物(2)(206mmol,1eq)。将在添加期间形成的橙色悬液在冰上降温至0degC。2h后，过滤固体并使用二乙醚完成滤饼清洗(5x 50mL)。收集滤饼(1st收获)并将过滤物在4degC过夜储存。另外的固体过夜沉淀(2nd收获)。将其过滤并与1st收获合并以提供黄色固体(33.7g)。将其悬于5M盐酸并实施二乙醚萃取(3x 100mL)。将合并的有机物用盐水清洗(1x 100mL)，经硫酸镁干燥，过滤并浓缩以提供三乙基草酰中间物(3)为粗制黄色油(24.5g)。
水解和产物分离(4)
将粗制三乙基草酰中间物(3)(24.5g)溶解于10M盐酸(100mL)，在RT过夜搅拌。将反应混合物真空浓缩以提供粘性橙色油。将其溶解于丙酮(100mL)并加入活性炭(4g)。将悬液硫酯在RT过夜搅拌并经由硅藻盘过滤。将滤饼用丙酮清洗(5x 10mL)，将所得淡黄色滤液浓缩以供应淡橙色油(20.5g)。
将产物再溶解于水(10mL)(pH 0.2)并用10M氢氧化钠中和至pH 4。将形成的淡黄色悬液降温至0degC。伴随搅拌注入异丙醇(10mL)。将所得悬液过滤以提供米白色(off-white)滤饼(7.4g)，其被转移到真空干燥器并过夜干燥。此后分离产物为米白色固体(3.77g)。使用NMR来表征终产物(见附录部分的光谱)。
生物转化条件
IlvE(L-选择性氨基转移酶)
实验室登记参照 RH0912-021-56
底物浓度 10mM
L-谷氨酸单钠(氨基供体) 50mM
生物催化剂加载(g/L) 100g/L全细胞(IlvE)
pH 7-7.4
温度(degC) 30degC
最终反应体积 10mL
B.s.D-AAAT(D-选择性氨基转移酶)
生物转化方案
IlvE(L-AAAT)
在5mL的终体积中实施4份生物转化。每份生物转化包含10mM底物和50mM L-谷氨酸单钠。以全细胞添加生物催化剂以得到终浓度为100g/L。反应在30摄氏度在15mL falcon管中伴随搅拌进行。对每份生物转化定时取样并通过HPLC分析。在注射前，将每份样品加热至100摄氏度达5分钟，在14000rpm离心2分钟并经由0.2微米注射器滤器过滤。
实验ID 底物 生物催化剂 注释
RH0912-56-1 2-氧-庚二酸 IlvE全细胞
RH0912-56-2 2-氧-辛二酸 IlvE全细胞
RH0912-56-3 2-氧-庚二酸 水 阴性对照
RH0912-56-4 2-氧-辛二酸 水 阴性对照
B.s.D-AAAT
在5mL的终体积中实施9份生物转化。每份生物转化包含10mM底物、50mM D-丙氨酸和0.4mM吡哆醛磷酸。以无细胞提取物添加生物催化剂以得到终浓度为21g/L全细胞当量。反应在30摄氏度在摇动培养箱的15mL falcon管中进行。对每份生物转化定时取样并通过HPLC分析。在注射前，将每份样品加热至100摄氏度达5分钟，在14000rpm离心2分钟并经由0.2微米注射器滤器过滤。
结论
使用大肠杆菌IlvE，成功证明了从2-氧辛二酸盐和2-氧庚二酸盐分别生成了L-2-氨基辛二酸和L-2-庚二酸产物。
该生物转化结果通过将外部参照标准的HPLC保留时间与在每次生物转化中形成的观察的产物峰关联来确定。
采用非手性衍生化HPLC方法使得能在338nm在反相C18柱上检测相应的衍生化产物加合物。公知IlvE是对映体特异性的，其仅从酮酸形成L-氨基酸，因而使用非手性分析方法以简便。非手性衍生化方案的细节在附录部分概述。
似乎在这些条件下通过HPLC测量的对于L-2-氨基庚二酸/2-氧庚二酸的酶活性大大低于L-2-氨基辛二酸/2-氧辛二酸。为了进一步研究这一令人惊讶的结果，使用另一批的2-氧庚二酸重复生物转化，但获得了相同结果，表明对于C8化合物的活性缺失高于对C7化合物的活性。鉴于C5氨基-二酸谷氨酸是所有这些反应的常见氨基供体，这是由其令人惊讶的。
通过将全细胞替换为水进行阴性对照实验。在这些实验中对于任一底物均未观察到背景活性。
使用球形芽孢杆菌D-AAAT，成功证明了从2-氧戊二酸、2-氧辛二酸和2-氧庚二酸分别生成了D-2-氨基谷氨酸(阳性对照)和D-2-氨基辛二酸和D-2-庚二酸产物。
该生物转化结果通过将外部参照标准的HPLC保留时间与在每次生物转化中形成的观察的产物峰关联来确定。
另外，还利用HPLC来显示酶的对映体选择性。在存在手性衍生化试剂的情况下对于每份样品使用柱前衍生化方案，可以在反相C18柱上在338nm波长处分离相应的非对映异构体加合物。手性衍生化方案的细节在附录部分概述。
对于每种底物运行两种阴性对照实验；I17空载体细胞即不表达靶氨基转移酶的大肠杆菌菌株和水。
对于每种底物在I17空载体阴性对照实验中观察到小量的背景转化。我们预期该结果是由宿主无细胞提取物中的低水平背景氨基转移酶活性所致。这最可能是内源性丙氨酸消旋酶活性的组合，其生产一些L-丙氨酸，随后充当大肠杆菌中内源性L-AAAT酶的氨基供体。
在这些条件下在任一个水阴性对照实验中均未观察到预期氨基酸的可检测水平。
HPLC分析条件：
仪器：Agilent 1100；柱：Phenomenex Kinetex 150x 4.6mm,5microGraceSmart 150x 4.6mm，5微米；柱温度：40degC；流速：1mL/min；检测：UV 338nm；注射体积：14uL
流动相：线A：5mM磷酸钠pH 7；线B：乙腈
梯度：
时间(分钟) ％B
0 5
4 25
6 80
8 80
8.5 5
12 5
对于IlvE实验如下实施非手性HPLC柱前衍生化：
制备5mL溶液，其含有β-巯基乙醇(50μL)、o-酞二醛(50mg)、400mM硼酸钾缓冲液pH10(4.5mL)和甲醇(0.5mL)。使用以下注射器程序在HPLC的自动取样器中完成衍生化：将2μL样品，6μL衍生化混合物，6μL硼酸钾缓冲液pH10在注射器环中混合并在注射前保持4分钟。
对于D-AAAT实验如下实施手性HPLC柱前衍生化：
制备5mL溶液，其含有Boc-L-Cysteine(128mg)、o-酞二醛(50mg)、400mM硼酸钾缓冲液pH10(4.5mL)和甲醇(0.5mL)。使用以下注射器程序在HPLC的自动取样器中完成衍生化：将2μL样品，6μL衍生化混合物，6μL硼酸钾缓冲液pH10在注射器环中混合并在注射前保持4分钟。
参照标准浓度：
10mM D-谷氨酸；10mM DL-2-氨基辛二酸；10mM DL-2-氨基庚二酸；10mM L-2-氨基辛二酸；50mM D-丙氨酸；50mM L-MSG
3.1.7  通过α-氨基脱羧酶(EC 4.1.1.-)的α-氨基辛二酸到7-氨基庚酸的转化(见图10)
合适的催化剂选自作为候选物的α-氨基酸脱羧酶以用于α-氨基辛二酸的脱羧，所述脱羧酶具体为天冬氨酸4-脱羧酶(EC 4.1.1.11)、谷氨酸脱羧酶(EC4.1.1.15)、赖氨酸脱羧酶(EC 4.1.1.18)、二氨基庚二酸脱羧酶(EC 4.1.1.20)和二氨基丁酸脱羧酶(EC 4.1.1.86)。
大肠杆菌GadA谷氨酸脱羧酶和大肠杆菌LysA二氨基庚二酸脱羧酶起初选自那些蛋白组。其他适宜的酶包括来自詹氏甲烷球菌的LysA(AAB99100)(EC 4.1.1.20)(Ray,S.S.等,Cocrystal structures of diaminopimelatedecarboxylase:mechanism,evolution,and inhibition of an antibiotic resistanceaccessory factor.Structure,2002.10(11):p.1499-508)和存在于大肠杆菌的赖氨酸脱羧酶：CadA(AAA23536)，其在厌氧条件下且通过赖氨酸是可诱导的，而且具有非常高的活性，以及构成性表达但对赖氨酸具有低活性的Ldc(登录号D87518)(Kikuchi,Y.,等.,Characterization of a second lysine decarboxylaseisolated from Escherichia coli.J Bacteriol,1997.179(14):p.4486-9)。
对应于选定基因的DNA序列及其相关蛋白质序列显示于SEQ ID 15-18。将大肠杆菌LysA二氨基庚二酸脱羧酶的序列选择为如先前描述的大肠杆菌密码子优化过的基因(Preparation of 6-aminocaproic acid from 5-formyl valericacid:DSM-US2011-0171699A1专利)。将大肠杆菌GadA谷氨酸脱羧酶选择为野生型序列。使用前述实施例中描述的方法克隆并表达所述基因。
除了先前制备的构建体(I29:pET21-GadA和I30:pET21-LysA)以外，使用inABLE技术通过导入ilvE片段制备2种另外的构建体(下文装配I31和I32)。先前显示在感兴趣蛋白质的上游导入大肠杆菌分支氨基酸氨基转移酶(IlvE)的15氨基酸Nter肽导致大肠杆菌中一些蛋白质靶物表达的增加。
表达结果在以下汇总：
制备蛋白质提取物用于活性测定
将来自诱导后24小时样品的先前冷冻的细胞团粒重悬于珠裂解缓冲液，其由补充有1.5mg溶菌酶的0.1mM Tris，1mg/ml Pepstatin A和200mM PMSF蛋白酶抑制剂(161μL的混合物应用于来自OD600为5的1mL培养物的细胞团粒的裂解)组成。向每份样品添加经酸洗涤的212-300μm玻璃珠(0.4g每1mL裂解缓冲液)。裂解通过30秒全速涡旋迸发，继之以30秒冰上温育，重复至总时间为10分钟来进行。
取1mL样品并将剩余培养物用于活性测定。将1mL样品在13000rpm离心2分钟，并分开上清液。制备SDS样品并在SDS-PAGE凝胶上如上文所述的分析(图18)。裂解后，在大肠杆菌GadA ilvE(I31)蛋白的可溶性级分中有一条较大条带(图18，第4道)，其不存在于通过bugbuster裂解的1mL样品中。先前显示高可溶性表达的大肠杆菌LysA(I32)在珠裂解中未显示很多的可溶性表达(图18，第5道)。这可能指示裂解方法中的高度可变性。然后将粗细胞提取物用于监测从4种构建体I29到I32表达的蛋白质的活性。
对于生物转化反应，实施大规模培养并制备含20g/L全细胞当量的无细胞提取物。将携带空载体的宿主细胞用作阴性对照。
实施生物转化来测定对2-氨基辛二酸以及2-氨基庚酸的活性。每份生物转化包含10mM底物、10ug/mL吡哆醛磷酸和1mMβ-巯基乙醇，用1M氢氧化钠调整为pH 7。以无细胞提取物添加生物催化剂以得到终浓度为20g/L全细胞当量。反应在37摄氏度伴随搅拌在15mL falcon管中进行。对每份生物转化定时取样并通过HPLC分析。在注射前，将每份样品加热至100摄氏度达5分钟，在14000rpm离心2分钟并经由0.2微米注射器滤器过滤。
如下通过HPLC分析反应混合物：
仪器：Agilent 1100；柱：GraceSmart RP C18150x 4.6mm，5微米；柱温度：40degC；流速：1mL/min.检测：UV 338nm.注射体积：14uL.
流动相：线A：5mM磷酸钠pH 7；线B：乙腈
梯度：
时间(分钟) ％B
0 5
4 25
6 80
8 80
8.5 5
12 5
对于所取的每份样品如下实施非手性HPLC柱前衍生化：
制备5mL溶液，其含有β-巯基乙醇(50μL)、o-酞二醛(50mg)、400mM硼酸钾缓冲液pH10(4.5mL)和甲醇(0.5mL)。使用以下注射器程序在HPLC的自动取样器中完成衍生化：将2μL样品，6μL衍生化混合物，6μL硼酸钾缓冲液(pH10)在注射器环中混合并在注射前保持4分钟。
参照标准浓度：
10mM 6-氨基己酸
10mM 7-氨基庚酸
10mM DL-2-氨基辛二酸
10mM DL-2-氨基庚二酸
成功地证明所有α-氨基酸脱羧酶具有对2-氨基庚二酸和2-氨基辛二酸的活性。通过HPLC测量相应的6-氨基己酸和7-氨基庚酸产物的形成。产物峰的鉴定通过关联其相应外部参照标准的保留时间来确定。
在评估I29、I30和I31菌株的实验中，对这两种底物观察到较低水平的活性。对许多样品掺入相应的内部参照标准品以确保鉴定正确的峰。
对于两种底物，I32大肠杆菌LysA iLvE给出最佳结果，证明相比于其他菌株具有更高的活性。
另外，在使用空载体细胞即不表达靶脱羧酶的大肠杆菌菌株的阴性对照实验中还观察到非常低水平的每种产物。我们预测这些结果是宿主无细胞提取物中的背景脱羧酶活性所致。
然而，HPLC结果清楚地显示，在相比于阴性对照含有具有过表达的脱羧酶的细胞的实验中形成更高水平的产物。在使用水作为无细胞提取物替换物的阴性对照实验中未观察到产物形成。
对应于7-氨基庚酸的观察到的峰的浓度显示于图19。
3.1.8  通过α-酮脱羧酶(EC 4.1.1.-)的α-酮辛二酸到庚二酸半醛的转化
3.1.8.1 合适催化剂的选择
在脱羧酶家族中，α-酮酸脱羧酶表现为用于将α-酮辛二酸脱羧的最佳候选物，特别是丙酮酸脱羧酶(EC 4.1.1.1)、苯甲酰甲酸脱羧酶(EC 4.1.1.7)和支链2-氧酸脱羧酶(EC 4.1.1.72)。
已从宽范围的宿主鉴定出编码来自那4组中每组的蛋白质的基因，而且将其产物生化表征且在一些情况中结构性表征(The crystal structure of benzoylformatedecarboxylase at 1.6A resolution Diversity of catalytic residues in ThDP-dependentenzymes:Hasson等.Biochemistry 1998,37,9918-9930；High resolution crystalstructure of pyruvate decarboxylase from Zymomonas mobilis:Dobritzsch等.J.Biol.Chem.1998,273,20196-20204；Structure of the branched-chain keto aciddecarboxylase(KdcA)from Lactococcus lactis provides insights into the structuralbasis for the chemoselective and enantioselective carboligation reaction:Berthold等.Acta Crystallographica Sec.D 2007.D63,1217-1224)。
然后，在那些组中依照其底物特异性选择以下酶：乳酸乳球菌kivD 2-酮异戊酸脱羧酶(GeneBank JA114157)；乳酸乳球菌kdcA支链alpha-酮酸脱羧酶(GeneBank JA114154)，酿酒酵母pdcl丙酮酸脱羧酶(GeneBank JA114148)，运动发酵单胞菌pdc(I472A)丙酮酸脱羧酶突变体(GeneBank JA114151)，恶臭假单胞菌mdlC(A460I)苯甲酰甲酸突变体(GeneBank AY143338；片段2860-4446)。
前面显示的头4种酶在α-酮庚二酸(靶化合物α-酮辛二酸的C-7衍生物)的脱羧中显示一些活性(Preparation of 6-aminocaproic acid from 5-formyl valericacid:DSM-US2011-0171699A1专利)。
对来自恶臭假单胞菌的苯甲酰甲酸脱羧酶A460I突变体的表征展现出与显示对2-酮辛酸低活性的野生型酶(Comparative characterisation ofThPP-dependent decarboxylases:Gocke等.J.Mol.Cat.B:Enzymatic 2009,61,30-35)相比对2-酮己酸的增加的选择性(Exchanging the substrate specificitiesof pyruvate decarboxylase from Zymomonas mobilis and benzoylformatedecarboxylase from Pseudomonas putida:Siegert等.Port.Eng.Des.Sel.2005,18,345-357)。
3.1.9通过具有脱羧酶活性的假定乙酰乳酸合酶的α-酮辛二酸到庚二酸半醛的转化
White[[White RH(1989)Biosynthesis of the 7-mercaptoheptanoic acidsubunit of component B[(7-mercaptoheptanoyl)threonine phosphate]ofmethanogenic bacteria,Biochemistry,28:860-865]已假定了用于合成辅酶B[(7-巯基庚酰)苏氨酸磷酸盐]的途径，其基于对古细菌中其他代谢途径的分析和对用2H和13C标记的前体掺入终产物的质谱分析。该途径含有2-酮辛二酸到7-氧庚酸(庚二酸半醛)的非氧化性脱羧步骤，其由假定的2-酮酸脱羧酶介导。在下一步中，形成7-巯基庚酸。由于仅形成此产物(而且没有C5和C6等同物)，这指示途径中的至少一种上游酶将仅接受C8而非C6和C7底物。
通过使用GC-MS确认从2-酮戊二酸到2-酮辛二酸的2-酮二羧酸延伸反应[White RH(1989)A novel biosynthesis of medium chain lengthalpha-ketodicarboxylic acids in methanogenic archaebacteria..Archivers ofBiochemistry and Biophysics,270:691-697]和从7-氧庚酸合成7-巯基庚酸和辅酶B来验证该途径[White RH(1989)Steps in the conversion ofα-ketosuberateto 7-mercaptoheptanoic acid in methanogenic bacteria,Biochemistry,28:9417-9423；White RH(1994)Biosynthesis of 7-mercaptoheptanoylthreoninephosphate,Biochemistry,33:7077-7081]。已鉴定出编码负责该途径中一些步骤的酶(aksA、aksD、aksE和aksF)的基因，在大肠杆菌中克隆和表达，但并没有编码2-酮辛二酸脱羧酶的基因[Howell DM,Harich K,Xu H,White RH.(1998)Alpha-keto acid chain elongation reactions involved in the biosynthesis ofcoenzyme B(7-mercaptoheptanoyl threonine phosphate)in methanogenicArchaea.Biochemistry,37:10108-10117；Howell DM,Graupner M,Xu H,White RH.(2000)Identification of enzymes homologous to isocitratedehydrogenase that are involved in coenzyme B and leucine biosynthesis inmethanoarchaea.J Bacteriol.182:5013-5016；Drevland RM,Jia Y,Palmer DR,Graham DE.(2008)Methanogen homoaconitase catalyzes both hydrolyasereactions in coenzyme B biosynthesis.J Biol Chem.283:28888-28896]。没有关于2-酮辛二酸到7-氧庚酸的非氧化性脱羧的信息，且未在体外报告该活性。然而，通过全细胞将2-酮辛二酸转化成辅酶B[White RH(1989)]。
方法
White和Graham完成的工作显示古细菌(如詹氏甲烷球菌)可能具有负责2-酮辛二酸到7-氧庚酸的非氧化性脱羧的酶。其他涉及辅酶B途径的酶通过分析以下生物的基因组来鉴定：詹氏甲烷球菌[Bult CJ,White O,Olsen GJ,Zhou L,Fleischmann RD,Sutton GG,Blake JA,FitzGerald LM,Clayton RA,Gocayne JD,Kerlavage AR,Dougherty BA,Tomb JF,Adams MD,Reich CI,Overbeek R,Kirkness EF,Weinstock KG,Merrick JM,Glodek A,Scott JL,Geoghagen NS,Venter JC.(1996)Complete genome序列of themethanogenicarchaeon,Methanococcus jannaschii.Science.273:1058-1073]和热自养甲烷杆菌(Methanobacterium thermoautotrophicum)ΔΗ[Smith DR,Doucette-Stamm LA,Deloughery C,Lee H,Dubois J,Aldredge T,BashirzadehR,Blakely D,Cook R,Gilbert K,Harrison D,Hoang L,Keagle P,Lumm W,Pothier B,Qiu D,Spadafora R,Vicaire R,Wang Y,Wierzbowski J,Gibson R,Jiwani N,Caruso A,Bush D,Reeve JN,(1997)Complete genome序列of热自养甲烷杆菌deltaH:functional analysis and comparative genomics.J Bacteriol.179:7135-7155]。分析基因组中靶基因簇的存在并BLAST搜索与现有酶显示同源性的蛋白质。我们采用了类似的办法来鉴定编码2-酮辛二酸脱羧酶的基因。
结果
基因簇的分析
细菌基因组能显示高组织水平，其中编码作用于特定途径的酶的基因位于操纵子和/或基因簇中。由于已鉴定出辅酶B途径的其他酶并公开了一些古细菌基因组的序列，因此试图鉴定2-酮辛二酸脱羧酶。下表显示涉及该途径的基因和酶。
除了编码热自养甲烷杆菌中(R)-高柠檬酸合酶(MTH1630)和高柠檬酸合酶/脱水酶大亚基(MTH1631)的基因以外，来自詹氏甲烷球菌和热自养甲烷杆菌的辅酶B生物合成基因似乎不位于基因簇中。对含有任何上文所列基因的假定操纵子的分析未显示与已知脱羧酶具有同源性的任何蛋白质的存在。因此，对詹氏甲烷球菌中相关代谢途径中的类似脱羧进行搜索。
詹氏甲烷球菌基因组的分析
对詹氏甲烷球菌中其他代谢途径的分析显示类似的脱羧存在于辅酶M途径[Graupner M,Xu H和White RH.(2000)Identification of the gene encodingsulfopyruvate decarboxylase,an enzyme involved in biosynthesis of coenzyme M.J Bacteriol.182:4862-4867]。
3-硫化丙酮酸到硫化乙醛的非氧化性脱羧由含两个亚基comD(SEQ ID19)和comE(SEQ ID 20)的硫化丙酮酸脱羧酶(EC.4.1.1.79)催化。由于辅酶B和辅酶M两者均牵涉产甲烷且脱羧下游的反应是类似的，因此可能的是脱羧酶一起进化且彼此显示高度同源性。
将ComD、comE及在BRENDA数据库中发现的其直系同源物用作查询来对詹氏甲烷球菌进行BLAST搜索。使用来自Methanocella paludicola的comD/comE脱羧酶(SEQ ID 21)获得最佳匹配。
仅詹氏甲烷球菌基因组编码的两个开放阅读框(MJ0277和MJ0663)显示对comD/comE的显著同源性，E-值<0.0001。这两者均注释为乙酰乳酸合酶(SEQ ID 22和SEQ ID 23)。
使用存放在BRENDA数据库中的接受类似底物的脱羧酶(2-酮戊二酸脱羧酶、草酰乙酸脱羧酶、α-酮异戊酸脱羧酶、转氨的氨基酸脱羧酶、苯甲酰甲酸脱羧酶、2-酮精氨酸脱羧酶、膦酰丙酮酸脱羧酶、丙酮酸脱羧酶和吲哚-3-丙酮酸脱羧酶)的序列来进行另一项搜索。
MJ0277(登录号NP_247250)和MJ0663(NP_247647)对于几乎所有用于搜索基因组的查询均为较好的命中。使用ClustalW算法的蛋白质比对显示MJ0277和comD/comE蛋白之间的显著同源性(图20)。然而，MJ0277显示甚至更高的对来自乳酸乳球菌的LACLA乙酰乳酸合酶的同源性(图21)。
对LACLA乙酰乳酸合酶、来自Methanocella paludicola的comD/comE和假定的乙酰乳酸合酶MJ0277中功能域的分析显示它们均具有含硫胺磷酸盐结合位点的类似结构(图22)。对来自詹氏甲烷球菌的第二开发阅读框MJ0663获得几乎相同的结果。
乙酰乳酸合酶(ALS)(亦称为乙酰羟酸合酶)催化丙酮酸到α-乙酰乳酸的转化。
反应的第一步骤是丙酮酸(为2-酮酸)脱羧成结合酶的中间物，其进一步与第二丙酮酸分子缩合，产生乙酰乳酸。如此，2-酮酸脱羧酶和乙酰乳酸合酶很可能彼此显示高度同源性。
结论
对詹氏甲烷球菌基因组的分析显示注释为乙酰乳酸合酶的两种蛋白质(MJ0277和MJ0663)的存在，其可能是先前未鉴定出的涉及辅酶B生物合成的2-酮辛二酸非氧化性脱羧酶。仅产甲烷菌物种明显具有此种第二型的乙酰乳酸合酶(MJ0663)，其中例如Methanocaldococcus fervens(NC_013156.1)(LocusYP_003128272)；Methanotorris igneus Kol 5(NC_015562.1)(LocusYP_004483786)和Methanocaldococcus infernus ME(NC_014122.1)(LocusYP_003615749)均具有对MJ0663有超过75％阳性的蛋白质。非产甲烷菌物种对MJ0663没有超过50％阳性。其他物种具有对MJ0277,Methanocaldococcusfervens(Locus YP_003127480)；Methanotorris igneus Kol 5(LocusYP_004484320)和Methanocaldococcus infernus ME(Locus YP_003615922)有同源性的第二基因且该基因被注释为乙酰乳酸合酶。该基因对其他非产甲烷生物体中的乙酰乳酸合酶具有同源性。
非常可能的是，其中一种是真正的乙酰乳酸合酶。已在许多古细菌中显示该酶促活性，且詹氏甲烷球菌编码乙酰乳酸合酶调节亚基MJ0161。然而，其中一种酶可能是未鉴定的2-酮酸脱羧酶且只不过是被错误注释了。很可能调节亚基MJ0161或ILVN(詹氏甲烷球菌基因座NP_247129)，乙酰乳酸合酶的小亚基，是MJ0277或MJ0663的脱羧酶活性所需要的。这是一个～190aa的小亚基，其以相等数目结合AHAS/ILVB的二聚体或可能的四聚体全酶。ILVN应答缬氨酸浓度，其充当反馈以阻止过度生产(Barak和Chipman 2012)。ILVB全酶在缺乏ILVN时仅5-15％有效，该调节亚基对其本身没有活性(M.Vyazmensky,C.Sella,Z.Barak,D.M.Chipman.Isolation and Characterizationof Subunits of Acetohydroxy Acid Synthase Isozyme III and Reconstitution ofthe Holoenzyme.Biochemistry,35(1996),pp.10339–10346)。
或者，2-酮辛二酸可能被负责辅酶M途径中3-硫化丙酮酸脱羧的酶脱羧。因此，comD/comE脱羧酶也应被视为靶酶。
鉴定注释为乙酰乳酸合酶MJ0277(NP_247250)和MJ0663(NP_247647)的蛋白质是用于2-酮己二酸、2-酮庚二酸和2-酮辛二酸的非氧化性脱羧的主要候选物。已报道乙酰乳酸合酶催化2-酮酸的脱羧(Atsumi,S.等,2009.Acetolactate synthase from Bacillus subtilis serves as a 2-ketoisovaleratedecarboxylase fro isobutanol synthesis in Escherichia coli.Applied andEnvironmental Microbiology,75(19):6306-6311)。另外：3-硫化丙酮酸脱羧酶comD/comE(P58415/P58416)、Kgd(Q9CC97)、citM(Q7X4Z5)、kivd(Q684J7)、ARO10(Q06408)、MdlC(Q97XR3)、aruI(B7V368)、fom2(Q6D9X5)、PDC6(P26263)和IpdC(F2EPZ5)是用于将2-酮辛二酸转化成庚二酸半醛的优秀候选物(SEQ ID 24-40)。
3.1.10  通过α-酮酸链延伸的α-酮庚二酸到α-酮辛二酸的转化(见图10)
3.1.10.1酶基因靶物的选择
先前报告α-酮庚二酸到α-酮辛二酸的转化是产甲烷古细菌中辅酶B生物合成中的一部分，所述产甲烷古细菌如詹氏甲烷球菌、Methanocaldococcusvannielii、Methanocaldococcus maripaludis、热自养甲烷杆菌、Methanosarcinatermophila等(White,Arch.Biochem.Biophys.270:691-697(1989))。从詹氏甲烷球菌鉴定出编码涉及α-酮戊二酸到辛二酸的多轮链延伸的酶(与涉及亮氨酸和赖氨酸生物合成的酶同源)的基因，并表征其相应蛋白质(a-keto acidchain elongation reactions involved in the biosynthesis of coenzyme B(7-mercaptoheptanoyl threonine phosphate)于Howell等,Biochemistry 37:10108-10I17(1998)；Drevland等,J.Bacteriol.189:4391-4400(2007)；Howell等,J.Bacteriol.182:5013-5016(2000)；Drevland等,J.Biol Chem.283:28888-28896(2008)；和Jeyakanthan等,Biochemistry 49:2687-2696(2010)。
还从热自养甲烷杆菌鉴定出直系同源基因，但尚未表征其产物。在该古细菌中针对每种所需活性(AskA、AksD/E和AksF)至少报告了两种isogene，如先前在詹氏甲烷球菌中报告的(Smith等.1997,179,7135-7155)。下表呈现了相应的热自养甲烷杆菌蛋白与确立的詹氏甲烷球菌蛋白的直系同源性，其基于前述文献及其推导的潜在功能。
在文献中报告了对热自养甲烷杆菌中链延伸蛋白直系同源物的鉴定，其来自詹氏甲烷球菌和热自养甲烷杆菌基因组之间的比较基因组学数据，相应的蛋白质序列分析和活性测定。报告了备选的热自养甲烷杆菌基因产物及其相应的詹氏甲烷球菌直系同源物用于合成alpha-酮庚二酸的潜在应用(WO2010-104391A2)。因此，选出8种热自养甲烷杆菌蛋白来例示庚二酸和辛二酸之间的链延伸反应，所述蛋白即AksA 2-异丙基苹果酸合酶/高柠檬酸合酶MTH1630(GeneBank AE000666.1；片段1494539-1495714)和MTH1481，((GeneBank AE000666.1；片段1337346-1338863)；AksD 3-异丙基苹果酸脱水酶/高顺乌头酸酶(大亚基)MTH1386(GeneBank AE000666.1；片段1253910-1255169)；和MTH1631(GeneBank AE000666.1；片段1495715-1497001；AksE 3-异丙基苹果酸脱水酶或异构酶/高顺乌头酸酶(小亚基)MTH 0829((GeneBank AE000666.1；片段752586-753098；和MTH1387(GeneBank AE000666.1；片段1255181-1255669；和AksF 3-异丙基苹果酸脱氢酶/高异柠檬酸脱氢酶MTH0184(GeneBank AE000666.1；片段130396-131391；和MTH 1388(GeneBank AE000666.1；片段1255666-1256655)。
选择野生型基因用于构建相应的大肠杆菌表达载体，不过排除了其中起始密码子GTG或TTG变为ATG的基因AksA(1)-MTH1630、AksD(2)-MTH1631和AksF(2)-MTH1388。
3.1.10.2克隆含有基因靶物的表达载体
然后，使用inABLE技术将选定的来自热自养甲烷杆菌的基因靶物克隆到IPTG可诱导的pET21-a主链中(如3.1.1.2部分详述的)以生成I9(热自养甲烷杆菌AksA(1)-MTH1630基因在pET21-a中)，I10(热自养甲烷杆菌AksA(2)-MTH1481基因在pET21-a中)，I11(热自养甲烷杆菌AksD(1)-MTH1386基因在pET21-a基因中)，I12(热自养甲烷杆菌AksD(2)-MTH1631基因在pET21-a中)，I13(热自养甲烷杆菌AksE(1)-MTH0829基因在pET21-a中)，I14(热自养甲烷杆菌AksE(2)-MTH1387基因在pET21-a中)，I15(热自养甲烷杆菌AksF(1)-MTH0184基因在pET21-a中)和I16(热自养甲烷杆菌AksF(2)-MTH1388基因在pET21-a中)。
简言之，破坏选定基因及载体主链中潜在的EarI位点以阻止对涉及EarI消化/连接循环的部分/接头融合制备物的干扰。在AksD(1)-MTH1386、AksD(2)-MTH1631和AksE(2)-MTH1387中未观察到EarI位点。在AksA(1)-MTH1630、AksA(2)-MTH1481、AksE(1)-MTH0829和AksF(2)-MTH1388基因的每一个中观察到1个EarI位点，且在AksF(1)-MTH0184基因中观察到2个EarI位点，在载体主链pET21-a中检测到3个EarI位点。通过在限制性位点中引入沉默突变来破坏EarI位点。载体中的3个EarI位点通过将限制性位点的最后一个鸟嘌呤突变成胸腺嘧啶来破坏。
然后，将无EarI的序列用作部分设计软件的输入序列来设计相应的由EarI位点侧接的截短部分，如3.1.1.2部分中论述的。将合成的热自养甲烷杆菌AksA(1)-MTH1630(TP48)、AksA(2)-MTH1481(TP49)、AksD(1)-MTH1386(TP50)、AksD(2)-MTH1631(TP51)、AksE(1)-MTH0829(TP52)、AksE(2)-MTH1387(TP53)、AksF(1)-MTH0184(TP54)和AksF(2)-MTH1388(TP55)截短部分插入到DNA2.0pJ201载体中。全部合成pET21-a截短部分载体，其中引入包含氯霉素抗性基因的片段以生成载体TP31。
如3.1.1.2部分所述对inABLE寡核苷酸进行磷酸化和随后的退火。简言之，将寡聚体与T4激酶在37℃温育30分钟，接着使酶在65℃失活20分钟。
接下来，通过将截短部分的5’端与其相应部分寡聚体退火的片段连接，以及截短部分的3’端与接头寡聚体退火的片段连接来制备部分接头融合物，如先前3.1.1.2部分描述的。制备对应于选定基因(热自养甲烷杆菌AksA(1)-MTH1630、AksA(2)-MTH1481、AksD(1)-MTH1386、AksD(2)-MTH1631、AksE(1)-MTH0829、AksE(2)-MTH1387、AksF(1)-MTH0184和AksF(2)-MTH1388)的部分接头融合物，其通过连接它们相应的退火部分寡聚体(POA48、POA49、POA50、POA51、POA52、POA53、POA54或POA55)、其截短部分(TP48、TP49、TP50、TP51、TP52、TP53、TP54或TP55)和来自载体主链的退火的接头寡聚体。制备对应于载体主链的部分接头融合物，其通过连接它的退火部分寡聚体、它的截短部分和来自任一基因的退火接头寡聚体。还制备阴性对照无基因装配物，其通过连接载体主链退火的部分寡聚体、它的截短部分和它的退火接头寡聚体，从而导致载体主链的自身装配。
在基因和载体反应中使用比截短部分10倍和20倍摩尔过量的接头和部分寡聚体以利于截短部分和寡核苷酸在每个EarI消化/连接循环期间的连接。将50μL EarI消化/连接反应在热循环仪(Eppendorf Mastercycler Gradient)中温育，在37℃至16℃变换温度。当完成循环后，将样品加载到0.7％琼脂糖凝胶上，且对部分/接头融合的制备物观察到预期大小的片段。然后，将正确大小的条带从凝胶切出，并使用QIAGEN QIAquick Gel Extraction Kit凝胶提取DNA。在30μ1的总体积中，DNA浓度为从13.6ng/μl到24.8μg/μl(DNA浓度，范围4.9nM到53.9nM)。还进行部分/接头融合物(pET21-a部分/pET21-a接头)的自身装配来生成阴性对照无基因构建体。
然后，经由如3.1.1.2部分描述的2部分装配实施基因部分/接头融合物与其相应载体部分/接头融合物的组合。简言之，将基因部分接头和载体部分接头在室温温育30min，接着转化高效率化学感受态ΝΕΒ10β大肠杆菌细胞，其使用2μL装配反应液和10μL感受态细胞。将转化后的细胞铺板于LB-Amp-琼脂上并在37℃过夜温育。对于每种装配获得约1000个克隆。从每种装配挑取2个随机克隆并使用QIAGEN QIAprep Miniprep Kit分离相应的载体。
实施限制来确认载体构建，如3.1.1.2部分描述的。简言之，使用BglII和XmnI分析从I9获得的克隆以鉴定对于Methanobacterium thermoaiitotrophiciimAksA(1)-MTH1630基因插入到pET21-a中为阳性的克隆，使用PstI和XmaI/XbaI分析从I10装配获得的克隆以鉴定AksA(2)-MTH1481基因到pET21-a的插入，使用HincII和AlwNI分析从I11装配获得的克隆以鉴定AksD(1)-MTH1386基因的插入，使用NcoI和BglII分析从I12装配获得的克隆以鉴定AksD(2)-MTH1631基因的插入，使用MluI和XmnI分析从I13装配获得的克隆以鉴定AksE(1)-MTH0829到pET21-a的插入，使用PsiI和XmaI/AlwNI分析从I14装配获得的克隆以鉴定AksE(2)-MTH1387基因到大肠杆菌表达载体的插入，使用AlwNI和HincII分析从I15装配获得的克隆以鉴定AksF(1)-MTH0184基因到大肠杆菌表达载体的插入，且使用BsaI和HindIII/AlwNI分析从I16装配获得的克隆以鉴定AksF(2)-MTH1388的插入。将限制性产物运行在琼脂糖凝胶上，并对从每种装配测试的克隆观察预期的条带模式，从而确认携带热自养甲烷杆菌链延伸基因的大肠杆菌pET21-a表达载体的构建。另外，对载体主链3’端和基因5’端之间以及基因3’端和载体主链5’端之间的部分交界处测序以确认构建。
3.1.10.3外源硫酯酶基因在大肠杆菌中的表达
如3.1.1.3部分描述的实施外源热自养甲烷杆菌AksA(1)-MTH1630、AksA(2)-MTH1481、AksD(1)-MTH1386、AksD(2)-MTH1631、AksE(1)-MTH0829、AksE(2)-MTH1387、AksF(1)-MTH0184和AksF(1)-MTH0184链延伸基因基因产物在大肠杆菌中的表达。简言之，将电感受态BL21(DE3)细胞用10ng DNA转化，并将转化样品铺板于LB-Amp-Agar上。在37℃过夜温育后获得转化体。从每种装配挑取单个克隆，并将5ml的LB-Amp培养基接种作为起始培养物。在37℃和250rpm过夜温育后测量培养物的OD600，将2mL培养物(约8xl07)用于接种100mL的LB-Amp，将其在37℃和250rpm的500mL带障板摇瓶中温育。
蛋白质表达通过添加1mM IPTG(终浓度)诱导，且将培养物在37℃和250rpm温育。在诱导前、诱导后温育4h和24h后，取1mL样品，并测量OD600来确定细胞生长。诱导后温育24h后，将剩余培养物转移至50mL falcon管，通过在5000rpm离心10分钟收获并将细胞团粒用于进一步分析或储存于-20℃。
对于SDS-PAGE分析，将样品在13000rpm离心2min，除去上清液，并使用补充有溶菌酶(15mg/mL)和Benzonase(3.4U/μL)的Bugbuster蛋白质提取试剂来裂解细胞。然后，将裂解反应液在13000rpm离心2min，将可溶级分转移至新管，而将不溶性级分重悬于水。将20μl的每种级分与80μlSDS-Sample缓冲液(SDS-Loading缓冲液，9％DTT和水)混合，在热块中于95℃加热5分钟，然后将10μl的每种SDS-样品制备物加载到SDS-PAGE4-20％Tricene凝胶上来分析可溶和不可溶级分的蛋白质含量。
仅AksE(2)-MTH1387蛋白成功以可溶形式表达，即在IPTG诱导后可溶级分中有18kD条带。AksA(1)-MTH1630、AksD(2)-MTH1631、AksF(1)-MTH0184和AksF(2)-MTH1388蛋白以不可溶形式表达，即在不可溶部分中分别检测到44、36和46kD条带。未检测到AksA(2)-MTH1481、AksD(1)-MTH1386和AksE(2)-MTH1387蛋白的表达。因此，对AksA(1)-MTH1630、AksD(2)-MTH1631、AksF(1)-MTH0184、AksF(2)-MTH1388、AksA(2)-MTH1481、AksD(1)-MTH1386和AksE(2)-MTH1387进行表达优化，其基于文献中詹氏甲烷球菌直系同源物成功表达的报告。具体地，关于詹氏甲烷球菌直系同源物表达的文献数据揭示了具体就诱导物浓度和诱导温度而言的一组不同条件。IPTG浓度在0.1至1mM变化(起始浓度1mM)而诱导温度在16至37C变化(起始条件37C)。将如3.1.1.3部分所述的相同表达方案和相同SDS-PAGE样品制备物用于溶解性优化实验。
在将IPTG浓度降低10倍后改进了AksA(1)-MTH1630蛋白的表达水平，但该蛋白仍不可溶；温度的优化未影响表达或溶解性。通过将IPTG浓度降低10倍未在AksD(2)-MTH1631和AksF(2)-MTH1388溶解性中有显著改进，因为这两种蛋白均仅在诱导后不可溶级分中可见。通过将诱导温度降低至16℃未对AksD(2)-MTH1631和AksF(2)-MTH1388观察到溶解性中的显著改进，因为这两种蛋白均仅在诱导后不可溶级分中可见。然而，通过将诱导温度降低至30℃改进了AksF(1)-MTH0184溶解性。因此，AksA(1)-MTH1630(19)、AksD(2)-MTH1631(112)和AksF(2)-MTH1388(116)可在不同宿主例如真核系统如酿酒酵母或在嗜热细菌如嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)中表达。
由于热自养甲烷杆菌AksA(1)-MTH1630、AksA(2)-ΜL′H1481、AksD(2)-MTH1631和AksE(1)-MTH0829基因产物在使用pET21-a/TPTG表达系统的大肠杆菌中不以可溶形式表达，因此克隆这些基因用于使用酿酒酵母表达系统表达。使用上述inABLE技术装配表达载体，只不过在酵母载体主链的部分/接头融合物制备中SapI限制性酶替换了EarI，所述酵母载体主链包含构成性启动子ADHlp、转录终止子CYC 1t、和源自YEplacl95质粒的高拷贝数载体主链。将电感受态TOP 10大肠杆菌细胞用每种部分/接头装配物转化并使用QIAGEN Hi-Speed Plasmid Purification Midi Kit制备大量DNA存库(120μl中67.4-173.0nM)。对于酵母载体部分/ADH1启动子接头观察到预期大小的片段，尽管在琼脂糖凝胶电泳后使用SapI。然后从凝胶切出正确的条带，并使用QIAGEN QIAquick Gel Extraction Kit凝胶提取DNA(30μl中14.1-138.1nM)。
然后，在37C温育4部分装配反应液，即ADHl启动子，每种热自养甲烷杆菌基因AksA(1)-MTH1630、AksA(2)-MTH1481、AksD(2)-MTH1631和AksE(1)-MTH0829，CYC1终止子和酵母载体主链来制备最终构建体。接着，将10μl高效率化学感受态ΝΕΒ10β大肠杆菌细胞用2μl装配反应液转化，铺板于LB-Kan-琼脂，并在37℃过夜温育。对于4部分装配获得200至250个克隆。然后，从板挑取5个随机克隆，并使用QIAGEN QIAprep Miniprep Kit分离相应的载体。
使用限制性分析分析分离的构建体。使用PmeI/SapI进行初步分析来鉴定任何截短的载体污染物。所述克隆不含截短的载体污染物，因此接着使用限制性酶XhoI/NdeI、BsaI和MluI对其进行分析以确认4部分/接头融合物的插入。对于两种克隆均观察到预期的条带模式，从而确认了携带ADH1启动子、感兴趣基因、CYC1终止子和酵母载体主链的酿酒酵母表达载体的构建。最后，对4部分之间的交界处测序以确认适宜的装配。
可如本文中描述的实施用酿酒酵母I24-I27表达载体的转化，并在细胞裂解后使用SDS-PAGE来监测从构成性启动子ADH1p的表达。I24构建体包含插入酵母载体主链的ADH1启动子、热自养甲烷杆菌AksA(1)-MTH1630基因和CYC1终止子。I25构建体包含ADH1启动子、热自养甲烷杆菌AksA(2)-MTH1481基因和CYC1终止子。I26构建体包含ADH1启动子、热自养甲烷杆菌AksD(2)-MTH1631基因和CYC1终止子。I27构建体包含ADH1启动子、热自养甲烷杆菌AksE(1)-MTH0829基因和CYC1终止子。
贯穿本申请引用的专利、专利申请、公开出版物、产物描述和方案通过提述完整并入本文用于所有目的。

Claims (183)

1.一种转化化合物的方法，所述方法包括使选自2,6二氨基庚二酸盐(2,6diaminopimelate,2,6DAP)和α-氨基-庚二酸盐(α-amino-pimelate,AAP)的化合物与催化2,6DAP到6-氨基-2-庚烯二酸(6-amino-2-heptenedioic acid,6A2HA)的还原性脱氨基化或AAP到2-庚烯二酸(2-heptene dioic acid,2HDA)的还原性脱氨基化的酶接触，其中产生6A2HA或2HDA。
2.权利要求1的方法，其中所述化合物是2,6DAP。
3.权利要求2的方法，其还包括使所述6A2HA与催化6A2HA到AAP的烯酸还原的酶接触，其中产生AAP。
4.权利要求3的方法，其还包括使所述AAP与催化AAP到2HDA的还原性脱氨基化的酶接触，其中产生2HDA。
5.权利要求4的方法，其还包括使所述2HDA与催化2HDA到庚二酸(pimelic acid,PA)的烯酸还原的酶接触，其中产生PA。
6.权利要求5的方法，其还包括使所述PA与催化PA到庚二酸半醛(pimelic acid semialdehyde,PAS)的羧酸还原的酶接触，其中产生PAS。
7.权利要求6的方法，其还包括使所述PAS与催化PAS到7-氨基-庚酸(7-amino-heptanoic acid,7AHA)的半醛氨基化的酶接触，其中产生7AHA。
8.权利要求7的方法，其还包括使所述7AHA与催化7AHA到庚内酰胺(enantholactam,ENTL)的酰胺水解的酶接触，其中产生ENTL。
9.权利要求7的方法，其还包括使所述7AHA与催化7AHA到7-氨基-庚醛(7-amino-heptanal,7AHT)的醛脱氢的酶接触，其中产生AHT。
10.权利要求9的方法，其还包括使所述7AHT与催化氨基基团到7AHT的转移以产生1,7-二氨基庚烷(1,7-diaminoheptane,1,7DAH)的酶接触，其中产生1,7DAH。
11.权利要求4的方法，其还包括使所述2HDA与催化辅酶A(CoA)到2HAD的转移以产生2-庚烯二酸-CoA(2-heptene diacid-CoA,2HDA-CoA)的酶接触，其中产生2HDA-CoA。
12.权利要求11的方法，其还包括使所述2HDA-CoA与催化2HDA-CoA到庚二酰-CoA(pimeloyl-CoA,PCoA)的烯酸还原的酶接触，其中产生PCoA。
13.权利要求12的方法，其还包括使所述PCoA与催化PCoA到PA的硫酯水解的酶接触，其中产生PA。
14.权利要求13的方法，其还包括使所述PA与催化PA到PAS的羧酸还原的酶接触，其中产生PAS。
15.权利要求14的方法，其还包括使所述PAS与催化PAS到7AHA的半醛氨基化的酶接触，其中产生7AHA。
16.权利要求15的方法，其还包括使所述7AHA与催化7AHA到ENTL的酰胺水解的酶接触，其中产生ENTL。
17.权利要求15的方法，其还包括使所述7AHA与催化7AHA到7AHT的醛脱氢的酶接触，其中产生7AHT。
18.权利要求17的方法，其还包括使所述7AHT与催化氨基基团到7AHT的转移以产生1,7DAH的酶接触，其中产生1,7DAH。
19.权利要求4的方法，其还包括使所述AAP与催化氨基基团到AAP的转移以产生α-酮-庚二酸盐(α-keto-pimelate,AKP)的酶接触，其中产生AKP。
20.权利要求19的方法，其还包括使所述AKP与催化AKP到α-羟基-庚二酸盐(α-hydroxy-pimelate,AHP)的酮还原的一种或多种酶接触，其中产生AHP。
21.权利要求20的方法，其还包括使所述AHP与催化CoA到AHP的转移以产生α-羟基-庚二酸盐-CoA(α-hydroxy-pimelate-CoA,AHP-CoA)的酶接触，其中产生AHP-CoA。
22.权利要求21的方法，其还包括使所述AHP-CoA与催化AHP-CoA到2HDA-CoA的脱水的酶接触，其中产生2HDA-CoA。
23.权利要求22的方法，其还包括使所述2HDA-CoA与催化2HDA-CoA到PCoA的烯酸还原的酶接触，其中产生PCoA。
24.权利要求23的方法，其还包括使所述PCoA与催化PCoA到PA的硫酯水解的酶接触，其中产生PA。
25.权利要求24的方法，其还包括使所述PA与催化PA到PAS的羧酸还原的酶接触，其中产生PAS。
26.权利要求25的方法，其还包括使所述PAS与催化PAS到7AHA的半醛氨基化的酶接触，其中产生7AHA。
27.权利要求26的方法，其还包括使所述7AHA与催化7AHA到ENTL的酰胺水解的酶接触，其中产生ENTL。
28.权利要求26的方法，其还包括使所述7AHA与催化7AHA到7AHT的醛脱氢的酶接触，其中产生7AHT。
29.权利要求28的方法，其还包括使所述7AHT与催化氨基基团到7AHT的转移以产生1,7DAH的酶接触，其中产生1,7DAH。
30.权利要求20的方法，其还包括使所述AHP与催化AHP到2HDA的脱水的酶接触，其中产生2HDA。
31.权利要求30的方法，其还包括使所述2HDA与催化2HDA到庚二酸(PA)的烯酸还原的酶接触，其中产生PA。
32.权利要求31的方法，其还包括使所述PA与催化PA到PAS的羧酸还原的酶接触，其中产生PAS。
33.权利要求32的方法，其还包括使所述PAS与催化PAS到7AHA的半醛氨基化的酶接触，其中产生7AHA。
34.权利要求33的方法，其还包括使所述7AHA与催化7AHA到ENTL的酰胺水解的酶接触，其中产生ENTL。
35.权利要求33的方法，其还包括使所述7AHA与催化7AHA到7AHT的醛脱氢的酶接触，其中产生7AHT。
36.权利要求35的方法，其还包括使所述7AHT与催化氨基基团到7AHT的转移以产生1,7DAH的酶接触，其中产生1,7DAH。
37.权利要求30的方法，其还包括使所述2HDA与催化CoA到2HAD的转移以产生2HDA-CoA的酶接触，其中产生2HDA-CoA。
38.权利要求37的方法，其还包括使所述2HDA-CoA与催化2HDA-CoA到PCoA的烯酸还原的酶接触，其中产生PCoA。
39.权利要求38的方法，其还包括使所述PCoA与催化PCoA到PA的硫酯水解的酶接触，其中产生PA。
40.权利要求39的方法，其还包括使所述PA与催化PA到PAS的羧酸还原的酶接触，其中产生PAS。
41.权利要求40的方法，其还包括使所述PAS与催化PAS到7AHA的半醛氨基化的酶接触，其中产生7AHA。
42.权利要求41的方法，其还包括使所述7AHA与催化7AHA到ENTL的酰胺水解的酶接触，其中产生ENTL。
43.权利要求41的方法，其还包括使所述7AHA与催化7AHA到7AHT的醛脱氢的酶接触，其中产生7AHT。
44.权利要求43的方法，其还包括使所述7AHT与催化氨基基团到7AHT的转移以产生1,7DAH的酶接触，其中产生1,7DAH。
45.权利要求19的方法，其还包括使所述AKP与催化AKP到α-酮-辛二酸盐(α-keto-suberate,AKS)的α-酮酸链延伸的酶接触，其中产生AKS。
46.权利要求45的方法，其还包括使所述AKS与催化氨基基团到AKS的转移以产生α-氨基辛二酸盐(α-amino suberate,AAS)的酶接触，其中产生AAS。
47.权利要求46的方法，其还包括使所述AAS与催化AAS到7AHA的α-氨基酸脱羧化的酶接触，其中产生7AHA。
48.权利要求47的方法，其还包括使所述7AHA与催化7AHA到ENTL的酰胺水解的酶接触，其中产生ENTL。
49.权利要求47的方法，其还包括使所述7AHA与催化7AHA到7AHT的醛脱氢的酶接触，其中产生7AHT。
50.权利要求49的方法，其还包括使所述7AHT与催化氨基基团到7AHT的转移以产生1,7DAH的酶接触，其中产生1,7DAH。
51.权利要求45的方法，其还包括使所述AKS与催化AKS到PAS的α-酮酸脱羧化的酶接触，其中产生PAS。
52.权利要求51的方法，其还包括使所述PAS与催化PAS到7AHA的半醛氨基化的酶接触，其中产生7AHA。
53.权利要求52的方法，其还包括使所述7AHA与催化7AHA到ENTL的酰胺水解的酶接触，其中产生ENTL。
54.权利要求52的方法，其还包括使所述7AHA与催化7AHA到7AHT的醛脱氢的酶接触，其中产生7AHT。
55.权利要求54的方法，其还包括使所述7AHT与催化氨基基团到7AHT的转移以产生1,7DAH的酶接触，其中产生1,7DAH。
56.权利要求23的方法，其还包括使所述PCoA与催化PCoA到PAS的还原的酶接触，其中产生PAS。
57.权利要求56的方法，其还包括使所述PAS与催化PAS到7AHA的半醛氨基化的酶接触，其中产生7AHA。
58.权利要求57的方法，其还包括使所述7AHA与催化7AHA到ENTL的酰胺水解的酶接触，其中产生ENTL。
59.权利要求57的方法，其还包括使所述7AHA与催化7AHA到7AHT的醛脱氢的酶接触，其中产生7AHT。
60.权利要求59的方法，其还包括使所述7AHT与催化氨基基团到7AHT的转移以产生1,7DAH的酶接触，其中产生1,7DAH。
61.权利要求38的方法，其还包括使所述PCoA与催化PCoA到PAS的还原的酶接触，其中产生PAS。
62.权利要求61的方法，其还包括使所述PAS与催化PAS到7AHA的半醛氨基化的酶接触，其中产生7AHA。
63.权利要求62的方法，其还包括使所述7AHA与催化7AHA到ENTL的酰胺水解的酶接触，其中产生ENTL。
64.权利要求62的方法，其还包括使所述7AHA与催化7AHA到7AHT的醛脱氢的酶接触，其中产生7AHT。
65.权利要求64的方法，其还包括使所述7AHT与催化氨基基团到7AHT的转移以产生1,7DAH的酶接触，其中产生1,7DAH。
66.一种转化化合物的方法，所述方法包括使选自6A2HA和2HDA的化合物与催化6A2HA到AAP的烯酸还原或2HDA到PA的烯酸还原的酶接触，其中产生AAP或PA。
67.一种转化化合物的方法，所述方法包括使选自PCoA和庚二酰[acp](PACP)的化合物与催化PCoA或PACP到PA的硫酯酶水解的酶接触，其中产生PA。
68.权利要求67的方法，其还包括使所述PA与催化PA到PAS的羧酸还原的酶接触，其中产生PAS。
69.权利要求68的方法，其还包括使所述PAS与催化PAS到7AHA的半醛氨基化的酶接触，其中产生7AHA。
70.权利要求69的方法，其还包括使所述7AHA与催化7AHA到ENTL的酰胺水解的酶接触，其中产生ENTL。
71.权利要求69的方法，其还包括使所述7AHA与催化7AHA到7AHT的醛脱氢的酶接触，其中产生7AHT。
72.权利要求71的方法，其还包括使所述7AHT与催化氨基基团到7AHT的转移以产生1,7DAH的酶接触，其中产生1,7DAH。
73.一种转化化合物的方法，所述方法包括使AKP与催化AKP到AHP的酮还原的一种或多种酶接触，其中产生AHP。
74.权利要求73的方法，其中所述AKP通过α-酮己二酸或α-酮戊二酸的链延伸产生。
75.权利要求73的方法，其进一步包括将AHP转化成PA或PcoA。
76.一种转化化合物的方法，所述方法包括通过α-酮酸链延伸将AKP转化为AKS。
77.权利要求76的方法，其中所述AKP通过α-酮己二酸或α-酮戊二酸的链延伸产生。
78.一种转化化合物的方法，所述方法包括使所述PAS与催化PAS到7AHA的半醛氨基化的酶接触，其中产生7AHA。
79.权利要求78的方法，其中通过从2,6DAP、AKG、PCoA或PACP的转化获得所述PAS。
80.一种转化化合物的方法，所述方法包括使选自PCoA和PACP的化合物与催化该化合物到PAS还原的酶接触，其中产生PAS。
81.一种转化化合物的方法，所述方法包括使PAS与催化PAS到7-羟基-庚酸(7HHA)的醇脱氢的酶接触，其中产生7HHA。
82.权利要求1-81中任一项的方法，其中所述酶、或一种或多种酶是纯化的酶。
83.权利要求1-81中任一项的方法，其中所述酶、或一种或多种酶在细胞裂解物或部分纯化的细胞裂解物中。
84.权利要求1-81中任一项的方法，其中所述酶、或一种或多种酶在重组表达其的细胞中。
85.权利要求1或2的方法，其中所述酶包含氨裂合酶。
86.权利要求85的方法，其中所述氨裂合酶是EC 4.3.1中的氨裂合酶。
87.权利要求86的方法，其中所述EC 4.3.1中的氨裂合酶包括EC 4.3.1.1；EC 4.3.1.2；EC 4.3.1.3；EC 4.3.1.9；EC 4.3.1.12；EC 4.3.1.13；EC 4.3.1.23；或EC 4.3.1.24。
88.权利要求3、5、12、23、31、38和66中任一项的方法，其中所述酶包括烯酸还原酶。
89.权利要求88的方法，其中所述烯酸还原酶包括EC 1.3.1中的烯酸还原酶。
90.权利要求88的方法，其中所述烯酸还原酶为：
(a)在EC 1.3.1中，且包括EC 1.3.1.8；EC 1.3.1.9；EC 1.3.1.10、EC 1.3.1.31；EC 1.3.1.38；EC 1.3.1.39；EC 1.3.1.44；或EC 1.3.1.62中的庚二酰-CoA脱氢酶如PimC/PimD或ThnJ/ThnK；或
(b)在EC 1.3中，如EC 1.3.8.1；EC 1.3.99.3；EC 1.3.99.B10；或Syntrophusaciditrophicus 2,3-二脱氢庚二酰-CoA还原酶及其同源物。
91.权利要求6、14、25、32、40和68中任一项的方法，其中所述酶包括羧酸还原酶或NAD依赖性非酰化醛脱氢酶。
92.权利要求91的方法，其中所述羧酸还原酶包括EC 1.2.99中的羧酸还原酶或NAD依赖性非酰化醛脱氢酶如鞘氨醇单胞菌属(Shingomonas)或贪铜菌属(Cupriavidus)物种中的ThnG。
93.权利要求92的方法，其中所述EC 1.2.99中的羧酸还原酶包括EC1.2.99.6，且所述NAD依赖性非酰化醛脱氢酶是鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)中的ThnG。
94.权利要求7、15、26、33、52、57、62、69和78中任一项的方法，其中所述酶包括ω-转氨酶。
95.权利要求94的方法，其中所述ω转氨酶包括EC 2.6.1中的转氨酶。
96.权利要求95的方法，其中所述EC 2.6.1中的ω转氨酶包括EC 2.6.1.18；EC 2.6.1.19；EC 2.6.1.11；EC 2.6.1.13；EC 2.6.1.39，EC 2.6.1.48，EC 2.6.1.62。
97.权利要求13、24、39、56、61和67中任一项的方法，其中所述酶包含硫酯酶、酸-硫醇连接酶或CoA转移酶。
98.权利要求97的方法，其中所述硫酯酶包含EC 3.1.2中的硫酯酶。
99.权利要求98的方法，其中所述EC 3.1.2中的硫酯酶包括：
作用于CoA-硫酯的硫酯酶，其来自EC 3.1.2.18；EC 3.1.2.19；或EC3.1.2.20；
YciA、tesB或Acot13的基因产物；或
作用于[acp]-硫酯的硫酯酶，其来自EC 3.1.2.14和EC 3.1.2.21。
100.权利要求97的方法，其中所述酸-硫醇连接酶包括EC 6.2.1中的酸-硫醇连接酶。
101.权利要求100的方法，其中所述EC 6.2.1中的酸-硫醇连接酶包括来自EC 6.2.1.3；EC 6.2.1.5；EC 6.2.1.14；或EC 6.2.1.23的作用于CoA酯的CoA合成酶和EC 6.2.1.14(如BioW)和EC 6.2.1.20中的酰基-[acp]-合成酶。
102.权利要求97的方法，其中所述CoA转移酶包括EC 2.8.3中的CoA转移酶。
103.权利要求102的方法，其中所述EC 2.8.3中的CoA转移酶包括EC2.8.3.12；EC 2.8.3.13或EC 2.8.3.14或ThnH的基因产物。
104.权利要求10、18、19、29、36、44、46、50、60、65和72中任一项的方法，其中所述酶包括氨基酸氨基转移酶或脱氨基脱氢酶。
105.权利要求104的方法，其中所述氨基酸氨基转移酶包含EC 2.6.1中的氨基转移酶。
106.权利要求105的方法，其中所述EC 2.6.1中的氨基酸氨基转移酶包括EC 2.6.1.21；EC 2.6.1.39；EC 2.6.1.42；或EC 2.6.1.67。
107.权利要求20或73的方法，其中所述一种或多种酶包括羰基还原酶。
108.权利要求107的方法，其中所述羰基还原酶包括EC.1.1.1.184、EC1.1.1.79、EC 1.1.1.B3；EC 1.1.1.B4；或来自EC 1.1.99.2.或EC 1.1.99.6的2-羟基戊二酰脱氢酶/α酮戊二酸还原酶。
109.权利要求47或51的方法，其中所述酶包括α-酮酸脱羧酶或乙酰乳酸合酶。
110.权利要求56、61、或80的方法，其中所述酶包括脂肪-酰基-CoA还原酶或脂肪-酰基-[acp]还原酶或醛脱氢酶。
111.权利要求110的方法，其中所述脂肪-酰基-CoA还原酶、脂肪-酰基-[acp]还原酶或醛脱氢酶是EC 1.2.1中的还原酶。
112.权利要求111的方法，其中所述EC 1.2.1中的脂肪-酰基-CoA还原酶、脂肪-酰基-[acp]还原酶或醛脱氢酶包括EC 1.2.1.3；EC 1.2.1.4；EC 1.2.1.20；EC 1.2.1.22；EC 1.2.1.50；EC 1.2.1.57；EC 1.2.1.63；或EC 1.2.1.76。
113.权利要求9、15、28、35、43、49、55、59、64和71中任一项的方法，其中所述酶包括醛脱氢酶、羧酸还原酶或非酰化醛脱氢酶。
114.权利要求113的方法，其中所述醛脱氢酶包括EC 1.2.1，所述羧酸还原酶或非酰化醛脱氢酶包括EC 1.2.99中的羧酸还原酶或非酰化醛脱氢酶如ThnG。
115.权利要求114的方法，其中所述EC 1.2.1中的醛脱氢酶包括EC1.2.1.3、EC 1.2.1.4或EC 1.2.1.63，所述羧酸还原酶包括EC 1.2.99.6；且所述非酰化醛脱氢酶包括来自鞘氨醇单胞菌属或贪铜菌属物种的ThnG。
116.权利要求11、21和37中任一项的方法，其中所述酶包括CoA转移酶或酸-硫醇连接酶。
117.权利要求116的方法，其中所述CoA转移酶包括EC 2.8.3中的CoA转移酶，且所述酸-硫醇连接酶包括EC 6.2.1。
118.权利要求117的方法，其中所述EC 2.8.3中的CoA转移酶包括EC2.8.3.12；EC 2.8.3.13或EC 2.8.3.14或ThnH的基因产物，且所述EC 6.2.1中的酸-硫醇连接酶包括EC 6.2.1.3；EC 6.2.1.5；EC 6.2.1.14；和EC 6.2.1.23。
119.权利要求8、16、27、34、42、48、53、58、63和70中任一项的方法，其中所述酶是EC 3.5.2如3.5.2.11中的氨基水解酶。
120.权利要求22或30的方法，其中所述酶包括水裂合酶。
121.权利要求120的方法，其中所述水裂合酶包括EC 4.2.1中的水裂合酶。
122.权利要求121的方法，其中所述EC 4.2.1中的水裂合酶包括EC4.2.1.2；EC 4.2.1.59；4.2.1.61；4.1.2.17或4.1.2.18。
123.权利要求45、74、76和77中任一项的方法，其中所述α-酮酸链延伸由包含以下的一组或多组酶催化：AksA、AksD、AksE和AksF。
124.权利要求123的方法，其中所述AksA包括EC 2.3.3中的AksA酶。
125.权利要求124的方法，其中所述EC 2.3.3中的AksA酶包括EC2.3.3.13或2.3.3.14。
126.权利要求123的方法，其中所述AksD和Aks E均包括EC 4.2.1.114中的AksD/E酶。
127.权利要求123的方法，其中所述AksD包括EC 4.2.1.114中的酶，而Aks E包括EC 4.2.1.36中的酶。
128.权利要求123的方法，其中所述AksF包括EC 1.1.1中的AksF酶。
129.权利要求128的方法，其中所述EC 1.1.1.中的AksF酶包括EC1.1.1.87。
130.权利要求45、74、76和77中任一项的方法，其中所述一种或多种α-酮酸链延伸酶来自产甲烷的细菌。
131.权利要求81的方法，其中所述酶包括醇脱氢酶或醛还原酶。
132.权利要求131的方法，其中所述醇脱氢酶包括EC.1.1.1.1、EC 1.1.1.2或EC 1.1.1.21。
133.权利要求131的方法，其中所述醇脱氢酶选自来自运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)的adhA、来自运动发酵单胞菌的adhB、来自丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)的丁醇脱氢酶、酵母属(Saccharomyces)ADHIV、和来自酿酒酵母(S.cerevisiae)的ADH6。
134.权利要求67或80的方法，其中所述PCoA或PACP源自乙酰-CoA或苯甲酰-CoA。
135.权利要求134的方法，其中所述乙酰-CoA源自可再生给料，其包含纤维素给料、糖、甘油或脂肪酸。
136.权利要求134的方法，其中所述乙酰-CoA源自合成气(SynGas)、甲烷或甲醇。
137.权利要求134的方法，其中所述苯甲酰-CoA源自多环芳香烃。
138.权利要求1、2和79中任一项的方法，其中所述2,6DAP由缺少二氨基庚二酸脱羧酶的产赖氨酸生物体产生。
139.权利要求1、2、79和138中任一项的方法，其中所述2,6DAP源自可再生给料。
140.权利要求139的方法，其中所述可再生给料包括糖。
141.一种生物衍生的尼龙-7、尼龙-7,x或尼龙-x,7。
142.由包括聚合7AHA的工艺产生的尼龙-7，其中所述7AHA源自PAS或AAS。
143.由包括聚合PA和1,7DHA的工艺产生的尼龙-7,7，其中所述PA源自PCoA；PACP；或2HDA而1,7DHA源自7AHA。
144.由包括聚合7AHA的工艺产生的尼龙-7，所述7AHA由包括以下方法步骤的方法制备：
(i)权利要求2-7；
(ii)权利要求2-4和11-15；
(iii)权利要求2-4和19-26；
(iv)权利要求2-4、19-20和30-33；
(v)权利要求2-4、19-20、30和37-41；
(vi)权利要求2-4、19和45-47；
(vii)权利要求2-4、19、45和51-52；
(viii)权利要求2-4、19-23和56-57；
(ix)权利要求2-4、19-20、30、37-38和61-62；
(x)权利要求67-69；
(xi)权利要求73-75；
(xii)权利要求76-77；
(xiii)权利要求78-79；或
(xiv)权利要求80。
145.由包括聚合1,7DHA和PA的工艺产生的尼龙7,7，其中1,7DHA由包括以下方法步骤的方法制备：
(a)权利要求2-7和9-10；
(b)权利要求2-4、11-15和17-18；
(c)权利要求2-4、19-26和28-29；
(d)权利要求2-4、19-20、30-33和35-36；
(e)权利要求2-4、19-20、37-41和43-44；
(f)权利要求2-4、19、45-47和49-50；
(g)权利要求2-4、19、45、51-52和54-55；
(h)权利要求2-4、19-23和56-60；
(i)权利要求2-4、19-20、37-38和61-65；
(j)权利要求67-69和71-72；
(k)权利要求73-75；
(l)权利要求76-77；
(m)权利要求78-79；或
(n)权利要求80，且
其中PA由包括以下方法步骤的方法制备：
(o)权利要求2-5；
(p)权利要求2-4和11-13；
(q)权利要求2-4和19-24；
(r)权利要求2-4、19-20和30-31；
(s)权利要求2-4、19-20、30和37-39；
(t)权利要求67；或
(u)权利要求73-75。
146.一种基本纯的宿主细胞培养物，大量所述宿主细胞包含一种或多种外源核酸，该外源核酸编码一种或多种酶，该酶涉及选自下组的一种或多种聚合物单体的生物合成：7AHA；PA；1,7DAH；ENTL；和7HHA，其中所述酶选自下组：氨裂合酶、烯酸还原酶、羧酸还原酶、ω-转氨酶、硫酯酶、酸-硫醇连接酶或CoA合成酶(synthtase)、CoA转移酶、酰基-[acp]硫酯酶、酰基-[acp]合成酶、氨基酸氨基转移酶、脱氨基脱氢酶、羰基还原酶、α-酮酸脱羧酶、乙酰乳酸合酶、α-氨基酸脱羧酶、脂肪-酰基-CoA还原酶、酰基-[acp]-还原酶、醛脱氢酶、醛氧化酶、酰胺水解酶、水裂合酶、和催化α-酮酸链延伸的酶。
147.权利要求146的培养物，其中所述细胞是原核细胞。
148.权利要求147的培养物，其中所述原核细胞选自下组：埃希氏菌属(Escherichia)如物种大肠杆菌(Escherichia coli)；梭菌属(Clostridia)如物种杨氏梭菌(Clostridium ljungdahlii)、自产乙醇梭菌(Clostridium autoethanogenum)或克氏梭菌(Clostridium kluyveri)；棒状杆菌属(Corynebacteria)如物种谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)；贪铜菌属如物种钩虫贪铜菌(Cupriavidus necator)或耐金属贪铜菌(Cupriavidus metallidurans)；假单胞菌属(Pseudomonas)如物种荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)或食油假单胞菌(Pseudomonas oleavorans)；代尔夫特菌属(Delftia)如物种食酸代尔夫特菌(Delftia acidovorans)；芽孢杆菌属(Bacillus)如物种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtillis)；乳杆菌属(Lactobacillus)如物种德氏乳酸杆菌(Lactobacillus delbrueckii)；和乳球菌属(Lactococcus)如物种乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)。
149.权利要求146的培养物，其中所述细胞是真核细胞。
150.权利要求149的培养物，其中所述真核细胞选自下组：曲霉属(Aspergillus)如物种黑曲霉(Aspergillus niger)；酵母属(Saccharomyces)如物种酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)；假丝酵母属(Candida)如物种热带假丝酵母(C.tropicalis)、白色假丝酵母(C.albicans)、C.cloacae、C.guillermondii、中型假丝酵母(C.intermedia)、麦芽糖假丝酵母(C.maltosa)、近平滑假丝酵母(C.parapsilosis)或C.zeylenoides；毕赤酵母属(Pichia)如物种巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)；耶氏酵母属(Yarrowia)如物种解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)；伊萨酵母属(Issatchenka)如物种东方伊萨酵母(Issathenkiaorientalis)；德巴利酵母属(Debaryomyces)如物种汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)；Arxula属如物种Arxula adenoinivorans；克鲁维酵母属(Kluyveromyces)如物种乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)；外瓶霉属(Exophiala)；毛霉属(Mucor)；木霉属(Trichoderma)；枝孢属(Cladosporium)；平革菌属(Phanerochaete)；Cladophialophora属；拟青霉属(Paecilomyces)；Scedosporium属和Ophiostoma属。
151.权利要求146的培养物，其中所述氨裂合酶包括EC 4.3.1中的氨裂合酶。
152.权利要求151的培养物，其中所述EC 4.3.1中的氨裂合酶包括EC4.3.1.1；EC 4.3.1.2；EC 4.3.1.3；EC 4.3.1.9；EC 4.3.1.12；EC 4.3.1.13；EC4.1.3.14；EC 4.1.3.23或EC 4.3.1.24。
153.权利要求146的培养物，其中所述烯酸还原酶包括EC 1.3.1中的烯酸还原酶。
154.权利要求153的培养物，其中所述烯酸还原酶为：
(a)在EC 1.3.1中，且包括EC 1.3.1.8；EC 1.3.1.9；EC 1.3.1.10、EC 1.3.1.31；EC 1.3.1.38；EC 1.3.1.39；EC 1.3.1.44；或EC 1.3.1.62中的庚二酰-CoA脱氢酶如PimC/PimD或ThnJ/ThnK；或
(b)在EC 1.3中，如EC 1.3.8.1；EC 1.3.99.3；EC 1.3.99.B10；或Syntrophusaciditrophicus 2,3-二脱氢庚二酰-CoA还原酶及其同源物。
155.权利要求146的培养物，其中所述羧酸还原酶包括EC 1.2.99中的羧酸还原酶或非酰化醛脱氢酶。
156.权利要求155的培养物，其中所述EC 1.2.99中的羧酸还原酶包括EC1.2.99.6，且所述非酰化醛脱氢酶包括来自鞘氨醇单胞菌属中的Spingomonas和贪铜菌属(Cupriavidus)物种的ThnG或其同源物。
157.权利要求156的培养物，其中所述ω-转氨酶包括EC 2.6.1中的转氨酶。
158.权利要求157的培养物，其中所述EC 2.6.1中的ω-转氨酶包括EC2.6.1.18；EC 2.6.1.19；EC 2.6.1.1；EC 2.6.1.13；EC 2.6.1.39EC 2.6.1.48；EC2.6.1.48；或EC 2.6.1.62。
159.权利要求146的培养物，其中所述硫酯酶包括EC 3.1.2中的硫酯酶。
160.权利要求159的培养物，其中所述EC 3.1.2中的硫酯酶包括来自EC3.1.2.18；EC 3.1.2.19；或EC 3.1.2.20的作用于CoA硫酯的硫酯酶；YciA、tesB或Acot13的基因产物；或来自EC 3.1.2.14和EC 3.1.2.21的作用于[acp]-硫酯的硫酯酶。
161.权利要求146的培养物，其中所述酸-硫醇连接酶包括EC 6.2.1中的酸-硫醇连接酶。
162.权利要求161的培养物，其中所述EC 6.2.1中的酸-硫醇连接酶包括来自EC 6.2.1.3；EC 6.2.1.14；或EC 6.2.1.23的作用于CoA酯的CoA合成酶和EC 6.2.1.14(如BioW)和EC 6.2.1.20中的酰基-[acp]-合成酶。
163.权利要求146的培养物，其中所述CoA转移酶包括EC 2.8.3中的CoA转移酶，或ThnH的基因产物及其同源物。
164.权利要求163的培养物，其中所述EC 2.8.3中的CoA转移酶包括EC2.8.3.12；EC 2.8.3.13；EC 2.8.3.14；或ThnH的基因产物。
165.权利要求146的培养物，其中所述氨基酸氨基转移酶包括EC 2.6.1中的氨基转移酶。
166.权利要求165的培养物，其中所述EC 2.6.1中的氨基酸氨基转移酶包括EC 2.6.1.21；EC 2.6.1.39；EC 2.6.1.42；或EC 2.6.1.67。
167.权利要求146的培养物，其中所述羰基还原酶包括EC.1.1.1.184；EC1.1.1.79；EC 1.1.1.B3；EC 1.1.1.B4或来自EC 1.1.99.2.或EC 1.1.99.6的2-羟基戊二酰脱氢酶/α酮戊二酸还原酶。
168.权利要求146的培养物，其中所述脂肪-酰基-CoA还原酶、脂肪-酰基-[acp]还原酶或醛脱氢酶包括EC 1.2.1中的还原酶。
169.权利要求168的培养物，其中所述EC 1.2.1中的脂肪-酰基-CoA还原酶、脂肪-酰基-[acp]还原酶或醛脱氢酶包括EC 1.2.1.3；EC 1.2.1.4；EC1.2.1.20；EC 1.2.1.22；EC 1.2.1.50；EC 1.2.1.57；EC 1.2.1.63；或EC 1.2.1.76。
170.权利要求146的培养物，其中所述醛脱氢酶包括EC 1.2.1中的醛脱氢酶。
171.权利要求170的培养物，其中所述EC 1.2.1中的醛脱氢酶包括EC1.2.1.3；EC 1.2.1.4或EC 1.2.1.63。
172.权利要求146的培养物，其中所述水裂合酶包括EC 4.2.1中的水裂合酶。
173.权利要求172的培养物，其中所述EC 4.2.1中的水裂合酶包括EC4.2.1.2；EC 4.2.1.59；EC 4.2.1.61；EC 4.1.2.17或EC 4.1.2.18。
174.权利要求146的培养物，其中所述催化α-酮酸链延伸的酶包括选自包含以下的酶组中的一种或多种酶：AksA、AksD、AksE和AksF酶。
175.权利要求174的培养物，其中所述AksA包括EC 2.3.3中的AksA酶。
176.权利要求175的培养物，其中所述EC 2.3.3中的AksA酶包括EC2.3.3.13或EC 2.3.3.14。
177.权利要求174的培养物，其中所述AksD和Aks E均包括EC 4.2.1.114中的AksD/E酶。
178.权利要求177的培养物，其中所述EC 4.2.1中的AksD酶包括EC4.2.1.36。
179.权利要求174的培养物，其中所述AksF包括EC 1.1.1中的AksF酶。
180.权利要求179的培养物，其中所述EC 1.1.1.中的AksF酶包括EC1.1.1.87。
181.权利要求146的培养物，其中所述醇脱氢酶包括EC.1.1.1.1或EC1.1.1.2或EC 1.1.1.21。
182.权利要求146的培养物，其中所述醇脱氢酶选自来自运动发酵单胞菌的adhA、来自运动发酵单胞菌的adhB、来自丙酮丁醇梭菌的丁醇脱氢酶、酵母属ADHIV、和来自酿酒酵母的ADH6。
183.一种分离的细胞，其包含一种或多种外源核酸，该外源核酸编码一种或多种酶，该酶涉及选自下组的一种或多种聚合物单体的生物合成：7AHA；PA；1,7DAH；ENTL；和7HHA，其中所述酶选自下组：氨裂合酶、烯酸还原酶、羧酸还原酶、ω-转氨酶、硫酯酶、酸-硫醇连接酶或CoA合成酶、CoA转移酶、酰基-[acp]硫酯酶、酰基-[acp]合成酶、氨基酸氨基转移酶、脱氨基脱氢酶、羰基还原酶、α-酮酸脱羧酶、乙酰乳酸合酶、α-氨基酸脱羧酶、脂肪-酰基-CoA还原酶、酰基-[acp]-还原酶、醛脱氢酶、醛氧化酶、酰胺水解酶、水裂合酶、和催化α-酮酸链延伸的酶。
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